JPH03224498A - 胆汁酸の高感度定量法および定量用組成物 - Google Patents
胆汁酸の高感度定量法および定量用組成物Info
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- JPH03224498A JPH03224498A JP30941290A JP30941290A JPH03224498A JP H03224498 A JPH03224498 A JP H03224498A JP 30941290 A JP30941290 A JP 30941290A JP 30941290 A JP30941290 A JP 30941290A JP H03224498 A JPH03224498 A JP H03224498A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は胆汁酸、特に生体試料中の胆汁酸の高感度定量
法及び胆汁酸定量用組成物に関する。
法及び胆汁酸定量用組成物に関する。
〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕血清等
の生体試料中の胆汁酸を測定することは、肝機能検査と
して、あるいは黄痘、胆石症の成立機序の解明などのた
め重要である。
の生体試料中の胆汁酸を測定することは、肝機能検査と
して、あるいは黄痘、胆石症の成立機序の解明などのた
め重要である。
従来、コール酸、デオキシコール酸やケノデオキシコー
ル酸などを含む胆汁酸の測定法としては種々の方法が報
告されているが、近年臨床検査には、一般に３α−ヒド
ロキシステロイドデヒドロゲナーゼ及び１つの補酵素と
してニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下Ｎ
ＡＤ類という）またはニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドホスフェート類（以下ＮＡＤＰ類という）を反応
させて、胆汁酸量に比例して生成する還元型ＮＡＤ類（
以下ＮＡＤＨ類という）又は還元型ＮＡＤＰ類（以下Ｎ
ＡＤＰＨ類という）を測定する方法（特公昭５９−１３
１９７号）が使用されている。しかしながら、この方法
はビリルビンの影響を受は易いために予め胆汁酸の分離
が必要である、多量の検体が必要である、また感度が低
いという欠点があった。そのため高感度発色剤を使用す
る工夫もなされているが〔第３３回日本臨床病理学会総
会抄録、１２３頁（１９８６）及び第３４回向抄録、１
２４頁（１９８９）） 、これも本質的な解決とはなっ
ていない。
ル酸などを含む胆汁酸の測定法としては種々の方法が報
告されているが、近年臨床検査には、一般に３α−ヒド
ロキシステロイドデヒドロゲナーゼ及び１つの補酵素と
してニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下Ｎ
ＡＤ類という）またはニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドホスフェート類（以下ＮＡＤＰ類という）を反応
させて、胆汁酸量に比例して生成する還元型ＮＡＤ類（
以下ＮＡＤＨ類という）又は還元型ＮＡＤＰ類（以下Ｎ
ＡＤＰＨ類という）を測定する方法（特公昭５９−１３
１９７号）が使用されている。しかしながら、この方法
はビリルビンの影響を受は易いために予め胆汁酸の分離
が必要である、多量の検体が必要である、また感度が低
いという欠点があった。そのため高感度発色剤を使用す
る工夫もなされているが〔第３３回日本臨床病理学会総
会抄録、１２３頁（１９８６）及び第３４回向抄録、１
２４頁（１９８９）） 、これも本質的な解決とはなっ
ていない。
また、他の方法として、生成した３−オキソステロイド
を更に３−オキソ−△４−ステロイドデヒドロゲナーゼ
の作用により３−△４−ステロイドとし、ホルマザン色
素を従来の２倍量生成させるキットも市販されているが
、これも感度がたかだか２倍になったにすぎない。
を更に３−オキソ−△４−ステロイドデヒドロゲナーゼ
の作用により３−△４−ステロイドとし、ホルマザン色
素を従来の２倍量生成させるキットも市販されているが
、これも感度がたかだか２倍になったにすぎない。
更にまた、胆汁酸の量に比例して生成されるＮＡＤＨ又
はＮＡＤＰＨを酵素サイクリング反応を利用して高感度
に測定する方法が報告されている（特公昭６３−３６７
５８号）。しかし、この方法も、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰ
Ｈを酵素サイクリング反応によって増幅させるためには
、残存している過剰のＮＡＤ又はＮＡＤＰをアルカリ加
温処理によって分解除去しなければならないため操作が
煩雑であり、臨床検査のような多検体を処理する場合に
は不利なるを免れなかった。
はＮＡＤＰＨを酵素サイクリング反応を利用して高感度
に測定する方法が報告されている（特公昭６３−３６７
５８号）。しかし、この方法も、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰ
Ｈを酵素サイクリング反応によって増幅させるためには
、残存している過剰のＮＡＤ又はＮＡＤＰをアルカリ加
温処理によって分解除去しなければならないため操作が
煩雑であり、臨床検査のような多検体を処理する場合に
は不利なるを免れなかった。
従って、例えば血中胆汁酸の低下をきたす疾患に吸収不
良症候群があるが、このような正常値以下の濃度を正確
に測定することは現在の酵素法では困難である。
良症候群があるが、このような正常値以下の濃度を正確
に測定することは現在の酵素法では困難である。
また、大部分の胆汁酸は、３α位に水酸基を有するが、
胆汁酸の種類により、３α位のほかに７α位、１２α位
に水酸基を有するため、３α−ヒドロキシステロイドデ
ヒドロゲナーゼ（３α−Ｈ２Ｃ）のほかに、７α−Ｈ２
Ｃ，１２α−Ｈ２Ｃを用いてそれぞれ検体中胆汁酸を測
定すれば、ガスクロマトグラフィーなどの機器を用いな
くても、個々の胆汁酸レベルを測定することが理論上可
能である。実際、３α−Ｈ２Ｃによる総胆汁酸の測定に
加え、１２α−ヒドロキシ胆汁酸を同時に測定すること
は、肝実質障害の程度、推移の把握に利用しうる可能性
がある、との報告もあり（医学のあゆみ、ｖｏｌ、１４
３．Ｎ。
胆汁酸の種類により、３α位のほかに７α位、１２α位
に水酸基を有するため、３α−ヒドロキシステロイドデ
ヒドロゲナーゼ（３α−Ｈ２Ｃ）のほかに、７α−Ｈ２
Ｃ，１２α−Ｈ２Ｃを用いてそれぞれ検体中胆汁酸を測
定すれば、ガスクロマトグラフィーなどの機器を用いな
くても、個々の胆汁酸レベルを測定することが理論上可
能である。実際、３α−Ｈ２Ｃによる総胆汁酸の測定に
加え、１２α−ヒドロキシ胆汁酸を同時に測定すること
は、肝実質障害の程度、推移の把握に利用しうる可能性
がある、との報告もあり（医学のあゆみ、ｖｏｌ、１４
３．Ｎ。
１０、７７５−７７６（１９８７）） 、このような面
からも胆汁酸定量の高感度化が望まれている。
からも胆汁酸定量の高感度化が望まれている。
そこで、本発明者らは先に胆汁酸を基質としてオキソ胆
汁酸を生成する可逆反応において、特定ノ微生物由来の
ステロイドデヒドロゲナーゼを使用し、ＮＡＤ類（又は
ＮＡＤＰ類）を補酵素として胆汁酸からオキソ胆汁酸を
生成させる反応系となし、かつ当該補酵素と異なる少量
のＮＡＤＰＨ類（又はＮＡＤＨ類）を共存させて、胆汁
酸とオキシ胆汁酸の間の可逆的サイクリング反応を行え
ば、ＮＡＤＨ類（又はＮＡＤＰＨ類）の生成量が時間経
過と共に直線的に増加し、しかもその増加速度が胆汁酸
の量と比例することを見出し、先に出願した（特願平１
−９８４４３号）。
汁酸を生成する可逆反応において、特定ノ微生物由来の
ステロイドデヒドロゲナーゼを使用し、ＮＡＤ類（又は
ＮＡＤＰ類）を補酵素として胆汁酸からオキソ胆汁酸を
生成させる反応系となし、かつ当該補酵素と異なる少量
のＮＡＤＰＨ類（又はＮＡＤＨ類）を共存させて、胆汁
酸とオキシ胆汁酸の間の可逆的サイクリング反応を行え
ば、ＮＡＤＨ類（又はＮＡＤＰＨ類）の生成量が時間経
過と共に直線的に増加し、しかもその増加速度が胆汁酸
の量と比例することを見出し、先に出願した（特願平１
−９８４４３号）。
しかしながら、この方法も生成するＮＡＤＰＨとＮＡＤ
Ｈの極大吸収波長がどちらも３４０ｎｍと同じであるた
め、胆汁酸の量と比例して生成した還元型のみを測定す
る際に誤差を生じるという問題があつた。
Ｈの極大吸収波長がどちらも３４０ｎｍと同じであるた
め、胆汁酸の量と比例して生成した還元型のみを測定す
る際に誤差を生じるという問題があつた。
一方、ＮＡＤ及びＮＡＤＰのアナログであるチオニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド（以下チオＮＡＤとい
う）及びチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホ
スフェート（以下チオＮＡＤＰという）は還元型の極大
吸収波長が４００ｎｍ付近にあり、ＮＡＤ及びＮＡＤＰ
の還元型の極大吸収波長とは異なることが知られている
。
ンアミドアデニンジヌクレオチド（以下チオＮＡＤとい
う）及びチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホ
