JPH03224494A - 生理活性多糖ｒｏｎの生産法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は優れた抗腫瘍活性、免疫調節活性並びに感染防
御活性を有する生理活性多糖ＲＯＮを蔗糖から生成する
作用を有する該生理活性多糖ＲＯＮ合成酵素および該酵
素を用いて該生理活性多糖ＲＯＮを生産する方法に関す
る。

〔従来の技術〕

本発明に係る生理活性多糖ＲＯＮおよび米糠から該生理
活性多糖ＲＯＮを抽出する方法は既に特公開６２−７１
７３号公報に開示されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記従来法では米糠を原料として生理活性多糖ＲＯＮを
抽出し、精製するものであるため、原料の品質が不安定
で得られる物質の物性、生理活性等に相当なバラツキが
ある上に、収率が低く、しかも多くの工程を必要とし、
時間的、経済的な課題があった。

そこで、本発明者らは上記課題を解決すべく検討を重ね
た結果、ロイコノストック属に属する微生物が菌体外に
生理活性多糖ＲＯＮを蔗糖から合成する酵素、すなわち
生理活性多Ｉｔ！ＲＯＮ合成酵素を生産することを見出
し、本酵素を蔗糖に作用させることによって物理化学的
性質や生理活性の安定した生理活性多糖ＲＯＮを高い収
率で得られることを確認して本発明を完成した。

［課題を解決するための手段〕 すなわち、本発明は蔗糖に作用して下記の性質を有する
生理活性多糖ＲＯＮを生成せしめる生理活性多ｌｌＲＯ
Ｍ合成酵素および該酵素を蔗糖に作用させて該生理活性
多１１ＲＯＮを生成せしめで回収することを特徴とする
生理活性多１１ＲＯＮの生産法を提供するものである。

（１）性状：白色の無晶性粉末で無味無臭（２）溶解性
：水に可溶、濃度を上げると乳白色で粘稠な溶液となる
。ホルムアミド、ジメチルスルホキシドに可溶、アルコ
ール、アセトン、ヘンゼン、酢酸エチル、ヘキサン、ク
ロロホルム、四塩化炭素に不溶 （３）水溶液のｐＨ：中性ないし弱酸性（４）構成糖：
グルコースのみ （５）元素分析値：　Ｃ：　４４．０〜４５．０χ＋Ｈ
：６．１〜６．３χ（６）構造：α−１，６結合を主鎖
としたα−グルカンで少量の１．３．６位分岐構造を有
する。

（７）蛍白質：殆んど含有せず （８）分子量二透析膜を通過せず、分子量１万以上と推
定される。

（９）比旋光度＝　［α〕ｒ・＋１９０°〜＋２２０゜
（ｃ＝０．５．　ホルムアミド） ａＯ）呈色反応：アンスロン硫酸反応　フェノール硫酸
反応が陽性、ヒ゛′ウレント反応、ローリー・フォーリ
ン反応、エルソン・モルガン反応、　　ヨード反応が陰
性 ０υ　融点：明確な融点を示さない。

Ｑ２）　　紫外部吸収スペクトル：特徴的吸収を有さす
。

（１３）　　赤外部吸収スペクトル：α−グルカンに特
徴的吸収を示す。

（＋４）　　１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：主シグナルと
してα−１，６グルカンに特徴的スペクトルを示す。

（１５１　　抗腫瘍作用を有す。

本発明の生理活性多１１ＲＯＮ合成酵素は、以下の方法
によって製造することができる。

蔗糖に作用して前記の性質を有する生理活性多＄１ＲＯ
Ｎを生成せしめる生理活性多糖ＲＯＮ合成酵素を生産す
る能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に該生
理活性多糖ＲＯＮ合成酵素を蓄積せしめ、これを採取す
る。ここで、本酵素を生産する能力を有する微生物とし
てはロイコノストック属に属する微生物がある。具体的
には、生理活性多１１ＲＯＮ生産能を有する微生物とし
ては、米糠等より分離されたロイコノストック・メセン
テロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカム（Ｌ
ｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　ｍｅｓｅｈｔｅｒｏｉｄｅｓ　
５ｕｂｓｐ、　ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｓ）ＢＬ−７５株
および同４６−１株があり、その菌学的性質は以下の通
りである。

虱コＬ採 ダラム染色　　　　　　　　十 形　　　態　　　球〜卵型、０．４〜０．７μｍ３〜４
　連鎖、　クラスクー形成 カタラーゼ　反応 オキシダーゼ反応 遊離酸素要求性 フルギニン　の分解 乳酸発酵　　　　へテロ型。

炭水化物からの酸産生 アラビノース フラクトース ガラクトース グルコース ラクトース マンノース トレハロース エスクリンの加水分解性 デキストラン産生 通性嫌気性 り一乳酸 食塩存在下での生育 ３．０χＮａＣ１ ６，５χＮａＣ１ 各種初発ｐＨでの生育 ｐＨ４，８ ｐＨ６，５ グルコース培地での最終ｐＨ 土旦二土抹 ダラム染色 形　　　　態 十 球〜卵型、０．４〜０．６μｍ。

ベアおよび短い連鎖 ＋ ＋ ４．３ カタラーゼ　反応 オキシダーゼ反応 遊離酸素要求性 アルギニン　の分解 乳酸発酵　　　　へテロ型。

炭水化物からの酸産生 アラビノース フラクトース ガラクトース グルコース 通性嫌気性 り一乳酸 十 ＋ ＋ ラクトース　　　　　　　　　＋ マンノース　　　　　　　　　＋ トレハロース　　　　　　　　＋ Ｉスクリンの加水分解性　　　　十 デキストラン産生　　　　　十 食塩存在下での生育 ３．０χＮａＣ４２＋ ６．５χＮａＣ１ 各種初発ｐＨでの生育 ｐｉｆ　　４．８ ｐＨ６，５＋ グルコース培地での最終ｐｆ（４，１ 以上の性状から両菌株の菌学的性質を要約すると次の通
りになる。すなわち、１：ダラム染色陽性で通性嫌気性
である。２：形態は球〜卵型の連鎖である。３：アラビ
ノースを除き、炭水化物からの酸産生は陽性である。４
：乳酸醗酵のタイプかへテロ型であり、産生ずる乳酸が
０体のみである。５：アルギニン分解反応は陰性である
。

ＢＬ　−７５株について「　パージエイズ・マニュアル
・オブ・デターミネティブ・バクテリオロジー」第８版
（１９７４年）　（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　
ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｙａｒｎａｔ３ｖｅＢａｃｔｅｒｉｏ
ｌｏｇｙ　８ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ）によれば、上記の
諸性質より本菌株はロイコノストックμμ瓜凹因山瓜）
属に属し、しかもデキストラン産生陽性であり、かつア
ラビノースからの酸産生が陰性であることおよび６．５
χＮａＣｊ！存在下で発育しない点からロイコノストッ
ク・デキストラニカム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓ　ｔｏｃｄｅ
ｘｔｒａｎｉｃｕｍ）に属する菌株ＢＬ−７５株と同定
し、本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所にＦＥＲ
ＭＢＰ−２２４２として寄託した。

