JPH0525242B2

JPH0525242B2 -

Info

Publication number: JPH0525242B2
Application number: JP13214085A
Authority: JP
Inventors: Takeshi Myazawa; Satoru Sugano; Hiroshi Yamaguchi; Kinji Takada; Yoshasu Shidori
Original assignee: KANTO ISHI PHARMA CO Ltd
Current assignee: KANTO ISHI PHARMA CO Ltd
Priority date: 1985-06-18
Filing date: 1985-06-18
Publication date: 1993-04-12
Also published as: JPS61289895A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は工業的に有用な新規な粘質多糖類B62
−５物質及びその製造法に関する。従来、粘質多糖類は粘着性、粘稠性等の性質か
らその利用範囲は広く、食料品、化粧品への添加
剤として、更に接着剤、被覆剤、凍結安定剤、潤
滑剤、ドリリングマツド添加剤及び油田に於る石
油回収用剤等として各方面への用途が開発されつ
つある。また、近年、ある種の多糖類の抗腫瘍作
用、血圧降下作用等の薬理作用が認められるに至
り、医薬としての利用範囲の拡大も期待されてい
る。そして、ある種の微生物が多糖類を生産するこ
とは公知であり、たとえば、アルカリゲネス属、
キサントモナス属、アークロバクター属、アゾト
バクター属、シユードモナス属、ロイコノストツ
ク属、アセトバクター属、オーレオバシジウム
属、プロジスクルス属あるいはペスタロチオプシ
ス属等の菌株の生産するものが知られている。また、バチルス属に属する菌株がある種の多糖
類を生産することも公知である。すなわち、バチ
ルス・ポリミキサが高粘性酸性多糖〔酸工、59、
303（1981）〕を、バチルス・ズブチルスが熱可塑
性ゲルを形成する酸性多糖〔酸工、51，653
（1973）；特許公告、52−12789（1977）〕を、そし
てバチルス・サーキユランスがゼラチン状を呈す
る多糖〔特許公告、52−4635（1977）〕を生産する
こと等が報告されている。本発明者らは、自然界より分離した微生物の生
産する有用物質の探索中に、土壌より分離したバ
チルス属の菌株がグルコース、マンノース、キシ
ロース、グルクロン酸を主構成成分とする多糖類
を生産すること、そしてこの多糖類が従来知られ
ている微生物の生産する多糖類とは異なる新規な
水溶性高粘性酸性ヘテロ多糖類であること及びそ
の製造法を見出し、本発明を完成するに至つた。以下、本発明について詳細に説明する。本発明の多糖類B62−５物質（以下、本多糖類
と称する）は、２規定硫酸で100℃、６時間加水
分解した後、ｎ−ブタノール：ピリジン：ベンゼ
ン：水（５：３：１：３）及びフエノール：水
（５：１）の展開溶媒を用いてのキーゼルゲル
60F−254（メルク社製、シリカゲル薄層板）薄膜
クロマトグラフイーとウロン酸の確認をチオグリ
コール酸・マンノース・硫酸法で行うと、グルコ
ース・モンノース・キシロース・グルクロン酸が
検出される。更に、本多糖類を加水分解してダウ
エクス（Dowex）−１（ダウケミカル社製、強塩
基性陰イオン交換樹脂）とアンバーライト
（Amberlite）IR−120B（ローム・アンド・ハー
ス社製、強酸性陽イオン交換樹脂）イオン交換ク
ロマトグラフイーにかけた後、３％ECNSS−
Ｍ／ガスクロム（Gaschrom）−Ｑ｛（100〜120）
