JPH0673479B2 - 胆汁酸の高感度定量法および定量用組成物 - Google Patents

胆汁酸の高感度定量法および定量用組成物

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JPH0673479B2
JPH0673479B2 JP2309412A JP30941290A JPH0673479B2 JP H0673479 B2 JPH0673479 B2 JP H0673479B2 JP 2309412 A JP2309412 A JP 2309412A JP 30941290 A JP30941290 A JP 30941290A JP H0673479 B2 JPH0673479 B2 JP H0673479B2
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nad
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成 植田
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旭化成工業株式会社
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は胆汁酸、特に生体試料中の３α−ヒドロキシ胆
汁酸の高感度定量法及び３α−ヒドロキシ胆汁酸定量用
組成物に関する。
〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕
血清等の生体試料中の胆汁酸を測定することは、肝機能
検査として、あるいは黄疸、胆石症の成立機序の解明な
どのため重要である。
従来、コール酸、デオキシコール酸やケノデオキシコー
ル酸などを含む３α−ヒドロキシ胆汁酸、７α−ヒドロ
キシ胆汁酸や12α−ヒドロキシ胆汁酸などの胆汁酸の測
定法としては種々の方法が報告されているが、近年臨床
検査には、一般に、３α−ヒドロキシステロイドデヒド
ロゲナーゼ及び１つの補酵素としてニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド類（以下NAD類という）またはニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート類（以
下NADP類という）を反応させて、３α−ヒドロキシ胆汁
酸量に比例して生成する還元型NAD類（以下NADH類とい
う）又は還元型NADP類（以下NADPH類という）を測定す
る方法（特公昭59−13197号）が使用されている。しか
しながら、この方法はビリルビンの影響を受け易いため
に予め胆汁酸の分離が必要である、多量の検体が必要で
ある、また感度が低いという欠点があった。そのため高
感度発色剤を使用する工夫もなされているが〔第33回日
本臨床病理学会総会抄録、123頁（1986）及び第34回同
抄録、124頁（1987）〕、これも本質的な解決とはなっ
ていない。
また、他の方法として、生成した３−オキソステロイド
を更に３−オキソ−△４−ステロイドデヒドロゲナーゼ
の作用により３−△４−ステロイドとし、ホルマザン色
素を従来の２倍量生成させるキットも市販されている
が、これも感度がたかだか２倍になったにすぎない。
更にまた、胆汁酸の量に比例して生成されるNADH又はNA
DPHを酵素サイクリング反応を利用して高感度に測定す
る方法が報告されている（特公昭63−36758号）。しか
し、この方法も、NADH又はNADPHを酵素サイクリング反
応によって増幅させるためには、残存している過剰のNA
D又はNADPをアルカリ加温処理によって分解除去しなけ
ればならないため操作が煩雑であり、臨床検査のような
多検体を処理する場合には不利なるを免れなかった。
従って、例えば血中胆汁酸の低下をきたす疾患に吸収不
良症候群があるが、このような正常値以下の濃度を正確
に測定することは現在の酵素法では困難である。
また、大部分の胆汁酸は、３α位に水酸基を有するが、
胆汁酸の種類により、３α位のほかに７α位、12α位に
水酸基を有するため、３α−ヒドロキシ胆汁酸の測定に
は３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３α
−HSD）を用いるものであるが、７α−ヒドロキシ胆汁
酸や12α−ヒドロキシ胆汁酸の測定には７α−HSD、12
α−HSDを用いてそれぞれ検体中の胆汁酸を測定すれ
ば、ガスクロマトグラフィーなどの機器を用いなくて
も、個々の胆汁酸レベルを測定することが理論上可能で
ある。実際、３α−HSDによる胆汁酸の測定に加え、12
α−ヒドロキシ胆汁酸を同時に測定することは、肝実質
障害の程度、推移の把握に利用しうる可能性がある、と
の報告もあり（医学のあゆみ、vo1.143,No.10,775−776
（1987））、このような面からも胆汁酸定量の高感度化
が望まれている。
〔課題を解決するための手段〕
そこで、本発明者らは先に胆汁酸を基質としてオキソ胆
汁酸を生成する可逆反応において、特定の微生物由来の
ステロイドデヒドロゲナーゼを使用し、NAD類（又はNAD
P類）を補酵素として胆汁酸からオキソ胆汁酸を生成さ