その後、ロイコノストック・デキストラニカムの種が名
称変更されたことを知り、新たに見出された４６−１株
とともに、「バージエイズ・マニュアル・オブ・システ
マティック・バクテリオロジー第２巻」第９版、　（１
９８６年）、および「メソッド・イン・マイクロバイオ
ロジー」１６巻、１４７〜１７８頁（１９８４年）に従
い、再同定し、両菌株とも、ロイコノストック・メセン
テロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカム（Ｌ
ｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏ４ｔ３ｅｓ
ｓｕｂｓｐ、　ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｍ）に属する菌株
と同定された。

従って、ＢＬ−７５株は、ロイコノストック・メセンテ
ロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカム（Ｌｅ
ｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ　
　５ｕｂｓｐ、　　ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｍ）ＢＬ−７
５株と名称変更し、４６−１株は、同４６−１株と命名
し、工業技術院微生物工業技術研究所にＦＥＲＭＢＰ−
２６７０として寄託されている。

本発明者らは、生理活性多糖ＲＯＮ生産菌の検索をさら
に続けたところ、公知菌株の中に上記ＢＬ−７５株、　
４６−１株と同様な生理活性多糖ＲＯＮ生産能を有して
いる菌株を見出した。すなわち、ロイコノストック・メ
センテロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカム
ＮＣＦＢ　５１７株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２７１１）、同
ＮＣＦＢ　５３１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２７１２）、同
ＮＣＦＢ８６１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２７１３）、同Ｎ
ＣＦＢ　８６４株（Ｆ）：ＲＭ　ＢＰ−２７１４）　、
同ＮＣＦＢ８８０株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２７１５）、同
＾ＴＣＣ１９５６株、同ＩＦＯ３３４９株などであり、
これら菌株はＢＬ−７５株と同様な方法により、生理活
性多１！ＲＯＮを生産することができる。

したがって、ロイコノストック属に属し、生理活性多糖
ＲＯＮ生産能を有する酵素を生産しうる微生物であれば
、本発明による生理活性多糖ＲＯＮの製造に利用するこ
とができる。

生理活性多ｗａＲＯＮ生産能を有する酵素を生産しうる
微生物を培養する方法は、原則的には一般の微生物の培
養方法に準ずればよいが、ロイコノストック属に属する
微生物は特に酸素を要求しない通性嫌気性菌であること
から、通常は液体培地による静置培養あるいは温度分布
を均一にする目的で緩和な条件での攪拌培養が有利であ
る。

培養に用いる培地としては、炭素源として蔗糖が生理活
性多＄１ＲＯＮ生産能を有する酵素を生産するために必
須である。そのほか上記酵素生産菌が利用できる他の炭
素源や窒素源、無機物等の栄養源を含有する培地であれ
ば合成培地、半合成培地および天然培地のいずれでも用
いることができる。

蔗糖としては粗製品から精製品まで任意に使用でき、た
とえば上白糖、黒糖、ＩＩ蜜、廃塘蜜、試薬用サッカロ
ース等のいずれも利用することができる。蔗糖の濃度は
高い捏水酵素の生産性を向上させるが、同時に生成する
生理活性多＄１１ＲＯＮの濃度が高くなって菌体の除去
が困難となるので、通常は１〜３％程度が適当である。

窒素源とじては酵母エキス、ペプトン、グルテンミール
、大豆粉、コーンステイープリカー、乾燥酵母、肉エキ
ス、硫酸アンモニウム、尿素等が使用できる。その他、
無機物としてリン酸塩やマグネシウム、マンガン　鉄、
コバルト、ナトリラムなどの金属塩等を適宜添加するこ
とができる。本酵素の生成にはｐ）ｌが影響するので、
特にリン酸塩は培地の緩衝能を高めるために１〜３％程
度添加することが望ましい。

培養温度は、通常の中温菌の培養温度に準ずればよく、
１５〜４５℃１好ましくは２０〜３０℃が適当であり、
培養時間は通常１０〜３０時間であるが、本酵素の生成
が確認されたとき、好ましくは生成が最大に達した後に
培養を停止すればよい。

本酵素は菌体中にも培地中にも蓄積されるので、培養物
中からの本酵素の回収は、遠心分離等により集めた菌体
から行ってもよいし、菌体を除いた上澄液から行っても
よい。なお、本酵素は培養物自体や上記菌体、上澄液な
どを粗酵素として使用することもできる。本酵素を菌体
から回収する場合、適当な手段、たとえば界面活性剤に
よる抽出や菌体破砕等により本酵素を可溶化後、遠心分
離等の固液分離にて不溶物を除去する。しかし、上澄液
からの回収の方が簡便であるので、通常は上澄液から本
酵素を回収する。

本酵素の精製は、酵素の精製に通常使用される手段、た
とえば有機溶媒沈澱、塩析、各種クロマトグラフィー（
イオン交換、ゲル濾過、疎水クロマト　アフィニティク
ロマト、ハイドロキシアパタイト等）、限外濾過などの
単独あるいは組合せにより行うことができるが、限外濾
過による低分子成分（分子量３万以下）の除去だけでも
本酵素は十分に精製される。

次に、本発明の生理活性多糖ＲＯＮ合成酵素の性質を示
す。なお、本酵素の標品としては後記実施例１で得られ
た酵素を用いた。また、酵素力価の測定は以下の方法に
より実施した。

酵素力価の測定：生理活性多糖ＲＯＮの生成と同時に遊
離された果糖の量を測定して求める。

あらかじめ３０℃に温めた蔗＄１　（６０％　ｗ／ｖ）
酢酸緩衝液（０，３Ｍ、　ｐＨ５，５）からなる反応試
液に、同じく３０℃に温めた酵素液（０，５〜ＩＵ／ｄ
）を反応試液の５等量加え、よくかきまぜて３０℃で３
０分間反応させる。この反応液に、反応液の４等量の４
０−Ｍ水酸化ナトリウム溶液を加えて反応を停止させる
。この反応停止液を適当に希釈し、ソモジー法（Ｓｏｍ
ｏｇｙｉ法、　Ｍ、　Ｓｏｎ＋ｏｇｙｉ　：　Ｊ、　Ｂ
ｉｏｌ、　Ｃｈｅｎ＋、。

１６０．６１（１９４５））により還元糖を果糖として
定量する。対照として蔗糖を加えないで同様に処理した
酵素反応停止液中の還元糖を果糖として定量し、補正を
行う。求めた果糖量から反応に関与した蔗糖量を求める
。生理活性多１１ＩＲＯＮ合成酵素の力価は、上記の条
件で１分間に１μ＋ｍｏｌｅの蔗糖を生理活性多糖ＲＯ
Ｎに転換させる（１μｍｏｌｅの果糖を生成する）酵素
量を１単位として表示する。

