JPH03201997A - 酵素試薬組成物及びそれを用いる液体試料中分析対象物の酵素的測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の技術分野） 本発明は、特定の分析対象物の存在又は濃度について試
料を酵素的に分析するための組成物及び方法に関する。

さらに詳しくは、本発明は、担体マトリックスに包含せ
しめた安定化酵素試薬組成物を含む乾式相試験片を利用
することによって、グルコース、尿酸、コレステロール
、低級アルコール類（例えばエチルアルコール）のよう
な分析対象物について、尿又は血清のような液体試料を
酵素的に分析するための新規で改良された方法及び組成
物に関する。本発明は、特に、グルコースについて、液
体試料を試験するための新規で改良された組成物及び方
法に関する。担体マトリックス中に包含せしめた安定化
酵素試薬組成物は、対象とする分析対象物と相互作用す
ることができるオキシダーゼ酵素：分析対象物−オキシ
ダーゼ酵素量相互作用に応答して色の遷移を受けて液体
試料中の分析対象物の存在もしくは濃度を示す色原体（
クロモーゲン）：並びに、試験片の熱安定性を改良する
安定剤を含み、試験片のシェルフ・ライフ（保存寿命）
を改善し、液体試料中の分析対象物含量をより正確に検
出測定するちのである。安定化酵素試薬組成物に含まれ
て診断用試験片の安定性を、意外にち改善する安定剤は
、ヒドラジンのような、ヒドラジンをベースとする化合
物（ギラード試薬Ｔのような）、又はアルギニン６しく
はりジンのようなアミノ酸、又はグルクミン酸のトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のようなアミノ酸
誘導体である。

（本発明及び先行技術の背景） 酵素をベースとする組成物を包含した乾式相試験片は、
臨床検査室、開業医の医院、病院及び家庭において、グ
ルコース、コレステロール、低級アルコール類及び潜血
について、尿その他の液体試料を試験するために広く使
用されている。ヒトの血糖値もしくはグルコース濃度を
測定する分析対象物試験具は特に重要である。事実、こ
れらの試験具は、国民の内の数百万の糖尿病患者の多く
の者のために日々必要なものとなっている。糖尿病は、
血液化学における危険な異常を来たしうるちので、視力
喪失及び腎不全の原因となると考えられているため、多
くの糖尿病患者は、自分自身で定期的に試験を行って、
通常は、インシュリン注射によってしかるべくそのグル
コース・カウントを調節しなければならない、インシュ
リン依存性の患者、すなわち、糖尿病患者の約１０％〜
１５％は、日に４回ら、その血中糖レベルを試験口なけ
ればならない。

したがって、尿もしくは血清中のグルコースの検出及び
定量測定は、糖摂取量を調整するために食餌をコントロ
ールしなければならず、血中及び尿中グルコースについ
て頻繁に試験することによって、この点に関するガイド
を受けなければならない糖尿病の個々人にとって特に重
要である。更に、糖尿病のスクリーニング計画は、迅速
で、経済的で、正確なグルコース測定法の利用可能性に
依存している。

他の糖類、例えば、ラクトース、フラクトース、ガラク
トース及びペントースも、一定の条件下で、尿中に見出
されるが、グルコースは尿中に最も普通に見出される糖
である。尿中グルコースの検出しうる量の存在は糖尿と
して知られている。糖尿は、血中グルコース濃度が再吸
収能すなわち腎閾値を超えた場合、すなわち、腎糸球体
のｉ戸液が細管が再吸収できる量を超えるグルコースを
含んでいる場合に起きる。検出できる量の尿中グルコー
スは、良性の状態に６病気にががった状態にち関係しつ
るので、医者は、これら二つの起りつる状態を区別して
、必要ならば治療を始めなければならない。

例えば、腎性糖尿は、たとえ血中グルコース濃度か正常
であってち観察される。なぜならば、細管からのグルコ
ースの再吸収量が正常値未満の場合に、いくらかのグル
コースが尿中に出てくるからである。これは、重厚な食
事をとった後や感情的なストレス期間中の糖尿現象のよ
うに、良性の状態である。これとは対照的に、真性糖尿
病、すなわち、糖尿の主たる原因は、病的な状態である
。この病態は、いちじるしい血糖値の上昇をもたらし、
通常は尿量の増大を６たらす。したがって、診療試験に
おいて、糖尿病の尿中グルコース含量は１０％のレベル
にも達しつるが、２％〜５％の値がより普通である。

その結果、個人が過剰量のグルコースを排泄しているか
どうかを調べたり、ある特定の治療法の効果を監視する
ために、簡単、正確かつ経済的なグルコース検出試験法
が開発されている。さらに、尿中ちしくは血中グルコー
スの検出もしくは測定のために開発された数種類の異な
った試験法のうちで、グルコース・オキシダーゼとグル
コース間の酵素反応に基づく方法が特に有用であること
が判っている。

家庭における血中グルコースの試験は、全血試験のため
の試薬含浸試験片が開発されたときに可能となった。こ
の試薬試験片は、グルクロン酸と過酸化水素へのグルコ
ースの酸化反応の触媒となることができる、グルコース
・オキシダーゼのような酵素：被酸化性の色原体指示薬
、例えば〇−トリジンのような被酸化性色素：及び、該
指示薬の酸化の触媒の働きをしつるペルオキシダーゼ様
活性（ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙｌ
を示す物質を含む試薬組成物である。被酸化性の色素す
なわち指示薬は、酸化の程度によって、視覚上に異なっ
た色相に変わる。酸化の程度は、それ自身、血液試料中
グルコースの濃度に依存する。

グルコースと試薬組成物間に起きる反応は、次のように
表される。

グルコース＋０２ｆ空気） グルコース・ オキシダーゼ。

Ｌ→グルクロン酸十過酸化水素（Ｈ，０，１Ｌ→酸化さ
れた色素（色の変化）＋８２０試薬試験片は、一般に、
上記したようにグルコースと反応することができる試薬
組成物を含浸せしめたセルロースのような吸水性材料の
ような担体マトリックスを含んでいる。

ここ数年、糖尿病患者は、市販の尿分析キットにたよっ
てきたが、これは、繰返して改良されたに６かかわらず
、不正確な血中グルコースの測定値しか与えなかった。

最近、尿中グルコースを分析するための試薬試験片が開
発された。初期の尿中グルコース試験の例は、米国特許
筒２．３８７．２４４号及び同第３．１６４．５３４号
に記載されている。ごく最近、家庭で使用されている、
尿中グルコースの試験法には、上述したようなグルコー
ス・オキシダーゼとグルコース間の反応に基づく酵素的
な試験法か、あるいは、ある金属イオンのグルコースに
よる還元に基づく還元試験法がある。尿に適用されるよ
うな、グルコースについての、この酵素的グルコース・
オキシダーゼ試験は、グルコースに特異的である。この
試験法においては、血液試験と同様に、グルコース・オ
キシダーゼは、グルコースのグルクロン酸と過酸化水素
への酸化の触媒として動く。生成した過酸化水素は、ペ
ルオキシダーゼの存在下、指示薬を酸化して色の変化を
６たらす、他の糖類、例えば、ラクトース、フラクトー
ス、ガラクトース及びペントースは、グルコース・オキ
シダーゼの基質ではないため、反応して、被酸化性指示
薬の最終的な色の遷移（移行）を来たすことはない。

金属イオン、例えば第２銅イオン（Ｃｕ″０）の還元に
基づく尿中グルコース試験法は、グルコースに対して非
特異的である。金属イオンの還元は、クレアチニン、尿
酸、アスコルビン酸又はいくつかの他の還元糖のような
、尿中に存在するいかなる還元性物質との反応によって
も起こり得る。銅這元試験法の非特異性は、グルコース
以外の尿中糖類を検出するという点で有利である。しか
しながら、この試験法は、糖類のほかにも他の還元性物
質を検出するという点で不利である。

（橙赤色） グルコースについて試験するために用いられる。いくつ
かの乾式相試験片は、グルコース・オキシダーゼ、ペル
オキシダーゼ及び被酸化性色原体指示薬を含浸した担体
マトリックスの小さい四角形のパッドからなる単一の試
験領域を有する。他の乾式相試験片は、上述した一つの
グルコース試験域を含み、さらに、同じ試験片上にいく
つかの付加的な試験域を含んで他の尿中成分の同時試験
を可能にする多目的試験片である０両方のライフの色分
析用乾式相試験片と６、尿中グルコースの試験は、試験
片をよく混合され遠心された尿試料中に単に浸漬し、過
剰の尿を容器の側面に触れさせて除き、次に、試験片の
試験域に生じた色を、色分析用試験片の容器に備えられ
た標準色票（カラー・チャート）と比較することによっ
て行われる。例えば、液体試料中のグルコースの存在量
又は濃度を分析するために用いられる銅還光試験法にお
いては、グルコースとの反応によって生じた色を、００
１％未満のグルコース濃度を示す青色から、２％以上の
グルコース濃度を示す褐色に亘る６ブロツク式色票と比
較する。上述した方法によれば、各人は、約Ｏ％から約
２％の範囲の尿試料中グルコース含量を、視覚的に、容
易に測定することができる。今日の試験片の最ち大きな
利点は、低価格であること、使用し易いこと、比較的正
確な試験ができること、及び、応答時間が短いことであ
る。これらの利点のため、試験片は、個々人が家庭で尿
中グルコースを検出測定するために、理想的なちのとな
っている。しかしながら、グルコース・オキシダーゼ、
ベルオキシグーゼ及び被酸化性色原体指示薬の組合せが
グルコース試験において広く用いられているが、酵素を
利用するグルコース試験法には、いくつかの問題点や欠
点が、未だ存在している。酵素を用いる試験片の製造業
者及び使用者を悩まし続けている大きな問題点は、乾式
用試験片の製造、輸送、保管及び使用中、酵素を用いる
試験用組成物が熱的に不安定であるということである。

ある特定の酵素組成物についてこの熱安定性の問題の程
度を調べるために、製造業書違は、日常的に、高温にお
ける安定性試験を行っている。これらの安定性試験の結
果は、乾式用試験片のシェルフ・ライフ（保存寿命）及
び使用限度期日を予測するために用いられる。この保存
寿命が余りにも短いと、試験片の市販品としての寿命が
制限されることは明らかである。

