JPH03247295A - ジフルクトース・ジアンヒドリドｉの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ジフルクトース・ジアンヒドリドＩ（以下、
ｒＤＦＡＩ　Ｊという。）の製造法に関するものである
。

（従来技術及び発明が解決しようとする問題点）ＤＦＡ
Ｉはフルクトース２分子が１−２’、２−１′の間で脱
水縮合した構造を持つ２Ｗ類であり、ジャクソンらによ
り１９２９年に単離同定されている（Ｂｕｒ、５ｔａｎ
ｄ、Ｊ、Ｒｅｓ、。

主、２７．　１９２９）。

ＤＦＡＩは、動物体内では代謝されず、非発酵性の糖で
あるため低カロリー甘味剤として注目されており、今後
美容食等多方面に利用されることが予想される。

ジャクソンらは、フルクトースを主成分とする多糖であ
るイヌリンを酸加水分解することによりＤＦＡＩを得て
いるが、収率はわずか２％弱であり、化学的にイヌリン
を加水分解する方法は効率的とはいえない。

そこで近年、微生物学的方法を利用してイヌリンからＤ
ＦＡＩを製造する方法が提唱されている。

例えば、日中らは１９７９年かびの産生ずるイヌリン分
解酵素を用いてイヌリンからＤＦＡＩを生成させている
。（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、Ｒｅｓ、。

ユ５，３４０．１９７９）。また厚木らはアルスロバク
タ−・グロビフォルミスの産生ずるイヌリン分解酵素を
用いてイヌリンからＤＦＡＩを生成させている（特開昭
６２−２７５６９３号公報）。

しかしながら、微生物学的方法によるＤＦＡＩの製造法
についてはまだ数が少なく効率的に生産する酵素の提供
が必要である。

（問題点を解決するための手段） そこで、本発明者らはイヌリンからＤＦＡＩを微生物学
的方法により製造する方法について鋭意研究を進めた結
果、アルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃ
ｔｅｒ　　ｓｐ、）微工研菌寄第１１２８７号（ＦＥＲ
ＭＰ−１１２８７）由来のイヌリン分解酵素が効率よ＜
ＤＦＡＩを生産することを見いだし、本発明をするに至
った。

すなわち本発明の要旨は、イヌリン含有液中、イヌリン
をアルスロバクター・エスピー微工研菌寄第１１２８７
号（ＦＥＲＭＰ−１１２８７）由来のイヌリン分解酵素
と反応させることを特徴とするジフルクトース・ジアン
ヒドリドＩの製造法に存する。　　以下本発明を説明す
るに、本発明で使用するイヌリン分解酵素は、アルスロ
バクター・エスピー微工研菌寄第１１２８７号（ＦＥＲ
ＭＰ−１１２８７）由来のものである。

本発明のアルスロバクター・エスピー（ＭＣＩ２４９３
号菌）は、本発明者等により、天然土壌から分離された
細菌であり、その菌学的性状は次の通りである。

１、形態的性状 ○ハートインフュージョン寒天培地上、３０°Ｃ１１週
間培養後のコロニーの特徴 １）外形　　　　：　円形 ２）大きさ　　　：　２〜３ｍｍ ３）表面の隆起　：　凸状 ４）表面の形状　：　平滑 ５）光沢　　　　：　鈍光 ６）色調　　　　：　黄味灰色 ７）透明度　　　：　半透明 ８）周縁　　　　：　金縁 ○ハートインフュージョン寒天培地上、３０°Ｃ１３〜
４８時間培養中の形態的性質 １）細胞形態：培養後６〜１２時間ぐらいまでは、細胞
は不均一に伸長し、長い桿状になる。