酵素の性質： （ａ）作用 １モルの蔗糖を分解し、１モルの果糖を生成すると同時
に受容体となる多糖ＲＯＮにグルコース部分を転移する
。

（ｂ）至適ｐＨ 各ｐＨにおける相対活性を３０℃で求めたところ、本酵
素の至適ｐＨは５，５付近であった。

（ｃ）安定ｐｎ範囲 各ｐｕにおける相対残存活性を２５’Ｃ，１８時間で測
定したところ本酵素はｐＨ４，５〜７．０の緩衝液中で
安定であった。

また、本酵素はｐＨ５，５の溶液でトルエン飽和した場
合、冷蔵（４〜６℃）で２ケ月間は安定である。

（ｄ）基質特異性 グルコース、果糖、麦芽糖、イソ麦芽糖からの生理活性
多糖ＲＯＮの生成は認められず、蔗糖とのみ反応して生
理活性多＄１ＲＯＮを生成する。

（ｅ）至適温度 酵素力価測定の方法において、温度だけを変化させて酵
素の力価を測定したところ、本酵素の至適温度は４０℃
付近にあることが明らかとなった。

（ｆ）安定温度範囲 各温度における相対残存活性を求めたところ、本酵素は
４０℃以下の温度で安定であった。

輸）阻害および活性化 濃度１ｎＭの各金属塩化物を添加し、各金属塩化物１ｍ
Ｍ添加時の相対活性を表１に示した。

表１ （χ） 無添加　　　　　　　　１（１１） Ｍ　ｇ　Ｃ１ｚ　　　　　　　　７　ＢＣａＣｊ２ｚ　
　　　　　　　１１０ Ｍ　ｎ　Ｃ１２７５ ＦｅＣ１ｚ　　　　　　　　１０３ ＦｅＣＩｌｓ　　　　　　　　８２ Ｃｏ　Ｃ７２ｚ　　　　　　　　９５ Ｎ　ｉ　Ｃｆ、　　　　　　　　９　ＢＣｕ　Ｃｉ！、
ｚ　　　　　　　　５０ＺｎＣＩｌ　　　　　　　　　
９３ 表から明らかなとおり、本酵素はＣａ塩によって若干活
性化され、Ｃｕ塩によって阻害される。

本酵素はゲル濾過を行った場合、排除限界分子１ｉｏｏ
ｏ万のカラム（トヨバール１（Ｗ−７５（！ｌ　）　テ
ＩＦ　際限界で溶出される。しかし、同時に生理活性多
糖ＲＯＮも溶出することから、本酵素は生理活性多糖Ｒ
ＯＮとの親和力が強く、これと結合していると思われる
。多糖ＲＯＮと分離すると、本酵素の活性が不安定にな
ることが認められる。

本酵素は蔗糖を分解し生理活性多糖ＲＯＮを生成する作
用を有する。よって、本酵素を使用することによって生
理活性多１１ＲＯＮの製造が可能である。

また、酵素液は生理活性多１ｉＲＯＮ生産菌の培養上澄
程度の純度であっても、生理活性多１ｉＲＯＭ生成後の
精製操作によって十分に生理活性多糖ＲＯＮの純度を上
げることができる。原料となる蔗糖は、純度が高いほど
生理活性多糖の精製操作に有利であるが、実用上は市販
の白糖で十分である。反応液中の蔗糖濃度は高いほど生
成される生理活性多糖ＲＯＮの量は増えるが、反応に要
する時間が長くなるので、通常は５〜３０％、好ましく
は１０〜２０％の範囲で反応を行う。

また、反応液中の酵素濃度についても高いほど反応に要
する時間が短かくなるが、蔗糖濃度が同じ場合は生成さ
れる生理活性多糖ＲＯＮの量は変らないので、通常は０
．２〜２Ｕ／ｕｄｌ、好ましくは０．５〜Ｉ　Ｕ／ｌｄ
の範囲で反応を行う。

反応液のｐＨは酵素の安定ｐＨ範囲であればよいが、酵
素の至適ｐ）Ｉで行うのが最も効率がよいので、ｐｔ＋
５．５付近にするのが望ましい。また、酵素反応によっ
てｐ）Ｉは変化しないが、リン酸緩衝液あるいは酢酸緩
衝液などを使うと、反応液のｐＨ調整を容易に行うこと
ができる。

反応温度は酵素の安定温度範囲であればよいが、酵素反
応は温度が高いほど効率が良いので、３０℃付近にする
のが望ましい。

反応時間は蔗糖の濃度、酵素の濃度２反応部度反応液の
ｐＨ等によって変わってくるが、たとえば、蔗糖濃度１
０χ（２９２ｍＭ）　、酵素濃度１１／戚として反応さ
せると、反応時間は６〜７時間とするのが望ましい。

反応後、生成した生理活性多糖ＲＯＮは水に可溶な極性
有機溶媒による有機溶媒沈澱で精製することができる。

ここで有機溶媒としてはメタノール、エタノール、アセ
トン等の多糖の精製によく使われるものが用いられる。

反応液に添加する有機溶媒は生理活性子１１ＲＯＮが沈
澱するまで添加すれば良いが、反応液中の不純物、例え
ば蔗糖果糖、緩衝剤などのまき込みを防ぐため、通常は
最終濃度４０〜６０％、好ましくは４３〜４８χ程度と
なるように撹拌しながら注意深く添加するのが望ましい
。生じた沈澱は濾過、遠心分離などによっても回収でき
るが、傾斜濾過による回収が簡便である。

一般に、１回の溶媒沈澱では不純物をまき込んで純度が
上らないことが多いので、必要に応じてこの操作を数回
くり返すことが望ましい。この様にして精製し、沈澱と
して回収した生理活性子ＩＪ！１ＲＯＮは再び水に溶解
し、凍結乾燥、噴霧乾燥あるいは極性有機溶媒中に徐々
に添加し脱水された状態にした後、減圧乾燥することに
よって、白色の粉末として回収することができる。また
、多糖ＲＯＮは該多糖ＲＯＮ合成酵素を利用したバイオ
リアクターによってさらに効率よく製造することができ
る。

本発明の生理活性子［ＲＯＮの製造は、力価の定まった
酵素を使うことができるから、生理活性子１１ＲＯＮの
調製を常に一定の最適条件下で行うことが可能である。

したがって、短時間で均一な品質の製品を得ることがで
きる。また、生理活性多＄１ＲＯＮ生産菌を直接生理活
性多糖ＲＯＮの生産に利用しないから、原料の蔗糖が菌
の生育に消費されることがない。したがって、本発明の
方法は原料の利用効率が良い。さらに、酵素によって生
成された生理活性多糖ＲＯＮは分解を受ける恐れもない
。したがって、収量も発酵生産の場合よりも高い等の利
点がある。