スフェート（以下チオＮＡＤＰという）は還元型の極大
吸収波長が４００ｎｍ付近にあり、ＮＡＤ及びＮＡＤＰ
の還元型の極大吸収波長とは異なることが知られている
。
斯かる実情において、本発明者らは更に研究を進めた結
果、先の酵素サイクリング反応を実施するに当り、２種
類の補酵素の１つにチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類
を使用して、どちらか一方の補酵素の変化量のみを定量
すれば、ヒドロキシステロイド又はオキソステロイドを
高感度に定量できることを見出し、更にこの方法によれ
ば胆汁酸定量を正確に行うことができることを見出し、
本発明を完成した。
果、先の酵素サイクリング反応を実施するに当り、２種
類の補酵素の１つにチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類
を使用して、どちらか一方の補酵素の変化量のみを定量
すれば、ヒドロキシステロイド又はオキソステロイドを
高感度に定量できることを見出し、更にこの方法によれ
ば胆汁酸定量を正確に行うことができることを見出し、
本発明を完成した。
すなわち、本発明は被検体に、
■チオＮＡＤＰ類及びチオＮＡＤ類からなる群より選ば
れる１つと、ＮＡＤＰ類及びＮＡＤ類からなる群より選
ばれる１つとを補酵素とし、少なくとも胆汁酸を基質と
してオキソ胆汁酸を生成する可逆反応をなすステロイド
デヒドロゲナーゼ、 ■Ａ１、 ■Ｂ１、 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式（Ｉ）（式
中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類
又はＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物を示し
、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類又はチオＮＡＤ類のとき
は還元型ＮＡＤＰ類又は還元型ＮＡＤ類を、Ａ、がＮＡ
ＤＰ類又はＮＡＤ類のときは還元型チオＮＡＤＰ類又は
還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ１はＢ、の酸化型生成物
を示す）で表されるサイクリング反応を形成せしめ、該
反応によって変化するＡ２又はＢ１の量を測定すること
を特徴とする胆汁酸の高感度定量法、並びに上記■、■
及び■を含有することを特徴とする胆汁酸定量用組成物
を提供するものである。
れる１つと、ＮＡＤＰ類及びＮＡＤ類からなる群より選
ばれる１つとを補酵素とし、少なくとも胆汁酸を基質と
してオキソ胆汁酸を生成する可逆反応をなすステロイド
デヒドロゲナーゼ、 ■Ａ１、 ■Ｂ１、 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式（Ｉ）（式
中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類
又はＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物を示し
、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類又はチオＮＡＤ類のとき
は還元型ＮＡＤＰ類又は還元型ＮＡＤ類を、Ａ、がＮＡ
ＤＰ類又はＮＡＤ類のときは還元型チオＮＡＤＰ類又は
還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ１はＢ、の酸化型生成物
を示す）で表されるサイクリング反応を形成せしめ、該
反応によって変化するＡ２又はＢ１の量を測定すること
を特徴とする胆汁酸の高感度定量法、並びに上記■、■
及び■を含有することを特徴とする胆汁酸定量用組成物
を提供するものである。
本発明において、ステロイドデヒドロゲナーゼとしては
上記要件を具備するものであれば何れのものでも使用で
きるが、その具体例は、ＮＡＤ類及びチオＮＡＤ類を補
酵素とするものとしては、シュードモナス テストステ
ロニ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎ
ｉｉ、 Ｊ、Ｂ、Ｃ，、２２７、 ３７−５２（１９５
７））、バラルス スファエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ ；特開昭５４−１５７８９４号
公報）由来の３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナ
ーゼ（３α−Ｈ２Ｃ） （ＥＣ１，１，１，５０）
；バクテロイデス フラギリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄ
ｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、 Ｂｉｏｃｈｉｍ。
上記要件を具備するものであれば何れのものでも使用で
きるが、その具体例は、ＮＡＤ類及びチオＮＡＤ類を補
酵素とするものとしては、シュードモナス テストステ
ロニ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎ
ｉｉ、 Ｊ、Ｂ、Ｃ，、２２７、 ３７−５２（１９５
７））、バラルス スファエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ ；特開昭５４−１５７８９４号
公報）由来の３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナ
ーゼ（３α−Ｈ２Ｃ） （ＥＣ１，１，１，５０）
；バクテロイデス フラギリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄ
ｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、 Ｂｉｏｃｈｉｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ、 ３８４．１２−２１（
１９７５））やシュードモナスｓｐ、 Ｂ−０８３１（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ、 Ｂ−０８３１、東洋
醸造カタログＮｏ、 Ｔ −２８）由来の７α−Ｈ２Ｃ
（ＥＣ１，１，１，１５９） ；バラルス スファエ
リカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ、東
洋醸造カタログＮＯ。
１９７５））やシュードモナスｓｐ、 Ｂ−０８３１（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ、 Ｂ−０８３１、東洋
醸造カタログＮｏ、 Ｔ −２８）由来の７α−Ｈ２Ｃ
（ＥＣ１，１，１，１５９） ；バラルス スファエ
リカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ、東
洋醸造カタログＮＯ。
Ｔ −２９）由来の１２α−Ｈ２Ｃ（ＥＣ１，１，１，
１７６）等が挙げられる。また、ＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類
、チオＮＡＤ類及びチオＮＡＤＰ類を共に補酵素とする
ものとしては、ラット肝、前立腺（Ｊ、 ５ｔｅｒｏｉ
ｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 ８．４ｌ−４６（１９７７）
） 、シュードモナス ｓｐ、 Ｂ−０８３１（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ、 Ｂ−０８３１，東洋醸造カ
タログＮＯ，Ｔ −２７）由来の３α−Ｈ２Ｃが挙げら
れる。
１７６）等が挙げられる。また、ＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類
、チオＮＡＤ類及びチオＮＡＤＰ類を共に補酵素とする
ものとしては、ラット肝、前立腺（Ｊ、 ５ｔｅｒｏｉ
ｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 ８．４ｌ−４６（１９７７）
） 、シュードモナス ｓｐ、 Ｂ−０８３１（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ、 Ｂ−０８３１，東洋醸造カ
タログＮＯ，Ｔ −２７）由来の３α−Ｈ２Ｃが挙げら
れる。
また、Ａ、及びＢ２はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、
ＮＡＤＰ類又はＮＡＤ類を示すが、このうちＮＡＤＰ類
又はＮＡＤ類としては例えば、ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ） 、アセチル
ピリジンアデニンジヌクレオチドホスフェート（アセチ
ルＮＡＤＰ）及びニコチンアミドヒポキサンチンジヌク
レオチドホスフェート（デアミノＮＡＤＰ）；およびニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ） 、ア
セチルピリジンアデニンジヌクレオチド（アセチルＮＡ