せる反応系となし、かつ当該補酵素と異なる少量のNADP
H類（又はNADH類）を共存させて、胆汁酸とオキシ胆汁
酸の間の可逆的サイクリング反応を行えば、NADH類（又
はNADPH類）の生成量が時間経過と共に直線的に増加
し、しかもその増加速度が胆汁酸の量と比例することを
見出し、先に出願した（特願平１−98443号）。
しかしながら、この方法も生成するNADPHとNADHの極大
吸収波長がどちらも340nmと同じであるため、胆汁酸の
量と比例して生成した還元型のみを測定する際に誤差を
生じるという問題があった。
一方、NAD及びNADPのアナログであるチオニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド（以下チオNADという）及び
チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェー
ト（以下チオNADPという）は還元型の極大吸収波長が40
0nm付近にあり、NAD及びNADPの還元型の極大吸収波長と
は異なることが知られている。
斯かる実情において、本発明者らは更に研究を進めた結
果、３α−HSDを用いて先の酵素サイクリング反応を実
施するに当り、２種類の補酵素の１つにチオNADP類又は
チオNAD類を使用して、どちらか一方の補酵素の変化量
のみを定量すれば、特に３α−ヒドロキシステロイド又
はオキソステロイドを高感度に定量できることを見出
し、更にこの方法によれば３α−ヒドロキシ胆汁酸定量
を正確に行うことができることを見出し、本発明を完成
した。
すなわち、本発明は被検体に、 チオNADP類及びチオNAD類からなる群より選ばれる１
つと、NADP類及びNAD類からなる群より選ばれる１つと
を補酵素とし、少なくとも３α−ヒドロキシ胆汁酸を基
質として３−オキソ胆汁酸を生成する可逆反応をなす３
α−ヒドロキシステロイドヒドロゲナーゼ、 A1、 B1、 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式（Ｉ） （式中、A1はチオNADP類、チオNA類、NADP類又はNAD類
を示し、A2はA1の還元型生成物を示し、B1はA1がチオNA
DP類又はチオNAD類のときは還元型NADP類又は還元型NAD
類を、A1がNADP類又はNAD類のときは還元型チオNADP類
又は還元型チオNAD類を示し、B2はB1の酸化型生成物を
示す） で表されるサイクリング反応を形成せしめ、該反応によ
って変化するA2又はB1の量を測定することを特徴とする
３α−ヒドロキシ胆汁酸の高感度定量法、並びに上記
、及びを含有することを特徴とする３α−ヒドロ
キシ胆汁酸定量用組成物を提供するものである。
本発明において、３α−ヒドロキシステロイドデヒドロ
ゲナーゼとしては上記要件を具備するものであれば何れ
のものでも使用できるが、その具体例は、NAD類及びチ
オNAD類を補酵素とするものとしては、シュードモナス
テストステロニ（Pseudomonas testosteroni、J.B.
C.,227,37−52（1957））、バシルス スファエリカス
（Bacillus sphaericus;特開昭54−157894号公報）由来
の３α−ヒドロキシステロイドヒドロゲナーゼ（３α−
HSD）（EC 1.1.1.50）等が挙げられる。また、NAD類、N
ADP類、チオNAD類及びチオNADP類を共に補酵素するもの
としては、ラット肝、前立腺（J.Steroid Biochem.,8,4
1−46（1977））、シュードモナス sp.B−0831（Pseud
omonas sp.B−0831、東洋醸造カタログNO.T−27）由来
の３α−HSDが挙げられる。
また、A1及びB2はチオNADP類、チオNAD類、NADP類又はN
AD類を示すが、このうちNADP類又はNAD類としては例え
ば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェー
ト（NADP）、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド
ホスフェート（アセチルNADP）及びニコチンアミドヒポ
キサンチンジヌクレオチドホスフェート（デアミノNAD
P）；及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NA
D）、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド（アセ
チルNAD）及びニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレ
オチド（デアミノNAD）が挙げられる。
本発明においてはA1及びB2のいずれか一方がチオNAD類
又はチオNADP類であることが必要である。
また、チオNADP類又はチオNAD類としては、例えばチオ
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート
（チオNADP）、チオニコチンアミドヒポキサンチンジヌ
クレオチドホスフェート及びチオニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（チオNAD）、チオニコチンアミドヒ
