JPH03219887A - ストレプトバリシンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、高い生産効率を有するストレプトバリシンの
製造方法に関する。

〔従来の技術〕

ストレプトバリシンは、主にＡ、Ｂ、Ｃ，ＤおよびＥの
５種からなり、当初抗結核抗生物質としての有用性が注
目され、最近になってこれを化学変性して得られる誘導
体が抗レトロウィルス剤、抗癌剤等として有用であるこ
とが判明し注目されるに到っている（例えば、特開昭５
４−１１００００号公報参照）。このような有用誘導体
はストレプトバリシンＣから誘導されているため、スト
、レプトバリシンＣが特に注目されている。

従来、かかるストレプトバリシンの製造方法としては、
ストレプトマイセス・スペクタビリスの深部培養により
発酵生産する方法が知られているしかし、上記の従来の
製造方法は生産効率が低く、極めて少量のストレプトバ
リシンしか得られない。そのため、工業的には実用化は
困難であるという欠点を有する。上記従来の方法におい
ては、生産されたストレプトバリシンが培地中で速やか
に分解されることが判明したほか、生産されたストレプ
トバリシンが脂溶性が高いために菌糸表面に蓄積し生産
抑制を引き起こすためと考えられる。

〔課路を解決するだめの手段〕

そこで、本発明の目的は、従来の方法を改良し、ストレ
プトバリシンを高い生産効率で製造することができる製
造方法を提供することにある。

すなわち、本発明は、上記の従来の方法の問題点を解決
するものとして、 ストレプトマイセス属に属するストレプトバリシン生産
菌を、非イオン性吸着剤の存在下で培養する工程を有す
るストレプトバリシンの製造方法を提供するものである
。

微生物 本発明の方法に用いられるストレプトマイセス属に属す
るストレプトバリシン生産菌としては、例えば、ストレ
プトマイセス・スペクタビリス（ＡＴＣＣ２７４６５の
寄託Ｎｏ、でＡＴＣＣから入手できる）が挙げられる。

非イオン性吸着剤 本発明の方法によると、上記細菌の培養により生産され
たストレプトバリシンは速やかに非イオン性吸着剤に移
行し貯蔵される結果、培地中で分解され難く、また菌糸
表面に蓄積され難いので菌の活性を抑制することが少な
い。その結果、効率よくストレプトバリシンの生産が持
続される。

かかる非イオン性吸着剤としては、比表面積が大きい、
種々の合成樹脂、例えばスチレン、ジビニルベンゼン、
アクリル酸エステル等の１種または２種以上の化合物の
重合体からなる多孔質微粒子を用いることができる。具
体例としては、スチレン−ジビニルベンゼン系合成樹脂
からなる吸着剤、例えば）ＩＰ−１０，８Ｐ−２０，Ｈ
Ｐ−３０，ＨＰ、４０．　ＨＰ−５０（商品名、三菱化
成工業■製）、アンバーライトＸＡＤ−２，ＸＡＤ−４
（商品名、Ｄ−Ａ・７ン）’・ハ７ス社製）、アクリル
酸エステル系樹脂からなる吸着剤、例えばアンバーライ
トＸＡＤ−７（商品名、ローム・アンド・ハース社製）
等を挙げることができる。このような非イオン性吸着剤
のなかでも、特に好ましいものは、粒径５０〜１．００
０μｍ１比表面積５０〜１．０００　ｍ’／　ｇ　、細
孔容積０．２〜１．５ｍ／ｇのものである。前記の市販
品では、例えばＨＰ−２０゜ＸＡＤ−４等が挙げられる
が、これらに特に限定されるものではない。

本発明の方法の実施においては、非イオン性吸着剤は、
発酵の開始後でもよいが、通常、菌を発酵培地に接種す
る前に培地に添加するのが好ましい。培地への添加量は
、０．１〜２０％程度が適当であり、さらには０．５〜
１０％が好ましい。

好適な態様 本発明の方法を実施する際には、培地にさらにフマル酸
およびその水溶性塩から選ばれる少なくとも１種をも前
記の非イオン性吸着剤を含む培地に添加し共存させるこ
とが好ましい。フマル酸やその塩を培地に添加すること
によって、ストレプトバリシン、特に有用性の高いスト
レプトバリシンＣの生産が促進され、生産量がさらに高
まる。

用いることができる水溶性塩どしては、例えば、フマル
酸カリウム、フマル酸ナトリウム、フマル酸カリウムナ
トリウム、フマル酸−カリウム、フマル酸−ナトリウム
等が挙げられる。フマル酸および上に例示のフマル酸塩
は、１種単独でも２種以上を組み合わせても使用するこ
とができる。