このようにして得られた生理活性子ＩＲＯＮの性質を示
す。

（１）性状：白色の無晶性粉末で無味無臭（２）溶解性
：水に可溶、濃度を上げると乳白色で粘稠な溶液となり
、ホルムアミド　ジメチルスルホキシドに可溶、アルコ
ール、アセトン、ベンゼン、酢酸エチル、ヘキサン、ク
ロロホルム、四塩化炭素に不溶 （３）水溶液のｐＨ：中性ないし弱酸性（４）構成糖：
グルコースのみ （５）元素分析値：　Ｃ：　４４．０〜４５．０％、　
Ｈ：　６．１〜６．３Ｘ（６）構造：α−１，６結合を
主鎖としたα−グルカンで少量のＬ３．６位分岐構造を
有する。

（７）蛋白質：殆んど含有せず （８）分子量：透析膜を通過せず、分子量１万以上と推
定され、後述の実施例２により製造された生理活性子Ｉ
！１ＲＯＮはセファロース２Ｂ■　ゲル濾過法による測
定よると分子量２（１１）０万以上と推定された。

（９）比旋光度：　〔α〕乙’＝＋１９０°〜＋２２０
゜（ｃ＝０．５．ホルムアミド） （１１））呈色反応：アンスロン硫酸反応、フェノール
硫酸反応が陽性、ビウレット反応、ローリー・フォーリ
ン反応、エルソン・モルガン反応、ヨード反応が陰性 （１１）融点：明確な融点を示さない。

０２）　　第１図のような紫外部吸収スペクトルを示す
如く、特徴的吸収を有さす。

ｑ９　　第２図のような赤外部吸収スペクトルを示す如
く、α−グルカンに特徴的吸収を示す。

ｑ４　　第３図のような１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示
す如く、主シグナルとしてα−１，６グルカンに特徴的
スペクトルを示す。

（１５）抗腫瘍作用を有す。

本発明により得られる生理活性子＄１ＲＯＮは抗腫瘍活
性、免疫調節活性、怒染防御活性等の種々の生理活性を
有していることが判明した。以下にそれぞれの生理活性
についてその検定法および後述する実施例２で得られた
生理活性子＄１ＲＯＮ（以下、ＲＯＮと略記する場合が
ある。）を投与した実験での検定結果について詳述する
。

（１）抗腫瘍活性について （イ）同系腫瘍メス−Ａに対する生理活性多糖ＲＯＮの
腹腔投与の効果 ６週令メス、平均体重２０ｇのＢＡＬＢ／Ｃ−ＣＲＪ　
？ウスに１週間、同系のマウスの腹腔内で継代した癌細
胞メス−Ａをマウス１匹当りｌＸ１０’個を腹腔内に移
植し、対照群２０匹（１群）、試験群各１０匹（３群）
の計４群に分けた。癌細胞を移植した翌日から連続５日
間、試験群には生理食塩水に溶解したＲＯＮをマウス１
匹の体重１ｋｇ当り各１０．３０．１（１１）■を０．
ｌｌｌ１ずつ腹腔内に投与し、対照群には同様にして生
理食塩水のみを投与した、以後、生存日数を観察し、延
命効果を次式により算出した。

（Ｅｌ）同系腫瘍メス−Ａに対する生理活性多１１ＲＯ
Ｎの経口投与の効果 ６週令メス、平均体重２０ｇのＢＡＬＢ／Ｃ−ＣＲＪマ
ウスに１週間、同系のマウスの腹腔内で継代した癌細胞
メス−Ａをマウス１匹当り６Ｘ１０’個を右腋下皮下に
移植し、対照群２０匹（１群）、試験群各１０匹（３群
）の計４群に分けた。癌細胞を移植した翌日から連続１
０日間、試験群には生理食塩水に溶解したＲＯＮをマウ
ス１匹の体重１ｋｇ当り各１０．３０，１（１１）■を
０．２ｄずつ経口ゾンデを用いて胃内に投与し、対照群
には同様にして生理食塩水のみを投与した。癌細胞を移
植してから３５日後に各マウスを層殺し、増殖した腫瘍
を切り出し重量を測定した。なお、阻止率は次式により
算出した。

上記（Ｖ）　、　（Ｉ＋）の方法により検定したへの抗
腫瘍効果は下表の通りであった。

上表より明らかなように腹腔投与、経口投与ともに３０
１１ｇＺｋｇ付近を至適投与量としてＲＯＮは強い抗腫
瘍活性を有していることが判明した。

その他にＲＯＮは同系腫瘍ルイス肺癌、メラノーマＢ−
１６．同種腫瘍ザルコーマ１８０．エールリッヒ腫瘍等
に対し、投与量１０〜１（１１）■／驕の範囲で腹腔投
与または経口投与により腫瘍阻止率３０〜７０％の効果
が確認されている。また、ＲＯＮを適当なプライマーと
組合わせてマウスに投与すると、その血清中にＬ−９２
９細胞に対する細胞傷害活性やメスーＡ固形腫瘍に対す
る壊死作用を誘導し、また担癌マウスの生体内にも腫瘍
壊死因子を自己誘導することが確認された。したがって
、ＲＯＮは後述するように毒性が全くみられない点とも
合わせて極めて有効な抗腫瘍剤となりうると考えられる
。

（２）免疫調節活性について （イ）カーボンクリアランステスト（ｃＣＴ）本性は免
疫調節作用のうち細網内皮系の先進作用について調べる
方法である。

４週令メス、平均体重２０ｇのＩＣＲ−ＣＲＪマウス１
群６匹に、生理食塩水に溶解したＡを２日間腹腔投与し
く対照群は生理食塩水のみを投与）、３日目にカーボン
液（ペリカン製黒インク、商品名：ファウント　インデ
ィアを生理食塩水で５倍に希釈した液）をマウス尾静脈
より０．２５１１ｉ！注入し、注入直後および１０分後
に眼窩静脈叢より０．０２５ｍ採血し、３．５ｔｄの０
．０１モル炭酸ナトリウム溶液に懸濁溶解させ、６５０
ｎ−にて吸光度（ＯＤｂｓ。）を測定し、血中カーボン
濃度の減少率を調べた。効果は次式に示す賞食係数で表
わした。

※Ｔ１時における０ＤａｓｏをＣｔ　、　Ｔ　ｚ時にお
ける０ＤｂｓｏをＣ２とする。

なお、担癌マウスについてはＲＯＮの投与開始より７日
前にザルコーマ１８０細胞をＩ　Ｘ　１０’個大腿部筋
肉に移植し、以下同様に試験した。結果は下表の通りで
あり、正常マウス、担癌マウスともにＲＯＮのｌＯ〜３
０■／ｋｇ、特に３０■／ｋｇの投与によりマウスの細
網内皮系の機能が光道していることが判明した。