メツシユ｝（ガスクロ工業製）用いたガスクロマ
トグラフイーによる中性単糖のアルジトール、ア
セテートの分析とカルバゾール・硫酸法による酸
性単糖の分析を行うと、そのグルコース、マンノ
ース、キシロースとグルクロン酸の構成比は約
2.8：３：８：１：2.1であることが認められる。また、本多糖類は、セチルピリジニウムクロラ
イドを添加すると白色沈澱が生じるので酸性であ
る。すなわち、本多糖類は、グルコース、マンノー
ス、キシロース及びグルクロン酸を主構成成分と
し、その構成糖比がグルコース：マンノース：キ
シロース：グルクロン酸＝2.8：３：８：１：2.1
である酸性ヘテロ多糖類である。そして、本多糖類は以下に示す理化学的性質を
有する。赤外吸収スペクトル第１図に示す通りである。主な吸収極大波長は次のとおりである。 νmax（KBr）（cm^-1）：3400、2920、1720、
1610 紫外吸収スペクトル特異的な吸収は見られない。呈色反応モーリツシユ反応、フエノール・硫酸反応、
アンスロン・硫酸反応、カルバゾール・硫酸反
応、オルシン・塩酸反応は陽性で、フエーリン
グ反応、ヨウ素反応、エルソン・モルガン反応
は陰性である。塩基性、酸性、中性の別セチルピリジニウムクロライドを添加すると
白色沈澱を生ずる。従つて、本多糖類は酸性で
ある。溶解性水に可溶であるが、メタノール、エタノー
ル、イソプロパノール、アセトン等には不溶で
ある。色及び形状精製品は白色綿状または繊維状である。粘度１％水溶液の粘度は約10000cP｛25℃、
30rpm（No.４ローター）、東京計器製Ｂ型粘度計
による｝である。また、固有粘度は99dl・ｇ^-1
である。構成糖及びその構成比グルコース、マンノース、キシロースグルク
ロン酸を主構成糖とし、その構成比は2.8：
3.8：１：2.1である。元素分析値Ｃ＝38.54％、Ｈ＝5.27％Ｏ＝55.4％、Ｎ＝0.79％、灰分＝痕跡。比旋光度〔α〕²⁰ _D：＋61°〜＋194° （ｃ＝0.01653、水溶液；高粘性のため測定困
難）分子量 TSK−GELトヨパールHW−65F（東洋曹達
製、ゲル〓過担体）を使用して、シヨーデツク
ス・スタンダードＰ−82（昭和電工製、分子量
キヤリブレーシヨン用標準試料）を分子量標準
物質として、ゲル過法を行うとき、上記標準
試料中で最大の分子量をもつｐ−800（分子量
8.5×10⁵）よりも分子量が大である。又、超遠心分析法により測定するとき、分子
量は約1.5×10⁶である。融点 225〜230℃で炭化分解する。粘性特性本多糖類の水溶液は著しい擬塑性流動を示
し、次のような粘性特性を示す。 (i) PHの影
響 PH４〜７で高粘度を示すが、更に低いPHで
は急速に、アルカリ側では徐々に粘度が低下
する。 (ii) 温度の影響低温側では粘度が急激に上昇し、40℃以上
では徐々に低下する。 (iii) 加熱温度の影響（10分間加熱後20℃で測
定） 70℃で最高粘度を示し、その前後で急速に
低下する。 (iv) 加熱時間の影響（70℃） 10分までは変化がないが、その後急速に粘
度が低下する。 (v) 塩濃度の影響塩化ナトリウム、塩化カルシウムとも濃度
と上昇と共に粘度が低下する。 (vi) 濃度により粘度変化濃度の増加と共に急速に粘度が上昇する。簡易急性毒性試験マウスに経口投与した場合、1.250mg／Kgま
で死亡例は見られず、一般症状及び剖検所見に
も変化は見られなかつた。なお、それ以上の投
与は高粘性のため困難であつた。その他本多糖類は無味無臭である。本多糖類の生産菌は土壌より分離したもので
あり、以下のような菌学的性質を有している。なお、菌学的性質に関する実験は、長谷川武
治著「微生物の分類と同定」（1975）と坂崎利