ポキサンチンジヌクレオチドが挙げられる。
また、定量に用いる３α−ヒドロキシステロイドデヒド
ロゲナーゼがNAD類のみを補酵素とする場合は、チオNAD
類と上述のNAD類より、また用いる３α−ヒドロキシス
テロイドデヒドロゲナーゼがNAD類及びNADP類を共に補
酵素とする場合は、チオNAD類及びチオNADP類と上述のN
AD類及びNADP類より適宜選択して用いればよい。
A1及びB1の量は被検体中の胆汁酸の量に比較して過剰量
であり、また３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナ
ーゼのA1及びB1それぞれに対するKm値に比較しても過剰
量であることが必要であり、特に３α−ヒドロキシ胆汁
酸量の20〜10000倍モルが好ましい。
本発明の３α−ヒドロキシ胆汁酸定量用組成物において
は、A1及びB1の濃度は0.02〜100mM、特に0.05〜30mMが
好ましく、３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナー
ゼの濃度は0.05〜100U/ml、特に１〜50U/mlが好ましい
が、その量は被検体の種類等により適宜決定することが
でき、これ以上の量を用いることもできる。
また、本発明定量法は３α−ヒドロキシステロイドデヒ
ドロゲナーゼがNAD類及びNADP類を共に補酵素とする場
合において、２つの補酵素にチオNAD類とNAD類もしくは
NADP類との組み合わせ、またはチオNADP類とNAD類もし
くはNADP類との組み合わせを選んだときは、更に被検体
に成分の３α−ヒドロキシ胆汁酸及びA1に作用せず、
B2→B1の反応を形成する第２のデヒドロゲナーゼ及び該
第２のデヒドロゲナーゼの基質を作用せしめることによ
り、後記反応式（II）の如く、B1とB2との間にB1の再生
のための反応系を付与せしめることにより３α−ヒドロ
キシ胆汁酸のサイクリング反応も形成し得る。この場
合、定量の際には反応により生成したA2の量を測定す
る。
（式中、A1はチオNADP類、チオNAD類、NADP類又はNAD類
を示し、A2はA1還元型生成物を示し、B1はA1がチオNADP
類又はチオNAD類のときは還元型NADP類又は還元型NAD類
を、A1がNADP類又はNAD類のときは還元型チオNADP類又
は還元型チオNAD類を示し、B2はB1の酸化型生成物を示
し、B2→B1はB2を補酵素としてB1を生成する酵素反応を
示す） すなわち、第２のデヒドロゲナーゼはB1の再生の為に補
助的に添加するものであり、これによってB1の使用量を
少なくすることが可能となり、特にB1が高価な場合には
有効である。また、B1の代わりにB2あるいはB1とB2の混
合物を用いて反応を行ってもよい。この場合、B1又は／
及びB2の使用量は特に限定されるものではないが、一般
的にはA1の1/10モル以下が好ましい。
この成分を用いる３α−ヒドロキシ胆汁酸定量用組成
物において、A1の濃度は0.02〜100mM、特に0.05〜30mM
が好ましく、B2又は／及びB1の濃度は0.05〜5000μＭ、
特に５〜500μＭが好ましく、３α−ヒドロキシステロ
イドデヒドロゲナーゼの濃度は0.05〜100U/ml、特に１
〜50U/mlが好ましく、第２のデヒドロゲナーゼはB2に対
するKm値（mM単位）の20倍量（U/ml単位）以上になるよ
うに調整すればよく、例えば１〜100U/mlが好ましく、
また第２のデヒドロゲナーゼの基質は過剰量、例えば0.
05〜20mMが好ましい。これらの量は被検体の種類等によ
り適宜決定することができ、これ以上の量を用いること
もできる。
第２のデヒドロゲナーゼ及びその基質としては、例え
ば、B2がNAD類またはチオNAD類のときは、アルコールデ
ヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.1）とエタノール、グリセロ
ールデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.6）（E.Coli由来）と
グリセロール、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ（EC 1.1.1.8）（ウサギ筋肉由来）とＬ−グリセロ
ール−３−リン酸、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.
1.1.37）（ブタ心筋、ウシ心筋由来）とＬ−リンゴ酸、
グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.
1.12）（ウサギ骨格筋、肝、酵母、E.Coli由来）とＤ−
グリセロアルデヒドリン酸とリン酸、B2がNADP類または
チオNADP類のときは、グルコース−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼ（EC 1.1.1.49）（酵母由来）とグルコース−
６−リン酸、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.