（ロ）プラークフォーミングセル法（ＰＦＣ）本性は免
疫調節作用のうち、宿主のＢ細胞の賦活による抗体産生
能の増強効果を調べるものである。

４週令メス、平均体重２０ｇのＩＣＲ−ＣＲＪマウス１
群６匹に、生理食塩水に溶解したＲＯＮを３日間連続し
て腹腔内に投与しく対照群は生理食塩水のみを投与）、
４日目と１１１日目それぞれ羊赤血球４Ｘ１０”個を尾
静脈より注入感作せしめ、その４日後にカニンガムの方
法でマウス牌細胞のプラーク形成能を測定した。

結果は下表の通りであり、ＲＯＮは１０−１（１１）■
／ｋｇの投与により抗体産生能を著しく増強しているこ
とが示された。

（ハ）遅延型皮膚反応法（ＤＨＲ） 本性は免疫調節作用のうち宿主のＴ細胞の賦活による細
胞性免疫の作用の増強効果を調べるものである。

８週令メス２平均体重２７ｇのＩＣＲ−ＣＲＪマウス１
群６匹に、生理食塩水に溶解したＲＯＮを８日間連続し
て経口投与しく対照群は生理食塩水のみを投与）、投薬
開始後４日目にマウスの刺毛腹部に５％塩化ビクリルエ
タノール溶液を塗布して一次感作し、１１１日目１％と
クリルオリーブ油溶液をマウス両耳の表裏に塗布して二
次感作し、その２４時間後に篤厚の増加をゲージで測定
し、塗布前の篤厚との差から篤厚の増加量をみた。一方
、担癌マウスについてはザルコーマ１８０１１水型腫瘍
細胞をｌＸｌ０’個を投薬開始前日にマウス腹腔内に移
植し、以下同様に試験した。

結果は下表の通りであり、ＲＯＮは試験した３０〜５（
１１）■／ｋｇの経口投与により、正常マウス、担癌マ
ウスおもに細胞性免疫能を著しく増強していることが示
された。

以上、（イ）、（１７）、（ハ）の各免疫実験により生
理活性多糖ＲＯＮはメカニズムの異なる免疫作用をそれ
ぞれ顕著に亢進させていることがわかった。免疫調節剤
は一般には生体の免疫機能が低下したり、異種抗原認識
機能が弱い場合などに使用され得ることから、特に微生
物感染症や悪性腫瘍の治療剤。

治療補強剤または併用剤、予防剤あるいは術後回復促進
剤としての薬剤用途が期待される。以上の免疫賦活回復
機能の他にも、免疫調節剤は異常に冗進した生体免疫反
応を正常化し、たとえばリウマチ、膠原病、アレルギー
等の自己免疫疾患にも適用できる場合が考えられる。

（３）感染防御活性について 一般には生体はこれら異種細菌の侵入に対しては充分な
防御作用を持っているが、担癌状態、特に癌の末期には
著しく防御作用が低下することが知られており、通常宿
主と共生している非病原菌によってさえ重篤な結果を招
来することが知られている。

そこで、生理活性多１ｉＲＯＮがこれらの細菌の感染症
に対して宿主の防御活性を増強するかどうかをエシェリ
ヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ上ひおよび
リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ肌匹
肛旦■ｕ針感染に対するＡの効果で調べた。

７週令メス、平均体重２６ｇのＩＣＲ−ＣＲＪマウスを
１群２０匹ずつ用い、生理食塩水に溶解したＲＯＮを１
０〜１（１１）Ｉ１ｇ／ｋｇ　（対照群は生理食塩水の
み）マウスの背中皮下に細菌感染１日前、−日後に各１
回投与した。エシェリヒア・コリの場合は２×１０７個
を背中皮下に、リステリア・モノサイトゲネスの場合は
２Ｘ１０’個を腹腔内に感染させ、それぞれ１遇間観察
して、生残マウス数を比較した。防御効果は次式により
算出した。

防御効果（％）＝ 結果は下表の通りであり、ＲＯＭの１０−１（１１）■
／ｋｇの事前投与により、エシェリヒア・コリ感染に対
しては非常に強い防御作用が生じ、リステリア・モノサ
イトゲネス感染に対しても有意な防御作用の増強効果が
みられた。また、感染後投与の場合でも両感染菌に対し
て有意な治療効果を示した。

後述するように、生理活性多１！ＲＯＮは毒性が全く見
られない点とも合わせて、極めて有効な感染症予防治療
剤となりうると考えられる。

／ ２−′ ／ 次に、生理活性多［ＲＯＮの急性毒性について言及する
。５週令オスのＳＤ　−ＣＲＪラット体重１２０〜１５
０ｇ、１群ｉｏ匹を用いてＲＯＮの物理的投与限界であ
る１５ｇ／ｋｇを経口投与し観察を続けたところ、金側
死亡例がなく体重増加も対照と変わらず、しかも外観上
や剖検上も全く異常が認められなかった。したがって、
ＬＤ、。＞ｘ５ｇ／−と考えられ、急性毒性はないもの
と判断されるＱさらに、ＲＯＮはマウスの肺臓細胞由来
のナチュラルキラー細胞の傷害活性を増強したり、マウ
スの腹腔常在性マクロファージのＬ−９２９１１１胞に
対する傷害活性を賦活する作用を有している。また、法
尻な免疫賦活活性を有し、かつインターフェロンなどの
サイトカイン生産能がみられることカラヘルペス、イン
フルエンザ、エイズ等のウィルス性疾患に対する発症予
防治療効果が期待できるほか、慢性肝炎等の肝炎・肝疾
患に対する予防・治療剤としても有用であると考えられ
る。

したがって、ＲＯＮは経口的または非経口的に投与でき
るので、極めて有用な抗腫瘍荊、免疫調節剤あるいは感
染症予防治療剤として期待される。

したがって、ＲＯＮは経口的または非経口的に投与でき
るので、極めて有用な抗腫瘍剤、免疫調節剤あるいは感
染症予防治療剤として期待される。

なお、実際の製剤化についてはＲＯＮは賦形剤（水、生
理食塩水、ポリエチレングリコール、グリセロゼラチン
、澱粉、デキストリン、乳糖など）と組み合わせて水剤
、火剤１錠剤、散剤、串刺なとの剤型にて製造すること
ができる。

さらに、生理活性多糖ＲＯＮは医薬品用途のほか、毒性
が認められないこと、経口投与で健康維持に有用な種々
の生理活性機能を有すること、無味無臭で加工し易いこ
と等から疾病予防用または保健用途の飲食品、飲食品添
加物等として使用することもできる。

一方、後述の実施例２により製造された本発明の生理活
性多＄１ＲＯＮは分子量２．（１１）０万以上の高分子
であるが、酸加水分解等によって一定限度まで低分子化
したものも元の生理活性多糖ＲＯＮと同程度の生理活性
を有することを見出した。