その後中央部に隔壁が形成され、細胞は湾曲状に曲がり
、漸次分節を繰り返す。１８時間以降はほとんどの細胞
が短稈状の斉一な形態に変化する。

２）細胞分裂様式：Ｂｅｎｄｉｎｇ　　ｔｙｐｅ３）運
動性　：なし ４）胞子形成　　：なし ５）ダラム染色　：陽性 ６）抗酸性　：陰性 ２、生理的性質 １）嫌気条件下での生育 ２）空気中での生育 ３）カタラーゼ ４）オキシダーゼ ５）０−Ｆテスト ロ）ゼラチンの加水分解 ：陰性 ：陽性 ：陽性 ：陰性 ：酸生成せず ：陽性 ８） ９） １０） １１） １２） 硝酸塩の還元 メチルレッドテス ＶＰテスト インドールの生成 硫化水素の生成 ：陰性 ト　：陰性 ：陰性 ：陰性 ：陰性 １３） デンプンの加水分解 ：陰性 １５） １６） １７） １８） 無機窒素源の利用 ウレアーゼ カゼインの加水分解 ＤＮａ　ｓ　ｅの生産 ：陽性 ：陰性 ：陽性 ：陰性 ２０）色素の生成 ２１）生育温度域 ２２）生育ｐＨ ：陰性 ２１０〜３７°Ｃ ：　ｐＨ５〜１０ ２３）各種糖類からの酸の生成 ・培養後１〜３週間観察 ＋ ：生成能有。

±：疑わしい。

：生成能無 ２４） 有機酸の資化性 ・培養後１〜３週間観察 ・十：資化能有、−：資化能無 ３、化学分類学的性状 １）ＤＮＡ中のＣＣ含量 ２）細胞壁のアミノ酸組成 リジン ６６％ アラニン スレオニン グルタミン酸 ３）ペプチドグリカン架橋構造 Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−ＡＩ または Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａｚ ４）細胞壁の糖組成′　　　　ラムノースガラクトース ５）グリコレート・テスト　アセチル型６）主要メナキ
ノン　　　　ＭＫ９（Ｈ２）４、分類学的考察 Ｏ属しベルの同定 本菌株（ＭＣ１２４９３号菌）は、 １発明ル・サイクル（ｃｅｌｌ　　ｃｙｃｌｅ）に桿状
〜短稈状（Ｒｏｄｓ−ｃｏｃｃｕｓ）の多形性を有する ２）絶対好気性菌である ３）グルコース等の糖類から酸を生成しない４）ＤＮＡ
中のＧＣ含量は６６％と高いＧＣを示す ５）細胞壁のジアミノ−アミノ酸はリジンを有する ６）主要メナキノンはＭＫ９（Ｈｚ）を有する などの特徴を示す。

これらの特徴から、本国はパージエイズ　マニュアル　
オブ　システマティック　バクテリオロジー（Ｂｅｒｇ
ｅｙ　　ｓ　　Ｍａｎｎｕａｌ　　ｏｆＳｙｓｔｅｍａ
ｔｉｃ　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第２巻に記載さ
れている、多形性、芽胞非形成、ダラム染色陽性桿菌（
Ｉｒｒｅｇｕｌａｒ。

Ｎｏｎｓｐｏｒｉｎｇ、Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　
　Ｒｏｄｓ）群のアルスロバクタ−属菌に帰属すること
が判明した。

０種レベルの同定 アルスロバクタ−属菌には、現在約１５種が含まれてい
る。これらの種は、各種の生理学的性質、化学分類学的
性質において識別されているが、特に細胞壁の架橋ペプ
チド構造、Ｉ１組成、メナキノン組成の相違が種レベル
の重要な分類基準と見なされている。　（Ｋ、Ｈ，５ｃ
ｈｌｅｉｂｅｒ＆　　Ｏ，Ｋａｎｄｌｅｒ、Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ。

