JPH0740953B2

JPH0740953B2 - 生理活性多糖ｒｏｎの生産法

Info

Publication number: JPH0740953B2
Application number: JP2022023A
Authority: JP
Inventors: 保雄米田; 久生加戸; 駿竹尾; 優三谷; 信宏渡辺
Original assignee: Sapporo Breweries Ltd
Current assignee: Sapporo Breweries Ltd
Priority date: 1989-02-08
Filing date: 1990-02-02
Publication date: 1995-05-10
Anticipated expiration: 2010-05-10
Also published as: JPH03224494A; DE69021599D1; ES2078253T3; KR900013073A; DE69021599T2; US5565342A; EP0382121B1; EP0382121A1; CA2009193A1

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は優れた抗腫瘍活性，免疫調節活性並びに感染防
御活性を有する生理活性多糖RONを蔗糖から生成する作
用を有する該生理活性多糖RON合成酵素および該酵素を
用いて該生理活性多糖RONを生産する方法に関する。

〔従来の技術〕

本発明に係る生理活性多糖RONおよび米糠から該生理活
性多糖RONを抽出する方法は既に特公昭62−7173号公報
に開示されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記従来法では米糠を原料として生理活性多糖RONを抽
出し、精製するものであるため、原料の品質が不安定で
得られる物質の物性，生理活性等に相当なバラツキがあ
る上に、収率が低く、しかも多くの工程を必要とし、時
間的，経済的な課題があった。

そこで、本発明者らは上記課題を解決すべく検討を重ね
た結果、ロイコノストック属に属する微生物が菌体外に
生理活性多糖RONを蔗糖から合成する酵素、すなわち生
理活性多糖RON合成酵素を生産することを見出し、本酵
素を蔗糖に作用させることによって物理化学的性質や生
理活性の安定した生理活性多糖RONを高い収率で得られ
ることを確認して本発明を完成した。

〔課題を解決するための手段〕

すなわち、本発明は蔗糖に作用して下記の性質を有する
生理活性多糖RONを生成せしめるロイコノストック属に
属する微生物由来の生理活性多糖RON合成酵素および該
酵素を蔗糖に作用させて該生理活性多糖RONを生成せし
めて回収することを特徴とする生理活性多糖RONの生産
法を提供するものである。

（１）性状：白色の無晶性粉末で無味無臭（２）溶解性：水に可溶、濃度を上げると乳白色で粘稠
な溶液となる。ホルムアミド，ジメチルスルホキシドに
可溶、アルコール，アセトン，ベンゼン，酢酸エチル，
ヘキサン，クロロホルム，四塩化炭素に不溶（３）水溶液のpH:中性ないし弱酸性（４）構成糖：グルコースのみ（５）元素分析値:C:44.0〜45.0％,H:6.1〜6.3％（６）構造：α−1,6結合を主鎖としたα−グルカンで
少量の1,3,6位分岐構造を有する。

（７）蛋白質：殆んど含有せず（８）分子量：透析膜を通過せず、分子量１万以上と推
定される。

（９）比旋光度：▲〔α〕²⁵ _D▼＝＋190゜〜＋220゜（ｃ＝0.5,ホルムアミド）（10）呈色反応：アンスロン硫酸反応，フェノール硫酸
反応が陽性、ビウレット反応，ローリー・フォーリン反
応，エルソン・モルガン反応，ヨード反応が陰性（11）融点：明確な融点を示さない。

（12）紫外部吸収スペクトル：特徴的吸収を有さず。

（13）赤外部吸収スペクトル：第２図に示したように、
α−グルカンに特徴的吸収を示す。

（14）¹³C−NMRスペクトル：第３図に示したように、主
シグナルとしてα−1,6グルカンに特徴的スペクトルを
示す。

（15）抗腫瘍作用を有す。

本発明の生理活性多糖RON合成酵素は、以下の方法によ
って製造することができる。

蔗糖に作用して前記の性質を有する生理活性多糖RONを
生成せしめる生理活性多糖RON合成酵素を生産する能力
を有する微生物を培地に培養し、培養物中に該生理活性
多糖RON合成酵素を蓄積せしめ、これを採取する。ここ
で、本酵素を生産する能力を有する微生物としてはロイ
コノストック属に属する微生物がある。具体的には、生
理活性多糖RON生産能を有する微生物としては、米糠等
より分離されたロイコノストック・メセンテロイデス・
サブスピーシーズ・デキストラニカム（Leuconostoc me
senteroides subsp.dextranicum）BL−75株および同46
−１株があり、その菌学的性質は以下の通りである。

BL−75株グラム染色＋形態球〜卵型,0.4〜0.7μｍ３〜４連鎖，クラスター形成カタラーゼ反応 − オキシダーゼ反応 − 遊離酸素要求性通性嫌気性アルギニンの分解 − 乳酸発酵ヘテロ型,D−乳酸炭水化物からの酸産性アラビノース − フラクトース＋ガラクトース＋グルコース＋ラクトース＋マンノース＋トレハロース＋エスクリンの加水分解性＋デキストラン産生＋食塩存在下での生育 3.0％NaCl ＋ 6.5％NaCl − 各種初発pHでの生育 pH 4.8 − pH 6.5 ＋グルコース培地での最終pH 4.3 46−１株グラム染色＋形態球〜卵型,0.4〜0.6μm, ペアおよび短い連鎖カタラーゼ反応 − オキシダーゼ反応 − 遊離酸素要求性通性嫌気性アルギニンの分解 − 乳酸発酵ヘテロ型,D−乳酸炭水化物からの酸産生アラビノース − フラクトース＋ガラクトース＋グルコース＋ラクトース＋マンノース＋トレハロース＋エスクリンの加水分解性＋デキストラン産生＋食塩存在下での生育 3.0％NaCl ＋ 6.5％NaCl − 各種初発pHでの生育 pH 4.8 − pH 6.5 ＋グルコース培地での最終pH 4.1 以上の性状から両菌株の菌学的性質を要約すると次の通
りになる。すなわち、1:グラム染色陽性で通性嫌気性で
ある。2:形態は球〜卵型の連鎖である。3:アラビノース
を除き、炭水化物からの酸産生は陽性である。4:乳酸醗
酵のタイプがヘテロ型であり、産生する乳酸がＤ体のみ
である。5:アルギニン分解反応は陰性である。