すなわち、本物質を０．５〜５％、好ましくは１〜３χ
の硫酸−ギ酸溶液中で３０〜７０℃０、好ましくは５０
〜６０℃で２〜２４時間、好ましくは３〜６時間加水分
解し、分解液に炭酸バリウムを加えて中和し遠心分離に
て上澄液を得、濃縮後セファロースＣＬ−２Ｂ■、セフ
ァデックスＧ−２（１１）■　等のカラムにてゲル濾過
を行ない、分子量に応した数両分を得てそれぞれの両分
について生物活性を測定したところ、分子量約１万以上
の両分には元の生理活性子１ｉＲＯＮと同程度の活性が
あることが判明した。

［実施例］ 次に本発明の実施例によりさらに詳細に説明する。

実施例１ ０イコノストツク・メセンテロイデス・サブスピーシー
ズ・デキストラニカム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓ　ｔｏｃｍｅ
ｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ　５ｕｂｓｐ、ｄｅｘｔｒａｎ
ｉｃｕｍ）　ＢＬ−７５株（ＦＥＲＭＢＰ−２２４２）
の穿刺培養から５厩の前培養培地（蔗糖２％、酵母エキ
スｏ、ｓｘ、　　トリプトン０．２５Ｘ、リン酸水素二
カリウム０．５％、ｐＨ７，４）に接種し、２５℃で２
４時間静置培養した。この培養液を２（１１）ｍの本培
養培地〔蔗糖２％、酵母エキス０．５％、リン酸水素二
カリウム２％、硫酸マグネシウム０．０２％、塩化ナト
リウムｏ、ｏｏｉ％、硫酸第−鉄０．（１１）１％、硫
酸マンガフ０．（１１）１％、　ｐＨ７，４）に加え、
２５°ｃで１７時間静置培養した。

得られた培養物を遠心分離（１０，０ＯＯＧ、１５分間
）して上澄液を得た。上澄液中の酵素活性は０．７４Ｕ
／−９液量は１８０ｍであった。この上澄液を限外濾過
膜（アミコン・ホローファイバー■１分画分子量１万）
で濃縮し、さらに５ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５，５と置換し
た。これにトルエンを飽和し、最終的に２Ｕ／ｍｌの酵
素液８０ｄを得た。

実施例２ 実施例１で得られた酵素液１０ｄ（２０Ｕ）を３０−の
１０χ蔗塘を含む５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐｉ（５，５に添
加、攪拌した後、３０℃で反応させた。反応終了時間は
酵素量と蔗糖から７．３時間と計算できるので、９時間
で反応を終了させた。反応終了は、二の反応液に３３ｄ
のメタノール（最終濃度４５χ）を攪拌しながら徐々に
添加し、生理活性子［ＲＯＮを沈澱させることで行った
。生理活性多糖ＲＯＮの精製はさらに再度メタノール沈
澱を行った。沈澱物は水に溶解後、凍結乾燥を行った。

その結果、白色の粉末として１．２０ｇの生理活性多糖
ＲＯＮを得た（理論収率の８５χ）。

実施例３ 実施例１で得られた酵素５ｄ　（１０Ｕ）を、１５−の
２０％蔗糖を含む５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５，５に添加
し、攪拌後３０℃で反応させた。反応時間は１８時間と
した。この反応液に１６−のメタノール（最終濃度４５
χ）を攪拌しながら徐々に添加し、生理活性多糖ＲＯＮ
を沈澱させた。さらに再度同様にメタノール沈澱を行っ
て、生理活性子ＩＩＲＯＮを精製し、水に溶解して凍結
乾燥を行った。その結果、白色の粉末として１　、１６
ｇの生理活性子Ｉ！ＲＯＮを得た（理論収率の８２ｚ）
。

実施例４ 実施例１で用いた前培養培地の培養液１（ｌをさらに前
培養培地５（１１）−に添加し２５℃で２４時間静置培
養した。これを本培養培地２５ｆの入った３０ｊ２容ジ
ャーファーメンタ−に添加し、ゆるやかに攪拌して２５
℃で２０時間本培養を行った。得られた培養物を連続遠
心分離機で遠心分離して（１３，０ＯＯＧ　、流速６０
ｉ／時間）、０．７Ｕ／ｄの粗酵素液２０Ｉ２を得た。

実施例５ 実施例４で得られた粗酵素液５　ｆ　（３５（１１）１
Ｊ）に蔗糖５（１１）ｇを攪拌しながら溶かし込み、３
０℃で１７時間反応させた。反応後、４ｉ！、のメタノ
ール（最終濃度４５χ）を攪拌しながら徐々に添加し、
生理活性多糖ＲＯＮを沈澱させた。この沈澱物を再度メ
タノール沈澱を行い精製した。これを水に溶解し噴霧乾
燥することにより、白色粉末として生理活性多糖ＲＯＮ
　１７４ｇを得た（理論収率の７４χ）。

実施例６ 実施例１においてロイコノストック・メセンテロイデス
・サブスピーシーズ・デキストラニカムＢＬ−７５株（
ＦＥＲＭ　ＢＰ−２２４２）の代わりにロイコノストッ
ク・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキストラ
ニカム４６−１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２６７０）に変え
たこと以外は同様の操作を行い、２Ｕ／１１１の酵素液
７０−を得た。

実施例７ 実施例１において、ロイコノストック・メセンテロイデ
ス・サブスピーシーズ・デキストラニカムＢＬ−７５株
（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２２４２）の代わりにロイコノスト
ック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキスト
ラニカムＮＣＦＢ　５１７（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２７１１
）に変えたこと以外は同様の操作を行い、２Ｕ／ＷＩｌ
の酵素液３０Ｉｄを得た。

実施例８ 実施例１において、ロイコノストック・メセンテロイデ
ス・サブスピーシーズ・デキストラニカムＢＬ−７５株
（ＦＥＲ？Ｉ　ＢＰ−２２４２）の代わりにロイコノス
トック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキス
トラニカムＮＣＦＢ　５３１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２７１
２）に変えたこと以外は同様の操作を行い、２Ｕ／ｒｒ
ｄｌの酵素液４５戚を得た。

実施例９ 実施例１において、ロイコノストック・メセンテロイデ
ス・サブスピーシーズ・デキストラニカムＢＬ−７５株
（ＦＵＲ阿ＢＰ−２２４２）の代わりにロイコノストッ
ク・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキストラ
ニカムＡＴＣＣ１９５６に変えたこと以外は同様の操作
を行い、２１１／ｍｅの酵素液５０−を得た。