上述したように、グルコース試験具は、訓練を受けた医
療業者及び家庭における個人の両者によって広く使用さ
れている。ところが、病院や診療所の保管条件は、通常
、比較的制御されている一方、家庭における保管条件は
極端に変わりつる。更に、家庭における使用者は、１日
にいくつかの試験片を使用し、そのため、短期間に一瓶
の試験片を消費するかと思えば、めったにしか試験片を
めったに使用しない場合もある。ちちろん、試験片は、
また、使用者によって持ち運びされ、それゆえ、広範囲
の温度条件に晒されることもある。このことは、糖尿病
患者によって頻繁に使用されるグルコース試験片につい
ては、特に、事実である。しかしながら、本発明の方法
及び組成物は、酵素を含むグルコース試験用組成物に対
して、グルコース・オキシダーゼ／ベルオキシダゼを利
用する試験片に対して、そして、他の分析対象物用の酵
素を含む試験用組成物に対して、乾式用試験片が、変動
する製造及び保存条件により耐性となるように、改善さ
れた熱安定性を与える。

試験片の安定性は、酵素を含む試験片の商業的な使用に
当っての重要な側面である。長い保存寿命を有する酵素
含有試験片は、診療所に運ばれる前に、長期間、製造業
者や販売業者の在庫品として置かれるように、製造・販
売経路中にとどまることができ、また１診療所は、充分
に大量の試験片の在庫を注文することができ、その結果
、頻繁に再注文する必要がなくなる。更に、益々重要と
なる経費の要素が、幾分緩和される。というのは、試験
片の保存寿命に基づく使用限度期日に達した後で廃棄さ
れる酵素含有試験片がより少なくなるからである。その
結果、診療所や家庭における使用者が、使用前に返品し
たり廃棄する必要がない安定な酵素含有試験片を供給す
ることは重要である。

したがって、不当に短い試験片保存寿命という欠点のな
い尿中もしくは血清中グルコースの、簡単かつ正確で、
信頼できる試験法を有することは、極めて有利なことで
ある。そのような利点は、期限を越えて試験具を使用し
て尿中グルコースを試験し、該試験具に包含せしめた酵
素試薬組酸物の不安定さが誤った試験結果を与え、これ
により、誤った診断を与えた場合を考えれば、最ち明白
である。尿もしくは血清中のグルコース濃度を測定する
ための安定な乾式相試験片を、浸漬−読取り式試験片の
ような使い易い形で与えることにより、診療所の担当者
及び家庭での個人が、グルコースについて尿らしくは血
清の試験を行って、より正確に、尿もしくは血清中のグ
ルコース濃度及び／又は個人が受けている治療の成功を
、期限切れで信頼性がない試験片を用いる可能性がある
欠点なしに、監視することができる。

以下により許細に述べるように、本発明の方法は、安定
化酵素をベースとする試薬組成物を含む乾式相試験片を
用いることにより、グルコースについて、迅速かつ正確
で、信頼性のある尿もしくは血清の試験を可能にしたも
のである。安定化された酵素を含む試薬組成物は、乾式
相試験片の熱安定性及び保存寿命を改良し、それにより
、比較的遠い昔に製造されたり、あるいは、異常に高い
温度で保存されていた酵素含有試験片を用いて試料のグ
ルコース濃度を正確に測定することを可能にする。

先に述べたように、糖尿は、臨床上及び病理学上の病態
のまさにその性質に関連づけられ、特定の病気の重さに
依存している。糖尿は、間欠的もしくは連続的で６あり
得、−時的で間欠的な糖尿は、通常、病態によるよりも
、むしろ、生理学的ないしは機能的な状態に起因する。

したがって。

グルコースに関する尿及びその他の試料の正確で信頼で
きる試験法が、診療所及び家庭の両方において使用でき
るようにならなければならない、これらの試験法は、正
しい診断を行うことができ、かつ、正しい治療が実施さ
れ、監視され、維持されるように、グルコースの検出及
び測定を可能にする６のでなければならない。

更にまた、尿その他の液体試料中グルコースのいかなる
試験方法ら、試料のグルコース含量との反応の結果とし
て、あるいは、それに関係づけられる色変化を受ける安
定な酵素含有試薬組成物を利用することによって、正確
で、信頼性があり、かつ、再現性のよい結果を生まなけ
ればならない。試験は、試料の真のグルコース濃度を反
映することが絶対に必要で、時間とともに、酵素含有試
薬組成物の力価の減少の結果として、見がけの低いグル
コース濃度を示すものであってはならない。さらに、グ
ルコースについての試験において用いられる方法や組成
物は、多重試験試薬パッドに存在する他の試験試薬パッ
ドに悪い影響を与えたり、それを隋書するものであって
はならない。

本発明前には、グルコースについて尿又は他の液体試験
試料を試験する公知の方法には、安定化された酵素を含
む試薬組成物を含み、乾式相試験片の安定性を、かくま
で予測できない程改良して、それにより、比較的古い及
び／又は保存が正しくなされていない試験片を用いて正
確で信頼できるグルコースの分析を可能としたちのはな
い。さらに、酵素をベースとする乾式相試験片は、数年
に亘って、グルコース試験に広く用いられているが、本
発明において使用される安定剤を酵素試薬組成物中に包
含せしめて酵素をベースとする乾式相試験片の安定性を
改善したちのはない。

先行技術は、乾式相試験片中に包含せしめられる酵素組
成物を安定化する試みに関する多くの参照文献を含んで
いる０例えば、グルーバー（Ｇｒｕｂｅｒ）らは、米国
特許第３，７２１．６０７号において、無機アジド化合
物と２．２゛−アジノージ−（３−エチルベンゾチアゾ
リン−６−スルホン酸）の両者を含む、グルコースの酵
素による測定のための安定化された試験試薬を開示して
いる。しかしながら、グルーバーによって開示された組
成物は、グルコースについての酵素を用いる湿式試験に
用いられる安定化された溶液であって、グルコースにつ
いての酵素試験に用いられる乾式試験片の安定化を目ざ
したちのではない。

同様に１日本国特許出願公開第５５１０１３００８号は
、グルコース・オキシダーゼ及び／又はペルオキシダー
ゼ溶液を保存するために低級アルコール類を用いること
を開示している。

ヨーロッパ特許筒０８０．３０４号は、酸性アミノ酸を
使用して酵素を含む試薬溶液を安定化させることを開示
している。アミノジカルボン酸類並びにそれらのアンモ
ニウム及びアルカリ金属塩（例えば、グルタミン酸、ア
スパラギン酸及びα−アミノアジピン酸）のような酸性
アミノ酸を用いて、グルコース・オキシダーゼやコリン
・オキシダーゼのような酵素を含む水溶液を安定化して
いる。

このヨーロッパ特許は、酸性アミノ酸を除く他のアミノ
酸もしくはアミノ酸塩の使用を教示も示唆もしておらず
、酵素含有乾式相試験片の安定剤としてこれらの酸性ア
ミノ酸を使用することを教示ら示唆もしていない。

ドゥーリー（Ｄｏｏｌｅｙ）に与えられた米国特許第３
、７７８．３８４号は、グルコース・オキシダーゼ／ペ
ルオキシダーゼ試薬組成物に基づくグルコース試験にヒ
素化合物を使用することを開示している。ヒ酸ナトリウ
ムのようなヒ素化合物は、グルコースに対する酵素試薬
組成物の感受性を増大せしめ、かつ、グルコース−酵素
反応の結果とじて起きる色の変化の安定性を増大せしめ
る。トウーノーは、また、組成物に、チオ尿素を包含せ
しめて、色の変化をさらに安定化させることを開示して
いる。これとは対照的に、本発明は、長時間の保存の後
、悪い保存条件下で６、試薬組成物が酵素的及び化学的
安定性を維持し、それ故、尿もしくは血清中グルコース
の試験が正確で信頼できる結果を与えるように、酵素試
薬組成物を安定化させることを目ざしている。

グリーン（Ｇｒｅｅｎｌは、米国特許第４．１８９．５
３６号において、２−メルカプトコハク酸のトリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン塩を、クレアチン・ホス
ホキナーゼ又はグルコースについての試験のような酵素
を用いる試験に活性化剤ないしは安定剤として用いるこ
とを開示している。しかしながら、米国特許第３．７２
１．６０７号において、グルーバーによって開示された
組成物と同様に、グリーンによって開示された化合物は
、先ず、混合物としての乾燥保存相における酵素試薬の
安定化に役立ち、次に、湿式相化学試験の性能を改善す
るために、酵素試薬を溶解したのち、水性相中の酵素試
薬を安定化することに役立つ、グリーンによって開示さ
れた化合物は、グルコース・オキシダーゼ及びペルオキ
シダーゼに基づくグルコースの乾式相試験片による試験
のための酵素試薬用安定剤とは異なり、グルコースのへ
キソキナーゼを触媒とするホスホリル化とそれに続くグ
ルコース−６−ホスフェートの酸化に基づく試薬組成物
のための増量剤（ｂｕｌｋｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）及び安
定剤として使用されている。

リッタースドルフ（Ｒｉｔｔｅｒｓｄｏｒｆｌらに与え
られた米国特許第４．２２０，７１３号は、グルコース
・オキシダーゼ及びペルオキシダーゼに基づくグルコー
ス試験のような、被酸化性指示薬を用いる比色試験用の
試験片の安定剤として１−アリールセミカルバジド類を
使用することを開示している。親化合物であるセミカル
バジドは安定剤としては作用しないと、具体的に記載さ
れている。これとは対照的に、本発明の方法及び組成物
は、分析対象物について試験するために用いられる酵素
含有試験片を安定化させる、種々のヒドラジド類、ある
種のアミノ酸類及びアミノ酸誘導体に向けられている。

モトバヤシは、米国特許第４．３８６．０５３号におい
て、有機ペルオキシド、色原体及び緩衝剤を含む潜血試
験具用の安定剤を開示している。この安定剤は、置換フ
ェニル部分及び置換アミドちしくは置換スルホンアミド
部分を有する芳香族化合物である。同様に、クローゼ（
Ｋｌｏｓｅｌに与えられたヨーロッパ特許筒０７１，７
３０号は、メチルベンゾチアゾロンヒドラゾン、被酸化
性芳香族アミン及び安定剤としてのフェロシアニド、ア
ジドちしくはキレート化剤を含む、過酸化水素又は過酸
化水素生成系を検出するための安定化された試薬混合物
を開示している。

先行技術とは対照的に、また、現在市販されている試験
片とは対照的に、本発明の方法及び組成物は、ヒドラジ
ド系安定剤、アミノ酸系安定剤らしくはアミノ酸誘導体
系安定剤を用いることによって、尿中もしくは血清中の
グルコース及び他の分析対象物の検出及び測定に用いら
れる乾式相酵素含有試験片の安定性を高める。予測でき
ない程改良された、酵素試薬組成物の安定性は、とくに
、ヒドラジドとアミノ酸の両者、ヒドラジドとアミノ酸
誘導体の両者を、酵素試薬組成物の安定剤として用いた
場合に６たらされる。したがって、本発明の方法及び組
成物によれば、ヒドラジドによって安定化された。ある
いは、アミノ酸によって安定化された、あるいは、アミ
ノ酸誘導体によって安定化された酵素試薬組成物を担体
マトリックスに包含せしめることによって、グルコース
やコレステロールのような分析対象物について尿その他
の液体試料を試験するために用いられる乾式用試験片を
安定化させるに当って新しくかつ予測できない結果が達
成される。