BL−75株について「バージェイズ・マニュアル・オブ・
デターミナティブ・バクテリオロジー」第８版（1974
年）（Bergey′s Manual of Determinative Bacteriolo
gy 8th edition）によれば、上記の諸性質より本菌株は
ロイコノストック（Leuconostoc）属に属し、しかもデ
キストラン産生陽性であり、かつアラビノースからの酸
産生が陰性であることおよび6.5％NaCl存在下で発育し
ない点からロイコノストック・デキストラニカム（Leuc
onostoc dextranicum）に属する菌株BL−75株と同定
し、本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所にFERM B
P−2242として寄託した。

その後、ロイコノストック・デキストラニカムの種が名
称変更されたことを知り、新たに見出された46−１株と
ともに、「バージェイズ・マニュアル・オブ・システマ
ティック・バクテリオロジー第２巻」第９版，（1986
年），および「メソッド・イン・マイクロバイオロジ
ー」16巻,147〜178頁（1984年）に従い、再同定し、両
菌株とも、ロイコノストック・メセンテロイデス・サブ
スピーシーズ・デキストラニカム（Leuconostoc mesent
eroides subsp.dextranicum）に属する菌株と同定され
た。従って、BL−75株は、ロイコノストック・メセンテ
ロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカム（Leuc
onostoc mesenteroides subsp.dextranicum）BL−75株
と名称変更し、46−１株は、同46−１株と命名し、工業
技術院微生物工業技術研究所にFERM BP−2670として寄
託されている。

本発明者らは、生理活性多糖RON生産菌の検索をさらに
続けたところ、公知菌株の中に上記BL−75株,46−１株
と同様な生理活性多糖RON合成酵素生産能を有している
菌株を見出した。すなわち、ロイコノストック・メセン
テロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカム NCF
B 517株（FERM BP−2711），同NCFB 531株（FERM BP−2
712），同NCFB 861株（FERM BP−2713），同NCFB 864株
（FERM BP−2714），同NCFB 880株（FERM BP−2715），
同ATCC 1956株，同IFO 3349株などであり、これら菌株
はBL−75株と同様な方法により、生理活性多糖RON合成
酵素を生産することができる。

したがって、ロイコノストック属に属し、生理活性多糖
RON生産能を有する酵素を生産しうる微生物であれば、
本発明による生理活性多糖RONの製造に利用することが
できる。

生理活性多糖RON生産能を有する酵素を生産しうる微生
物を培養する方法は、原則的には一般の微生物の培養方
法に準ずればよいが、ロイコノストック属に属する微生
物は特に酸素を要求しない通性嫌気性菌であることか
ら、通常は液体培地による静置培養あるいは温度分布を
均一にする目的で緩和な条件での撹拌培養が有利であ
る。

培養に用いる培地としては、炭素源として蔗糖が生理活
性多糖RON生産能を有する酵素を生産するために必須で
ある。そのほか上記酵素生産菌が利用できる他の炭素源
や窒素源，無機物等の栄養源を含有する培地であれば合
成培地，半合成培地および天然培地のいずれでも用いる
ことができる。

蔗糖としては粗製品から精製品まで任意に使用でき、た
とえば上白糖，黒糖，糖蜜，廃糖蜜，試薬用サッカロー
ス等のいずれも利用することができる。蔗糖の濃度は高
い程本酵素の生産性を向上させるが、同時に生成する生
理活性多糖RONの濃度が高くなって菌体の除去が困難と
なるので、通常は１〜３％程度が適当である。窒素源と
しては酵母エキス，ペプトン，グルテンミール，大豆
粉，コーンスティープリカー，乾燥酵母，肉エキス，硫
酸アンモニウム，尿素等が使用できる。その他、無機物
としてリン酸塩やマグネシウム，マンガン，鉄，コバル
ト，ナトリウムなどの金属塩等を適宜添加することがで
きる。本酵素の生成にはpHが影響するので、特にリン酸
塩は培地の緩衝能を高めるために１〜３％程度添加する
ことが望ましい。

培養温度は、通常の中温菌の培養温度に準ずればよく、
15〜45℃、好ましくは20〜30℃が適当であり、培養時間
は通常10〜30時間であるが、本酵素の生成が確認された
とき、好ましくは生成が最大に達した後に培養を停止す
ればよい。

本酵素は菌体中にも培地中にも蓄積されるので、培養物
中からの本酵素の回収は、遠心分離等により集めた菌体
から行ってもよいし、菌体を除いた上澄液から行っても
よい。なお、本酵素は培養物自体や上記菌体，上澄液な
どを粗酵素として使用することもできる。本酵素を菌体
から回収する場合、適当な手段、たとえば界面活性剤に
よる抽出や菌体破砕等により本酵素を可溶化後、遠心分
離等の固液分離にて不溶物を除去する。しかし、上澄液
からの回収の方が簡便であるので、通常は上澄液から本
酵素を回収する。

本酵素の精製は、酵素の精製に通常使用される手段、た
とえば有機溶媒沈澱，塩析，各種クロマトグラフィー
（イオン交換，ゲル濾過，疎水クロマト，アフィニティ
クロマト，ハイドロキシアパタイト等），限外濾過など
の単独あるいは組合せにより行うことができるが、限外
濾過による低分子成分（分子量３万以下）の除去だけで
も本酵素は十分に精製される。

次に、本発明の生理活性多糖RON合成酵素の性質を示
す。なお、本酵素の標品としては後記実施例１で得られ
た酵素を用いた。また、酵素力価の測定は以下の方法に
より実施した。