フマル酸またはその水溶性塩の培地への添加量は、フマ
ル酸として培地に対し０．１〜１０％、さらに０．５〜
５％程度が好ましい。このフマル酸またはその塩も、培
地に発酵前に添加してもよいし、発酵開始後に添加ある
いは追加してもよいが、通常は発酵開始前に添加してお
くのがよい。

その他の培養条件 本発明の方法に用いられる培地その他の条件には特に制
限はなく、微生物の培養により抗生物質等を製造する際
に通常用いられる条件を用いることができる。すなわち
、窒素源、資化性炭素源および無機塩を含む水性培地を
用い、好気的条件下で深部培養を行うのが一般的である
。

窒素源としては無機、有機のいずれも用いることができ
、例えば牛肉エキス、ペプトン、大豆粉等の植物性タン
パク質、カゼイン、麦芽エキス、魚粉、綿粉、ケイソイ
　（脱脂大豆微粉末）、落花生粉、醸造用酵母、コーン
グルテン粉、コーンスチープリカー等の有機窒素源；硫
酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸カリウム等の
無機窒素源が挙げられる。

資化性炭素源としては、例えばグルコース、デキストリ
ン、糖蜜、スターチ、マルトース、ガラクトース、マン
ニトール、蔗糖、乳糖、大豆油等が挙げられる。

栄養無機塩類としては、例えばす）　ＩＪウム、カルシ
ウム、燐酸根、硫酸根等のイオンを生じる塩類が挙げら
れ、具体的には、炭酸カルシウム、燐酸カリウム、硫酸
マグネシウム、塩化カリウム、塩化す）　ＩＪウム、硫
酸亜鉛、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、モ
リブデン酸アンモニウム等がある。

培養における、培地のｐｔ（は５．５〜７．５程度が適
当であり、温度は２３〜３７℃、特に２５〜３０℃の範
囲が適当で、およそ４〜８日程度の培養によって最大収
量が得られる。

ストレプトバリシンの採取 本発明の方法によると、発酵により生産されたストレプ
トバリシンは非イオン性吸着剤に吸着された形で得られ
るので、非イオン性吸着剤を培地から分離したのち、ス
トレプトバリシンを非イオン性吸着剤から分離する必要
がある。

非イオン性吸着剤を培地から分離するには、例えば、網
等を用いて濾別する方法、非イオン性吸着剤と培地との
比重差を利用する方法（具体的には、例えば、一定濃度
の食塩水に発酵後の発酵培地を投入する方法、遠心分離
機を用いる方法等）などが挙げられる。

非イオン性吸着剤からストレプトバリシンを分離するに
は、適当な有機溶剤または有機溶剤と水との混合溶剤を
溶出剤として用い、培地から回収された非イオン性吸着
剤を洗浄することにより、吸着剤に吸着しているストレ
プトバリシンを溶出させればよい。用いられる有機溶剤
としては、例えばメタノール、エタノール、アセトン、
アセトニトリル、酢酸エチル、ジクロロエタン１．クロ
ロホルム等、またはこれらの２種以上の混合溶剤；これ
ら有機溶剤の１種もしくは２種以上と水との混合溶剤な
どが挙げられる。ストレプトバリシンを効果的に溶出さ
せるには、第１に、有機溶剤濃度の低い水溶液でストレ
プトバリシンが吸着された吸着剤を洗浄し、次に有機溶
剤濃度の高い水溶液で洗浄するのが好ましい。

発酵により得られるストレプトバリシンの中でもストレ
プトバリシンＣが最も有用性が高いので、吸着剤から分
離する際にはストレプトバリシンＣを選択的に分離でき
ることが望ましい。このためには、アセトニトリル−水
混合溶媒が好ましい。

得られたストレプトバリシンは、例えば再結晶の繰り返
し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等によりさら
に精製することができる。

〔実施例〕

次に本発明を実施例により具体的に説明する。

実施例Ｉ Ｎ−ＺアミンＡ　１．２５ｇ、グルコース０．６３ｇ。

大豆酵素分解エキス０．６３ｇ、燐酸−カリウム０．１
６ｇ、燐酸二カリウム０．１６ｇおよび蒸留水１００証
を混合してつくった種培地を含む５００ｍ１−振盪フラ
スコ内にストレプトマイセス・スペクタビリスＡＴＣＣ
２７４６５株の培養菌を接種した。このフラスコを回転
振盪器に装填し、２７℃、２０Ｏｒｐｍの条件で７２時
間培養し、種培養体を得た。