（発明の要約） 要約して言えば、本発明は、グルコース、コレステロー
ル、尿酸及びアルコール類のような分析対象物の存在及
び／又は濃度について尿や血清を酵素を用いて試験する
ための組成物及び方法に関する。この試験は、試料中に
存在する分析対象物と反応して検出可能な応答を生じる
ことができる安定化された酵素試薬組成物を含浸した担
体マトリックスを含む乾式用試験片を用いて行われる。

家庭用のものでは、安定化された酵素試薬組成物は視覚
的に検出可能な応答を生じる０診療所用の６のでは、こ
の安定化酵素試薬組成物は視覚的に検出可能であるか、
あるいは、機器によって検出可能な応答を生じる。乾式
用試験片の担体マトリックスは、濾紙のような吸水性材
料であるか、あるいは、透過性の高分子物質の細片（ス
トリップ）、層又は膜のような非吸水性材料である。

グルコースについての試験に用いられるグルコース・オ
キシダーゼ、ペルオキシダーゼ及び被酸化性指示薬の組
成物のような酵素試薬組成物中にヒドラジド又はアミノ
酸又はアミノ酸誘導体を包含せしめると、酵素試薬組成
物が安定化され、それ故に、試験片が保護され、試験片
の使用寿命が伸びることが実証された。本発明の安定化
された酵素試薬組成物を酵素を用いる診断試験法に取り
入れることによって、尿又は血清試料中の分析対象物の
存在又は半定量的濃度を、試験片の色変化の強さによっ
て正確かつ信頼性良く測定することができる。本発明の
重要な特徴によれば、この安定化酵素試薬組成物を用い
ることにより、保存中に全ての酵素活性を失うか、かな
りの量の酵素活性を失ってしまった試験片を使用し、そ
の結果、不正確で間違った試験結果を生む可能性が少な
くなるか、あるいは皆無となる。

より詳しくは１本発明は、新規にして改良された安定化
酵素試薬組成物を用いることにより、分析対象物につい
て尿その他の試料を、酵素を用いて試験する方法に関す
る。酵素をベースとする試薬組成物中にヒドラジド又は
アミノ酸又はアミノ酸誘導体を用いることによって、改
良された安定性を有する乾式用試験片が得られ、その結
果、試験結果の信頼性が増大する。

本発明のちう一つの重要な特徴によれば、酵素試薬組成
物を使用した乾式用試験片は、現在の試験片の約３倍か
ら約５倍の増大した安定性と保存寿命を示す。診断試験
法において本発明の酵素試薬組成物を用いることによっ
て、尿その他の液体試料中の、グルコースのような分析
対象物の定量的及び／又は半定量的な濃度がより正確に
、かつ、より信頼性よく測定される。というのは、ヒド
ラジド又はアミノ酸又はアミノ酸誘導体の添加によって
得られる試験片の安定性は、酵素試薬組成物の高い化学
的活性及び酵素活性を長期及び／又は悪い保存条件下で
も維持することにより試験片の臨床検査上有用な寿命を
増大せしめる。

したがって、本発明の目的は、分析対象物について尿又
は他の液体試料を酵素を用いて試験する、簡単で、信頼
性が高く、かつ、正確で再現性の良い方法を提供するこ
とである。

本発明の目的は、また、酵素活性及び化学的活性を高い
温度下、長期に亘って維持する乾式用試験片を用いて尿
又は他の液体試料を酵素を用いて試験する方法を提供す
ることである。

本発明のもう一つの目的は、安定化酵素組成物を用いて
尿又は他の液体試料を酵素を用いて試験する方法を提供
することである。

本発明の６つ一つの目的は、分析対象物と反応して検出
可能かつ測定可能な色の変化を生じ、もって、試料中の
分析対象物の存在又は濃度を確立することができる安定
化酵素組成物を用いることによって尿又は他の液体試料
を酵素を用いて試験する方法を提供することである。

本発明の６つ一つの目的は、分析対象物と反応して視覚
的に及び／又は機器によって識別可能な色の変化を生じ
、ちって、尿その他の液体試料中の分析対象物濃度の信
頼できる半定量的測定を可能にすることができる安定化
酵素組成物を提供することである。

本発明のちう一つの目的は、グルコースについて、尿又
は血清を、酵素を用いて試験する方法を提供することで
ある。

本発明のもう一つの目的は、クルコース以外の分析対象
物についての同時尿試験又は同時血清試験において隋書
を行わず、又は、誤った結果を与えない、尿又は血清中
グルコースの酵素的試験法を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、長期に亘って、かつ、高温
下で酵素活性及び化学的活性を維持し、グルコースと反
応して検出可能な色の変化を生じ、その結果、尿又は血
清中グルコースの存在又は濃度を確立することができる
安定化酵素試薬組成物を提供することである。

本発明のちう一つの目的は、グルコースと反応して視覚
的に及び／又は機器により識別可能な色の変化を生じ、
尿又は血清中グルコース濃度の半定量的測定を可能にす
ることができる安定化酵素試薬組成物を提供することで
ある。

本発明のもう一つの目的は、グルコース・オキシダーゼ
、ペルオキシダーゼ、被酸化性指示薬並びに、酵素試薬
組成物がその酵素活性及び化学的活性を比較的高温で長
期に亘って維持するような安定剤を含む、液体試料中グ
ルコースの検出及び／又は半定量的測定用の安定化酵素
試薬組成物を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、分析対象物について、尿そ
の他の液体試料を試験するための乾式相試験片に包含せ
しめるための、ヒドラジド安定剤又はアミノ酸安定剤又
はアミノ酸誘導体安定剤を含む安定化酵素試薬組成物を
提供することである。

本発明のちう一つの目的は１分析対象物について、尿又
は他の液体試料を試験するための乾式相試験片中に包含
せしめるための安定化酵素試薬組成物であって、その安
定化酵素試薬組成物がグルコース・オキシダーゼ；ベル
オキシダーゼ二被酸化性色原体指示薬；緩衝剤：及び、
ヒドラジド、例えば、ヒドラジン−水和物、塩化（カル
ボキシメチル）ｈリメチルアンモニウム・ヒドラジド、
塩化１−（カルボキシメチル）−ピリジニウム・ヒドラ
ジド、２−ヒドラジン−２−イミダゾリン・臭化水素酸
塩もしくは２−フロイック酸ヒドラジド（２−フランカ
ルボン酸ヒドラジド）；又は、アミノ酸、例えば、アル
ギニンちしくはりジン、又は、アミノ酸誘導体、例えば
、グルタミン酸のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン塩のようなアミノ酸のトリス（ヒドロキシメチル）
アミツメクン塩のごとき安定剤を含んでいるちのを提供
することである。

本発明の上述の、及び他の目的及び利点は、次に述べる
発明の詳細な説明から明らかとなるであろう。

（発明の詳細な説明） 本発明の方法及び組成物によれば、尿又は血清のような
液体試料中のグルコースのような分析対象物の存在又は
量を、発色性指示薬に検出ないしは測定可能な変化を生
せしめるための、安定化酵素試薬組成物と問題の分析対
象物間の反応によって測定することができる０通常、使
用される酵素はグルコース・オキシダーゼのようなオキ
シダーゼであり、生じた酵素−分析対象物の反応は、ｏ
−１−ルイジン、０−ジアニシジンもしくは３．３′、
５．５’−テトラメチルベンジジンのような被酸化性発
色性指示薬に色の変化を起こさせる。

被酸化性の発色性指示薬を含む酵素を用いる試験に固有
の欠点は、この指示薬が、容易がっ比較的迅速に色の変
化を起こして分析対象物の存在らしくは濃度を示すよう
に、比較的容易に酸化される６のでなければならないこ
とである。しかしながら、指示薬は極めて容易に酸化さ
れるため、この指示薬は、特に、空気中の温気や光の存
在下で、空気中の酸素に感しやすい。したがって、酵素
試薬組成物中に包含せしめるために選ばれる発色性指示
薬の固有の安定性が考慮されなければならない。酵素／
被酸化性指示薬をベースとする試験操作の不安定性は、
長い保存期間、比較的高い温度並びに分析対象物につい
ての家庭における試験用の試験片の素人による試験片の
一般的な誤操作によって更に増強される。

したがって、本発明方法は、液体試料中分析対象物の試
験のための乾式試験片中に包含せしめることができる安
定化酵素試薬組成物に向けられる。ヒドラジド又はアミ
ノ酸又はアミノ酸誘導体の、オキシダーゼ・酵素と被酸
化性指示薬を含む試薬組成物への添加は、酵素試薬組成
物を空気中の酸素、空気中の水分及び光から効果的に保
護して、乾式試験片中ゼ 認容できないほど失うことなく、比較的高温下で６長期
に亘って保存することを可能にする。さらに、このヒド
ラジド又はアミノ酸又はアミノ酸誘導体は酵素試薬組成
物を安定化する働きをするが、これらの安定剤は酵素−
分析対象物間の反応や結果として生じる指示薬の色の変
化を遅らせるようなことはなく、したがって、依然とし
て、充分に迅速な試験がなされることを可能にする。さ
らに、安定化酵素試薬組成物がその酵素活性及び化学的
活性を長期に亘って充分に維持しているため、得られた
試験結果は信頼性のある、正確なちのである。この安定
化酵素試薬組成物を含有した試験片は、より長い診断用
の有効寿命を有し、そのため、比較的短い保存期間後に
未使用の試験片を廃棄しなければならない必要性が無く
なることが判った。

以下に記載する本発明の詳細な説明から、尿試験の他に
、本発明の方法及び組成物は、血しょうや血清中の分析
対象物の存在や濃度を、より一般的には、他の多くの分
析対象物含有液体の分析対象物含量を測定するために６
使用することができる。例えば、汗は血液の限外濾過の
炉液であって、低い様々なグルコース濃度を有している
。文献によれば、組織の細胞外空間及び筋肉内もしくは
皮下におけるグルコース濃度は血中グルコースより６低
いことが示されているが、このグルコース濃度は血中グ
ルコースの良き指標となると考えられる。かくして、グ
ルコースは、検出及び測定に潜在的には充分な量、皮膚
の下側に達しているのである。