一著「培地学各論(1)」（1967）に従つた。形態学的所見形状直状桿菌大きさ 0.8〜1.2×3.5〜6μｍ多形性あり、時々線維状運動性あり胞子形成あり、内生胞子グラム染色陽性培養的所見肉汁寒天平板培養：生育中程度肉汁寒天斜面培養：生育中程度、円形、半
レンズ状、全縁、平滑、クリーム色、光沢あ
り、粘稠肉汁液体培養：生育中程度肉汁ゼラチン穿刺培養：表面で生育中程
度。20℃では変化しないが、30℃では液化。リトマス・ミルク：わずかに酸を生成、凝
固せずブレイン・ハート・インフユージヨン・ブ
ロス：生育中程度ブレイン・ハート・インフユージヨン寒天
培地：生育中程度ミユラー・ヒントン寒天培地：生育良好生理学的性質硝酸塩の還元：陽性脱膣反応：陰性 MRテスト：陽性 VPテスト：陰性インドールの生成：陰性硫化水素の生成：陰性デンプンの加水分解：陽性クエン酸の利用：陽性無機窒素源の利用硝酸塩：陰性アンモニウム塩の利用：陽性色素の生成：陰性ウレアーゼ：陽性オキシダーゼ：陽性カタラーゼ：陽性生育の範囲温度：15〜45℃、最適25〜37℃ PH：5.3〜8.3 酸素に対する態度：好気性Ｏ−Ｆテスト（Hugh ＆ Leifson法によ
る）：酸を生成しないカゼインのペプトン化：陽性ゼラチンの液化：陽性 DNアーゼ：陽性フオスフアターゼ：微陽性２，３−ブタジオンの分解：陽性アルギニンの脱炭酸：陰性〓〓チロシンの分解：陰性グルコン酸の酸化：陰性〓〓馬尿酸の分解：微陽性〓〓２％NaCl下での生育：陰性炭素の資化性及びそれからの酸及びガスの生
成第１表の通りである。

【表】上記の諸性質に従い、本菌の分類学的地位を
「バージイズ・マニユアル・オブ・デターミネイ
テイブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual
of Determinative Bacteriology）第８版
（1974）」に従つて求めた。すなわち、本菌はグラム陽性の好気性直状桿菌
で運動性を有し、また中央もしくはやや端寄りに
内生胞子を形成することからバチルス
（Bacillus）属に属する菌株であると同定した。
本菌は、バチルス・エスピー・62−５（Bacillus
sp.62−５）〔微工研菌寄第7815号（FERM Ｐ−
7815）として工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託されている。なお、本菌を紫外線、エツクス
線、化学薬剤等を用いて人工的に変異させ、ある
いは自然に変異して得られる変異株であつても本
発明の多糖類を生産する能力を有するものはすべ
て本発明に使用することができる。本多糖類を生産する能力を有する菌株の培養に
使用する培地の炭素源としては、たとえば、シヨ
糖、グルコース、フラクトース、グリセリン、デ
ンプン、麦芽糖、ガラクトース、デキストラン、
トレハロース等が単独または混合して用いられ
る。また、窒素源としては、肉エキス、ペプトン、
酵母エキス、大豆粉等の有機窒素源及びアンモニ
ア、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等が用
いられる。培養は、25〜37℃、培地のPH5.5〜８において、
好気的条件下で通常深部培養で行なわれる。培養
時間は種々の条件によつて異なるが、通常48〜
120時間の範囲で行なわれる。このようにして培養液中に得られた本多糖類の
回収は公知の方法を用いて行うことができる。た
とえば、培養液を適量の水で希釈後、遠心分離、
過等によつて菌体を除去し、メタノール、エタ
ノール、イソプロパノールあるいはアセトン等の
沈澱剤を加え線維状の本多糖類を回収することが
できる。また、本多糖類は酸性物質であるので、菌体を
除いた培養液にセチルピリジニウムクロライド等