1.42）（酵母、ブタ心筋由来）とイソクエン酸、グリオ
キシル酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.17）（Pseudomon
as oxalaticus由来）とCoAとグリオキシル酸、ホスホグ
ルコン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.44）（ラット
肝、ビール酵母、E.Coli由来）と６−ホスホ−Ｄ−グル
コン酸、グルセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ
（EC 1.2.1.13）（植物葉緑体由来）とＤ−グリセロア
ルデヒド−３−リン酸とリン酸、ベンズアルデヒドデヒ
ドロゲナーゼ（EC 1.2.1.7）（Pseudomonas fluorescen
s由来）とベンズアルデヒド等が挙げられる。
更にまた、本発明定量法は３α−ヒドロキシステロイド
デヒドロゲナーゼがNAD類及びNADP類を共に補酵素とす
る場合において、２つの補酵素にチオNAD類とNAD類もし
くはNADP類との組み合わせ、またはチオNADP類とNAD類
もしくはNADP類との組み合わせを選んだときは、更に被
検体に成分の３α−ヒドロキシ胆汁酸及びB1に作用せ
ず、A2→A1の反応を形成する第３のデヒドロゲナーゼ及
び該第３のデヒドロゲナーゼの基質を作用せしめること
により、後記反応式（III）の如く、A1とA2との間にA1
の再生のための反応系を付与せしめることにより３α−
ヒドロキシ胆汁酸のサイクリング反応を形成し得る。こ
の場合、定量の際にはB1の消費量を測定する。
（式中、A1はチオNADP類、チオNAD類、NADP類又はNAD類
を示し、A2はA1の還元型生成物を示し、B1はA1がチオNA
DP類又はチオNAD類のときは還元型NADP類又は還元型NAD
類を、A1がNADP類又はNAD類のときは還元型チオNADP類
又は還元型チオNAD類を示し、B2はB1の酸化型生成物を
示し、A2→A1はA2を補酵素としてA1を生成する酵素反応
を示す） すなわち、第３のデヒドロゲナーゼはA1の再生の為に補
助的に添加するものであり、これによってA1の使用量を
少なくすることが可能となり、特にA1が高価な場合には
有効である。また、A1の代わりにA2あるいはA1とA2の混
合物を用いて反応を行ってもよい。この場合、A1又は／
及びA2の使用量は特に限定されるものではないが、一般
的にはB1の1/10以下が好ましい。
この成分を用いる３α−ヒドロキシ胆汁酸定量用組成
物において、B1の濃度は0.02〜100mM、特に0.05〜30mM
が好ましく、A2又は／及びA1の濃度は0.05〜5000μＭ、
特に５〜500μＭが好ましく、３α−ヒドロキシステロ
イドデヒドロゲナーゼの濃度は0.05〜100U/ml、特に１
〜50U/mlが好ましく、第３のデヒロゲナーゼはA2に対す
るKm値（mM単位）の20倍量（U/ml単位）以上になるよう
に調整すればよく、例えば１〜100U/mlが好ましく、ま
た第３のデヒドロゲナーゼの基質は過剰量、例えば0.05
〜20mMが好ましい。これらの量は被検体の種類等により
適宜決定することができ、これ以上の量を用いることも
できる。
第３のデヒドロゲナーゼ及びその基質としては、例え
ば、A1がNAD類又はチオNAD類のときは、アルコールデヒ
ドロゲナーゼ（EC 1.1.1.1）とアセトアルデヒド、グイ
セロールデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.6）（E.Coli由
来）とジヒドロキシアセトン、グリセロール−３−リン
酸デヒドロゲナーゼ（ED 1.1.1.8）（ウサギ筋肉由来）
とジヒドロキシアセトンリン酸、リンゴ酸デイドロゲナ
ーゼ（EC 1.1.1.37）（ブタ心筋、ウシ心筋由来）とオ
キザロ酢酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナー
ゼ（EC1.1.1.12）（ウサギ骨格筋、肝、酵母E.Coli由
来）と1,3−ジホスホ−Ｄ−グリセリン酸、A1がNADP類
またはチオNADP類のときは、グルコース−６−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.49）（酵母由来）とグリコ
ノラクトン−６−リン酸、グリセロアルデヒドリン酸デ
ヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.13）（植物葉緑体由来）
と、1,3−ジホスホ−Ｄ−グリセリン酸等が挙げられ
る。
本発明の３α−ヒドロキシ胆汁酸定量用組成物の調製に