酵素力価の測定：生理活性多糖RONの生成と同時に遊離
された果糖の量を測定して求める。

あらかじめ30℃に温めた蔗糖（60％w/v），酢酸緩衝液
（0.3M,pH5.5）からなる反応試液に、同じく30℃に温め
た酵素液（0.5〜1U/ml）を反応試液の５等量加え、よく
かきまぜて30℃で30分間反応させる。この反応液に、反
応液の４等量の40mM水酸化ナトリウム溶液を加えて反応
を停止させる。この反応停止液を適当に希釈し、ソモジ
ー法（Somogyi法,M.Somogyi:J.Biol.Chem.,160,61（194
5））により還元糖を果糖として定量する。対照として
蔗糖を加えないで同様に処理した酵素反応停止液中の還
元糖を果糖として定量し、補正を行う。求めた果糖量か
ら反応に関与した蔗糖量を求める。生理活性多糖RON合
成酵素の力価は、上記の条件で１分間に１μmoleの蔗糖
を生理活性多糖RONに転換させる（１μmoleの果糖を生
成する）酵素量を１単位として表示する。

酵素の性質：（ａ）作用１モルの蔗糖を分解し、１モルの果糖を生成すると同時
に受容体となる多糖RONにグルコース部分を転移する。

（ｂ）至適pH 各pHにおける相対活性を30℃で求めたところ、本酵素の
至適pHは5.5付近であった。

（ｃ）安定pH範囲各pHにおける相対残存活性を25℃,18時間で測定したと
ころ本酵素はpH4.5〜7.0の緩衝液中で安定であった。

また、本酵素はpH5.5の溶液でトルエン飽和した場合、
冷蔵（４〜６℃）で２ヶ月間は安定である。

（ｄ）基質特異性グルコース，果糖，麦芽糖，イソ麦芽糖からの生理活性
多糖RONの生成は認められず、蔗糖とのみ反応して生理
活性多糖RONを生成する。

（ｅ）至適温度酵素力価測定の方法において、温度だけを変化させて酵
素の力価を測定したところ、水酵素の至適温度は40℃付
近にあることが明らかとなった。

（ｆ）安定温度範囲各温度における相対残存活性を求めたところ、水酵素は
40℃以下の温度で安定であった。

（ｇ）阻害および活性化各金属塩化物1mM添加時の相対活性を表１に示した。

表１金属塩相対活性（％）無添加 100 MgCl₂ 78 CaCl₂ 110 MnCl₂ 75 FeCl₂ 103 FeCl₃ 82 CoCl₂ 95 NiCl₂ 98 CuCl₂ 50 ZnCl₂ 93 表から明らかなとおり、本酵素はCa塩によって若干活性
化され、Cu塩によって阻害される。

本酵素はゲル濾過を行った場合、排除限界分子量1000万
のカラム（トヨパール HW−75で排除限界で溶出され
る。しかし、同時に生理活性多糖RONも溶出することか
ら、本酵素は生理活性多糖RONとの親和力が強く、これ
と結合していると思われる。多糖RONと分離すると、本
酵素の活性が不安定になることが認められる。

本酵素は蔗糖を分解し生理活性多糖RONを生成する作用
を有する。よって、本酵素を使用することによって生理
活性多糖RONの製造が可能である。

また、酵素液は生理活性多糖RON生産菌の培養上澄程度
の純度であっても、生理活性多糖RON生成後の精製操作
によって十分に生理活性多糖RONの純度を上げることが
できる。原料となる蔗糖は、純度が高いほど生理活性多
糖の精製操作に有利であるが、実用上は市販の白糖で十
分である。反応液中の蔗糖濃度は高いほど生成される生
理活性多糖RONの量は増えるが、反応に要する時間が長
くなるので、通常は５〜30％、好ましくは10〜20％の範
囲で反応を行う。

また、反応液中の酵素濃度についても高いほど反応に要
する時間が短かくなるが、蔗糖濃度が同じ場合は生成さ
れる生理活性多糖RONの量は変らないので、通常は0.2〜
2U/ml、好ましくは0.5〜1U/mlの範囲で反応を行う。

反応液のpHは酵素の安定pH範囲であればよいが、酵素の
至適pHで行うのが最も効率がよいので、pH5.5付近にす
るのが望ましい。また、酵素反応によってpHは変化しな
いが、リン酸緩衝液あるいは酢酸緩衝液などを使うと、
反応液のpH調整を容易に行うことができる。

反応温度は酵素の安定温度範囲であればよいが、酵素反
応は温度が高いほど効率が良いので、30℃付近にするの
が望ましい。

反応時間は蔗糖の濃度，酵素の濃度，反応温度，反応液
のpH等によって変わってくるが、たとえば、蔗糖濃度10
％（292mM），酵素濃度1U/mlとして反応させると、反応
時間は６〜７時間とするのが望ましい。

反応後、生成した生理活性多糖RONは水に可溶な極性有
機溶媒による有機溶媒沈澱で精製することができる。こ
こで有機溶媒としてはメタノール，エタノール，アセト
ン等の多糖の精製によく使われるものが用いられる。反
応液に添加する有機溶媒は生理活性多糖RONが沈澱する
まで添加すれば良いが、反応液中の不純物、例えば蔗
糖，果糖，緩衝剤などのまき込みを防ぐため、通常は最
終濃度40〜60％，好ましくは43〜48％程度となるように
撹拌しながら注意深く添加するのが望ましい。生じた沈
澱は濾過，遠心分離などによっても回収できるが、傾斜
濾過による回収が簡便である。一般に、１回の溶媒沈澱
では不純物をまき込んで純度が上らないことが多いの
で、必要に応じてこの操作を数回くり返すことが望まし
い。この様にして精製し、沈澱として回収した生理活性
多糖RONは再び水に溶解し、凍結乾燥，噴霧乾燥あるい
は極性有機溶媒中に徐々に添加し脱水された状態にした
後、減圧乾燥することによって、白色の粉末として回収
することができる。また、多糖RONは該多糖RON合成酵素
を利用したバイオリアクターによってさらに効率よく製
造することができる。