本発明のもう一つの重要な特徴によれば、本発明の方法
及び組成物は、尿らしくは血中分析対象物の存在らしく
は濃度を測定するための乾式の試験パッド試験において
も、あるいは、水性の液相試験においても使用すること
ができる。乾式相酵素試薬試験片は、低度かつ簡便であ
るという利点を有するが、診断上有効に使用できる寿命
は比較的短い。したがって、酵素含有試験片に対してよ
り長い゛°シェルフ・ライフ”即ち保存寿命が与えられ
たならば、製造業者は大量の試験片をより効率的に製造
して保存することができ、かくして。

期限切れの未販売の試験片を廃棄する必要がなくなるこ
とによって試験片の価格をできる限り低く保つことに没
立つであろう、驚くべきことに、以外にも、全てではな
いが、種々のヒドラジド類、アミノ酸類及びアミノ酸の
誘導体類が、分析対象物と反応して検出可能な色の変化
を生じ液体試料中の分析対象物の存在及び／又は量を示
す酵素試薬組成物を安定化する能力を示した。乾式相試
薬試験片の安定性は、試験片を一定温度下で指定された
期間保存し、公知の標準品に対するその試験片の反応性
を測定することによって決定される。多くの試薬試験片
が、製造業者が使用者（ユーザー）のために作成した色
票（カラー・チャート）に対して１反応した試験片の色
を比較することによって用いられているので、安定性の
データは、このカラー・チャートを参照することによっ
て報告されている８例えば、ある特定の試験片を室温で
１０週間保存したのち、反応性が半カラー・ブロック分
失われた、と報告することができる。ここで用いられ、
以下において用いるように、カラー・ブロックは、連続
するグルコース・レベル間の色差として定義されている
。安定性のデータは、しばしば、温度を上げて試験片に
かかる負荷を増大せしめることによって得られるが、こ
の場合、試験片を短時間（期間）高温で保存したのち、
この上昇せしめた温度条件下の結果を室温における予測
保存寿命に実験的に関係づける。前記したように、熱的
に不安定であることは、グルコース・オキシダーゼの反
応及びペルオキシダーゼの反応に基づくグルコースの測
定に用いられる試験片のような酵素試薬試験片が直面す
る主たる問題である。しかしながら１発明の詳細な説明
において以下に示されるように、熱的に不安定であると
いう問題は、オキシダーゼ酵素をベースとする試薬組成
物にあるヒドラジド類又はあるアミノ酸類又はあるアミ
ノ酸誘導体を加えることによって軽減ないしは除去され
た。

通常の乾式相試験片の製造においては、酵素試薬組成物
を含む成分を溶解せしめ、次に濾紙のような担体マトリ
ックスに含浸せしめ、この含浸担体マトリックスを次に
高温で乾燥する。酵素試薬組成物の成分のうちのいくつ
か１例えば、酵素類は、試験片の製造中に加えられる熱
によって部分的に失活するか、全く失活してしまうが、
あるいは、この乾式相試験片を高温で保存すると１部分
的に失活するか、全く失活してしまう。本発明の方法及
び組成物によれば、熱による失活の問題及び長期保存に
よる試験片失活の問題は、ヒドラジド又はアミノ酸又は
アミノ酸誘導体を酵素試薬組成物中に包含せしめ、それ
により、６０℃における熱の負荷下高い安定性を持った
試験片を与えることによって、除かれた６ 先にも述べたとおり、酵素試薬組成物中に用いられる被
酸化性指示薬は、その固有の性質のために、容易に酸化
されつる物質である。したがって、それらは、空気によ
って、特に、光に晒された場合に１種々の程度で酸化さ
れる。その結果、いくつかの潜在的には有用な被酸化性
指示薬が、その被酸化性指示薬の保存安定性が非常に制
限されているとの理由で使用されていない、したがって
、幾人かの研究書違は、これらの被酸化性指示薬か酵素
をベースとする試験片に用いられるように、これらの適
当な安定剤を探し求めた。更に、安定剤は、一方で、そ
れ自身充分に安定でなければならず、例えば、酵素を不
活性化することによって試験片の感度もしくは正確さを
目に見えて変化せしめてはならない、これとは対象的に
、本発明の方法及び組成物は、酵素試薬組成物の酵素成
分の安定化と、乾式相試験片の安定化に向けられるので
あって、被酸化性色素の安定化もしくは酵素−分析対象
物量反応の結果として生じた色の安定化に関するもので
はない。

一般的に、酵素らしくは酵素溶液は、液状媒体の溶媒の
性質を変えるか、該酵素の構造的な安定性を高めるため
に高分子物質もしくは低分子物質に結合せしめるか、あ
るいはまた、殺菌剤を加えて液状媒体中の微生物の生長
を抑え、その結果、酵素分子の分解を防止することによ
って安定化することができる。

先行技術によれば、ある種のアミノ化合物がグルコース
・オキシダーゼの分解を抑えるために用いられているこ
とが示されている。酵素の分解の抑制は、アミノ抑制剤
が酵素に結合して酵素が安定化されるために起きると理
論つけられてきた。また、先行技術に開示されているよ
うに、他の群の化学物質（化合物）も酵素らしくは酵素
溶液の安定化のために用いられているが、これらの化合
物は、単に増量剤、指示薬安定剤又は殺菌剤のいずれか
として役立っているにすぎない。以下において詳しく論
じるように、本発明の方法及び組成物によれば、酵素試
薬組成物中に含まれるヒドラジド又はアミノ酸又はアミ
ノＭ誘導体は、指示薬色素を安定化させるのではなくて
酵素を安定化させるのに没立っている。

グルコース用の乾式相試験片の通常の製造においては、
試験片は二つの溶液によって次々に含浸せしめられる。

第１の含浸溶液は試料中グルコースの試験に必要な試験
試薬を含んでいる。第２の含浸溶液はグルコース試験に
おけるアスコルビン酸による隋書を最少にするが取り除
くために必要な試薬を含んでいる。ヒドラジド、アミノ
酸又はアミノ酸誘導体、例えば、グルタミン酸のトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩すなわちＴＲｌ５
グルタメート（これらは、酵素試薬組成物、引いては、
試験片の安定性を高める）は、通常、実施例１に示すよ
うに第１の含浸溶液中に存在する。

ＴＲｌ５グルタメート　　　　　　　２００ｍＭグルコ
ース・オキシダーゼ　　　　＋１２１／ｍＬペルオキシ
ダーゼ　　　　　　　　２４５１／＋ｕｌ、アセトン　
　　　　　　　　　　　　３０％最終水　　　　　　　
　　　　　　　全体で１００％になるように 上記に用いたように、及び、この明細書全体に用いるよ
うに、明細書中で使用される略語、略号は次のとおりで
ある。

ｍｇ　　ミリグラム ｍＬ　　ミリリットル Ｍ　モル濃度（モル／リットル〉 ｍＭ　　ミリモル濃度（ミリモル／リットル）Ｕ　単位
（特定の反応条件下、１分間に、塙質ｌマイクロモルの
反応を触媒する酵素活性として定義される国際単位） 実施例１の安定化酵素試薬組成物の成分は、界面活性剤
であるナトリウム・ラウリル・ザルコシネートの３０％
（重量で）水（′ｇ液を含んでいるが、このザルコシネ
ートは、５ＡＲＫＯ３ＹＬ　ＮＬ−３００（ＣＩＢＡ−
Ｇｅｉｇｙ　Ｃｏｒｐ、、　Ｇｒｅｅｎｓｂｏｒｏ、　
ＮＣ）：ＨＡＭＰＯ３ＹＬ　Ｌ−３０（Ｗ、Ｒ，Ｇｒａ
ｃｅ　Ｃｏ、、　ＬｅｘｉｎｇｔｏｎＭＡＩ；　ＭＡＰ
ＲＯ３ＹＬ　３０　（Ｓｔｅｐａｎ　Ｃｏ、、　Ｎｏｒ
ｔ、ｈｆｉｅｌｄ。

１１、、ｌ：及び５ＡＲＫＯ３ＩＮＥ　Ｉ−Ｄ　（Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ　Ｈｏｅｃｈｓｔ。

Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、　ＮＪ）の商品名で市販されて
いる。実施例１に含まれている他の成分は、ＰＶＰ　Ｋ
２Ｏ（ＧＡＦＣｏｒｐ、、　Ｎ、Ｙ、、　ＮＹ）の商品
名で市販されているポリビニルピロリドン（分子ｆｉ：
２２０．０００１の４５％（重量で）水溶戚、及び、Ｇ
ＡＮＴＲＥＺＥＳ−２２５（ＧＡＦ　Ｃａｒｐ、、　Ｎ
、Ｙ、、　ＮＹ）の商品名で市販されているポリ（メチ
ルビニルエーテル／マレイン６目のモノエチルエステル 液である。ＴＲＩＳグルタメートはグルタミン酸のトリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩である。この第
１の含’ｒＪＵ／Ｈ液のｐＨは、約４．５〜約６　０の
ｐ＋＋に調整され、緩衝化されるが、好ましいｐ＋＋範
囲は約５．４〜約５．７である。アセトンは実施例１の
安定化酵素試薬組成物に用いられる溶媒であるが、メト
キシプロパツールやエタノールのごとき低級アルコール
類のような他の有機溶媒も用いることができる。ＴＭＢ
指示薬、グルコース・オキシダーゼ及びペルオキシダー
ゼは、試料中のグルコースと反応し、グルコースの反応
に応答して、色の変化を生じるか，組成物中の他の成分
に色の変化を生ゼしめる酵素及び指示薬成分である。

アスコルビン酸による隋書を最少限にするが。

取り除くために必要な第２の含浸溶液は実施例２の組成
物によって例示される。

酸化第二水銀 ００ｍＭ ザルコシン ００ｍＭ オレイルアルコール イソプロピルアルコール　　　　　　　１５％ザルコシ
ンはＮ−メチルグリシンであって、Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、　Ｗ
ｉｓ、ｌから人手できる。ポリビニルピロリドンは実施
例１で用いたポリマーと同一である。乳化剤であるポリ
エトキシル化（２０）オレイルアルコールはＧＡＦＣＯ
，、（Ｎ、Ｙ、、　ＮＹ）からＥＭＵＬＰＨＯＲ０Ｎ−
８７０の商品名で市販されている。しかしながら、ポリ
エトキシル化（２０）オレイルアルコールの＋−＋ＬＢ
（１ｊＪ水性−疎水性バランス）値に近似したＩ−Ｉ　
Ｌ　Ｂ値をイイする他の非イオン性で不活性の乳化剤、
例えば、約１４〜約１７のＨＬＢを有する非イオン性孔
化剤もまた、実施例２の第２の含浸（Ｆｊ　！（々にお
いて用いることができる。イソプロピルアルコールは（
ｉ；媒として用いられるが、さらに、他の有機溶媒、例
えば、メトキシプロパツール、アセトンもしくはエタノ
ール又はこれらのｌ昆合物も用いることができる。