あたって、使用できる３α−ヒドロキシステロイドデヒ
ドロゲナーゼに関しては、例えば補酵素としてNAD類
（好ましくはNAD）、チオNAD類（好ましくはチオNA
D）、あるいはNADP類（好ましくはNADP）、チオNADP類
（好ましくはチオNADP）を用いて、基質となるコール酸
等の３α−ヒドロキシ胆汁酸に対する反応性を有するも
のであればよく、これら補酵素と基質を用いることによ
り確認できるものである。
反応液組成については、使用する３α−ヒドロキシステ
ロイドデヒドロゲナーゼの各補酵素間の相対活性等を考
慮して２種の補酵素を適宜選択し、その後正反応／逆反
応の至適pHの間のpH条件を適宜調整して、正反応／逆反
応の反応速度比が１に近づくようにpH条件を設定すれば
よい。例えば、３α−HSD（Pseudomonas sp.B−0831,東
洋醸造カタログNo.T−27）についてみれば、コール酸を
基質にし、補酵素にチトNADを用いた場合のNADを用いた
場合に対する相対活性は40％程度であり、また、正反応
の至適pHは9.5付近で、逆反応の至適pHは5.5付近であ
る。また、これらの酵素は単独でも、適宜２種以上を組
合せて用いてもよい。
斯くして、調製された本発明の３α−ヒドロキシ胆汁酸
定量用組成物によって被検体中の３α−ヒドロキシ胆汁
酸量を測定するには、上記成分〜、〜、あるい
は〜及びを含有する組成物に被検体0.001〜0.5ml
を加え、約37℃の温度にて反応させ、反応開始一定時間
後の２点間の数分ないし数十分間、例えば３分後と４分
後の１分間又は３分後と８分後の５分間における生成さ
れたA2の量又は消費されたB1の量を、それぞれの吸収波
長に基づく吸光度の変化によって測定すればよい。例え
ばA2がチオNADH、B1かNADHの場合、A2の生成を400nmの
吸光度の増加により測定するか、あるいはB1の消費を34
0nmの吸光度の減少により測定し、既知濃度の３α−ヒ
ドロキシ胆汁酸を用いて測定したときの値と比較すれ
ば、被検液中の３α−ヒドロキシ胆汁酸量をリアルタイ
ムで算出することができる。
また、本発明定量法は、被検液中の３α−ヒドロキシ胆
汁酸そのものを酵素サイクリング反応に導くものであ
り、被検液中の共存物質の影響を受けにくいため、被検
液のブランク測定を省略することができ、レイトアッセ
イによる簡便な測定を成し得る。更にまた、３α−ヒド
ロキシ胆汁酸測定用酵素を用いる本発明の高感度定量法
は、その３α−HSDの代りに、７α−HSDを用いて7a−ヒ
ドロキシ胆汁酸、12α−HSDを用いて12α−ヒドロキシ
胆汁酸を定量する場合に比較して、単位酵素量当たりの
感度がより良好に定量し得るものである。
尚、本発明においてはA2又はB1の測定に当り、吸光度測
定の代りに他の公知酵素測定法を使用して定量を行うこ
ともできる。
〔発明の効果〕
叙上の如く、本発明は還元型の吸収波長の異なる補酵素
を用いるため測定誤差が生じず、また、酵素的サイクリ
ング反応を組合せることによって感度を増大させること
ができるため、少量の検体で迅速かつ正確に被検体中の
３α−ヒドロキシ胆汁酸を特に高感度にて定量すること
ができる。
〔実施例〕 次いで本発明の実施例を挙げて具体的に述べるが、本発
明はこれによって何ら限定されるものではない。
尚、単位酵素濃度当たりのサイクリング率（Kc）は次に
示す式により計算した。
Kc:単位酵素濃度当たりのサイクリング率（サイクル／
分・u/ml） A:吸光度（mAbs） V:反応全液量（ml） e:反応液中での酵素濃度（u/ml） x:被検体量（nmol） tj反応時間（分） ε：分子吸光係数（cm2/μmol）（チオNADの場合11.9） 実施例１ ＜試薬＞ 40mM リン酸バッファー（pH8.0） 1mM チオNAD 0.2mM NADH 0.1％ トリトンＸ−100 5U/ml 3α−HSD（Pseudomonas testosteroni由来 シグ
マ社製） ＜操作＞ 上記試薬1mlをキュベットにとり、０、10、20、40、6
0、80、100μＭのコール酸溶液をそれぞれ10μｌ添加
し、37℃にて反応を開始させた。反応開始後２分目と３
分目の400nmにおける吸光度を読み取り、その差を求め
た。その結果を図１に示す。図１から明らかなように、
コール酸量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示し
た。
この図１からKc＝1.11（サイクル／分・u/ml）であり、
高感度測定をなし得たものと判断し得た。
実施例２ ＜試薬＞ 40mM トリス−HCl（pH8.5） 1mM チオNAD 2mM NADPH 9U/ml 3α−HSD（Pseudomonas sp.東洋醸造カタログNo.