実施例１０ 実施例１において、ロイコノストック・メセンテロイデ
ス・サブスピーシーズ・デキストラニカムＢＬ−７５株
（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２２４２）の代わりにロイコノスト
ック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキスト
ラニカムＮＣＦＢ　８６１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２７１
３）に変えたこと以外は同様の操作を行い、２　Ｕ　／
　ｔｔｒＲの酵素液３０ａｅを得た。

実施例１１ 実施例１において、ロイコノストック・メセンテロイデ
ス・サブスピーシーズ・デキストラニカムＢＬ−７５株
（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２２４２）の代わりにロイコノスト
ック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキスト
ラニカムＮＣＦＢ　８６４株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２７１
４）に変えたこと以外は同様の操作を行い、２Ｕ／ｄの
酵素液３０戚を得た。

実施例１２ 実施例１において、ロイコノストック・メセンテロイデ
ス・サブスピーシーズ・デキストラニカムＢＬ−７５株
（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２２４２）の代わりにロイコノスト
ック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキスト
ラニカムＩＦＯ３３４９株に変えたこと以外は同様の操
作を行い、２Ｕ／ｄの酵素液５０ｄを得た。

実施例１３ 実施例６で得られた酵素液を用いて実施例２と同様の操
作を行いｉ、　ｉ　ｓ　ｇの生理活性多糖ＲＯＮを得た
。

実施例１４ 実施例７で得られた酵素液の２倍希釈液を用いて実施例
２と同様の操作を行い１．２０ｇの生理活性多糖ＲＯＮ
を得た。

実施例１５ 実施例８で得られた酵素液を用いて実施例２と同様の操
作を行い１．１７ｇの生理活性多糖ＲＯＮを得た。

実施例１６ 実施例９で得られた酵素液を用いて実施例２と同様の操
作を行い１．１８ｇの生理活性多糖ＲＯＮを得た。

実施例１７ 実施例１０で得られた酵素液を用いて実施例２と同様の
操作を行い１．１０ｇの生理活性子ＩＲＯＮを得た。

実施例１８ 実施例１１で得られた酵素液を用いて実施例２と同様の
操作を行い１．１３ｇの生理活性多糖ＲＯＮを得た。

実施例１９ 実施例１２で得られた酵素液を用いて実施例２と同様の
操作を行い１．２１ｇの生理活性多糖ＲＯＮを得た。

実施例２０ 実施例２で製造した生理活性多糖ＲＯＮの白色粉末１ｇ
に２％の硫酸−ギ酸混液１（１１）ａｌｔを加え、６０
℃で４時間加水分解を行なった。分解液に炭酸バリウム
を加えて中和し、遠心分離にて上澄液を得、この半量を
セファロースＣＬ　−２Ｂ■のカラムにかけてゲル濾過
を行ない、ボイドボリュームに溶出する画分Ｆｌ（分子
量２（１１）０万以上）、中間分子量約１（１１）万の
画分Ｆ２を得た。また、残り半量をセファデックス■Ｇ
−２０にかけ中間分子量約１０万、約１万の画分Ｆｓ、
Ｆａを得た。それぞれの両分を凍結乾燥してＦｌｉ２（
１１）■、Ｆｚ：１６０ｍｇ１Ｆ：＋：１５０■、Ｆａ
：１２０１ｇの白色粉末を得た。

このようして得られた各両分の生物活性について以下に
示す。

（１）　　抗腫瘍活性について 同系腫瘍メス−Ａに対する投与量３０■／ｋｇ、経口投
与での効果は次表の通りであった。

（２）免疫調節活性について （イ）カーボンクリアランステスト（ｃＣＴ）担癌マウ
スを用い、投与量３０■／ｋｇ、腹腔投与での効果は次
表の通りであった。

（Ｕ）プラークフォーミングセル（ＰＦＣ）正常マウス
を用い、投与量３０ｘ／ｋｇ、　ｌｔｌ腔投与で４日目
に羊赤血球で感作した場合の結果は次表の通りであった
。

（ハ）遅延型皮膚反応（ＤＨＲ） 担癌マウスを用い、投与量３ｏｍｇ／ｂ、）１腔投（３
） 感染防御活性について 感染１日前に３０■／ｋｇを皮下投与した場合の防御活
性は次表に示す通りであった。

また、 感染１日後に３０■／ｋｇを皮下投与した場合の防御活
性は次表に示す通りであった。

／′ 以上の結果から、本発明の生理活性多糖ＲＯＮは加水分
解により分子量約１万程度まで小さくしても各種生物活
性はもとの生理活性多糖ＲＯＮと同程度に維持されてい
ることが判明した。

一方、低分子化した生理活性多糖ＲＯＮの毒性について
マウスを用いて調べたところ、経口投与による急性毒性
はいずれの画分にも元の生理活性多糖ＲＯＮと同様認め
られず、静脈内注射した場合は、元の生理活性多１ｉＲ
ＯＮがＬＤｓ。；３（１１）■／ｋｇであったのに対し
、分子量が小さくなるに従い毒性が減少し、分子量約１
万のＦ４画分はＬＤＳ。〉１ｇ／ｋｇであり、毒性は認
められなかった。

このように低分子化された生理活性多糖ＲＯＮが毒性も
なく、各種生物活性を有することは、例えば注射剤とし
て本物質を利用するとき、大変有利な性質と考えられる
。

〔発明の効果〕

生理活性多糖ＲＯＮは従来、天然物からの抽出により得
られていたが、本発明の生理活性多＄１ＲＯＮ合成酵素
は、蔗糖から生理活性多糖ＲＯＮを生成する作用を有す
る。また、本発明の生理活性多糖ＲＯＮの製造方法は、
この酵素を利用する方法である。したがって、蔗糖を原
料とし力価の定まった本酵素を使用することにより、常
に一定の最適条件下で生理活性多＄１ＲＯＮの製造を行
うことが可能である。このことにより、製品の品質を均
一に出来る。しかも、精製も簡単であるため、収量も高
い。

生物活性の面からも抗腫瘍活性、免疫調節活性および感
染防御活性ともに従来の製法での最も活性の高いものに
匹適する活性をもつ生理活性多糖ＲＯＮを安定して製造
できるようになり、量的。