本発明の生理活性多糖RONの製造は、力価の定まった酵
素を使うことができるから、生理活性多糖RONの調製を
常に一定の最適条件下で行うことが可能である。したが
って、短時間で均一な品質の製品を得ることができる。
また、生理活性多糖RON生産菌を直接生理活性多糖RONの
生産に利用しないから、原料の蔗糖が菌の生育に消費さ
れることがない。したがって、本発明の方法は原料の利
用効率が良い。さらに、酵素によって生成された生理活
性多糖RONは分解を受ける恐れもない。したがって、収
量も発酵生産の場合よりも高い等の利点がある。

このようにして得られた生理活性多糖RONの性質を示
す。

（１）性状：白色の無晶性粉末で無味無臭（２）溶解性：水に可溶、濃度を上げると乳白色で粘
稠な溶液となり、ホルムアミド，ジメチルスルホキシド
に可溶、アルコール，アセトン，ベンゼン，酢酸エチ
ル，ヘキサン，クロロホルム，四塩化炭素に不溶（３）水溶液のpH:中性ないし弱酸性（４）構成糖：グルコースのみ（５）元素分析値:C:44.0〜45.0％,H:6.1〜6.3％（６）構造：α−1,6結合を主鎖としたα−グルカン
で少量の1,3,6位分岐構造を有する。

（７）蛋白質：殆んど含有せず（８）分子量：透析膜を通過せず、分子量１万以上と
推定され、後述の実施例２により製造された生理活性多
糖RONはセファロース2Bゲル濾過法による測定よると
分子量2000万以上と推定された。

（９）比旋光度：▲〔α〕²⁵ _D▼＝＋190゜〜＋220゜（ｃ＝0.5,ホルムアミド）（10）呈色反応：アンスロン硫酸反応，フェノール硫
酸反応が陽性、ビウレット反応，ローリー・フォーリン
反応，エルソン・モルガン反応，ヨード反応が陰性（11）融点：明確な融点を示さない。

（12）第１図のような紫外部吸収スペクトルの如く、
特徴的吸収を有さず。

（13）第２図のような赤外部吸収スペクトルの如く、
α−グルカンに特徴的吸収を示す。

（14）第３図のような¹³C−NMRスペクトルの如く、主
シグナルとしてα−1,6グルカンに特徴的スペクトルを
示す。

（15）抗腫瘍作用を有す。

本発明により得られる生理活性多糖RONは抗腫瘍活性，
免疫調節活性，感染防御活性等の種々の生理活性を有し
ていることが判明した。以下にそれぞれの生理活性につ
いてその検定法および後述する実施例２で得られた生理
活性多糖RON（以下、RONと略記する場合がある、）を投
与した実験での検定結果について詳述する。

（１）抗腫瘍活性について（イ）同系腫瘍メス−Ａに対する生理活性多糖RONの腹
腔投与の効果６週令メス，平均体重20gのBALB/C−CRJマウスに１週
間、同系のマウスの腹腔内で継代した癌細胞メス−Ａを
マウス１匹当り１×10⁵個を腹腔内に移植し、対照群20
匹（１群），試験群各10匹（３群）の計４群に分けた。
癌細胞を移植した翌日から連続５日間、試験群には生理
食塩水に溶解したRONをマウス１匹の体重1kg当り各10,3
0,100mgを0.1mlずつ腹腔内に投与し、対照群には同様に
して生理食塩水のみを投与した。以後、生存日数を観察
し、延命効果を次式により算出した。

（ロ）同系腫瘍メス−Ａに対する生理活性多糖RONの経
口投与の効果６週令メス，平均体重20gのBALB/C−CRJマウスに１週
間、同系のマウスの腹腔内で継代した癌細胞メス−Ａを
マウス１匹当り６×10⁴個を右液下皮下に移植し、対照
群20匹（１群），試験群各10匹（３群）の計４群に分け
た。癌細胞を移植した翌日から連続10日間、試験群には
生理食塩水に溶解したRONをマウス１匹の体重1kg当り各
10,30,100mgを0.2mlずつ経口ゾンデを用いて胃内に投与
し、対照群には同様にして生理食塩水のみを投与した。
癌細胞を移植してから35日後に各マウスを屠殺し、増殖
した腫瘍を切り出し重量を測定した。なお、阻止率は次
式により算出した。

上記（イ），（ロ）の方法により検定したRONの抗腫瘍
効果は下表の通りであった。

上表より明らかなように腹腔投与，経口投与ともに30mg
/kg付近を至適投与量としてRONは強い抗腫瘍活性を有し
ていることが判明した。

その他にRONは同系腫瘍ルイス肺癌，メラノーマＢ−16,
同種腫瘍ザルコーマ180,エールリッヒ腫瘍等に対し、投
与量10〜100mg/kgの範囲で腹腔投与または経口投与によ
り腫瘍阻止率30〜70％の効果が確認されている。また、
RONを適当なプライマーと組合わせてマウスに投与する
と、その血清中にＬ−929細胞に対する細胞傷害活性や
メス−Ａ固形腫瘍に対する壊死作用を誘導し、また担癌
マウスの生体内にも腫瘍壊死因子を自己誘導することが
確認された。したがって、RONは後述するように毒性が
全くみられない点とも合わせて極めて有効な抗腫瘍剤と
なりうると考えられる。

（２）免疫調節活性について（イ）カーボンクリアランステスト（CCT）本法は免疫調節作用のうち細網内皮系の亢進作用につい
て調べる方法である。

４週令メス，平均体重20gのICR−CRJマウス１群６匹
に、生理食塩水に溶解したRONを２日間腹腔投与し（対
照群は生理食塩水のみを投与）、３日目にカーボン液
（ペリカン製黒インク，商品名：ファウントインディ
アを生理食塩水で５倍に希釈した液）をマウス尾静脈よ
り0.25ml注入し、注入直後および10分後に眼窩静脈叢よ
り0.025ml採血し、3.5mlの0.01モル炭酸ナトリウム溶液
に懸濁溶解させ、650nmにて吸光度（OD₆₅₀）を測定し、
血中カーボン濃度の減少率を調べた。効果は次式に示す
貪食係数で表わした。