T−27由来） ＜操作＞ 上記試薬1mlをキュベットにとり、０、10、20、30、4
0、50μＭのコール酸溶液をそれぞれ50μｌ添加し、37
℃にて反応を開始させた。反応開始後３分目と４分目の
400nmにおける吸光度を読み取り、その差を求めた。そ
の結果を図３に示す。図３から明らかなように、コール
酸量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示した。
この図３からKc＝0.54（サイクル／分・u/ml）であり良
好な高感度測定を示すものであった。
実施例３ ＜試薬＞ 40mM トリス−HCl（pH8.0） 1mM チオNAD 0.2mM NADH 0.2％ トリトンＸ−100 2mM オキサミン酸 10U/ml 3α−HSD（Pseudomonas sp.東洋醸造カタログN
o.T−27由来） ＜操作＞ 上記試薬1mlを石英キュベットにとり、５段階に希釈し
た血清それぞれ100μｌを添加し、37℃にて反応を開始
させた。反応開始後３分目と４分目の400nmにおける吸
光度を読み取り、その差を求めた。その結果を図４に示
す。
実施例４ ＜試薬＞ 40mM トリス−HCl（pH8.0） 1mM チオNAD 0.2mM NADH 0.2％ トリトンＸ−100 2mM オキサミン酸 3.5U/ml 3α−HSD（Pseudomonas sp.東洋醸造カタログN
o.T−27由来） ＜操作＞ 上記試薬1mlをキュベットにとり、プール血清に10、2
0、50μＭになるようにコール酸を加えた被検体50μｌ
を添加し、実施例３と同様の操作を行った。結果は表１
の如くであり、回収率は97.8〜104.0％であった。
実施例５ ＜試薬１＞ 20mM PIPES緩衝液（pH6.5） 3mM チオNAD 0.02％ トリトンＸ−100 ＜試薬２＞ 200mM トリス−HCl（pH8.5） 1.5mM NADH 9U/ml 3α−HSD（Pseudomonas sp.B−831） ＜操作＞ 日立7510自動分析機を用い以下の手順により測定を実施
した。試薬１を260μｌに５、10、15、20、25、30、3
5、40、45、50μmol/のコール酸溶液各々３μｌを混
合し37℃、５分間加温する。その後試薬２を130μｌ添
加し、添加後の１分目と３分目の405nmにおける吸光度
を読み取り、１分間当たりの吸光度変化量に換算した。
結果を図５に示した。図５から明らかなように、コール
酸量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示し、Kc＝
1.69（サイクル／分・u/ml）となった。
実施例６ ＜試薬＞ 40mM グリシン−NaOH（pH10.0） 5mM NADP 50μM チオNAD 0.4M エタノール 30U/ml アルコールデヒドロゲナーゼ（オリエンタル酵
母社製） 10U/ml 3α−HSD（Pseudomonas sp.B−0831東洋醸造カ
タログNo.T−27由来） 0.2％ トリトンＸ−100 ＜操作＞ 上記試薬1mlを石英キュベットにとり、０、0.1、0.2、
0.3、0.4、0.5mMのコール酸溶液をそれぞれ10μｌ添加
し、37℃にて反応を開始させた。反応開始後３分目と４
分目の340nmにおける吸光度を読み取り、その差を求め
た。その結果を図６に示す。図６から明らかなように、
コール酸量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示し
た。
実施例７ ＜試薬＞ 40mM PIPES−NaOH（pH7.0） 0.25mM NADPH 0.25mM チオNAD 5mM ジヒドロキシアセトリン酸 10U/ml グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ
（ベーリンガー社製；ウサギ筋肉由来） 20U/ml 3α−HSD（Pseudomonas sp.B−0831東洋醸造カ
タログNo.T−27由来） 0.2％ トリトンＸ−100 ＜操作＞ 上記試薬1mlを石英キュベットにとり、０、10、20、3
0、40、50μＭのコール酸溶液をそれぞれ50μｌ添加
し、37℃にて反応を開始させた。反応開始後３分目と４
分目の340nmにおける吸光度を読み取り、その差を求め
た。その結果を図７に示す。図７から明らかなように、
コール酸量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示し
た。
参考例１ ＜試薬＞ 40mM リン酸バッファー（pH7.0） 1mM チオNAD 1mM NADH 0.1％ トリトンＸ−100 20U/ml 7α−HSD（Pseudomonas sp.東洋醸造カタログN
o.T−28由来） ＜操作＞ 上記試薬1mlをキュベットにとり、０、100、200、300、