次に、脱脂大豆粉末１ｇ、コーンスチーブリ力−１８１
コーンスターチ２ｇ、ビール酵母０．２５ｇ。

塩化カリウム０．３ｇ、炭酸カルシウム０．４ｇおよび
蒸留水１００ｍｆを混合して調製した前培養培地を含む
５００　ｍｌ−振盪フラスコ内に前記の種培養体２−を
接種した。次に、このフラスコを回転振盪器に装着し、
２７℃、２０Ｏｒｐｍの条件で回転させながら４８時間
培養を行い、前培養体を得た。

次に、こうして得た前培養体５証を、予め５００ｍ１−
振盪フラスコ内に調製しておいた、大豆粉４８、グルコ
ース４ｇ、ビール酵母０．２５ｇ、塩化ナトリウム０．
３ｇ、炭酸カルシウム０．０５ｇ、　硫酸マグネシウム
０．２５ｇ、燐酸−水素カリウム０．２５ｇ、ポリスチ
レン系吸着剤（商品名；ダイヤイオンＨＰ２０）　３ｇ
および蒸留水１００　ｄを混合してなる発酵培地に接種
した。このフラスコを回転振盪器に装着し、２８℃で６
日間培養した。その後、培養液を網を用いて濾し、前記
の吸着剤を分離した。この吸着−剤をエチルアルコール
−酢酸エチル（１：１）混合溶剤で洗浄し、吸着されて
いる物質を溶出させた。洗浄後の溶剤を高圧液体クロマ
トグラフィーに供したところ、ストレプトバリシンＣが
０．４ｍｇ含まれていることが確ｇ忍された。

比較例１ 発酵培地としてポリスチレン系吸着剤を含まない以外は
同一組成の培地を使用した以外は、実施例１と同様にし
て培養を行い、ストレプトバリシンＣを培地および菌体
から分離した。ストレプトバリシンＣが０．０５ｍｇ得
られた。

実施例２ 発酵培地として、さらにフマル酸−ナトリウム１．２ｇ
を含む以外は実施例１で用いたものを同一組成の培地、
すなわち大豆粉４ｇ、グルコース４ｇ１ビール酵母０．
２５ｇ１塩化ナトリウム０．３ｇ、炭酸カルシウム０．
０５ｇ、硫酸マグネシウム０．２５ｇ。

燐酸−水素カリウム０．２５ｇ、フマル酸−ナトリウム
１．２ｇ、ポリスチレン系吸着剤（商品名：ダイヤイオ
ンＨＰ２０）　３ｇおよび蒸留水１００−を混合してな
る培地を使用した以外は、実施例１と同様にして培養を
行い、ストレプトバリシンＣを培地から分離した吸着剤
から実施例１の場合と同じ溶剤で分離した。洗浄後の溶
剤には、ストレプトバリシンＣが３．６ｍｇ含まれてい
ることが確認された。

比較例２ 発酵培地としてポリスチレン系吸着剤を含まない以外は
同一の組成である培地を使用した以外は、実施例２と同
様にして培養を行い、ストレプトバリシンＣを培地およ
び菌体から分離した。ストレプトバリシンＣが０．０８
ｍｇ得られた。

実施例３ 実施例２において、培養後に発酵培地から分離されたポ
リスチレン系吸着剤に吸着されている物質中のストレプ
トバリシンＣの割合は、高速液体クロマトグラフィーに
よる測定（２５４ｎｍにおいて分析）によると、１０重
量％であった。この吸着剤を１５％アセトニ）　ＩＪル
水溶液で洗浄後、５０％アセトニトリル水溶液で吸着物
質を溶出させた。溶出操作後の該アセトニトリル水溶液
を蒸発、乾固させたところ、得られた固形の粗生成物に
はストレプトバリシンＣが５０％含まれていた。

〔発明の効果〕

従来ストレプトマイセス属微生物の培養によっては極め
て少量のストレプトバリシンしか得ることができなかっ
たが、本発明の方法によれば１０倍以上、特に好適実施
態様によれば２０倍以上の効率でストレプトバリシンを
生産することができ、工業的にも実用性が極めて高い製
造方法である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ストレプトマイセス属に属するストレプトバリシ
   ン生産菌を、非イオン性吸着剤の存在下で培養する工程
   を有するストレプトバリシンの製造方法。
2. （２）請求項（１）記載の方法であって、前記の培養が
   さらにフマル酸およびその水溶性塩からなる群から選ば
   れる少なくとも１種が添加された培地で行われるストレ
   プトバリシンの製造方法。