Ｄ）及びニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド
（デアミノＮＡＤ）が挙げられる。
ＮＡＤＰ類又はＮＡＤ類を示すが、このうちＮＡＤＰ類
又はＮＡＤ類としては例えば、ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ） 、アセチル
ピリジンアデニンジヌクレオチドホスフェート（アセチ
ルＮＡＤＰ）及びニコチンアミドヒポキサンチンジヌク
レオチドホスフェート（デアミノＮＡＤＰ）；およびニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ） 、ア
セチルピリジンアデニンジヌクレオチド（アセチルＮＡ
Ｄ）及びニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド
（デアミノＮＡＤ）が挙げられる。
本発明においてはＡ、及びＢ、のいずれか一方がチオＮ
ＡＤ類又はチオＮＡＤＰ類であることが必要である。
ＡＤ類又はチオＮＡＤＰ類であることが必要である。
また、チオＮＡＤＰ類又はチオＮＡＤ類としては、例え
ばチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェ
ート（チオＮＡＤＰ） 、チオニコチンアミドヒポキサ
ンチンジヌクレオチドホスフェート及びチオニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ） 、チオニ
コチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドが挙げられ
る。
ばチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェ
ート（チオＮＡＤＰ） 、チオニコチンアミドヒポキサ
ンチンジヌクレオチドホスフェート及びチオニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ） 、チオニ
コチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドが挙げられ
る。
また、定量に用いるステロイドデヒドロゲナーゼがＮＡ
Ｄ類のみを補酵素とする場合は、チオＮＡＤ類と上述の
ＮＡＤ類より、また用いるステロイドデヒドロゲナーゼ
がＮＡＤ類及びＮＡＤＰ類を共に補酵素とする場合は、
チオＮＡＤ類及びチオＮＡＤＰ類と上述のＮＡＤ類及び
ＮＡＤＰ類より適宜選択して用いればよい。
Ｄ類のみを補酵素とする場合は、チオＮＡＤ類と上述の
ＮＡＤ類より、また用いるステロイドデヒドロゲナーゼ
がＮＡＤ類及びＮＡＤＰ類を共に補酵素とする場合は、
チオＮＡＤ類及びチオＮＡＤＰ類と上述のＮＡＤ類及び
ＮＡＤＰ類より適宜選択して用いればよい。
Ａ１及びＢ、の量は被検体中の胆汁酸の量に比較して過
剰量であり、またステロイドデヒドロゲナーゼのＡ１及
びＢ１それぞれに対するＫｍ値に比較しても過剰量であ
ることが必要であり、特に胆汁酸量の２０〜１００００
倍モルが好ましい。
剰量であり、またステロイドデヒドロゲナーゼのＡ１及
びＢ１それぞれに対するＫｍ値に比較しても過剰量であ
ることが必要であり、特に胆汁酸量の２０〜１００００
倍モルが好ましい。
本発明の胆汁酸定量用組成物においては、Ａ１及びＢ１
の濃度は０．０２〜１００ｍＭ、特に０．０５〜３０ｍ
Ｍが好ましく、ステロイドデヒドロゲナーゼの濃度は０
．０５〜１００Ｕ／ａｌｌ、特に１〜５０Ｕ／ｍｌカ好
マシイが、その量は被検体の種類等により適宜決定する
ことができ、これ以上の量を用いることもできる。
の濃度は０．０２〜１００ｍＭ、特に０．０５〜３０ｍ
Ｍが好ましく、ステロイドデヒドロゲナーゼの濃度は０
．０５〜１００Ｕ／ａｌｌ、特に１〜５０Ｕ／ｍｌカ好
マシイが、その量は被検体の種類等により適宜決定する
ことができ、これ以上の量を用いることもできる。
また、本発明定量法はステロイドデヒドロゲナーゼがＮ
ＡＤ類及びＮＡＤＰ類を共に補酵素とする場合において
、２つの補酵素にチオＮＡＤ類とＮＡＤ類もしくはＮＡ
ＤＰ類との組み合わせ、またはチオＮＡＤＰ類とＮＡＤ
類もしくはＮＡＤＰ類との組み合わせを選んだときは、
更に被検体に■成分の胆汁酸及びＡ１に作用せず、Ｂ、
→Ｂ１の反応を形成する第２のデヒドロゲナーゼ及び該
第２のデヒドロゲナーゼの基質を作用せしめることによ
り、後記反応式ＣＩ［）の如く、Ｂ１とＢ２との間にＢ
、の再生のための反応系を付与せしめることにより胆汁
酸のサイクリング反応も形成し得る。この場合、定量の
際には反応により生成したＡ２の量を測定する。
ＡＤ類及びＮＡＤＰ類を共に補酵素とする場合において
、２つの補酵素にチオＮＡＤ類とＮＡＤ類もしくはＮＡ
ＤＰ類との組み合わせ、またはチオＮＡＤＰ類とＮＡＤ
類もしくはＮＡＤＰ類との組み合わせを選んだときは、
更に被検体に■成分の胆汁酸及びＡ１に作用せず、Ｂ、
→Ｂ１の反応を形成する第２のデヒドロゲナーゼ及び該
第２のデヒドロゲナーゼの基質を作用せしめることによ
り、後記反応式ＣＩ［）の如く、Ｂ１とＢ２との間にＢ
、の再生のための反応系を付与せしめることにより胆汁
酸のサイクリング反応も形成し得る。この場合、定量の
際には反応により生成したＡ２の量を測定する。
Ｂ２
Ｂ□
Ｃ式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
ＰＱ又はＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ工の還元型生成物を
示し、ＢユはＡ、がチオＮＡＤＰ類又はチオＮＡＤ類の
ときは還元型ＮＡＤＰ類又は還元型ＮＡＤ類を、Ａ、が
ＮＡＤＰ類又はＮＥ類のときは還元型チオＮＡＤＰ類又
は還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ、はＢ、の酸化型生成
物を示し、Ｂ１→Ｂ１はＢ２を補酵素としてＢ１を生成
する酵素反応を示すすなわち、第２のデヒドロゲナーゼ
はＢ１の再生の為に補助的に添加するものであり、これ
によってＢ１の使用量を少な（することが可能となり、
特にＢ、が高価な場合には有効である。また、Ｂｌの代
わりにＢ、あるいはＢ、とＢ２の混合物を用いて反応を
行ってもよい。この場合、Ｂ１又は／及びＢ、の使用量
は特に限定されるものではないが、−船釣ニハＡ、の１
／１０モル以下が好ましい。
ＰＱ又はＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ工の還元型生成物を
示し、ＢユはＡ、がチオＮＡＤＰ類又はチオＮＡＤ類の
ときは還元型ＮＡＤＰ類又は還元型ＮＡＤ類を、Ａ、が
ＮＡＤＰ類又はＮＥ類のときは還元型チオＮＡＤＰ類又
は還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ、はＢ、の酸化型生成
物を示し、Ｂ１→Ｂ１はＢ２を補酵素としてＢ１を生成
する酵素反応を示すすなわち、第２のデヒドロゲナーゼ
はＢ１の再生の為に補助的に添加するものであり、これ
によってＢ１の使用量を少な（することが可能となり、
特にＢ、が高価な場合には有効である。また、Ｂｌの代
わりにＢ、あるいはＢ、とＢ２の混合物を用いて反応を
行ってもよい。この場合、Ｂ１又は／及びＢ、の使用量
は特に限定されるものではないが、−船釣ニハＡ、の１
／１０モル以下が好ましい。
この成分■を用いる胆汁酸定量用組成物において、Ａ、
の濃度は０．０２〜１００ｍＭ、特１：０．０５〜３０
ｍＭ；６＜好ましく、Ｂ、又は／及びＢ１の濃度は０．
０５〜５０００μＭ１特に５〜５００μＭが好ましく、
ステロイドデヒドロゲナーゼの濃度はＯ，ＯＳ〜１００
Ｕ／７ｄ、特に１〜５０Ｕ／７ｄが好ましく、第２のデ
ヒドロゲナーゼはＢ、に対するＫｍ値（ｍＷ単位）の２
０倍量（Ｕ／顧単位）以上になるように調整すればよく
、例えば１〜１００Ｕ／Ｔｎｆ１が好ましく、また第２
のデヒドロゲナーゼの基質は過剰量、例えば０．０５〜
２０ｍＭが好マしい。これらの量は被検体の種類等によ
り適宜決定することができ、これ以上の量を用いること
もできる。
の濃度は０．０２〜１００ｍＭ、特１：０．０５〜３０
ｍＭ；６＜好ましく、Ｂ、又は／及びＢ１の濃度は０．
０５〜５０００μＭ１特に５〜５００μＭが好ましく、
ステロイドデヒドロゲナーゼの濃度はＯ，ＯＳ〜１００
Ｕ／７ｄ、特に１〜５０Ｕ／７ｄが好ましく、第２のデ
ヒドロゲナーゼはＢ、に対するＫｍ値（ｍＷ単位）の２
０倍量（Ｕ／顧単位）以上になるように調整すればよく
、例えば１〜１００Ｕ／Ｔｎｆ１が好ましく、また第２
のデヒドロゲナーゼの基質は過剰量、例えば０．０５〜
２０ｍＭが好マしい。これらの量は被検体の種類等によ
り適宜決定することができ、これ以上の量を用いること
もできる。
第２のデヒドロゲナーゼ及びその基質としては、例えば
、Ｂ２がＮＡＤ類またはチオＮＡＤ類のときは、アルコ
ールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，１）とエタノ
ール、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１゜１
．６） （Ｅ、Ｃｏ１１由来）とグリセロール、グリ
セロール−３−リン酸デヒドロゲナーセ（ＥＣ１，１，
１，８）（ウサギ筋肉由来）とＬ−グリセロール−３−