※T₁時におけるOD₆₅₀をC₁,T₂時におけるOD₆₅₀をC₂とす
る。

なお、担癌マウスについてはRONの投与開始より７日前
にザルコーマ180細胞を１×10⁷個大腿部筋肉に移植し、
以下同様に試験した。結果は下表の通りであり、正常マ
ウス，担癌マウスともにRONの10〜30mg/kg、特に30mg/k
gの投与によりマウスの細網内皮系の機能が亢進してい
ることが判明した。

（ロ）プラークフォーミングセル法（PFC）本法は免疫調節作用のうち、宿主のＢ細胞の賦活による
抗体産生能の増強効果を調べるものである。

４週令メス，平均体重20gのICR−CRJマウス１群６匹
に、生理食塩水に溶解したRONを３日間連続して腹腔内
に投与し（対照群は生理食塩水のみを投与）、４日目と
11日目にそれぞれ羊赤血球４×10⁶個を尾静脈より注入
感作せしめ、その４日後にカニンガムの方法でマウス脾
細胞のプラーク形成能を測定した。

結果は下表の通りであり、RONは10〜100mg/kgの投与に
より抗体産生能を著しく増強していることが示された。

（ハ）遅延型皮膚反応法（DHR）本法は免疫調節作用のうち宿主のＴ細胞の賦活による細
胞性免疫の作用の増強効果を調べるものである。

８週令メス，平均体重27gのICR−CRJマウス１群６匹
に、生理食塩水に溶解したRONを８日間連続して経口投
与し（対照群は生理食塩水のみを投与）、投薬開始後４
日目にマウスの剃毛腹部に５％塩化ピクリルエタノール
溶液を塗布して一次感作し、11日目に１％ピクリルオリ
ーブ油溶液をマウス両耳の表裏に塗布して二次感作し、
その24時間後に耳厚の増加をゲージで測定し、塗布前の
耳厚との差から耳厚の増加量をみた。一方、担癌マウス
についてはザルコーマ180腹水型腫瘍細胞を１×10⁵個を
投薬開始前日にマウス腹腔内に移植し、以下同様に試験
した。

結果は下表の通りであり、RONは試験した30〜500mg/kg
の経口投与により、正常マウス、担癌マウスともに細胞
性免疫能を著しく増強していることが示された。

以上、（イ），（ロ），（ハ）の各免疫実験により生理
活性多糖RONはメカニズムの異なる免疫作用をそれぞれ
顕著に亢進させていることがわかった。免疫調節剤は一
般には生体の免疫機能が低下したり、異種抗原認識機能
が弱い場合などに使用され得ることから、特に微生物感
染症や悪性腫瘍の治療剤，治療補強剤または併用剤，予
防剤あるいは術後回復促進剤としての薬剤用途が期待さ
れる。以上の免疫賦活回復機能の他にも、免疫調節剤は
異常に亢進した生体免疫反応を正常化し、たとえばリウ
マチ，膠原病，アレルギー等の自己免疫疾患にも適用で
きる場合が考えられる。

（３）感染防御活性について一般には生体はこれら異種細菌の侵入に対しては充分な
防御作用を持っているが、担癌状態、特に癌の末期には
著しく防御作用が低下することが知られており、通常宿
主と共生している非病原菌によってさえ重篤な結果を招
来することが知られている。

そこで、生理活性多糖RONがこれらの細菌の感染症に対
して宿主の防御活性を増強するかどうかをエシェリヒア
・コリ（Escherichia coli）およびリステリア・モノサ
イトゲネス（Listeria monocytogenes）感染に対するRO
Nの効果で調べた。

７週令メス，平均体重26gのICR−CRJマウスを１群20匹
ずつ用い、生理食塩水に溶解したRONを10〜100mg/kg
（対照群は生理食塩水のみ）マウスの背中皮下に細菌感
染１日前，一日後に各１回投与した。エシェリヒア・コ
リの場合は２×10⁷個を背中皮下に、リステリア・モノ
サイトゲネスの場合は２×10⁷個を腹腔内に感染させ、
それぞれ１週間観察して、生残マウス数を比較した。防
御効果は次式により算出した。

結果は下表の通りであり、RONの10〜100mg/kgの事前投
与により、エシェリヒア・コリ感染に対しては非常に強
い防御作用が生じ、リステリア・モノサイトゲネス感染
に対しても有意な防御作用の増強効果がみられた。ま
た、感染後投与の場合でも両感染菌に対して有意な治療
効果を示した。

後述するように、生理活性多糖RONは毒性が全く見られ
ない点とも合わせて、極めて有効な感染症予防治療剤と
なりうると考えられる。

次に、生理活性多糖RONの急性毒性について言及する。
５週令オスのSD−CRJラット，体重120〜150g,1群10匹を
用いてRONの物理的投与限界である15g/kgを経口投与し
観察を続けたところ、全例死亡例がなく体重増加も対照
と変わらず、しかも外観上や剖検上も全く異常が認めら
れなかった。したがって、LD₅₀＞15g/kgと考えられ、急
性毒性はないものと判断される。

さらに、RONはマウスの脾臓細胞由来のナチュラルキラ
ー細胞の傷害活性を増強したり、マウスの腹腔常存性マ
クロファージのＬ−929細胞に対する傷害活性を賦活す
る作用を有している。また、広汎な免疫賦活活性を有
し、かつインターフェロンなどのサイトカイン生産能が
みられることからヘルペス，インフルエンザ，エイズ等
のウィルス性疾患に対する発症予防治療効果が期待でき
るほか、慢性肝炎等の肝炎・肝疾患に対する予防・治療
剤としても有用であると考えられる。

したがって、RONは経口的または非経口的に投与できる
ので、極めて有用な抗腫瘍剤，免疫調節剤あるいは感染
症予防治療剤として期待される。

なお、実際の製剤化についてはRONは賦形剤（水，生理
食塩水，ポリエチレングリコール，グリセロール，ゼラ
チン，澱粉，デキストリン，乳糖など）と組み合わせて
水剤，丸剤，錠剤，散剤，坐剤などの剤型にて製造する
ことができる。