Ｒｅｖ、、Ｖｏｌ、３６：４０７−４７７．１９７２、
Ｂｅｒｇｅｙ　　ｓ　　Ｍａｎｎｕａｌ　　ｏｆＳｙｓ
ｔｅｍａｔｉｃ　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　　Ｖ
ｏｌ、　２） 本菌株（ＭＣＩ２４９３号菌）は、 １発生要メナキノンとしてＭＫ９（Ｈ２）を含有する ２）細胞壁の架橋ペプチド構造はＬｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈ
ｒ−ＡｌａまたはＬｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａ、である ３）細胞壁の糖としてラムノース及びガラクトースを含
有する ４）運動性を示さない という特徴を持っている。これらの性状と、Ｂｅｒｇｅ
ｙ　　ｓ　　Ｍａｎｎｕａｌ　　ｏｆ　　Ｓｙｓｔｅｍ
ａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ第２巻及び、Ｍ、
Ｔａｋｅｕｃｈｉ　　＆　　Ａ、Ｙ。

ｋｏｔａ、Ｊ、Ｇｅｎ、Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
、、　　ｖｏｌ、　　３５：２３３−２５２．　１９８
９に記載されているアルスロバクタ−属の種の特徴と比
較した結果、本菌株はアルスロバクタ−・アラレセンス
（Ａｌｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　　ａｕれた。しかし、有
機酸の資化性、デンプンの加水分解等の生理的性質に違
いが見られた。正式な種の帰属は、今後アルスロバクタ
−・アラレセンスあるいは類似種と本国との核酸レベル
での比較をした上で決定することとする。従って現段階
では編菌株（ＭＣＩ２４９３号菌）をアル発生バクタ−
・エスピーと同定した。

さらに、ＤＦＡＩ生産菌として公知であるアルスロバク
タ−・グロビフォルミス（Ａ　１　ｔ　ｈ　ｒ　ｂａｃ
ｔｅｒ　　　ｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）の菌学的性状と本
菌株を対比したところ、下記表に示すように、架橋ペプ
チドの構造及び細胞壁の糖組成の主要な点において明ら
かに区別された。

本発明においては、前記の菌を通常の微生物が利用しう
る栄養物を含有する培地で培養することにより容易に増
殖させることができる。栄養源としては、グルコース、
水飴、デキストリン、シュクロース、澱粉、１１蜜、動
・植物油等を使用できる。また窒素源として、大豆粉、
小麦胚芽、コーンステイープリカー、綿実粕、肉エキス
、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸ソー
ダ。

尿素等を使用できる。その他必要に応じ、ナトリウム、
カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素
、燐酸、硫酸及びその他のイオンを生成する無機塩類を
添加する事は有効である。

本発明においては、イヌリンあるいはキクイモ。

ゴボウ等のイヌリン含有量の高い植物の抽出液を唯一の
炭素源として含む溶液中で、上記アルスロバクター・エ
スピー微工研菌寄第１１２８７号（ＦＥＲＭＰ−１１２
８７）由来のイヌリン分解酵素を作用させる。その際、
該細菌そのものを作用させても良いし、また、該細菌か
ら該酵素を抽出し、それを作用させても良い。

細菌そのものを作用させる場合、炭素源としてのイヌリ
ンを約１−１０％含有し、その他、例えば窒素源として
、大豆粉、小麦胚芽、コーンステイープリカー、綿実粕
、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム
、硝酸ソーダ、尿素等、更に必要に応じ、ナトリウム、
カリウム、マグネシウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸
及びその他のイオンを生成する事のできる無機塩類等を
添加した培地に重囲を接種し振とう培養を行う。

この際培養温度は２０−３７°Ｃが、また、培養時間は
１２−４０時間が好適である。得られた培養液を遠心分
離により除菌し、その上清中の酵素を加熱処理により失
活させる。そして濃縮を行い、例えばこれを活性炭カラ
ムクロマトグラフィーにより活性炭カラムに吸着させる
。蒸留水でフルクトースを溶出させた後、５％エタノー
ル水溶液にて溶出を行う。この分画中にＤＦＡＩが得ら
れるので、それを濃縮乾固すると所期のＤＦＡＩを得る
ことができる。