乾式相試験片は、先ず、担体マトリックス（例えば、濾
紙や透過性のポリマーフィルム）に実施例１の第１の含
浸溶液を含浸させることによって製造される。この含浸
担体マトリックスを６０℃で２０分乾燥させたのち、こ
の含浸担体マトリックスに実施例２の第２の含浸溶液を
含浸せしめ、次に、再び６０℃で２０分間乾燥した。こ
の乾燥され、２回含浸された担体マトリックスを１１５
”　ｘ　１１５″のパッドに裁断した。実施例１及び実
施例２の各溶液を含浸せしめた担体マトリックスのパッ
ドを両面接着剤を用いてプラスチック性把持具の頂部に
取り付けた。

アミノ酸又はアミノ酸誘導体を含む酵素試薬組成物を含
有した試験片の増大した熱安定性を示すために、実施例
１及び実施例２の各含浸溶液を含んだ試験片を上述の方
法によって製造し、これを、対照試験片に包含せしめた
第１の含浸溶液にはＴＲｌ５グルタメート安定剤が含ま
れていないことを除き、同様に製造した対照試験片と比
較した。この２組の試験片を、グルコース濃度が無し、
３０．１００，２５０．５００．１．０００及び３．０
００ｍｇ１ｄｌである標準尿溶液中に試験片を浸漬した
のち、色の変化の度合及び／又は強度について、これら
の試験片を調べた。ＴＲｌ５グルタメートを省いた対照
試験片は、熱をかけると非常に不安定であった０例えば
、６０℃で３日間保存したのちには、３０ｍｇ／ｄＩの
グルコースを含む標準尿溶液は、グルコース無しの読み
を与え、１００　ｍｇ／　ｄｉのグルコースを含む標準
尿溶液でも微量のグルコースの読みしか与えなかった。

しかしながら、実施例１のように、２００ｍＭのＴＲｌ
５グルタメートを酵素試薬組成物中に包含せしめると、
６０℃で３日間後でも、試験片は、　　３０ｍｇ／Ｖｔ
’〜３．０００Ｈ／ｄｌのグルコースを含むすべての標
準尿溶液の試験において、初期活性の９０％以上を保持
した。

アミノ酸誘導体であるＴＲｌ５グルタメートが酵素試験
片の安定性を増大せしめる成分であることを実証するた
めに、実施例１の安定化酵素試薬組成物から種々の他の
成分を取り除いた場合の試験片の安定性に対する効果を
実証するために実験を行った。いうまでちなく、溶媒は
、酵素試薬組成物の成分を溶解する必要があるため取り
除いたり、置き換えたりすることはできない。同様にＴ
ＭＢ被酸化性指示薬、グルコース・オキシダーゼ及びペ
ルオキシダーゼは、これらの成分がグルコース試験用の
必須成分であるため、除くことはできない。同様に、緩
衝剤は、それが信頼できるグルコース試験を行うために
必要であるため、除くことはできない。しかしながら、
実施例１の酵素試薬組成物からナトリウム・ラウリル・
ザルコシネート、ポリビニルピロリドン又はポリ（メチ
ルビニルエーテル／マレイン酸）のモノエチルエステル
を除去してｔＴＲＩｓＴＲｌ５グルタメートる酵素試薬
組成物の安定性に悪影響を与えないことから、ＴＲｌ５
グルタメートが、この試験片の増大した安定性に寄与す
る組成物成分であることが実証される。−数的に、ザル
コシネート及びつのポリマーは、試験片を製造したり、
試験を行うために試験片を使用する場合に、それらの表
部活性化性、レベリング性、膜形成性、分散性及び色素
安定化性並びに色素溶解性を利用するために、実施例１
の酵素試薬組成物に包含せしめる。

以下により詳しく述べるように、他のアミノ酸類及びア
ミノ酸誘導体類も、特にヒドラジドと組合わせて用いる
と、乾式用試験片の安定性の増大に役立つ。さらに、本
発明のもう一つの重要な特徴によれば、塩化（カルボキ
シメチル）トリメチルアンモニウムヒドラジド、塩化１
−（カルボキシメチル〉ピリジニウムヒドラジド、ヒド
ラジン−水和物、２−ヒドラジン−２−イミダゾリン・
臭化水素酸塩もしくは２−フロイック酸ヒドラジド、又
はそれらの組合せが、熱負萌及び／又は長期保存による
酵素活す１及び化学的活性の重大な損失に対して酵素試
薬組成物を保護し、安定化することが刊った。奸ましい
ヒドラジドとしては、塩化（カルボキシメチル）トノメ
チルアンモニウムヒドラジド、塩化ｌ−（カルボキシメ
チル）ピリジニウムヒドラジド及びヒドラジン−水和物
が挙げられる。ジラード試薬Ｔ　（ＧＩＲＡＲＤ’Ｓ　
ＲＥＡＧＥＮＴ　Ｔ）として、ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍ
ｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ　Ｉｎｃ、　（Ｍｉｌｗａｕ
ｋｅｅ、　ＷＩ、米国）から市販されているヒドラジド
、塩化（カルボキシメチル）トリメチルアンモニウムヒ
ドラジドが特に好ましい。

酵素試薬組成物を含む乾式用試験片の不安定性は、酵素
の有効性を減じるところの、試験片内で起きる、酵素も
しくは酵素類の熱的もしくは化学的不活性化、あるいは
物理的変化のどちらかに起因する。

上述したような、ＴＲｌ５グルタメートを含む酵素試薬
組成物を包含した試験片は、試験片中で起きる物理的変
化を防止することによって酵素含有試験片を安定化して
いると、理論付けられている。酵素試薬組成物中に存在
するヒドラジドは、酵素と結合して安定なヒドラジド複
合体を形成することにより、酵素含有試験片を安定化す
るものと、理論付けられている。リッタースドルフらの
米国特許第４．２２０．７１３号に記載されているセミ
カルバジドは、本発明において開示されるヒドラジドと
構造は似ているが、ここで開示されたヒドラジドとは、
酵素含有試験片の安定化に関して全く異なった機能を有
する。米国特許第４、２２０．１７３号に開示されたセ
ミカルバジド類を酵素試薬組成物に添加、する唯一の目
的は、試験片中に存在する被酸化性の指示薬が空気中の
酸素によって不完全に酸化されるのを防止することであ
る。米国特許第４．２２０．１７３号に開示された特定
の安定剤は、抗酸化剤であり、親代合物のセミカルバジ
ドは安定剤としては不適当なものであることが具体的に
開示されている。リッタースドルフらの特許によれば、
Ａ　ｒ　　Ｎ　ＨＣＯＮ　Ｌｌ　２の構造を有する特別
のセミカルバジド類だけが試験片に充分な安定化をもた
らすことか教示されている。本発明のこの先行技術の特
許においては、ヒドラジド化合物は、乾式用試験片に怨
念される酵素試薬組成物用の酵素安定化剤としては開示
も示唆もなされていない。

本発明の方性によれば、Ｒ−Ｎ　Ｈ−Ｎ　Ｈ□の構造を
有するある種のヒドラジド化合物は、酵素含有試験片の
安定性を大きく改善する。試験片の安定性を改善するに
は、ヒドラジド部分（−ＮＨＮＨ，）が必須で、増大し
た安定性の程度は、Ｒ基の性質に依存する。Ｒ基として
水素を有するか、あるいは、Ｒ基中に存在する正の電荷
を有する第４級アンモニウム部分を有するヒドラジドが
最も有効な安定剤であり；Ｒ基中に存在する複素環部分
を有するヒドラジドは、様々な程度の効果を示す。更に
、Ｒ基中に存在する負の電荷を有する部分を有するか、
フェニル部分を有するヒドラジドは、強い不安定化効果
を示す。

上述したように、グルコース試験に用いられる酵素試薬
組成物は、グルコース・オキシダーゼ、ペルオキシダー
ゼ及び被酸化性の色原体（発色性）指示薬を、担体マト
リックス、例えば、を片組中に含有する。ｐ）Ｉ約４〜
約７を与えることができる種々の緩衝剤又はこれらの組
合せを酵素試薬組成物中に包含せしめて体液の試験を行
う。例えば、ｐＨを約４．７〜約５．７に維持すること
ができる、コハク酸緩衝ｌ夜は、視覚による試験用の尿
中グルコース試験に好ましいが、他の適切な緩衝剤もま
た試験用キットの分野において人手可能で、当業者によ
く知られている。

さらに、他の成分も、乾式相試験片用の、より安定な市
販組成物を得るために、酵素試薬組成物中に包含せしめ
ることができる。例えば、ポリビニルピロリドンやポリ
（メチルビニルエーテル／マレイン酸）のようなポリマ
ーを発色の均一性を改善し、色の安定性を高めるために
、又は、グルタミン酸塩、最も好ましくは、グルタミン
酸トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを試験片の
安定性を高めるために包含せしめる。他の成分、例えば
、界面活性剤もしくは背景色素を酵素試薬組成物に加え
て、発色の均一性を高め、かつ、試料との接触前後の試
験片の色差を改善することができる。例えば、尿試料に
よる試薬試験パッドの変色（それは、色変化の視覚測定
を所書する）の問題を減するために酵素試薬組成物に付
加的な不活性色素を添加する。

上述したように、酵素試薬組成物を担体マトリックス中
に包含せしめ、次に、試薬含有７トリツクスを乾燥して
乾式相試験片を得る。担体マトリックスは酵素試薬組成
物の諸成分を含みつるものであればいかなる物質であっ
てもよい。しかしながら、担体マトリックスは、酵素試
薬組成物に対して、実質的に不活性でなければならず、
かつ、試験すべきン夜体試料に対して多孔質及び／又は
吸収性でなければならない。「担体マトリックス」とは
、吸水性（ｂｉｂｕｌｏｕｓ）マトリックスが非吸水性
マトリックスであって、水又は生理学的７夜体に不溶で
、それらに晒された場合にその構造りの一体性を維持す
るものを言う。本発明の方法に有用な適切な吸水性マト
リックスとしては、紙、スポンジ材料、セルロース、疎
水性無機質粉末、木材、合成樹脂フリース、織布及び不
織布、並びに、これらに類する材料が挙げられるが、こ
れらのものに限定されるわけではない。

通常、乾式相試験片は、単一パッド試験片（単一の分析
対象物についての試験用）であれ、多重パッド試験片（
数種の、尿中もしくは血清中分析対象物についての同時
試験用）であれ、通常疎水性プラスチック製の支持体細
片（ストリップ）又は把持体；及び問題の試験を行うの
に必要な化学試薬類を含浸した担体マトリックスを含む
試薬試験パッドを含んでいる。この把持体は、通常、酢
酸セルロース、ポリエチレン、テレフタレート、ポリカ
ーボネート又はポリスチレンのような材料から形成され
る。担体マトリックスは、７戸紙又は透過性のポリマー
フィルムから形成するのが最も有利である。