さらに、生理活性多糖RONは医薬品用途のほか、毒性が
認められないこと，経口投与で健康維持に有用な種々の
生理活性機能を有すること，無味無臭で加工し易いこと
等から疾病予防用または保健用途の飲食品，飲食品添加
物等として使用することもできる。

一方、後述の実施例２により製造された本発明の生理活
性多糖RONは分子量2,000万以上の高分子であるが、酸加
水分解等によって一定限度まで低分子化したものも元の
生理活性多糖RONと同程度の生理活性を有することを見
出した。すなわち、本物質を0.5〜５％、好ましくは１
〜３％の硫酸−ギ酸溶液中で30〜70℃、好ましくは50〜
60℃で２〜24時間、好ましくは３〜６時間加水分解し、
分解液に炭酸バリウムを加えて中和し遠心分離にて上澄
液を得、濃縮後セファロースCL−2B，セファデックス
Ｇ−200等のカラムにてゲル濾過を行ない、分子量に
応じた数画分を得てそれぞれの画分について生物活性を
測定したところ、分子量約１万以上の画分には元の生理
活性多糖RONと同程度の活性があることが判明した。

〔実施例〕

次に本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。

実施例１ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシー
ズ・デキストラニカム（Leuconostoc mesenteroides su
bsp.dextranicum）BL−75株（FERM BP−2242）の穿刺培
養から5mlの前培養培地（蔗糖２％，酵母エキス0.5％，
トリプトン0.25％，リン酸水素二カリウム0.5％,pH7.
4）に接種し、25℃で24時間静置培養した。この培養液
を200mlの本培養培地（蔗糖２％，酵母エキス0.5％，リ
ン酸水素二カリウム２％，硫酸マグネシウム0.02％，塩
化ナトリウム0.001％，硫酸第一鉄0.001％，硫酸マンガ
ン0.001％,pH7.4）に加え、25℃で17時間静置培養し
た。

得られた培養物を遠心分離（10,000G、15分間）して上
澄液を得た。上澄液中の酵素活性は0.74U/ml,液量は180
mlであった。この上澄液を限外濾過膜（アミコン・ホロ
ーファイバー，分画分子量１万）で濃縮し、さらに5m
M酢酸緩衝液pH5.5と置換した。これにトルエンを飽和
し、最終的に2U/mlの酵素液80mlを得た。

実施例２実施例１で得られた酵素液10ml（20U）を30mlの10％蔗
糖を含む50mM酢酸緩衝液pH5.5に添加，撹拌した後、30
℃で反応させた。反応終了時間は酵素量と蔗糖から7.3
時間と計算できるので、９時間で反応を終了させた。反
応終了は、この反応液に33mlのメタノール（最終濃度45
％）を撹拌しながら徐々に添加し、生理活性多糖RONを
沈澱させることで行った。生理活性多糖RONの精製はさ
らに再度メタノール沈澱を行った。沈澱物は水に溶解
後、凍結乾燥を行った。その結果、白色の粉末として1.
20gの生理活性多糖RONを得た（理論収率の85％）。

実施例３実施例１で得られた酵素液5ml（10U）を、15mlの20％蔗
糖を含む50mM酢酸緩衝液pH5.5に添加し，撹拌後30℃で
反応させた。反応時間は18時間とした。この反応液に16
mlのメタノール（最終濃度45％）を撹拌しながら徐々に
添加し、生理活性多糖RONを沈澱させた。さらに再度同
様にメタノール沈澱を行って、生理活性多糖RONを精製
し、水に溶解して凍結乾燥を行った。その結果、白色の
粉末として1.16gの生理活性多糖RONを得た（理論収率の
82％）。

実施例４実施例１で用いた前培養培地の培養液10mlをさらに前培
養培地500mlに添加し25℃で24時間静置培養した。これ
を本培養培地25の入った30容ジャーファーメンター
に添加し、ゆるやかに撹拌して25℃で20時間本培養を行
った。得られた培養物を連続遠心分離機で遠心分離して
（13,000G、流速60／時間）、0.7U/mlの粗酵素液20
を得た。

実施例５実施例４で得られた粗酵素液５（3500U）を蔗糖500g
を撹拌しながら溶かし込み、30℃で17時間反応させた。
反応後、４のメタノール（最終濃度45％）を撹拌しな
がら徐々に添加し、生理活性多糖RONを沈澱させた。こ
の沈澱物を再度メタノール沈澱を行い精製した。これを
水に溶解し噴霧乾燥することにより、白色粉末として生
理活性多糖RON174gを得た（理論収率の74％）。

実施例６実施例１においてロイコノストック・メセンテロイデス
・サブスピーシーズ・デキストラニカムBL−75株（FERM
BP−2242）の代わりにロイコノストック・メセンテロ
イデス・サブスピーシーズ・デキストラニカム46−１株
（FERM BP−2670）に変えたこと以外は同様の操作を行
い、2U/mlの酵素液70mlを得た。

実施例７実施例１において、ロイコノストック・メセンテロイデ
ス・サブスピーシーズ・デキストラニカムBL−75株（FE
RM BP−2242）の代わりにロイコノストック・メセンテ
ロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカムNCFB 5
17株（FERM BP−2711）に変えたこと以外は同様の操作
を行い、2U/mlの酵素液30mlを得た。

実施例８実施例１において、ロイコノストック・メセンテロイデ
ス・サブスピーシーズ・デキストラニカムBL−75株（FE
RM BP−2242）の代わりにロイコノストック・メセンテ
ロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカムNCFB 5
31株（FERM BP−2712）に変えたこと以外は同様の操作
を行い、2U/mlの酵素液45mlを得た。

実施例９実施例１において、ロイコノストック・メセンテロイデ
ス・サブスピーシーズ・デキストラニカムBL−75株（FE
RM BP−2242）の代わりにロイコノストック・メセンテ
ロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカムATCC 1
956株に変えたこと以外は同様の操作を行い、2U/mlの酵
素液50mlを得た。

実施例10 実施例１において、ロイコノストック・メセンテロイデ
ス・サブスピーシーズ・デキストラニカムBL−75株（FE
RM BP−2242）の代わりにロイコノストック・メセンテ
ロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカムNCFB 8
61株（FERM BP−2713）に変えたこと以外は同様の操作
を行い、2U/mlの酵素液30mlを得た。