400、500μＭのケノデオキシコール酸溶液をそれぞれ10
μｌ添加し、37℃にて反応を開始させた。反応開始後２
分目と３分目の400nmにおける吸光度を読み取り、その
差を求めた。その結果を図２に示す。図２から明らかな
ように、ケノデオキシコール酸量に対する吸光度変化量
は良好な直線性を示した。この図２からKc＝0.15（サイ
クル／分・u/ml）であると判断し得た。
【図面の簡単な説明】
図１は実施例１における、コール酸量に対する400nmに
おける吸光度変化量の結果を示す図面である。 図２は参考例１における、ケノデオキシコール酸量に対
する400nmにおける吸光度変化量の結果を示す図面であ
る。 図３は実施例２における、コール酸量に対する400nmに
おける吸光度変化量の結果を示す図面である。 図４は実施例３における、血清量に対する400nmにおけ
る吸光度変化量の結果を示す図面である。 図５は実施例５における、コール酸量に対する400nmに
おける吸光度変化量の結果を示す図面である。 図６は実施例６における、コール酸量に対する340nmに
おける吸光度変化量の結果を示す図面である。 図７は実施例７における、コール酸量に対する340nmに
おける吸光度変化量の結果を示す図面である。

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】被検体に、 チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェ
    ート類（以下チオNADP類という）及びチオニコチンアミ
    ドアデニンジヌクレオチド類（以下チオNAD類という）
    からなる群より選ばれる１つと、ニコチンアミドアデニ
    ンジヌクレオチドホスフェート類（以下NADP類という）
    及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下NA
    D類という）からなる群より選ばれる１つとを補酵素と
    し、少なくとも３α−ヒドロキシ胆汁酸を基質として３
    −オキソ胆汁酸を生成する可逆反応をなす３α−ヒドロ
    キシステロイドデヒドロゲナーゼ、 A1、 B1、 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式 （式中、A1はチオNADP類、チオNAD類、NADP類又はNAD類
    を示し、A2はA1の還元型生成物を示し、B1はA1がチオNA
    DP類又はチオNAD類のときは還元型NADP類又は還元型NAD
    類を、A1がNADP類又はNAD類のときは還元型チオNADP類
    又は還元型チオNAD類を示し、B2はB1の酸化型生成物を
    示す） で表されるサイクリング反応を形成せしめ、該反応によ
    って変化するA2又はB1の量を測定することを特徴とする
    ３α−ヒドロキシ胆汁酸の高感度定量法。
  2. 【請求項２】被検体に、 チオNADP類及びチオNAD類からなる群より選ばれる１
    つと、NADP類及びNAD類からなる群より選ばれる１つと
    を補酵素とし、少なくとも３α−ヒドロキシ胆汁酸を基
    質として３−オキソ胆汁酸を生成する可逆反応をなす３
    α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、 A1、 B1又は／及びB2、 ３α−ヒドロキシ胆汁酸及びA1に作用せず、B2→B1の
    反応を形成する第２のデヒドロゲナーゼ及び該第２のデ
    ヒドロゲナーゼの基質、 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式 （式中、A1はチオNADP類、チオNAD類、NADP類又はNAD類
    を示し、A2はA1の還元型生成物を示し、B1はA1がチオNA
    DP類又はチオNAD類のときは還元型NADP類又は還元型NAD
    類を、A1がNADP類又はNAD類のときは還元型チオNADP類
    又は還元型チオNAD類を示し、B2はB1の酸化型生成物を
    示し、B2→B1はB2を補酵素としてB1を生成する酵素反応
    を示す）で表されるサイクリング反応を形成せしめ、該
    反応によって生成されるA2の量を測定することを特徴と
    する３α−ヒドロキシ胆汁酸の高感度定量法。
  3. 【請求項３】被検体に、 チオNADP類及びチオNAD類からなる群より選ばれる１
    つと、NADP類及びNAD類からなる群より選ばれる１つと
    を補酵素とし、少なくとも３α−ヒドロキシ胆汁酸を基
    質として３−オキソ胆汁酸を生成する可逆反応をなす３