リン酸、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，
３７）（ブタ心筋、ウシ心筋由来）とＬ−リンゴ酸、グ
リセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１゜１
．１．１２） （ウサギ骨格筋、肝、酵母、Ｅ、Ｃｏ
１１由来）とＤ−グリセロアルデヒドリン酸とリン酸、
Ｂ宏がＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤＰ類のときは、グル
コース−６−リン酸ゾヒドロゲナ−セ（ＥＣ１，１，１
，４９） （酵母由来）とグルコース−６−リン酸、
インクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，４２
） （酵母、ブタ心筋由来）とインクエン酸、グリオ
キシル酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，２，１，１７）
（ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＯＸａｌａｔｉＣｕＳ由来
）とＣｏＡとグリオキシル酸、ホスホグルコン酸デヒド
ロゲナーゼ（ＥＣ，１，１，１，４４）（ラット肝、ビ
ール酵母、Ｅ、Ｃｏ１ｆ由来）と６−ポスホーＤ−グル
コン酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（
ＥＣ１，２，１，１３） （植物葉緑体由来）とＤ−
グリセロアルデヒド−３−リン酸とリン酸、ベンズアル
デヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，２，１，７） （
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来
）とベンズアルデヒド等が挙げられる。
、Ｂ２がＮＡＤ類またはチオＮＡＤ類のときは、アルコ
ールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，１）とエタノ
ール、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１゜１
．６） （Ｅ、Ｃｏ１１由来）とグリセロール、グリ
セロール−３−リン酸デヒドロゲナーセ（ＥＣ１，１，
１，８）（ウサギ筋肉由来）とＬ−グリセロール−３−
リン酸、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，
３７）（ブタ心筋、ウシ心筋由来）とＬ−リンゴ酸、グ
リセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１゜１
．１．１２） （ウサギ骨格筋、肝、酵母、Ｅ、Ｃｏ
１１由来）とＤ−グリセロアルデヒドリン酸とリン酸、
Ｂ宏がＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤＰ類のときは、グル
コース−６−リン酸ゾヒドロゲナ−セ（ＥＣ１，１，１
，４９） （酵母由来）とグルコース−６−リン酸、
インクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，４２
） （酵母、ブタ心筋由来）とインクエン酸、グリオ
キシル酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，２，１，１７）
（ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＯＸａｌａｔｉＣｕＳ由来
）とＣｏＡとグリオキシル酸、ホスホグルコン酸デヒド
ロゲナーゼ（ＥＣ，１，１，１，４４）（ラット肝、ビ
ール酵母、Ｅ、Ｃｏ１ｆ由来）と６−ポスホーＤ−グル
コン酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（
ＥＣ１，２，１，１３） （植物葉緑体由来）とＤ−
グリセロアルデヒド−３−リン酸とリン酸、ベンズアル
デヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，２，１，７） （
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来
）とベンズアルデヒド等が挙げられる。
更にまた、本発明定量法はステロイドデヒドロゲナーゼ
がＮＡＤ類及びＮＡＤＰ類を共に補酵素とする場合にお
いて、２つの補酵素にチオＮＡＤ類とＮＡＤ類もしくは
ＮＡＤＰ類との組み合わせ、またはチオＮＡＤＰ類とＮ
ＡＤ類もしくはＮＡＤＰ類との組み合わせを選んだとき
は、更に被検体に■成分の胆汁酸及びＢ１に作用せず、
Ａ３→Ａ、の反応を形成する第３のデヒドロゲナーゼ及
び該第３のデヒドロゲナーゼの基質を作用せしめること
により、後記反応式（ＩＩ）の如＜、Ａ、とＡ、との間
にＡ１の再生のための反応系を付与せしめることにより
胆汁酸のサイクリング反応を形成し得る。この場合、定
量の際にはＢ１の消費量を測定する。
がＮＡＤ類及びＮＡＤＰ類を共に補酵素とする場合にお
いて、２つの補酵素にチオＮＡＤ類とＮＡＤ類もしくは
ＮＡＤＰ類との組み合わせ、またはチオＮＡＤＰ類とＮ
ＡＤ類もしくはＮＡＤＰ類との組み合わせを選んだとき
は、更に被検体に■成分の胆汁酸及びＢ１に作用せず、
Ａ３→Ａ、の反応を形成する第３のデヒドロゲナーゼ及
び該第３のデヒドロゲナーゼの基質を作用せしめること
により、後記反応式（ＩＩ）の如＜、Ａ、とＡ、との間
にＡ１の再生のための反応系を付与せしめることにより
胆汁酸のサイクリング反応を形成し得る。この場合、定
量の際にはＢ１の消費量を測定する。
（式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
Ｐ類又はＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ、の還元型生成物を
示し、Ｂ、はＡ、がチオＮＡＤＰ類又はチオＮＡＤ類の
ときは還元型ＮＡＤＰ類又は還元型ＮＡＤ類を、Ａ、が
ＮＡＤＰ類又はＮＡＤ類のときは還元型チオＮＡＤＰ類
又は還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ、はＢ１の酸化型生
成物を示し、Ａ２→Ａ１はＡ２を補酵素としてＡ１を生
成する酵素反応を示す）すなわち、第３のデヒドロゲナ
ーゼはＡ１の再生の為に補助的に添加するものであり、
これによってＡ□の使用量を少なくすることが可能とな
り、特にＡ、が高価な場合には有効である。また、Ａ１
の代わりにＡ、あるいはＡ、とＡ、の混合物を用いて反
応を行ってもよい。この場合、Ａ１又は／及びＡ２の使
用量は特に限定されるものではないが、−船釣にはＢ１
の１／１０モル以下が好ましい。
Ｐ類又はＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ、の還元型生成物を
示し、Ｂ、はＡ、がチオＮＡＤＰ類又はチオＮＡＤ類の
ときは還元型ＮＡＤＰ類又は還元型ＮＡＤ類を、Ａ、が
ＮＡＤＰ類又はＮＡＤ類のときは還元型チオＮＡＤＰ類
又は還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ、はＢ１の酸化型生
成物を示し、Ａ２→Ａ１はＡ２を補酵素としてＡ１を生
成する酵素反応を示す）すなわち、第３のデヒドロゲナ
ーゼはＡ１の再生の為に補助的に添加するものであり、
これによってＡ□の使用量を少なくすることが可能とな
り、特にＡ、が高価な場合には有効である。また、Ａ１
の代わりにＡ、あるいはＡ、とＡ、の混合物を用いて反
応を行ってもよい。この場合、Ａ１又は／及びＡ２の使
用量は特に限定されるものではないが、−船釣にはＢ１
の１／１０モル以下が好ましい。
この成分■を用いる胆汁酸定量用組成物において、Ｂ１
ノ濃度ハ０．０２〜１０１００ＩＩＩ特４；：０．０５
〜３０ｍＭが好ましく、Ａ、又は／及びＡ１の濃度は０
，０５〜５０００μＭ１特に５〜５００μＭが好ましく
、ステロイドデヒドロゲナーゼの濃度は０．０５〜１０
０Ｕ／ｍＱ、特に１〜５０Ｕ／ｎｉｌが好ましく、第３
のデヒドロゲナーゼはＡ２に対するＫｍ値（ｍＭ単位）
の２０倍量（Ｕ／ｍｌｌ単位）以上になるように調整す
ればよく、例えば１〜１００Ｕ／Ｔｎｆ１が好ましく、
また第３のデヒドロゲナーゼの基質は過剰量、例えば０
．０５〜２０ｍＭが好ましい。これらの量は被検体の種
類等により適宜決定することができ、これ以上の量を用
いることもできる。
ノ濃度ハ０．０２〜１０１００ＩＩＩ特４；：０．０５
〜３０ｍＭが好ましく、Ａ、又は／及びＡ１の濃度は０
，０５〜５０００μＭ１特に５〜５００μＭが好ましく
、ステロイドデヒドロゲナーゼの濃度は０．０５〜１０
０Ｕ／ｍＱ、特に１〜５０Ｕ／ｎｉｌが好ましく、第３
のデヒドロゲナーゼはＡ２に対するＫｍ値（ｍＭ単位）
の２０倍量（Ｕ／ｍｌｌ単位）以上になるように調整す
ればよく、例えば１〜１００Ｕ／Ｔｎｆ１が好ましく、
また第３のデヒドロゲナーゼの基質は過剰量、例えば０
．０５〜２０ｍＭが好ましい。これらの量は被検体の種
類等により適宜決定することができ、これ以上の量を用
いることもできる。
第３のデヒドロゲナーゼ及びその基質としては、例えば
、ＡｔがＮＡＤ類またはチオＮＡＤ類のときは、アルコ
ールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，１）とアセト