実施例11 実施例１において、ロイコノストック・メセンテロイデ
ス・サブスピーシーズ・デキストラニカムBL−75株（FE
RM BP−2242）の代わりにロイコノストック・メセンテ
ロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカムNCFB 8
64株（FERM BP−2714）に変えたこと以外は同様の操作
を行い、2U/mlの酵素液30mlを得た。

実施例12 実施例１において、ロイコノストック・メセンテロイデ
ス・サブスピーシーズ・デキストラニカムBL−75株（FE
RM BP−2242）の代わりにロイコノストック・メセンテ
ロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカムIFO 33
49株に変えたこと以外は同様の操作を行い、2U/mlの酵
素液50mlを得た。

実施例13 実施例６で得られた酵素液を用いて実施例２と同様の操
作を行い1.18gの生理活性多糖RONを得た。

実施例14 実施例７で得られた酵素液の２倍希釈液を用いて実施例
２と同様の操作を行い1.20gの生理活性多糖RONを得た。

実施例15 実施例８で得られた酵素液を用いて実施例２と同様の操
作を行い1.17gの生理活性多糖RONを得た。

実施例16 実施例９で得られた酵素液を用いて実施例２と同様の操
作を行い1.18gの生理活性多糖RONを得た。

実施例17 実施例10で得られた酵素液を用いて実施例２と同様の操
作を行い1.10gの生理活性多糖RONを得た。

実施例18 実施例11で得られた酵素液を用いて実施例２と同様の操
作を行い1.13gの生理活性多糖RONを得た。

実施例19 実施例12で得られた酵素液を用いて実施例２と同様の操
作を行い1.21gの生理活性多糖RONを得た。

実施例20 実施例２で製造した生理活性多糖RONの白色粉末1gに２
％の硫酸−ギ酸混液100mlを加え、60℃で４時間加水分
解を行なった。分解液に炭酸バリウムを加えて中和し、
遠心分離にて上澄液を得、この半量をセファロースCL−
2Bのカラムにかけてゲル濾過を行ない、ボイドボリュ
ームに溶出する画分F₁（分子量2000万以上）、中間分子
量約100万の画分F₂を得た。また、残り半量をセファデ
ックスＧ−20にかけ中間分子量約10万、約１万の画分
F₃,F₄を得た。それぞれの画分を凍結乾燥してF₁:200m
g、F₂:160mg、F₃:150mg、F₄:120mgの白色粉末を得た。

このようにして得られた各画分の生物活性について以下
に示す。

（１）抗腫瘍活性について同系腫瘍メス−Ａに対する投与量30mg/kg、経口投与で
の効果は次表の通りであった。

（２）免疫調節活性について（イ）カーボンクリアランステスト（CCT）担癌マウスを用い、投与量30mg/kg、腹腔投与での効果
は次表の通りであった。

（ロ）プラークフォーミングセル（PFC）正常マウスを用い、投与量30mg/kg、腹腔投与で４日目
に羊赤血球で感作した場合の結果は次表の通りであっ
た。

（ハ）遅延型皮膚反応（DHR）担癌マウスを用い、投与量30mg/kg、腹腔投与での効果
は次表の通りであった。

（３）感染防御活性について感染１日前に30mg/kgを皮下投与した場合の防御活性は
次表に示す通りであった。

また、感染１日後に30mg/kgを皮下投与した場合の防御
活性は次表に示す通りであった。

以上の結果から、本発明の生理活性多糖RONは加水分解
により分子量約１万程度まで小さくしても各種生物活性
はもとの物理活性多糖RONと同程度に維持されているこ
とが判明した。

一方、低分子化した生理活性多糖RONの毒性についてマ
ウスを用いて調べたところ、経口投与による急性毒性は
いずれの画分にも元の生理活性多糖RONと同様認められ
ず、静脈内注射した場合は、元の生理活性多糖RONがLD
₅₀:300mg/kgであったのに対し、分子量が小さくなるに
従い毒性が減少し、分子量約１万のF₄画分はLD₅₀＞1g/k
gであり、毒性は認められなかった。

このように低分子化された生理活性多糖RONが毒性もな
く、各種生物活性を有することは、例えば注射剤として
本物質を利用するとき、大変有利な性質と考えられる。

〔発明の効果〕

生理活性多糖RONは従来、天然物からの抽出により得ら
れていたが、本発明の生理活性多糖RON合成酵素は、蔗
糖から生理活性多糖RONを生成する作用を有する。ま
た、本発明の生理活性多糖RONの製造方法は、この酵素
を利用する方法である。したがって、蔗糖を原料とし力
価の定まった本酵素を使用することにより、常に一定の
最適条件下で生理活性多糖RONの製造を行うことが可能
である。このことにより、製品の品質を均一に出来る。
しかも、精製も簡単であるため、収量も高い。