    α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、 A1又は／及びA2、 B1、 ３α−ヒドロキシ胆汁酸及びB1に作用せず、A2→A1の
    反応を形成す る第３のデヒドロゲナーゼ及び該第３のデヒドロゲナー
    ゼの基質、 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式 （式中、A1はチオNADP類、チオNAD類、NADP類又はNAD類
    を示し、A2はA1の還元型生成物を示し、B1はA1がチオNA
    DP類又はチオNAD類のときは還元型NADP類又は還元型NAD
    類を、A1がNADP類又はNAD類のときは還元型チオNADP類
    又は還元型チオNAD類を示し、B2はB1の酸化型生成物を
    示し、A2→A1はA2を補酵素としてA1を生成する酵素反応
    を示す）で表されるサイクリング反応を形成せしめ、該
    反応によって消費されるB1の量を測定することを特徴と
    する３α−ヒドロキシ胆汁酸の高感度定量法。
  4. 【請求項４】NAD（Ｐ）類が、ニコチンアミドアデニン
    ジヌクレオチドホスフェート（NADP）、アセチルピリジ
    ンアデニンジヌクレオチドホスフェート（アセチルNAD
    P）およびニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチ
    ドホスフェート（デアミノNADP）からなる群より選ばれ
    るNADP類、又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
    （NAD）、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド
    （アセチルNAD）およびニコチンアミドヒポキサンチン
    ジヌクレオチド（デアミノNAD）からなる群より選ばれ
    るNAD類である請求項１〜３のいずれかの項記載の３α
    −ヒドロキシ胆汁酸の高感度定量法。
  5. 【請求項５】チオNAD（Ｐ）類が、チオNAD、チオニコチ
    ンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドからなる群より
    選ばれるチオNAD類、又はチオNADP、チオニコチンアミ
    ドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフェートからなる
    群より選ばれるチオNADP類である請求項１〜３のいずれ
    かの項記載の３α−ヒドロキシ胆汁酸の高感度定量法。
  6. 【請求項６】次の成分〜 チオNADP類及びチオNAD類からなる群より選ばれる１
    つと、NADP類及びNAD類からなる群より選ばれる１つと
    を補酵素とし、少なくとも３α−ヒドロキシ胆汁酸を基
    質として３−オキソ胆汁酸を生成する可逆反応をなす３
    α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、 A1、 B1、 を含有することを特徴とする３α−ヒドロキシ胆汁酸定
    量用組成物。
  7. 【請求項７】次の成分〜 チオNADP類及びチオNAD類からなる群より選ばれる１
    つと、NADP類及びNAD類からなる群より選ばれる１つと
    を補酵素とし、少なくとも３α−ヒドロキシ胆汁酸を基
    質として３−オキソ胆汁酸を生成する可逆反応をなす３
    α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、 A1、 B1又は／及びB2 ３α−ヒドロキシ胆汁酸及びA1に作用せず、B2→B1の
    反応を形成する第２のデヒドロゲナーゼ及び該第２のデ
    ヒドロゲナーゼの基質、 を含有することを特徴とする３α−ヒドロキシ胆汁酸定
    量用組成物。
  8. 【請求項８】次の成分〜及び チオNADP類及びチオNAD類からなる群より選ばれる１
    つと、NADP類及びNAD類からなる群より選ばれる１つと
    を補酵素とし、少なくとも３α−ヒドロキシ胆汁酸を基
    質として３−オキソ胆汁酸を生成する可逆反応をなす３
    α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、 A1又は／及びA2、 B1、 ３α−ヒドロキシ胆汁酸及びB1に作用せず、A2→A1の
    反応を形成する第３のデヒドロゲナーゼ及び該第３のデ
    ヒドロゲナーゼの基質、 を含有することを特徴とする３α−ヒドロキシ胆汁酸定
    量用組成物。
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