アルデヒド、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，
１，１，６） （Ｅ、ＣｏＬｉ由来）とジヒドロキシ
アセトン、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ
（ＥＣ１，１，１，８） （ウサギ筋肉由来）とジヒ
ドロキシアセトンリン酸、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（
ＥＣ１，１，１，３７） （ブタ心筋、ウシ心筋由来
）とオキザロ酢酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロ
ゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，１２） （ウサギ骨格筋
、肝、酵母、Ｅ、Ｃｏ１１由来）と１．３−ジホスホー
Ｄ−グリセリン酸、Ａ１がＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ
Ｐ類のときは、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼ（ＥＣ１，１，１，４９） （酵母由来）とグルコ
ノラクトン−６−リン酸、グリセロアルデヒドリン酸デ
ヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，２，１，１３） （植物葉
緑体由来）と１．３−ジホスホーＤ−グリセリン酸等が
挙げられる。
、ＡｔがＮＡＤ類またはチオＮＡＤ類のときは、アルコ
ールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，１）とアセト
アルデヒド、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，
１，１，６） （Ｅ、ＣｏＬｉ由来）とジヒドロキシ
アセトン、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ
（ＥＣ１，１，１，８） （ウサギ筋肉由来）とジヒ
ドロキシアセトンリン酸、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（
ＥＣ１，１，１，３７） （ブタ心筋、ウシ心筋由来
）とオキザロ酢酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロ
ゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，１２） （ウサギ骨格筋
、肝、酵母、Ｅ、Ｃｏ１１由来）と１．３−ジホスホー
Ｄ−グリセリン酸、Ａ１がＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ
Ｐ類のときは、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼ（ＥＣ１，１，１，４９） （酵母由来）とグルコ
ノラクトン−６−リン酸、グリセロアルデヒドリン酸デ
ヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，２，１，１３） （植物葉
緑体由来）と１．３−ジホスホーＤ−グリセリン酸等が
挙げられる。
本発明の胆汁酸定量用組成物の調製にあたって、使用で
きるステロイドデヒドロゲナーゼに関しては、例えば補
酵素としてＮＡＤ類（好ましくはＮＡＤ）、チオＮＡＤ
類（好ましくはチオＮＡＤ） 、あるいはＮＡＤＰ類（
好ましくはＮＡＤＰ） 、チオＮＡＤＰ類（好ましく！
まチオＮＡＤＰ）を用いて、基質となるコール酸等の胆
汁酸に対する反応性を有するものであればよく、これら
補酵素と基質を用いることにより確認できるものである
。
きるステロイドデヒドロゲナーゼに関しては、例えば補
酵素としてＮＡＤ類（好ましくはＮＡＤ）、チオＮＡＤ
類（好ましくはチオＮＡＤ） 、あるいはＮＡＤＰ類（
好ましくはＮＡＤＰ） 、チオＮＡＤＰ類（好ましく！
まチオＮＡＤＰ）を用いて、基質となるコール酸等の胆
汁酸に対する反応性を有するものであればよく、これら
補酵素と基質を用いることにより確認できるものである
。
反応液組成については、使用するステロイドデヒドロゲ
ナーゼの各補酵素間の相対活性等を考慮して２種の補酵
素を適宜選択し、その後止反応／逆反応の至適ｐｉ（の
間のｐＨ条件を適宜調整して、正反応／逆反応の反応速
度比が１に近づくようにｐＨ条件を設定すればよい。例
えば、３α−）ＩＳＤ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ
、 Ｂ−０８３１，東洋醸造カタログＮｏ。
ナーゼの各補酵素間の相対活性等を考慮して２種の補酵
素を適宜選択し、その後止反応／逆反応の至適ｐｉ（の
間のｐＨ条件を適宜調整して、正反応／逆反応の反応速
度比が１に近づくようにｐＨ条件を設定すればよい。例
えば、３α−）ＩＳＤ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ
、 Ｂ−０８３１，東洋醸造カタログＮｏ。
Ｔ−２７）についてみれば、コール酸を基質にし、補酵
素にチオＮＡＤを用いた場合のＮＡＤを用いた場合に対
する相対活性は４０％程度であり、また、正反応の至適
ｐＨは９．５付近で、逆反応の至適ｐｉ（は５．５付近
である。また、これらの酵素は単独でも、適宜２種以上
を組合せて用いてもよい。
素にチオＮＡＤを用いた場合のＮＡＤを用いた場合に対
する相対活性は４０％程度であり、また、正反応の至適
ｐＨは９．５付近で、逆反応の至適ｐｉ（は５．５付近
である。また、これらの酵素は単独でも、適宜２種以上
を組合せて用いてもよい。
斯くして、調製された本発明の胆汁酸定量用組成物によ
って被検体中の胆汁酸量を測定するには、上記成分■〜
■、■〜■、あるいは■〜■及び■を含有する組成物に
被検体０．００１〜０．５ｍｌを加え、約３７℃の温度
にて反応させ、反応開始一定時間後の２点間の数分ない
し数十分間、例えば３分後と４分後の１分間又は３分後
と８分後の５分間における生成されたＡ、の量又は消費
されたＢ、の量を、それぞれの吸収波長に基づく吸光度
の変化によって測定すればよい。例えば、ＡｔがチオＮ
ＡＤＨ，ＢｌがＮＡＤＨの場合、Ａ、の生成を４００ｎ
ｍの吸光度の増加により測定するか、あるいはＢ、の消
費を３４０ｎｍの吸光度の減少により測定し、既知濃度
の胆汁酸を用いて測定したときの値と比較すれば、被検
液中の胆汁酸量をリアルタイムで算出することができる
。
って被検体中の胆汁酸量を測定するには、上記成分■〜
■、■〜■、あるいは■〜■及び■を含有する組成物に
被検体０．００１〜０．５ｍｌを加え、約３７℃の温度
にて反応させ、反応開始一定時間後の２点間の数分ない
し数十分間、例えば３分後と４分後の１分間又は３分後
と８分後の５分間における生成されたＡ、の量又は消費
されたＢ、の量を、それぞれの吸収波長に基づく吸光度
の変化によって測定すればよい。例えば、ＡｔがチオＮ
ＡＤＨ，ＢｌがＮＡＤＨの場合、Ａ、の生成を４００ｎ
ｍの吸光度の増加により測定するか、あるいはＢ、の消
費を３４０ｎｍの吸光度の減少により測定し、既知濃度
の胆汁酸を用いて測定したときの値と比較すれば、被検
液中の胆汁酸量をリアルタイムで算出することができる
。
また、本発明定量法は、被検液中の胆汁酸そのものを酵
素サイクリング反応に導くものであり、被検液中の共存
物質の影響を受けにくいため、被検液のブランク測定を
省略することができ、レイトアッセイによる簡便な測定
を成し得る。更にまた、胆汁酸測定用酵素を適宜変える
ことにより、３α−ＨＳＤによる総胆汁酸のみならず、
７α−ＨＳＤにょる７α−ヒドロキシ胆汁酸、１２α−
ＨＳＤにょる１２α−ヒドロキシ胆汁酸の分別定量を可
能ならしめるものである。
素サイクリング反応に導くものであり、被検液中の共存
物質の影響を受けにくいため、被検液のブランク測定を
省略することができ、レイトアッセイによる簡便な測定
を成し得る。更にまた、胆汁酸測定用酵素を適宜変える
ことにより、３α−ＨＳＤによる総胆汁酸のみならず、
７α−ＨＳＤにょる７α−ヒドロキシ胆汁酸、１２α−
ＨＳＤにょる１２α−ヒドロキシ胆汁酸の分別定量を可
能ならしめるものである。
尚、本発明においてはＡ２又はＢ、の測定に当り、吸光
度測定の代りに他の公知酵素測定法を使用して定量を行
うこともできる。
度測定の代りに他の公知酵素測定法を使用して定量を行
うこともできる。
叙上の如く、本発明は還元型の吸収波長の異なる補酵素
を用いるため測定誤差が生じず、また、酵素的サイクリ
ング反応を組合せることによって感度を増大させること
ができるため、少量の検体で迅速かつ正確に被検体中の
胆汁酸を定量することができる。
を用いるため測定誤差が生じず、また、酵素的サイクリ
ング反応を組合せることによって感度を増大させること
ができるため、少量の検体で迅速かつ正確に被検体中の
胆汁酸を定量することができる。
次いで本発明の実施例を挙げて具体的に述べるが、本発
明はこれによって何ら限定されるものではない。
明はこれによって何ら限定されるものではない。
実施例１
く試薬〉
４０ｍＭリン酸バッファ −（ｐＨ８，０）１ｍＭチオ