試薬類の担体マトリックスへの包含は、浸漬、展延（塗
布）又は噴霧のようないかなる方法によって６行うこと
ができる。好ましい方法は、ン片組のような担体マトリ
ックスに、試薬溶液に担体マトリックスを浸漬し１次い
で含浸担体マトリックスを乾燥させて溶媒を除去するこ
とによって含浸させる方法である。乾燥は、担体マトリ
ックスに包含した試薬類に悪い影響を与えないかぎり、
いかなる方法によって６行うことができる。通常の乾燥
法は、空気オープン乾燥器による。

本発明のもう一つの重要な特徴によれば、種々のヒドラ
ジド化合物を、単独で、又は、アミノ酸もしくはアミノ
酸誘導体と一緒に、酵素試薬組成物中に含ませることが
できる。続いて、担体マトリックスに、ヒドラジド、ア
ミノ酸又はアミノ酸誘導体を含む酵素試薬組成物を包含
せしめると、得られた酵素含有試験片の熱安定性が高ま
り保存寿命が伸びる。例えば、実施例３の酵素試薬組成
物を用いて種々のヒドラジドを試験し、その乾式相試験
片を安定化させる能力を評価した。実施例２の組成物ら
、尿試験のアスコルビン酸塩にょる訪客を除くために担
体マトリックスに含浸せしめた。実施例３の組成物及び
実施例２の組成物を、次の操作法に従って担体マトリッ
クスに含浸せしめてグルコースの試験に有用な安定化酵
素含有試験片を得た。

丈凰旦旦 ヒドラジド　を　　する アセトン １．１２…Ｌ ガントレツ（ＧＡＮＴＲＥＺＩ　ＥＳ−２２５〈アセト
ン中２０％） １．５０…Ｌ コハク酸（ＩＭ、　ｐＨ５，３１ １，５ｍＬ ポリビニルピロリドン （ＰＶＰ　Ｋ２Ｏ）　（水中２０％） １．５０ｍ１− アスコルビン酸（１０％） ０、［１３ｍ１ ＴＲＩＳグルタメート（２Ｍｌ　　　　　　　１　、０
０ｍＬヒドラジド（２５０ｍＭＩ　　　　　　　　　　
０．１５ｍ１、グルコース・オキシダーゼ　　　　　　
０．１５…Ｌ（５００００／ｍＬ） ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　０．５０ｍ１、
（５，０００１／ｍＬｌ 含浸担体マトリックスを６０℃で１５分間乾燥したのち
、この含浸担体マトリックスを、次に、実施例２の組成
物中に浸漬して、試験片に、アスコルビン酸による所書
に対する耐性を付与した。実施例２のアスコルビン酸隋
書組成物によって例示されるように、酸化水銀−ザルコ
シン複合体を用いて、アスコルビン酸耐性を付与するこ
とは、米国特許第４．２８８．５４１号に詳しく開示さ
れている。この２回含浸担体マトリックスを、６０℃で
１５分間、再び乾燥した。

酵素含有組成物及びアスコルビン酸隋書組成物を含む担
体マトリックスを、次に、　１７５″の四角形に裁断し
、両面接着テープを用いてプラスチックスの把持体の頂
部に固定した。この酵素含有試験片に、６０℃の熱を３
日間かけた。この熱をかけた試験片の活性を、ヒドラジ
ド安定剤を含まない実施例３の酵素試薬組成物を含浸し
た、熱をかけた対照試験片の反応性と比較した。

下記表Ｉには、実施例３の酵素試薬組成物に含有され、
酵素含有試験片の化学的活性及び酵素活性の安定化のた
めの相対的効果について試験した、種々のヒドラジド類
が掲げられている。表■において、「非常に有効」とは
、ヒドラジドを含まない対照試験片に比べて、強い安定
化効果を示すことを意味し：　「有効」とは、わずかに
安定化効果があることを示し：　「効果なし」とは活性
化ら不活性化も観察されなかったことを示し：そして、
「強い不活性化作用」とは、不活性化作用があることを
意味する。

以下により詳細に述べるように、酵素試薬組成物中にア
ミノ酸又はアミノ酸誘導体を含有せしめることによって
もたらされる安定化効果を証明するのと同様にして、実
施例３の酵素試薬組成物のヒドラジド成分を、たとえ他
の酵素試薬組成物の成分、例えば、ポリ（メチルビニル
／マレイン酸）エステル、ポリビニルピロリドンもしく
はＴＲｌ５グルクメートが存在しなくても、該酵素試薬
組成物の安定剤成分であることを実証するための試験を
行った。

ある種のヒドラジド類が乾式酵素含有試験片内熱安定性
を高め、その保存寿命を伸ばすことを示すために、二組
の乾式相試験片を上記のようにして、実施例２及び実施
例３の組成物を用いて調製した。−組の試験片には、Ｔ
Ｒｌ５グルタメートを含む実施例３の酵素試薬組成物を
含浸せしめ、他の組の試験片にはＴＲｌ５グルタメート
をｔＪＦ除した実施例３の酵素試薬組成物を含浸せしめ
た。各組の乾式酵素含有試験片内に、酵素試薬組成物中
にヒドラジドＧＩＲＡＲＤ試薬Ｔ　ｏ−及び２５−を含
有せしめてサブの組の試験片を調製した。−数的に、こ
れらの試験片を加熱試験に付したのち、ＧＩＲＡＲＤ試
薬Ｔが、試薬片中にＴＲｌ５グルタメートが存在しない
場合に６゜酵素含有試験片の熱安定性を増大せしめるこ
とが判った。さらに、このヒドラジド及びＴＲｌ５グル
タメートの両者を酵素試薬組成物から省いた場合には、
酵素含有試験片は、６０℃で３日間加熱したのち、実質
的に酵素活性もしくは化学的活性を示さなかった。さら
にまた、このヒドラジド及びＴＲｌ５グルタメートの両
者を含む酵素含有試験片は、このヒドラジドおよびＴＲ
ｌ５グルタメートの片方のみを含む試験片よりもはるか
に高い試験片の熱安定性を示した。したがって、このヒ
ドラジド及びアミノ酸誘導体が、クルコースについて液
体試料を試験するために用いられる酵素含有試験片の熱
安定性を高める酵素試薬組成物の成分であることが認め
られた６表ＩＩは、ＴＲｌ５グルタメートを含む酵素試
薬組成物にヒドラジドを加えることにより、特に高グル
コース濃度についての試験において、乾式相試験片の安
定性がはるかに改善されることを示している０表ＩＩは
、それぞれ２５ｍＭ又はＯＩＩＩＭのヒドラジンＧＩＲ
ＡＲＤ試薬Ｔを含む実施例３の酵素試薬組成物から製造
される一連の酵素含有試験片を用いる尿中グルコース試
験の結果を実証している。これらの安定化された試験片
を用いて、３０ｍｇ／ｄＬ〜２０００ｍｇ／ｄＬの範囲
の標準グルコース濃度を有する尿試料を試験した０表Ｉ
Ｉから、ヒドラジドであるＧ　Ｉ　ＲＡＲＤ試薬Ｔを含
む酵素含有試験片について、カラーブロック損失が少な
く、したがって、酵素試薬組成物のより大きな安定性を
示した。さらに、実施例３の酵素試薬組成物は安定剤で
あるＴＲｌ５グルタメートを含んでいるため、表１１の
結果は、このヒドラジドとアミノ酸誘導体であるＴＲｌ
５グルタメートの両者を含む酵素含有試験片が、アミノ
酸誘導体であるＴＲｌ５グルタメートのみによって酵素
含有試験片を安定化させるのに比べて、酵素含有組成物
をはるかに安定化させていることを示している。

老−一匹 ５− ０．２ ０．１ ０．５ ０．２ ０．３ ０．４ ｍＶ １．０ ０．８ ０．７ ０．３ ０．５ ０．６ 注意すべき点は、表ＩＩに示された値は、尿中グルコー
スについての試験において、室温に保存した対照試験片
に比べて、６０℃、３日の加熱の後の酵素含有試験片に
よるカラーブロック損失の数のことを言う、カラーブロ
ック損失の値が小さいほど、試験片のより高い安定性に
関係する。例えば、２０００＋ａｇ／ｄＬのグルコース
を含む尿試料の試験は、加熱しない試験片に比べて、Ｔ
Ｒｌ５グルタメートを含みＧＩＲＡＲＤ試薬Ｔを含試薬
中、加熱された試験片について１．０ブロツクの色損失
を与えたが、一方、ＧＩ　ＲＡＲＤ試薬Ｔ及びＴＲｌ５
グルタメートの両者を含む試験片は、わずかに０．２の
カラーブロック損失を示したにすぎない、ヒドラジン及
びアミノ酸誘導体を両者共に含まない試験片は、尿中グ
ルコース濃度に対して実質的に反応性を有しない。同様
に、３０ｍｇ／　ｄＬ　〜２０００　ｍｇ／　ｄＬのグ
ルコース濃度範囲に亘って改良された結果が得られた。

担体マトリックスに約２５１１ＩＭ〜約２００＋ａＭの
濃度のアミノ酸又はアミノ酸誘導体を含む酵素試薬組成
物を含浸せしめるか、あるいは、約１０−〜約５０ｍＭ
の濃度のヒドラジドを含む酵素試薬組成物を含浸せしめ
ることによって、得られた酵素含有試験片は熱に対して
充分に安定化され保護されるばかりでなく液体試料と接
触した場合に乾式相試験片が迅速に再水和され、それに
より、比較的迅速な分析対象物の試験が可能となること
が判った。試料による。試験片の迅速な浸透及び試験片
の迅速な再水和は、比較的迅速な発色と、はんの比較的
短い時間後の溶解を可能とする。したがって試験者は、
分析対象物の濃度を測定するために試験片と試料とを接
触させたのち比較的短い時間内に試験片を調べることが
できる。酵素試薬組成物巾約５０ｍＭ〜約１００ｍＭの
ごとき高いＴＭＢもしくは他の被酸化性指示薬濃度並び
に、酵素試薬組成物巾約１０００１Ｍ〜約２００ｍＭの
ごとき高濃度のＴＲｌ５グルタメ一ト濃度はヒドラジド
の安定化効果を高める。