を添加して、本多糖類を沈澱させることにより回
収することができる。粗製の本多糖類は公知の多糖類の精製法に従つ
て精製することができる。たとえば、粗製の本多
糖類を水に再溶解し、エタノール等の沈澱剤で再
沈澱を繰り返し凍結乾燥することにより純度の高
い白色綿状の精製された本多糖類が得られる。ま
た、セチルピリジニウムクロライドによる沈澱を
併用して高純度の精製品を得ることもできる。次に、本発明を実施例により詳しく説明する。実施例１シヨ糖２％、ペプトン0.5％、酵母エキス0.5
％、硫酸マグネシウム0.05％、リン酸−カリウム
0.025％、塩化カルシウム0.025％からなる培地を
調製し、121℃、20分間オートクレーブで滅菌し
た。バチルス・エスピー・62−５（FERM Ｐ−
7815）の保存用斜面培養から／白金耳を上記の培
地に接種し、30℃48時間振盪培養を行つた。次
に、その前培養液２mlを上記培地に接種し、30℃
96時間振盪培養を行つた。培養後、培養終了液1.4に対し等量のエタノ
ールと２％の塩化カリウムを加えると白色の線維
状沈澱が得られた。次に、その沈澱を採取し、エ
タノールで数回洗浄した後1.5の水に溶解させ、
再び２％の塩化カリウムを用いて等量のエタノー
ルで沈澱させた。このエタノール沈澱操作を４回
繰り返した後、このようにして得た粗製の本多糖
類を３の水に溶解し、これに２％セチルピリジ
ニウムクロライド水溶液を沈澱が生じなくなるま
で徐々に加え、本多糖類をセチルピリジニウムク
ロライドとの複合体として沈澱させた。この複合
体を水で十分に洗浄して過剰のセチルピリジニウ
ムクロライドを除いた後、1.5の10％塩化ナト
リウム水溶液に対し複合体を溶解した。この溶液
に等量のエタノールを加えて本多糖類を沈澱させ
た。更に、エタノール沈澱を２回繰り返した。得
られた沈澱をエタノールで十分洗浄し減圧乾燥
後、水に溶解させ凍結乾燥を行い精製された本多
糖類7.47ｇ（収率26.7％）を得た。実施例２前記の実施例１と同じ条件で培養した時、培養
終了液の前記Ｂ型粘度計による粘度は約8000cP
（25℃、30rpm；No.４ローター）で、本多糖類の
生産は2.84ｇ・^-1（収率14.2％）であつた。実施例３溶性デンプン３％、グルコース0.6％、ソーヤ
ー・フラワーFT（日清製油社製脱脂大豆粉）2.2
％、酵母エキス0.1％、硫酸マグネシウム0.03％、
リン酸−カリウム0.03％、炭酸カルシウム0.2％
からなる培地を調製し、PH6.6とした後500ml容三
角フラスコに80ml分注して、121℃20分間オート
クレーブで滅菌した。実施例１と同一組成の培地を用いて前培養した
前記生産菌を上記三角フラスコに接種し、培養温
度28℃で108時間振盪培養を行つた。培養終了液
の前記Ｂ型粘度計による粘度は約70000cP（25℃、
6rpm；No.４ローター）であつた。また、この培
養終了液中の本多糖類は5.72ｇ・^-1（収率19.1
％）であつた。実施例４シヨ糖２％、ペプトン0.5％、硫酸マグネシウ
ム0.05％、リン酸−カリウム0.025％、塩化カル
シウム0.025％からなる培地を調製し、PH6.5とし
た後100ml容坂口フラスコに20ml分注し、121℃20
分間オートクレーブで滅菌を行つた。前培養した前記生産菌を上記フラスコに接種
し、培養温度30℃で96時間振盪培養した。培養終
了液のPHは6.0で、前記Ｂ型粘度計による粘度は
約6000cP（25℃、30rpm；No.４ローター）とな
り、本多糖類の生産は2.9ｇ・^-1（収率14.5％）
であつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の多糖類B62−５物質の赤外吸
収スペクトルである。

Claims