生物活性の面からも抗腫瘍活性，免疫調節活性および感
染防御活性ともに従来の製法での最も活性の高いものに
匹敵する活性をもつ生理活性多糖RONを安定して製造で
きるようになり、量的，質的にみて大幅な改良が見られ
産業上大変有利である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明で得られた生理活性多糖RONの紫外線吸
収スペクトル，第２図は同物質の赤外線吸収スペクト
ル，第３図は同物質の¹³C−核磁気共鳴スペクトルであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者三谷優静岡県焼津市岡当目10番地サッポロビール株式会社医薬開発研究所内 (72)発明者渡辺信宏静岡県焼津市岡当目10番地サッポロビール株式会社医薬開発研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ロイコノストック属に属する微生物に由来
し、下記の性質を有する生理活性多糖RONを合成する酵
素を蔗糖に作用させて該生理活性多糖RONを生成せしめ
て回収することを特徴とする生理活性多糖RONの生産
法。（１）性状：白色の無晶性粉末で無味無臭（２）溶解性：水に可溶、濃度を上げると乳白色で粘稠
な溶液となる。ホルムアミド，ジメチルスルホキシドに
可溶、アルコール，アセトン，ベンゼン，酢酸エチル，
ヘキサン，クロロホルム，四塩化炭素に不溶（３）水溶液のpH:中性ないし弱酸性（４）構成糖：グルコースのみ（５）元素分析値:C:44.0〜45.0％,H:6.1〜6.3％（６）構造：α−1,6結合を主鎖としたα−グルカンで
少量の1,3,6位分岐構造を有する。（７）蛋白質：殆んど含有せず（８）分子量：透析膜を通過せず、分子量１万以上と推
定される。（９）比旋光度：▲〔α〕²⁵ _D▼＝＋190゜〜＋220゜（ｃ＝0.5,ホルムアミド）（10）呈色反応：アンスロン硫酸反応，フェノール硫酸
反応が陽性、ビウレット反応，ローリー・フォーリン反
応，エルソン・モルガン反応，ヨード反応が陰性（11）融点：明確な融点を示さない。（12）紫外部吸収スペクトル：特徴的吸収を有さず。（13）赤外部吸収スペクトル：第２図のような、α−グ
ルカンに特徴的吸収を示す。（14）¹³C−NMRスペクトル：第３図のような、主シグナ
ルとしてα−1,6グルカンに特徴的スペクトルを示す。（15）抗腫瘍作用を有す。
【請求項２】ロイコノストック属に属する微生物がロイ
コノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・
デキストラニカムBL−75株（FERM BP−2242），同NCFB
517株（FERM BP−2711），同NCFB 531株（FERM BP−271
2），同NCFB 861株（FERM BP−2713），同NCFB 864株
（FERM BP−2714），同NCFB 880株（FERM BP−2715），
同46−１株（FERM BP−2670），同ATCC 1956株，同IFO
3349株およびそれらの変異株からなる群から選ばれる１
種の微生物である請求項１記載の生産法。
【請求項３】ロイコノストック属に属する微生物がロイ
コノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・
デキストラニカムBL−75株（FERM BP−2242）または同4
6−１株（FERM BP−2670）である請求項１記載の生産
法。
【請求項４】ロイコノストック属に属する微生物由来の
生理活性多糖RON合成酵素が、下記の性質を有するもの
である請求項１記載の生産法。（ａ）作用:1モルの蔗糖を分解し、１モルの果糖を生
成すると同時に受容体となる多糖RONにグルコース部分
を転移する。（ｂ）至適pH:5.5付近（ｃ）安定pH:4.5〜7.0 （ｄ）基質特異性：グルコース，果糖，麦芽糖，イソ
麦芽糖からは多糖RONの生成は認められず、蔗糖とのみ
反応して多糖RONを生成する。（ｅ）至適温度:40℃付近（ｆ）安定温度範囲:40℃以下で安定
【請求項５】蔗糖に作用して下記の性質を有する生理活
性多糖RON （１）性状：白色の無晶性粉末で無味無臭（２）溶解性：水に可溶、濃度を上げると乳白色で粘
稠な溶液となる。ホルムアミド，ジメチルスルホキシド
に可溶、アルコール，アセトン，ベンゼン，酢酸エチ
ル，ヘキサン，クロロホルム，四塩化炭素に不溶（３）水溶液のpH:中性ないし弱酸性（４）構成糖：グルコースのみ（５）元素分析値:C:44.0〜45.0％,H:6.1〜6.3％（６）構造：α−1,6結合を主鎖としたα−グルカン
で少量の1,3,6位分岐構造を有する。（７）蛋白質：殆んど含有せず（８）分子量：透析膜を通過せず、分子量１万以上と
推定される。（９）比旋光度：▲〔α〕²⁵ _D▼＝＋190゜〜＋220゜（ｃ＝0.5,ホルムアミド）（10）呈色反応：アンスロン硫酸反応，フェノール硫酸
反応が陽性、ビウレット反応，ローリー・フォーリン反
応，エルソン・モルガン反応，ヨード反応が陰性（11）融点：明確な融点を示さない。（12）紫外部吸収スペクトル：特徴的吸収を有さず。（13）赤外部吸収スペクトル：第２図のような、α−グ
ルカンに特徴的吸収を示す。（14）¹³C−NMRスペクトル：第３図のような、主シグナ
ルとしてα−1,6グルカンに特徴的スペクトルを示す。（15）抗腫瘍作用を有す。を生成せしめる下記の理化学的性質を有する生理活性多
糖RON合成酵素。（ａ）作用:1モルの蔗糖を分解し、１モルの果糖を生
成すると同時に受容体となる多糖RONにグルコース部分
を転移する。（ｂ）至適pH:5.5付近（ｃ）安定pH:4.5〜7.0 （ｄ）基質特異性：グルコース，果糖，麦芽糖，イソ
麦芽糖からは多糖RONの生成は認められず、蔗糖とのみ
反応して多糖RONを生成する。（ｅ）至適温度:40℃付近（ｆ）安定温度範囲:40℃以下で安定
【請求項６】酵素が、ロイコノストック属に属する該生
理活性多糖RON生産能を有する微生物に由来するもので
ある請求項５記載の生理活性多糖RONの合成酵素。
【請求項７】ロイコノストック属に属する生理活性多糖
RON生産能を有する微生物がロイコノストック・メセン
テロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカムBL−
75株（FERM BP−2242），同NCFB 517株（FERM BP−271
1），同NCFB 531株（FERM BP−2712），同NCFB 861株
（FERM BP−2713），同NCFB 864株（FERM BP−2714），
同NCFB 880株（FERM BP−2715），同46−１株（FERM BP
−2670），同ATCC 1956株，同IFO 3349株およびそれら
の変異株からなる群から選ばれる１種の微生物である請
求項６記載の生理活性多糖RONの合成酵素。
【請求項８】ロイコノストック属に属する生理活性多糖
RON生産能を有する微生物がロイコノストック・メセン
テロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカムBL−
75株（FERM BP−2242）または同46−１株（FERM BP−26
70）である請求項６記載の生理活性多糖RON合成酵素。