酵素試薬組成物中に存在するヒドラジド又はアミノ酸又
はアミノ酸誘導体が酵素含有試験片を安定住させること
を更に示すために、実施例３の酵素試薬組成物を、ＧＡ
ＮＴＲＥＺ　　ＥＳ−２２５を含ませないで、担体に含
浸せしめ、裁断して試験片とした。酵素を用いるグルコ
ース試験において、これらの試験片をＧＡＮＴＲＥＺ　
　ＥＳ−２２５及びヒドラジンの両方を含まない実施例
３の酵素試薬組成物を含浸した担体マトリックスを有す
る試験片と比較した。６０℃に加熱して３日後、ヒドラ
ジンを含む試験片は、３０　ｍｇ／　ｄＬ〜２０００ｍ
ｇ／ｄＬの尿中グルコースの全範囲にわたって、グルコ
ースの濃度に対して実質的により大きな活性を示し、し
たがって、より熱に安定である６例えば、尿が１０００
ｍｇ／ｄＬ又は２０００ｍｇ／ｄＬのグルコースを含む
尿試験において、ＧＡＮＴＲＥＺ　　ＥＳ−２２５及び
ヒドラジドを含ｌない酵素試薬組成物を入れた試験片は
２カラーブロツク損失するが、ＧＡＮＴＲＥＺＥＳ−２
２５のみを省いた酵素試薬組成物を入れた試験片はｌカ
ラーブロック損失しただけであった。同様に、１００　
ｍｇ／　ｄＬのグルコースを含む尿試験については、そ
れぞれのカラーブロック損失は０．８及び０．５カラー
ブロツクであった。

ＧＡＮＴＲＥＺ　　ＥＳ−２２５ではなくてポリビニル
ピロリドンを酵素試薬組成物から省いた同様の試験結果
も、３０　ｍｇ／　ｄＬ　〜２００　ｍｇ／　ｄＬノグ
ルコース濃度の全範囲に亘って同様の結果であった。例
えば、ポリビニルピロリドン及びヒドラジンを含まない
酵素試薬組成物を入れた試験片は、２０００ｍｇ／ｄＬ
、　　１０００ｍｇ／ｄＬ又は２５０ｍｇ／ｄＬのグル
コースを含む尿試料の試験において３カラーブロツクの
損失を示したが、これに対し、ポリビニルピロリドンの
みを省いた酵素試薬組成物を含む試験片については、そ
れぞれ１．２．２．２及び２カラーブロツクの損失であ
った。

酵素試薬組成物中にポリビニルピロリドンを含有せしめ
ると試験片の全体的な反応性が低下することは良く知ら
れている。そのため、試験片中にポリビニルピロリドン
が存在しないと、ＧＡＮＴＲＥＺ　　ＥＳ−２２５が存
在しない試験片に比べて試験片の反応性は対応して増大
（より大きなカラーブロック損失）する。これらの結果
は表１１１に要約されている０表ＩＩ＋に示された試験
に用いた各試験片は、また、安定剤ＴＲｌ５グルタメー
トを含んでいる。

辺和卸当薦立 表　　ｒｌｌ １、ＧａＥＺ　Ｅ−２５５ なし ０．５ ３、ポリビニル− ピロリドン なし １．２ ２．２ １．０ １．５ ４、ポリビニル− ピロリドン 及びヒドラジド 共になし １．５ １．５ 表Ｉ１１を解釈するに当って、数が大なる程、カラーブ
ロックの損失は大であることを理解すべきである。さら
に、カラーブロックの損失が大なる程、試験片はグルコ
ースと接触した場合の色変化を受ける能力がより小さい
。言い換えれば、試験片はより反応性が小さく、したが
って安定性はより低い。したがって、酵素試薬組成物か
らＧＡＮＴＲＥＺ　　ＥＳ−２２５かポリビニルピロッ
ドンのどちらかを省き、ヒドラジドは含んだままにして
おくと、酵素含有試験片の安定性が増すことが１表１１
１から判る。

本発明の６つ一つの重要な特徴によれば、他のアミノ酸
類、アミノ酸誘導体又はヒドラジドを、単独もしくは組
合せて用いて、オキシダーゼをベースとする試験片の安
定性を高めることもできる。上述の議論では、アミノ酸
誘導体であるＴＲｌ５グルタメート及びヒドラジドであ
るＧＩＲＡＲＤ試薬Ｔを、酵素試薬組成物の安定剤とし
て、単独又は組合せて用いることを述べた。

しかしながら、いくつかの他のアミノ酸又はアミノ酸誘
導体、特にリジンやアルギニンも、酵素含有試験片の熱
安定性を改善する。

先に述べたように、ヨーロッパ特許第０８０．３０４号
は、酸性アミノ酸、すなわち、アミノ基を含む炭素数６
以下ジカルボン酸の酵素含有試薬溶液に対する安定化効
果を開示している。ヨーロッパ特許第０８０．３０４号
は、酸性アミノ酸を乾式相試験片の酵素安定剤として使
用することを教示も示唆もしていない、しかしながら、
本発明の重要な特徴によれば、種々のアミノ酸類、特に
アミン基又はヒドロキシル基を含むモノカルボン酸のよ
うな塩基性アミノ酸類（例えば、トレオニン）ち、酵素
含有試験片の熱安定性を改善することが判った。

アミノ酸、アミノ酸誘導体又はヒドラジド化合物は、二
つの別々の機構で化学的な失活及び酵素活性の失活から
試験片を保護することが理論づけられている。一つの機
構は、オキシダーゼの直接的な安定化であり、他の機構
は、アスコルビン酸による妨害を無くすために試験片に
入れられる水銀により失活からの酵素の保護である。し
かしながら、酵素安定化、したがって試験片の安定化の
正確な一般化は、主として理論的なものである。たとえ
ば、ヒドラジド誘導体の−であるＧ　Ｉ　ＲＡＲＤ試藁
Ｔは、アミノ酸又はアミノ酸誘導体とは異った化学構造
をとっている。しかしながら、アミノ酸又はアミノ酸誘
導体と同様、ヒドラジドによってもたらされる試験片安
定化の機構は、該安定剤中に存在する正電荷を有する基
の酵素に対する結合又は該安定剤の酸化水銀との複合体
形成能、あるいはこれら両者の理論によって合理的に説
明することができる。

酵素をベースとするグルコース用試験片の製造は、通常
、二つの含浸工程を含む、第１の含浸溶液は、被酸化性
ＴＭＢ色素及び酵素類を含有する酵素試薬組成物である
。第２の含浸溶液は、酸化水銀−ザルコシン複合体を含
む、第２の含浸溶液は、アスコルビン酸による妨害を取
り除くためにのみ試験片中に用いられる。試験片にこの
水銀含有複合体を加えると、通常、試験片の反応性が急
激に低下することは良く知られている。しかしながら、
ヒドラジド、アミノ酸又はアミノ酸誘導体の主たる機能
や利点は、試験片に水銀含有複合体を加えようと加えま
いと、認められる。

特定の安定剤の効果を、該安定剤を含む試験片の安定性
を対照の試験片と比べることによって評価した。対照試
験片には安定剤を加えなかったが、一方、他の試験片に
おいては、安定剤を２５ｍＭ〜２００ｍｋｌの濃度で酵
素試薬組成物に添加した。試験片の反応性はラビッド・
スキャナー（Ｒａｐｉｄ　５ｃａｎｎｅｒ１反射型分光
光度計を用いて測定した。反射率Ｒ（０〜ｌの反射率の
尺度でとった）をクベルカームンクの式： ％式％） （式中、には吸光係数、Ｓは分散係数、Ｒは反射率であ
る） に入れた０反射率は５４０ｎｍ（ナノメータ）で測定し
て、Ｋ／Ｓ値の計算に用いた。に／Ｓ値は、試験片の色
に比例し、したがって、試験片の反応性に比例する。グ
ルコース濃度０１３０，２５０及び１０００ｍｇ／ｄＬ
の尿標準液をそれぞれ用いて酵素試薬組成物を含有する
試験片の安定性を評価した。しかしながら、試験片の反
応性の不活化は、　　ｌ　ＯＯＯｍｇ／ｄＬのグルコー
ス濃度の尿を試験した場合に、−数的に良く認められ、
かつ、より容易かつ正確に測定されたので、グルコース
濃度１０００ｍｇ／ｄＬの標準尿を試験することによっ
て決定されるに／Ｓ値を用いて試験片の反応性、ひいて
は、試験片の安定性を計算した。

酵素含有試験片の安定性は、二つの方法で表現される。

すなわち、＋１１室温における、対照試験片に対する安
定化酵素試薬組成物含浸試験片の反応性比として計算さ
れる相対反応性、及び、（２）室温に３日間保持した後
の同じ試験片の活性に対する、６０℃で３日間熱を加え
た後に残留する試験片の活性（％）として計算される残
留活性（％）である。

この反応性／安定性試験に用いられる酵素含有試験片は
、先に述べた方法で、先ず、実施例４の安定化酵素試薬
組成物を担体マトリックスに浸漬し、次に、これを乾燥
後、実施例５の水銀−ザルコシン複合体組成物中に浸漬
することによって調製した。

スルホスクシネート Ｆ　Ｄ　＆　ＣＹｅｌｌｏｗ　　＃　５色素０、０２％ コハク酸緩衝液　　　　　　　　　　　２５０ｍＭグル
コース・オキシダーゼ　　　　　　９　Ｑ　Ｕ／ｍＬペ
ルオキシダーゼ　　　　　　　　　２４５　Ｕ／ｍＬア
セトン（溶媒）　　　　最終４０％（容量で）！癒史互 アスコルビン酸による 酸化水銀 ００ｍｋｌ ザルコシン ００ｍＭ スルホスクシネート イソプロピルアルコール　最終１５％（溶液で）表１ｖ
は、それぞれが、１３種のアミノ化合物、ちしくはヒド
ラジドＧＩＲＡＲＤ試薬Ｔを酵素試薬組成物用安定剤と
して含む酵素試薬組成物を含浸した酵素試験片について
の安定性試験の結果を示す。安定化剤の、試験片の熱安
定性を改善する能力は、試験片が酵素試薬組成物のみを
含浸したちのであるか、酵素試薬組成物とアスコルビン
酸による隋書組成物の両者を含浸したものであるかによ
って異なる。あるいくつかの場合には、安定剤によって
与えられる改善された能力の程度は、試験片中にアスコ
ルビン酸隋書組成物を加えることによって高められる（
すなわち、ＧＩＲＡＲＤ試ｉＴの場合）が、あるいくつ
かの場合には、安定剤によって与えられる改善された能
力の程度は、試験片中にアスコルビン酸隋書組成物を加
えることによって低下する（すなわち、アルギニンの場
合）、シかしながら、試験片が、酵素試薬組成物のみを
含浸したものであるか、酵素試薬組成物とアスコルビン
酸隋書組成物を含浸したちのであるかにかかわらず、酵
素試薬組成物中に本発明の安定剤を含有せしめると、酵
素試験片の熱安定性を改善することができることが判っ
た。