ＮＡＤ ０．２ｍＭ ＮＡＤＨ ０１１％ トリトンＸ−１００ ５Ｕ ／ ｍＱ ３ ａ −ＨＳＤ （Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉｉ由来 シグマ社製
）〈操作〉 上記試薬１顧をキュベツトにとり、０．１０．２０．４
０．６０．８０．１００μＭのコール酸溶液をそれぞれ
１０μＱ添加し、３７℃にて反応を開始させた。反応開
始後２分目と３分目の４０ｏｎ餡こおける吸光度を読み
とり、その差を求めた。その結果を図１に示す。
ＮＡＤ ０．２ｍＭ ＮＡＤＨ ０１１％ トリトンＸ−１００ ５Ｕ ／ ｍＱ ３ ａ −ＨＳＤ （Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉｉ由来 シグマ社製
）〈操作〉 上記試薬１顧をキュベツトにとり、０．１０．２０．４
０．６０．８０．１００μＭのコール酸溶液をそれぞれ
１０μＱ添加し、３７℃にて反応を開始させた。反応開
始後２分目と３分目の４０ｏｎ餡こおける吸光度を読み
とり、その差を求めた。その結果を図１に示す。
図１から明らかなように、コール酸量に対する吸光度変
化量は良好な直線性を示した。
化量は良好な直線性を示した。
実施例２
く試薬〉
４０ｍＭリン酸バッフｙ −（ｐＨ７，０）１ｍＭチオ
ＮＡＤ １ ｎ＋Ｍ ＮＡＤＨ ０，１％ トリトンＸ−１００ ２０Ｕ／ｍＱ ７ ａ−ＨＳＤ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ ｓｐ、東洋醸造カタログＮｏ、Ｔ−２８由来） 〈操作〉 上記試薬１顧をキュベツトにとり、０．１００．２００
、３００．４００．５００μＭノケノテオキシコール酸
溶液をそれぞれ１０μａ添加し、３７℃にて反応を開始
させた。反応開始後２分目と３分目の４００ｎｍにおけ
る吸光度を読みとり、その差を求めた。その結果を図２
に示す。図２から明らかなように、ケノデオキシコール
酸量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示した。
ＮＡＤ １ ｎ＋Ｍ ＮＡＤＨ ０，１％ トリトンＸ−１００ ２０Ｕ／ｍＱ ７ ａ−ＨＳＤ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ ｓｐ、東洋醸造カタログＮｏ、Ｔ−２８由来） 〈操作〉 上記試薬１顧をキュベツトにとり、０．１００．２００
、３００．４００．５００μＭノケノテオキシコール酸
溶液をそれぞれ１０μａ添加し、３７℃にて反応を開始
させた。反応開始後２分目と３分目の４００ｎｍにおけ
る吸光度を読みとり、その差を求めた。その結果を図２
に示す。図２から明らかなように、ケノデオキシコール
酸量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示した。
実施例３
〈試薬〉
４０ｍＭ ）リス−〇ＣＩＩ （ｐＨ８，５）１ｍＭチ
オＮＡＤ ２ ｍＭ ＮＡＤＰＨ ９Ｕ ／ ｉｌｌ ３ ａ −ＨＳＤ （Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ｓｐ、東洋醸造カタログＮｏ、Ｔ−２７由
来） 〈操作〉 上記試薬１ｍ１ｌをキュベツトにとり、０．１０．２０
．４０．６０．８０．１００μＭのコール酸溶液をそれ
ぞれ５０μｌ添加し、３７℃にて反応を開始させた。反
応開始後３分目と４分目の４００ｎｍにおける吸光度を
読みとり、その差を求めた。その結果を図３に示す。
オＮＡＤ ２ ｍＭ ＮＡＤＰＨ ９Ｕ ／ ｉｌｌ ３ ａ −ＨＳＤ （Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ｓｐ、東洋醸造カタログＮｏ、Ｔ−２７由
来） 〈操作〉 上記試薬１ｍ１ｌをキュベツトにとり、０．１０．２０
．４０．６０．８０．１００μＭのコール酸溶液をそれ
ぞれ５０μｌ添加し、３７℃にて反応を開始させた。反
応開始後３分目と４分目の４００ｎｍにおける吸光度を
読みとり、その差を求めた。その結果を図３に示す。
図３から明らかなように、コール酸量に対する吸光度変
化量は良好な直線性を示した。
化量は良好な直線性を示した。
実施例４
〈試薬〉
４０ｍＭ トリス−ＨＣＱ（ｐＨ８，０）１ｍＭチオＮ
ＡＤ ０．２ｍＭ ＮＡＤＨ ０１２％ トリト”ｙ Ｘ−１００ ２ｍＭオキサミン酸 １０Ｕ ／ｙｎｌｌ ３ ａ −Ｈ５Ｃ（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ｓｐ、東洋醸造カタログＮｏ、Ｔ＝２７由
来） 〈操作〉 上記試薬１ｍ１ｌを石英キュベツトにとり、５段階に希
釈した血清それぞれ１００μｇを添加し、３７℃にて反
応を開始させた。反応開始後３分目と４分目の４００ｎ
ｍにおける吸光度を読みとり、その差を求めた。その結
果を図４に示す。
ＡＤ ０．２ｍＭ ＮＡＤＨ ０１２％ トリト”ｙ Ｘ−１００ ２ｍＭオキサミン酸 １０Ｕ ／ｙｎｌｌ ３ ａ −Ｈ５Ｃ（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ｓｐ、東洋醸造カタログＮｏ、Ｔ＝２７由
来） 〈操作〉 上記試薬１ｍ１ｌを石英キュベツトにとり、５段階に希
釈した血清それぞれ１００μｇを添加し、３７℃にて反
応を開始させた。反応開始後３分目と４分目の４００ｎ
ｍにおける吸光度を読みとり、その差を求めた。その結
果を図４に示す。
実施例５
〈試薬〉
４０ｍＭ トリス−ＨＣｌ２ （ｐＨ８，０）１ｍＭチ
オＮＡＤ ０．２ｍＭ ＮＡＤＨ ０，２％ トリトンＸ−１００ ２ｍＭオキサミン酸 ３．５Ｕ ／ ｍＱ ３ ａ −Ｈ５Ｃ（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ｓｐ、東洋醸造カタログＮｏ、Ｔ −２７
由来） 〈操作〉 上記試薬ＩＴｒｆｉをキュベツトにとり、プール血清に
１０．２０．５０μＮになるようにコール酸を加えた被
検体５０μｇを添加し、実施例４と同様の操作を行った
。結果は表１の如くであり、回収率は９７．８〜１０４
．０％であった。
オＮＡＤ ０．２ｍＭ ＮＡＤＨ ０，２％ トリトンＸ−１００ ２ｍＭオキサミン酸 ３．５Ｕ ／ ｍＱ ３ ａ −Ｈ５Ｃ（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ｓｐ、東洋醸造カタログＮｏ、Ｔ −２７
由来） 〈操作〉 上記試薬ＩＴｒｆｉをキュベツトにとり、プール血清に
１０．２０．５０μＮになるようにコール酸を加えた被
検体５０μｇを添加し、実施例４と同様の操作を行った
。結果は表１の如くであり、回収率は９７．８〜１０４
．０％であった。
以下余白
表１
実施例６
〈試薬〉
５０ｍＭリン酸バッファ −（ｐＨ７，０）２．５ｍＭ
チオＮＡＤ ０．３５ｍＭ ＮＡＤＨ ５９Ｕ／ｍ１２７ ａ−Ｈ２Ｃ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ ｓｐ、東洋醸造カタログＮｏ、Ｔ−２８由来） 〈操作〉 上記試薬０．５ｍ１２を試験管にとり、０．０．２．０
，４．０６．０，８．１．０μＭのコール酸溶液をそれ
ぞれ２５μＱ添加し、３０℃にて６０分間反応させた。
チオＮＡＤ ０．３５ｍＭ ＮＡＤＨ ５９Ｕ／ｍ１２７ ａ−Ｈ２Ｃ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ ｓｐ、東洋醸造カタログＮｏ、Ｔ−２８由来） 〈操作〉 上記試薬０．５ｍ１２を試験管にとり、０．０．２．０
，４．０６．０，８．１．０μＭのコール酸溶液をそれ
ぞれ２５μＱ添加し、３０℃にて６０分間反応させた。
その後、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶
液０．５ｍ１ｌを添加して反応を停止させ、４００ｎＩ
Ｉ＋における吸光度を測定した。その結果を図５に示す
。図５から明らかなように、コール酸量に対する吸光度
変化量は良好な直線性を示した。
液０．５ｍ１ｌを添加して反応を停止させ、４００ｎＩ
Ｉ＋における吸光度を測定した。その結果を図５に示す
。図５から明らかなように、コール酸量に対する吸光度
変化量は良好な直線性を示した。
実施例７
〈試薬〉
４０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ１０，０）５ ｍＭ
ＮＡＤＰ ５０μＭチオＮＡＤ ０．４Ｍエタノール ３０Ｕ／ｍアルコールデヒドロゲナーゼ（オリエンタル
酵母社製） １０Ｕ ／ ｍｌｌ ３ ａ −Ｈ３Ｃ（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ｓｐ、 Ｂ−０８３１東洋醸造カタログＮ
ｏ、Ｔ −２７由来）０．２％ トリトンＸ−１００ 〈操作〉 上記試薬１ｍｌを石英キュベツトにとり、０．０．１゜
０．２．０，３．０．４．０，５關のコール酸溶液をそ
れぞれ１０μ症添加し、３７℃にて反応を開始させた。
ＮＡＤＰ ５０μＭチオＮＡＤ ０．４Ｍエタノール ３０Ｕ／ｍアルコールデヒドロゲナーゼ（オリエンタル
酵母社製） １０Ｕ ／ ｍｌｌ ３ ａ −Ｈ３Ｃ（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ｓｐ、 Ｂ−０８３１東洋醸造カタログＮ
ｏ、Ｔ −２７由来）０．２％ トリトンＸ−１００ 〈操作〉 上記試薬１ｍｌを石英キュベツトにとり、０．０．１゜
０．２．０，３．０．４．０，５關のコール酸溶液をそ