【特許請求の範囲】１下記の性質を有する多糖類B62−５物質。構成糖グルコース、マンノース、キシロース、グル
クロン酸を主構成成分とし、その構成比が
2.8：3.8：１：2.1である。赤外吸収スペクトル主な吸収極大波長は次のとおりである。 νmax（KBr）（cm^-1）：3400、2920、1720、
1610 紫外吸収スペクトル特異的な吸収は見られない。塩基性、酸性、中性の別セチルピリジニウムクロライドを添加すると
白色沈澱を生ずるので酸性である。呈色反応モーリツシユ反応、フエノール・硫酸反応、
アンスロン・硫酸反応、カルバゾール・硫酸反
応、オルシン・塩酸反応は陽性で、フエーリン
グ反応、ヨウ素反応、エルソン・モルガン反応
は陰性である。溶解性水に可溶であるが、メタノール、エタノー
ル、イソプロパノール、アセトン等には不溶で
ある。色及び形状精製品は白色綿状又は繊維状である。粘度１％水溶液の粘度は約10000cP｛25℃、
30rpm（No.４ローター）、東京計器製Ｂ型粘度計
による｝である。また、固有粘度は99dl・ｇ^-1
である。元素分析値Ｃ＝38.54％、Ｈ＝5.27％Ｏ＝55.4％、Ｎ＝0.79％、灰分＝痕跡。比旋光度〔α〕²⁰ _D：＋61°〜＋194° （ｃ＝0.01653、水溶液；高粘性のため測定困
難）分子量 TSK−GELトヨパールHW−65F（東洋曹達
製、ゲル濾過担体）を使用して、シヨーデツク
ス・スタンダードＰ−82（昭和電工製、分子量
キヤリブレーシヨン用標準試料）を分子量標準
物質として、ゲル濾過法を行うとき、上記標準
試料中で最大の分子量をもつｐ−800（分子量
8.5×10⁵）よりも分子量が大である。又、超遠心分析法により測定するとき、分子
量は約1.5×10⁶である。融点 225〜230℃で炭化分解する。２バチルス属に属し、下記の性質を有する多糖
類B62−５物質を生産する能力を有する微生物を
培養し、培地中に生成された上記多糖類を採取す
ることを特徴とする多糖類B62−５物質の製造
法。構成糖グルコース、マンノース、キシロース、グル
クロン酸を主構成成分とし、その構成比が
2.8：3.8：１：2.1である。赤外吸収スペクトル主な吸収極大波長は次のとおりである。 νmax（KBr）（cm^-1）：3400、2920、1720、
1610 紫外吸収スペクトル特異的な吸収は見られない。塩基性、酸性、中性の別セチルピリジニウムクロライドを添加すると
白色沈澱を生ずるので酸性である。呈色反応モーリツシユ反応、フエノール・硫酸反応、
アンスロン・硫酸反応、カルバゾール・硫酸反
応、オルシン・塩酸反応は陽性で、フエーリン
グ反応、ヨウ素反応、エルソン・モルガン反応
は陰性である。溶解性水に可溶であるが、メタノール、エタノー
ル、イソプロパノール、アセトン等には不溶で
ある。色及び形状精製品は白色綿状又は線維状である。粘度１％水溶液の粘度は約10000cP｛25℃、
30rpm（No.４ローター）、東京計器製Ｂ型粘度計
による｝である。また、固有粘度は99dl・ｇ^-1
である。元素分析値Ｃ＝38.54％、Ｈ＝5.27％Ｏ＝55.4％、Ｎ＝0.79％、灰分＝痕跡。比旋光度〔α〕²⁰ _D：＋61°〜＋194° （ｃ＝0.01653、水溶液；高粘性のため測定困
難）分子量 TSK−GELトヨパールHW−65F（東洋曹達
製、ゲル濾過担体）を使用して、シヨーデツク
ス・スタンダードＰ−82（昭和電工製、分子量
キヤリブレーシヨン用標準試料）を分子量標準
物質として、ゲル濾過法を行うとき、上記標準
試料中で最大の分子量をもつｐ−800（分子量
8.5×10⁵）よりも分子量が大である。又、超遠心分析法により測定するとき、分子
量は約1.5×10⁶である。融点 225〜230℃で炭化分解する。