友トフ；シ）テ皇テミトＬトへ工 表ＩＶにまとめた結果によれば、酵素試薬組成物のみを
含み、かつ、安定剤としてアルギニン、ヒスチジン又は
ＧＩＲＡＲＤ試薬Ｔを含浸せしめた試験片が最も安定な
試験片であるが、グリシンやトリエタノールアミンは安
定剤としては効果がない。残りの化合物は、酵素含有試
験片用安定剤として様々な程度の効果を示している。上
述したように、試験片中にアスコルビン酸隋書組成物を
加えると、安定剤によって与えられる安定化の程度は変
わりつるが、全体としては、グリシンとトリエタノール
アミンを除き、試験片の熱安定性は改善される。

表１ｖにまとめたデータは、次に示す構造上の特徴を有
する化合物が、酵素試薬組成物を含浸した乾式相試験片
に対して熱安定性と延長された保存寿命をもたらすこと
が期待できる。

（１）３個以上の炭素の鎖を有し、−数式％式％ で示されるアミノ酸又はアミノ酸誘導体：（２）上記ｆ
ｉｌの一般式（式中、Ｘは水素、ヒドロキシル、イミダ
ゾールもしくは１〜４個の炭素原子を有するアルキル基
である）で示され、かつ正の電荷を有する基１例えば、
リジンのアンモニウム基、アルギニンのグアニジン基も
しくはカルボキシル基（例えば、グルタミン酸中の）を
有するアミノ酸又はアミノ酸誘導体： （３）ａ−アミノ基の存在は必ずし６必要ではないが、
アミノ基とカルボキシル基の両者が化合物中に存在しな
ければならない； （４）基−Ｘ中の負に荷電した基の存在は、酵素含有試
験片に対して安定化効果ら不安定効果も示さない： （５）イミダゾールは、酵素含有試験片に熱安定性を与
えることが予測（期待）される化合物のモデルの化学構
造を有さないが、特に、試験片がアスコルビン酸隋書組
成物をも含浸せしめたちのである場合には、熱安定性を
付与する６ 試験片の安定性に対するアスコルビン酸隋書組成物の効
果は、表１■に示した結果からは説明は困難である。両
方の組成物を加えた試験片の相対反応性は、０％〜１４
８％に変化する。試験片の反応性の程度は、安定剤の酸
化水銀と複合体を形成する能力に関係している。しかし
ながら、試験片の安定性は、必ずしも、相対的な試験片
の反応性と平行しているものではない、このことは、安
定剤の水銀コンプレックス形成の他に機構が関与してい
ることを示唆する。本発明の安定剤は、また、水銀によ
って引き起こされる不活性化から酵素を保護する他に、
熱による失活から酵素を保護する。一般に、正の荷電を
有する基を持ったアミノ酸は乾式相酵素含有試験片の効
果的な安定剤であることが示された。

さらに、ヒドラジドの−であるＧＩＲＡＲＤ試薬Ｔが、
酵素試薬組成物のみを含浸した試験片並びに酵素試薬組
成物とアスコルビン酸隋書組成物の両者を含浸した試験
片に対して非常に効果的な安定剤であることが判った。

構造式（■）： ＣＨ，０ ｃＨ，−Ｎ”−ＣＨ２−Ｃ−ＮＨ−ＮＨｚ　　　　　　
　ＩＨｓ で示されるＧ　Ｉ　ＲＡＲＤ試薬Ｔの構造は、試験片用
安定剤として働くアミノ酸系化合物の上記に提案したモ
デルの化学構造とは異なっている。

Ｇ　Ｉ　ＲＡＲＤ試薬Ｔが試験片を安定化させる機構は
不明であるが、正の荷電を有するアンモニウム基が酵素
に直接結合し、カルバジド基が水銀による失活から酵素
を護ることが理論的に考えられる。

加えるに、その固有の還元性の故に、カルバジド基が実
際に第２水銀イオンを還元して金属水銀に変えるのから
しれない。

ここに述べた本発明の方法及び組成物は、主として、グ
ルコース・オキシダーゼ／ペルオキシダーゼ試薬組成物
によるグルコースについての尿の試験に関するが、本発
明の方法及び組成物は、また、しかるべきオキシダーゼ
酵素を用いることによって、グルコース以外の他の分析
対象物、例えば、コレステロール、尿酸又は低級アルコ
ール類について、血しょうのような他の液体試料を試験
するためにも有用である。したがって、本発明の重要な
特徴によれば、オキシダーゼ酵素試薬組成物を含有する
乾式相酵素含有試験片の熱安定性は、オキシダーゼ酵素
試薬組成物中にヒドラジド、アミノ酸又はアミノ酸誘導
体を包含せしめることによって改善される。

本明細書中で述べた本発明は１本発明の精神を逸脱する
ことなく様々に修正もしくは変形することができる。し
たがって、唯一の限定は、クレームの記載に基づいてな
されるべきであることは明らかなことである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、液体試料中の対象とする分析対象物に接触すると、
   対象とする該分析対象物の存在量ないしは濃度を示すに
   充分な色の変化を示すことができ、かつ、長期間に亘っ
   て酵素活性を維持することができる、乾式相試験片に包
   含せしめるための酵素試薬組成物であって、オキシダー
   ゼ酵素；色原体；ペルオキシダーゼ；該酵素試薬組成物
   を約４〜約７の範囲のｐＨに緩衝化することができる緩
   衝剤；並びに、ヒドラジド、アミノ酸、アミノ酸誘導体
   、イミダゾール及びこれらの組合せよりなる群から選ば
   れる安定剤を含むことを特徴とする組成物。 ２、安定剤が、ヒドラジン、塩化（カルボキシメチル）
   トリメチルアンモニウム・ヒドラジド、塩化１−（カル
   ボキシメチル）ピリジニウム・ヒドラジド、２−ヒドラ
   ジン−２−イミダゾール・臭化水素酸塩、２−フロイッ
   ク酸（ｆｕｒｏｉｃａｃｉｄ）ヒドラジド及びこれらの
   組合せよりなる群から選ばれるヒドラジドである請求項
   １記載の酵素試薬組成物。 ３、ヒドラジドが約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の量で
   存在する請求項２記載の組成物。４、安定剤が、アルギ
   ニン、リジン、ヒスチジン、トレオニン、アラニン、Ｄ
   Ｌ−β−アミノ酪酸、γ−アミノ酪酸及びこれらの組合
   せよりなる群から選ばれるアミノ酸である請求項１記載
   の組成物。 ５、長期間に亘って酵素活性を維持することができ、か
   つ、グルコース含有液体試料に接触せしめると、グルコ
   ースの存在ないしは濃度を示すに充分な色の変化を示す
   ことができる、乾式相試験片に包含せしめるための安定
   化された酵素試薬組成物であって、グルコース・オキシ
   ダーゼ；３，３′，５，５′−テトラメチル−ベンジジ
   ン指示薬色素；ペルオキシダーゼ；該組成物を約４〜約
   ７の範囲のｐＨに緩衝化することができる緩衝剤；並び
   に、塩化（カルボキシメチル）トリメチルアンモニウム
   ・ヒドラジド、ヒドラジン、塩化１−（カルボキシメチ
   ル）ピリジニウム・ヒドラジド、２−ヒドラジン−２−
   イミダゾリン・臭化水素酸塩、２−フロイン酸ヒドラジ
   ド及びこれらの組合せよりなる群から選ばれる約１０ｍ
   Ｍ〜約５０ｍＭのヒドラジドを含むことを特徴とする組
   成物。 ６、約２５ｍＭ〜約２００ｍＭのグルタミン酸のトリス
   （ヒドロキシメチル）アミノメタン塩を更に含む請求項
   ５記載の組成物。 ７、液体試料中の特定の分析対象物の存在ないしは濃度
   を酵素的に測定する方法であって、（ａ）液体試料を、
   オキシダーゼ酵素；被酸化性色原体；ペルオキシダーゼ
   ；組成物のｐＨを約４〜約７の範囲に緩衝化することが
   できる緩衝剤；並びに、ヒドラジド、アミノ酸安定剤、
   アミノ酸誘導体安定剤、イミダゾール及びそれらの組合
   せよりなる群から選ばれる安定剤を含む試薬組成物と接
   触せしめ、そして （ｂ）該試薬組成物の色の変化の強度及び／又は程度か
   ら液体試料中の特定の分析対象物の存在もしくは濃度を
   測定する、 ことを特徴とする方法。 ８、液体試料中のグルコースの存在もしくは濃度を測定
   する方法であって、 （ａ）液体試料を、グルコース・オキシダーゼ；３，３
   ′，５，５′−テトラメチル−ベンジジン指示薬色素；
   ペルオキシダーゼ；組成物のｐＨを約４〜約７の範囲に
   緩衝化することができる緩衝剤；並びに、塩化（カルボ
   キシメチル）−トリメチルアンモニウム・ヒドラジド、
   ヒドラジン、塩化１−（カルボキシメチル）ピリジニウ
   ム・ヒドラジド、２−ヒドラジン−２−イミダゾリン・
   臭化水素酸塩、フロイック酸ヒドラジド及びこれらの組
   合せよりなる群から選ばれるヒドラジド約１０ｍＭ〜約
   ５０ｍＭを含む試薬組成物と接触せしめ、そして、 （ｂ）該試薬組成物の色の変化の強さ及び／又は程度か
   ら液体試料中グルコースの存在もしくは濃度を測定する
   、 ことを特徴とする方法。 ９、液体試料中の特定の分析対象物の存在もしくは濃度
   を測定する方法であって、 （ａ）液体試料を、オキシダーゼ酵素；被酸化性色原体
   ；ペルオキシダーゼ；組成物のｐＨを約４〜約７の範囲
   に緩衝化することができる緩衝剤；並びに、ヒドラジド
   、アミノ酸、アミノ酸誘導体、イミダゾール及びこれら
   の組合せよりなる群から選ばれる安定剤を含む試薬組成
   物を含有する試薬試験パッドを含む分析対象物検出具と
   接触せしめ、そして、（ｂ）液体試料中の特定の分析対
   象物の含有量に応答する色の変化について分析対象物検
   出具を調べる、 ことを特徴とする方法。 １０、高温で長期間活性を維持することができる、液体
   試料中の特定の分析対象物の存在もしくは濃度を測定す
   るための安定な分析対象物検出具であって、 支持体ストリップ； 支持体ストリップに取り付けられた試薬試験パッド；並
   びに、該試薬試験パッドに包含された試薬組成物であっ
   て、オキシダーゼ酵素、被酸化性色原体；ペルオキシダ
   ーゼ；組成物のｐＨを約４〜約７の範囲に緩衝化する緩
   衝剤；並びに、ヒドラジン、アミノ酸、アミノ酸誘導体
   、イミダゾール及びこれらの組合せよりなる群から選ば
   れる安定剤 を含む試薬組成物を包含することを特徴とする検出具。