れぞれ１０μ症添加し、３７℃にて反応を開始させた。
反応開始後３分目と４分目の３４０ｎｍにおける吸光度
を読みとり、その差を求めた。その結果を図６に示す。
を読みとり、その差を求めた。その結果を図６に示す。
図６から明らかなように、コール酸量に対する吸光度変
化量は良好な直線性を示した。
化量は良好な直線性を示した。
実施例８
〈試薬〉
４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７，０）０．２
５ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０，０２５ｍＭチオＮＡＤ ５＋ｏＭジヒドロキシアセトンリン酸 １０Ｕ／−グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ
（ベーリンガー社製；ウサ ギ筋肉由来） ２０ｔＪ ／ ｍＱ ３ ａ −）ＩＳＤ （Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ、 Ｂ−０８３１東洋醸造カタロ
グＮｏ、Ｔ −２７由来）０．２％ トリトンＸ−１０
０ 〈操作〉 上記試薬１顧を石英キュベツトにとり、０．１０．２０
．３０．４０．５０μＭのコール酸溶液をそれぞれ５０
μｇ添加し、３７℃にて反応を開始させた。反応量４゜ 始後３分目と４分目の３４０ｎｍにおける吸光度を読み
とり、その差を求めた。その結果を図７に示す。
５ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０，０２５ｍＭチオＮＡＤ ５＋ｏＭジヒドロキシアセトンリン酸 １０Ｕ／−グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ
（ベーリンガー社製；ウサ ギ筋肉由来） ２０ｔＪ ／ ｍＱ ３ ａ −）ＩＳＤ （Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ、 Ｂ−０８３１東洋醸造カタロ
グＮｏ、Ｔ −２７由来）０．２％ トリトンＸ−１０
０ 〈操作〉 上記試薬１顧を石英キュベツトにとり、０．１０．２０
．３０．４０．５０μＭのコール酸溶液をそれぞれ５０
μｇ添加し、３７℃にて反応を開始させた。反応量４゜ 始後３分目と４分目の３４０ｎｍにおける吸光度を読み
とり、その差を求めた。その結果を図７に示す。
図７から明らかなように、コール酸量に対する吸光度変
化量は良好な直線性を示した。
化量は良好な直線性を示した。
図１は実施例１における、コール酸量に対する４００ｎ
ｍにおけるレイトアッセイの結果を示す図面である。 図２は実施例２における、ケノデオキシコール酸量に対
する４００ｎｍにおけるレイトアッセイの結果を示す図
面である。 図３は実施例３における、コール酸量に対する４００ｎ
ｍにおけるレイトアッセイの結果を示す図面である。 図４は実施例４における、血清量に対する４００ｎｍに
おけるレイトアッセイの結果を示す図面である。 図５は実施例６における、コール酸量に対する４００ｎ
ｍにおけるレイトアッセイの結果を示す図面である。 図６は実施例７における、コール酸量に対する３４０ｎ
ｍｌこおけるレイトアッセイの結果を示す図面である。 図７は実施例８における、コール酸量に対する３４０止
におけるレイトアッセイの結果を示す図面である。 以上
ｍにおけるレイトアッセイの結果を示す図面である。 図２は実施例２における、ケノデオキシコール酸量に対
する４００ｎｍにおけるレイトアッセイの結果を示す図
面である。 図３は実施例３における、コール酸量に対する４００ｎ
ｍにおけるレイトアッセイの結果を示す図面である。 図４は実施例４における、血清量に対する４００ｎｍに
おけるレイトアッセイの結果を示す図面である。 図５は実施例６における、コール酸量に対する４００ｎ
ｍにおけるレイトアッセイの結果を示す図面である。 図６は実施例７における、コール酸量に対する３４０ｎ
ｍｌこおけるレイトアッセイの結果を示す図面である。 図７は実施例８における、コール酸量に対する３４０止
におけるレイトアッセイの結果を示す図面である。 以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、被検体に、 （１）チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホス
フェート類（以下チオＮＡＤＰ類という）及びチオニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下チオＮＡＤ
類という）からなる群より選ばれる１つと、ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドホスフェート類（以下ＮＡ
ＤＰ類という）及びニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド類（以下ＮＡＤ類という）からなる群より選ばれる
１つとを補酵素とし、少なくとも胆汁酸を基質としてオ
キソ胆汁酸を生成する可逆反応をなすステロイドデヒド
ロゲナーゼ、 （２）Ａ＿１、 （３）Ｂ＿１、 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式▲数式、化
学式、表等があります▼ （式中、Ａ＿１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡ
ＤＰ類又はＮＡＤ類を示し、Ａ＿２はＡ＿１の還元型生
成物を示し、Ｂ＿１はＡ＿１がチオＮＡＤＰ類又はチオ
ＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類又は還元型ＮＡＤ類
を、Ａ＿１がＮＡＤＰ類又はＮＡＤ類のときは還元型チ
オＮＡＤＰ類又は還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ＿２は
Ｂ＿１の酸化型生成物を示す）で表されるサイクリング
反応を形成せしめ、該反応によって変化するＡ＿２又は
Ｂ＿１の量を測定することを特徴とする胆汁酸の高感度
定量法。 ２、被検体に、 （１）チオＮＡＤＰ類及びチオＮＡＤ類からなる群より
選ばれる１つと、ＮＡＤＰ類及びＮＡＤ類からなる群よ
り選ばれる１つとを補酵素とし、少なくとも胆汁酸を基
質としてオキソ胆汁酸を生成する可逆反応をなすステロ
イドデヒドロゲナーゼ、 （２）Ａ＿１、 （３）Ｂ＿１又は／及びＢ＿２、 （４）胆汁酸及びＡ＿１に作用せず、Ｂ＿２→Ｂ＿１の
反応を形成する第２のデヒドロゲナーゼ及び該第２のデ
ヒドロゲナーゼの基質、 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式▲数式、化
学式、表等があります▼ （式中、Ａ＿１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡ
ＤＰ類又はＮＡＤ類を示し、Ａ＿２はＡ＿１の還元型生
成物を示し、Ｂ＿１はＡ＿１がチオＮＡＤＰ類又はチオ
ＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類又は還元型ＮＡＤ類
を、Ａ＿１がＮＡＤＰ類又はＮＡＤ類のときは還元型チ
オＮＡＤＰ類又は還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ＿２は
Ｂ＿１の酸化型生成物を示し、Ｂ＿２→Ｂ＿１はＢ＿２
を補酵素としてＢ＿１を生成する酵素反応を示す）で表
されるサイクリング反応を形成せしめ、該反応によって
生成されるＡ＿２の量を測定することを特徴とする胆汁
酸の高感度定量法。 ３、被検体に、 （１）チオＮＡＤＰ類及びチオＮＡＤ類からなる群より
選ばれる１つと、ＮＡＤＰ類及びＮＡＤ類からなる群よ
り選ばれる１つとを補酵素とし、少なくとも胆汁酸を基
質としてオキソ胆汁酸を生成する可逆反応をなすステロ
イドデヒドロゲナーゼ、 （２）Ａ＿１又は／及びＡ＿２、 （３）Ｂ＿１、 （５）胆汁酸及びＢ＿１に作用せず、Ａ＿２→Ａ＿１の
反応を形成する第３のデヒドロゲナーゼ及び該第３のデ
ヒドロゲナーゼの基質、 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式▲数式、化
学式、表等があります▼ （式中、Ａ＿１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＰ類、ＮＡ
ＤＰ類又はＮＡＤ類を示し、Ａ＿２はＡ＿１の還元型生
成物を示し、Ｂ＿１はＡ＿１がチオＮＡＤＰ類又はチオ
ＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類又は還元型ＮＡＤ類
を、Ａ＿１がＮＡＤＰ類又はＮＡＤ類のときは還元型チ
オＮＡＤＰ類又は還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ＿２は
Ｂ＿１の酸化型生成物を示し、Ａ＿２→Ａ＿１はＡ＿２
を補酵素としてＡ＿１を生成する酵素反応を示す）で表
されるサイクリング反応を形成せしめ、該反応によって
消費されるＢ＿１の量を測定することを特徴とする胆汁
酸の高感度定量法。 ４、ステロイドデヒドロゲナーゼが、３α−ヒドロキシ
ステロイドデヒドロゲナーゼである請求項１〜３のいず
れかの項記載の胆汁酸の高感度定量法。 ５、ステロイドデヒドロゲナーゼが、７α−ヒドロキシ