質的にみて大幅な改良が見られ産業上大変有利である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明で得られた生理活性多糖ＲＯＮの紫外線
吸収スペクトル、第２図は本物質の赤外線吸収スペクト
ル、第３図は同物質の１３ｃ−核磁気共鳴スペクトルで
ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）下記の性質を有する生理活性多糖ＲＯＮの合成酵素
   を蔗糖に作用させて該生理活性多糖ＲＯＮを生成せしめ
   て回収することを特徴とする生理活性多糖ＲＯＮの生産
   法。 （１）性状：白色の無晶性粉末で無味無臭 （２）溶解性：水に可溶、濃度を上げると乳白色で粘稠
   な溶液となる。ホルムアミド、ジメチルスルホキシドに
   可溶、アルコール、アセトン、ベンゼン、酢酸エチル、
   ヘキサン、クロロホルム、四塩化炭素に不溶 （３）水溶液のｐＨ：中性ないし弱酸性 （４）構成糖：グルコースのみ （５）元素分析値：Ｃ：４４．０〜４５．０％、Ｈ：６
   ．１〜６．３％（６）構造：α−１，６結合を主鎖とし
   たα−グルカンで少量の１，３，６位分岐構造を有する
   。 （７）蛋白質：殆んど含有せず （８）分子量：透析膜を通過せず、分子料１万以上と推
   定される。 （９）比旋光度：〔α〕＾２＾５＿Ｄ＝＋１９０°〜＋
   ２２０°（ｃ＝０．５、ホルムアミド） （１０）呈色反応：アンスロン硫酸反応、フェノール硫
   酸反応が陽性、ビウレット反応、ローリー・フォーリン
   反応、エルソン・モルガン反応、ヨード反応が陰性 （１１）融点：明確な融点を示さない。 （１２）紫外部吸収スペクトル：特徴的吸収を有さず。 （１３）赤外部吸収スペクトル：α−グルカンに特徴的
   吸収を示す。 （１４）＾１＾３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：主シグナルと
   してα−１，６グルカンに特徴的スペクトルを示す。 （１５）抗腫瘍作用を有す。 ２）生理活性多糖ＲＯＮ合成酵素が、ロイコノストック
   属に属する該生理活性多糖ＲＯＮ生産能を有する微生物
   に由来するものである請求項１記載の生理活性多糖ＲＯ
   Ｎの生産法。 ３）生理活性多糖ＲＯＮの生産能を有する微生物がロイ
   コノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・
   デキストラニカムＢＬ−７５株（ＦＥＲＭＢＰ−２２４
   ２）、同ＮＣＦＢ５１７株（ＦＥＲＭＢＰ−２７１１）
   、同ＮＣＦＢ５３１株（ＦＥＲＭＢＰ−２７１２）、同
   ＮＣＦＢ８６１株（ＦＥＲＭＢＰ−２７１３）、同ＮＣ
   ＦＢ８６４株（ＦＥＲＭＢＰ−２７１４）、同ＮＣＦＢ
   ８８０株（ＦＥＲＭＢＰ−２７１５）、同４６−１株（
   ＦＥＲＭＢＰ−２６７０）、同ＡＴＣＣ１９５６株、同
   ＩＦＣ３３４９株およびそれらの変異株からなる群から
   選ばれる１種の微生物である請求項２記載の生産法。 ４）生理活性多糖ＲＯＮの生産能を有する微生物が、ロ
   イコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ
   ・デキストラニカムＢＬ−７５株（ＦＥＲＭＢＰ−２２
   ４２）または同４６−１株（ＦＥＲＭＢＰ−２６７０）
   である請求項２記載の生産法。 ５）生理活性多糖ＲＯＮ合成酵素が、下記の性質を有す
   るものである請求項１の生産法。（ａ）作用：１モルの
   蔗糖を分解し、１モルの果糖を生成すると同時に受容体
   となる多糖ＲＯＮにグルコース部分を転移する。 （ｂ）至適ｐＨ：５．５付近 （ｃ）安定ｐＨ：４．５〜７．０ （ｄ）基質特異性：グルコース、果糖、麦芽糖、イソ麦
   芽糖からは多糖ＲＯＮの生成は認められず、蔗糖とのみ
   反応して多糖ＲＯＮを生成する。 （ｅ）至適温度：４０℃付近 （ｆ）安定温度範囲：４０℃以下で安定 ６）蔗糖に作用して下記の性質を有する生理活性多糖Ｒ
   ＯＮを生成せしめる生理活性多糖ＲＯＮ合成酵素。 （１）性状：白色の無晶性粉末で無味無臭 （２）溶解性：水に可溶、濃度を上げると乳白色で粘稠
   な溶液となる。ホルムアミド、ジメチルスルホキシドに
   可溶、アルコール、アセトン、ベンゼン、酢酸エチル、
   ヘキサン、クロロホルム、四塩化炭素に不溶 （３）水溶液のｐＨ：中性ないし弱酸性 （４）構成糖：グルコースのみ （５）元素分析値：Ｃ：４４．０〜４５．０％、Ｈ：６
   ．１〜６．３％（６）構造：α−１，６結合を主鎖とし
   たα−グルカンで少量の１，３，６位分岐構造を有する
   。 （７）蛋白質：殆んど含有せず （８）分子量：透析膜を通過せず、分子量１万以上と推
   定される。 （９）比旋光度：〔α〕＾２＾５＿Ｄ＝＋１９０°〜＋
   ２２０°（ｃ＝０．５、ホルムアミド） （１０）呈色反応：アンスロン硫酸反応、フェノール硫
   酸反応が陽性、ビウレット反応、ローリー・フォーリン
   反応、エルソン・モルガン反応、ヨード反応が陰性 （１１）融点：明確な融点を示さない。 （１２）紫外部吸収スペクトル：特徴的吸収を有さず。 （１３）赤外部吸収スペクトル：α−グルカンに特徴的
   吸収を示す。 （１４）＾１＾３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：主シグナルと
   してα−１，６グルカンに特徴的スペクトルを示す。 （１５）抗腫瘍作用を有す。 ７）酵素が、ロイコノストック属に属する該生理活性多
   糖ＲＯＮ生産能を有する微生物に由来するものである請
   求項６記載の生理活性多糖ＲＯＮの合成酵素。 ８）生理活性多糖ＲＯＮの生産能を有する微生物がロイ
   コノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・
   デキストラニカムＢＬ−７５株（ＦＥＲＭＢＰ−２２４
   ２）、同ＮＣＦＢ５１７株（ＦＥＲＭＢＰ−２７１１）
   、同ＮＣＦＢ５３１株（ＦＥＲＭＢＰ−２７１２）、同
   ＮＣＦＢ８６１株（ＦＥＲＭＢＰ−２７１３）、同ＮＣ
   ＦＢ８６４株（ＦＥＲＭＢＰ−２７１４）、同ＮＣＦＢ
   ８８０株（ＦＥＲＭＢＰ−２７１５）、同４６−１株（
   ＦＥＲＭＢＰ−２６７０）、同ＡＴＣＣ１９５６株、同
   ＩＦＯ３３４９株およびそれらの変異株からなる群から
   選ばれる１種の微生物である請求項７記載の生理活性多
   糖ＲＯＮの合成酵素。 ９）生理活性多糖ＲＯＮの生産能を有する微生物が、ロ
   イコノストック、メセンテロイデス、サブスピーシーズ
   ・デキストラニカムＢＬ−７５株（ＦＥＲＭＢＰ−２２
   ４２）または同４６−１株（ＦＥＲＭＢＰ−２６７０）
   である請求項７記載の生理活性多糖ＲＯＮ合成酵素。