また酵素を作用させる場合、まず前記方法により培養を
行った培養液を遠心分離により除菌し、得られた濾紙に
硫安（６５％飽和）を加え塩析を行い、析出した沈澱物
を遠心分離により取得し、少量の水に懸濁させたのち透
析を行い、粗酵素液を得る。この粗酵素液を例えばｐＨ
７，０に調製した０、０１−０．１Ｍのリン酸緩衝液中
でイヌリンに作用させる事によっても所期のＤＦＡＩが
得られる。

本粗酵素は、例えばＤＦＡＥ−Ｔｏ　ｙ　ｏ　ｐ　ｅ　
ａｒｌ　　ＨＷ　　５５Ｆ、ＳＰ−Ｔｏｙｏｐｅａｒ１
６５０Ｍカラム（東ソー製）によるイオン交換クロマト
グラフィーにて精製を行う事により、電気泳動的に単一
のバンドを示す酵素標品を得ることができる。本酵素標
品の至適ＰＨは６．０で、また５０°Ｃで最大活性を示
した。、ｐＨは５−９の範囲で安定であり、３０分間の
熱処理では６０°Ｃまで安定であり、５ＤＳ−ポリアク
リルアミド電気泳動による分子量は約４０，０００であ
った。

（実施例） 以下に実施例をあげて本発明の方法さらに具体的に説明
するが、本発明はその要旨を越えない限りこれらに限定
されるものではない。

実施例１ 市販イヌリン５％、酵母エキス０．０２％、硝酸ナトリ
ウム０．２％、硫酸マグネシウム０．０５％、塩化カリ
ウム０．０５％、リン酸−カリウム０．０５％、塩化第
二鉄０．００１％、を含んだ培地１５０ｄをｐＨ７，０
に調製して、１２０°Ｃで２０分間蒸気滅菌した。この
滅菌した溶液に、ＭＣＩ　２４９３菌を一白金耳接種し
、１６０　ｒ。

ｐ、ｍ、で３０°Ｃ１３０時間培養した。

培養終了後遠心分離により菌体を除去し、培養炉液を得
た。得られた培養炉液を１０分間加熱処理する事により
、酵素を失活させ、約１０ｄにまで減圧濃縮した。この
液は活性炭カラム（活性炭３０ｇとセライトＮα５３５
．６０ｇの混合物を蒸留水にて充填）に吸着させ、蒸留
水１１を流したのち、５％エタノール水溶液で溶出した
。

溶出ピークを集めて減圧濃縮にて乾固してＤＦＡｌを得
た。得られたＤＦＡＩは、原料イヌリンにたいして１０
％であった。薄層クロマトグラフィ（シリカゲルプレー
）　（ＭＥＲＣＫ社）；展開溶媒ｎ−ブタノール：エタ
ノール：水−２＝１：１　（ｖ／ｖ／ｖ））によると、
イヌリンの酸分解により得られた標準のＤＦＡＩとＲｆ
値（０，６）が一致した。

実施例２ 実施例１で得られた培養炉液１１ｄを、１０％のイヌリ
ンを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液４ｄに加えて３０°Ｃ
で一夜反応させた。

反応液を加熱し酵素を失活させた後、活性炭カラムクロ
マトグラフィーを行い、５％エタノールにて溶出させ、
溶出液を減圧濃縮にて乾固してＤＦＡＩを得た。

得られたＤＦＡＩは、原料イヌリンに対して３０％であ
った。

（発明の効果） 本発明のアルスロバクター・エスピー微工研菌寄第１１
２８７号（ＦＥＲＭＰ−１１２８７）由来のイヌリン分
解酵素は、イヌリンからＤＦＡＩを良好に生産するので
、 ＤＦＡＩの連続生産を行 わせる際に非常に有効であると考えられる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）イヌリン含有溶液中、イヌリンをアルスロバクタ
   ー・エスピー（ＭＣＩ２４９３）微工研菌寄第１１２８
   ７号（ＦＥＲＭＰ−１１２８７）由来のイヌリン分解酵
   素と反応させることを特徴とするジフルクトース・ジア
   ンヒドリドＩの製造方法。