ステロイドデヒドロゲナーゼである請求項１〜３のいず
れかの項記載の胆汁酸の高感度定量法。 ６、ステロイドデヒドロゲナーゼが、１２α−ヒドロキ
システロイドデヒドロゲナーゼである請求項１〜３のい
ずれかの項記載の胆汁酸の高感度定量法。 ７、ＮＡＤＰ類が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドホスフェート（ＮＡＤＰ）、アセチルピリジンアデ
ニンジヌクレオチドホスフェート（アセチルＮＡＤＰ）
およびニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドホ
スフェート（デアミノＮＡＤＰ）からなる群より選ばれ
るものである請求項１〜３のいずれかの項記載の胆汁酸
の高感度定量法。 ８、ＮＡＤ類がニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（ＮＡＤ）、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド
（アセチルＮＡＤ）およびニコチンアミドヒポキサンチ
ンジヌクレオチド（デアミノＮＡＤ）からなる群より選
ばれるものである請求項１〜３のいずれかの項記載の胆
汁酸の高感度定量法。 ９、チオＮＡＤ類がチオＮＡＤ、チオニコチンアミドヒ
ポキサンチンジヌクレオチドからなる群より選ばれるも
のである請求項１〜３のいずれかの項記載の胆汁酸の高
感度定量法。 １０、チオＮＡＤＰ類がチオＮＡＤＰ、チオニコチンア
ミドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフェートからな
る群より選ばれるものである請求項１〜３のいずれかの
項記載の胆汁酸の高感度定量法。 １１、次の成分（１）〜（３） （１）チオＮＡＤＰ類及びチオＮＡＤ類からなる群より
選ばれる１つと、ＮＡＤＰ類及びＮＡＤ類からなる群よ
り選ばれる１つとを補酵素とし、少なくとも胆汁酸を基
質としてオキソ胆汁酸を生成する可逆反応をなすステロ
イドデヒドロゲナーゼ、 （２）Ａ＿１、 （３）Ｂ＿１、 を含有することを特徴とする胆汁酸定量用組成物。 １２、次の成分（１）〜（４） （１）チオＮＡＤＰ類及びチオＮＡＤ類からなる群より
選ばれる１つと、ＮＡＤＰ類及びＮＡＤ類からなる群よ
り選ばれる１つとを補酵素とし、少なくとも胆汁酸を基
質としてオキソ胆汁酸を生成する可逆反応をなすステロ
イドデヒドロゲナーゼ、 （２）Ａ＿１、 （３）Ｂ＿１又は／及びＢ＿２ （４）胆汁酸及びＡ＿１に作用せず、Ｂ＿２→Ｂ＿１の
反応を形成する第２のデヒドロゲナーゼ及び該第２のデ
ヒドロゲナーゼの基質、 を含有することを特徴とする胆汁酸定量用組成物。 １３、次の成分（１）〜（３）及び（５） （１）チオＮＡＤＰ類及びチオＮＡＤ類からなる群より
選ばれる１つと、ＮＡＤＰ類及びＮＡＤ類からなる群よ
り選ばれる１つとを補酵素とし、少なくとも胆汁酸を基
質としてオキソ胆汁酸を生成する可逆反応をなすステロ
イドデヒドロゲナーゼ、 （２）Ａ＿１又は／及びＡ＿２、 （３）Ｂ＿１、 （５）胆汁酸及びＢ＿１に作用せず、Ａ＿２→Ａ＿１の
反応を形成する第３のデヒドロゲナーゼ及び該第３のデ
ヒドロゲナーゼの基質、 を含有することを特徴とする胆汁酸定量用組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2309412A JPH0673479B2 (ja) | 1989-12-01 | 1990-11-15 | 胆汁酸の高感度定量法および定量用組成物 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31320289 | 1989-12-01 | ||
| JP1-313202 | 1989-12-01 | ||
| JP2309412A JPH0673479B2 (ja) | 1989-12-01 | 1990-11-15 | 胆汁酸の高感度定量法および定量用組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03224498A true JPH03224498A (ja) | 1991-10-03 |
| JPH0673479B2 JPH0673479B2 (ja) | 1994-09-21 |
Family
ID=26565947
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2309412A Expired - Fee Related JPH0673479B2 (ja) | 1989-12-01 | 1990-11-15 | 胆汁酸の高感度定量法および定量用組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0673479B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996008581A1 (en) * | 1994-09-13 | 1996-03-21 | Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. | Integral multilayer analytical element for assaying sulfate-conjugated bile acid |
| WO2010082665A1 (ja) | 2009-01-19 | 2010-07-22 | 旭化成ファーマ株式会社 | メバロン酸、3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムaおよびコエンザイムaの測定方法ならびに測定試薬 |
| US10472665B2 (en) | 2014-09-26 | 2019-11-12 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Measuring method and composition using kinase |
| WO2025023240A1 (ja) * | 2023-07-24 | 2025-01-30 | 富士フイルム株式会社 | 胆汁酸分析用乾式分析要素および胆汁酸の測定方法 |
-
1990
- 1990-11-15 JP JP2309412A patent/JPH0673479B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996008581A1 (en) * | 1994-09-13 | 1996-03-21 | Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. | Integral multilayer analytical element for assaying sulfate-conjugated bile acid |
| US5776779A (en) * | 1994-09-13 | 1998-07-07 | Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. | Integral multi-layer element for analyzing bile acid sulfate |
| WO2010082665A1 (ja) | 2009-01-19 | 2010-07-22 | 旭化成ファーマ株式会社 | メバロン酸、3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムaおよびコエンザイムaの測定方法ならびに測定試薬 |
| US9458491B2 (en) | 2009-01-19 | 2016-10-04 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Method and reagent for measuring mevalonic acid, 3-hydroxymethylglutaryl coenzyme A, and coenzyme A |
| US10975411B2 (en) | 2009-01-19 | 2021-04-13 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Method and reagent for measuring mevalonic acid, 3-hydroxymethylglutaryl coenzyme A, and coenzyme A |
| US10472665B2 (en) | 2014-09-26 | 2019-11-12 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Measuring method and composition using kinase |
| WO2025023240A1 (ja) * | 2023-07-24 | 2025-01-30 | 富士フイルム株式会社 | 胆汁酸分析用乾式分析要素および胆汁酸の測定方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0673479B2 (ja) | 1994-09-21 |
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