JPS61264254A - ポリエチレンイミン結合クロマトグラフ充填剤 - Google Patents

ポリエチレンイミン結合クロマトグラフ充填剤

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JPS61264254A JP61090202A JP9020286A JPS61264254A JP S61264254 A JPS61264254 A JP S61264254A JP 61090202 A JP61090202 A JP 61090202A JP 9020286 A JP9020286 A JP 9020286A JP S61264254 A JPS61264254 A JP S61264254A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明に従えば、平均粒径約３〜約７０ミクロン及び平
均孔寸法約５０〜約１０００オングストローム単位を有
する微粒シリカゲル又は平均粒径約３７ニ約１７７ミク
ロン及び平均孔寸法約４０〜約１０００オングストロー
ム単位を有する微粒状の孔の抑制されたガラス（ＣＰＧ
）と、約４００〜約１８００の平均分子量を有するポリ
エチレンイミノプロピルトリメトキシシラン（ＰＥＩ−
Ｐｒ−ｔｒｉＭｅＯ−シラン）との共有結合非架橋ポリ
エチレンイミン反応生成物が、アシル官能基が末端カル
ボニルを有していない酸ハロゲン化物又は酸無水物でＮ
−アシル化され、生じるアシルかされたＰＥｌ−Ｐｒ５
ｉ−シリカゲル及びＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−ＣＰＧ生成物は
夫々蛋白質の精製及び分離の為の液体クロマトグラフィ
のカラム充填剤として適した同相として有用である。
（従来の技術） アルバート及びレグニア−はＪ、　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒ。
１８５、３７５−３９２（１９７９）でポリエチレンイ
ミン（ＰＥＩ）がシリカ表面に吸着出来それによって隣
接する吸着されたＰＥ１分子上に十分な第１級及び第２
級イミノ基を与え、これが多官能オキシランによって重
合層に架橋されることを示している。最近では、高性能
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用し、架橋さ
れたポリエチレンイミンで被覆された微粒子シリカのカ
ラムで合成オリゴヌクレオチドを分離することがＴ、Ｇ
、ロウソン等、Ａｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１３３゜８
５−９３１９８３に文献に報告されている。これに対し
て、本発明は、上に吸着されるのではなくて、非架橋性
のポリエチレンイミノプロとルシランが共有結合されて
いる多孔性のシリカ又はガラス支持体を提供するもので
あり、そのイミノ及びアミノ官能基は末端が非カルボキ
シル化されたアシル部分でアシル化されている。
（問題を解決する為の手段） 本発明は「ポリエチレンイミン結合クロマトグラフ充填
剤」という名称の特開昭６０−１３５７６１号の（１９
８３年１１月２５日米国出願の米国出願番号５５５，３
６８中において共同発明者の一人であるフグラムスデン
によって記載され、そして上記米国出願に基づいて優先
権主張をしている本発明者の出願している同じ題名の１
９８４年１１月１４日出願の南アフリカ特許出願８４／
８８８６に記載されている）共有結合非架橋ＰＥｌ−Ｐ
ｒ５ｉ−シリカゲル及びＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−ＣＰＧ生成
物のアシル化された改良を提供するものである。
上記の出願はここで参照する。ラムスデンのＰＥ１−Ｐ
ｒ５ｉ−シリカゲル生成物も米国特許４，４６９，６３
０に記載されている。
本発明にしてかってアシル化されるべき基質をラムスデ
ンの非架橋性共有結合表れたＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−シリカ
ゲル及びＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−ＣＰＧ製品が構成している
ので、上記の出願のラムスデンの関連のある抜粋をここ
に再び記載する。
［特開昭６０−１３５７６１の抜粋］ 該発明の非架橋共有結合ＰＥＩシリカゲル及びガラス生
成物は次の段階によフて都合よく生成される。
Ａ　平均粒径約３〜約７０ミクロン及び平均孔寸法約５
０〜約１．０００オングストロ一ム単位を有する微粒シ
リカゲル又は平均粒径約３７〜約１７７ミクロン及び平
均孔寸法約４０〜約１０００オングストローム単位を有
する微粒状の孔の制御されたガラスのいずれかを、不活
性有機溶媒スラリー中で、約４００〜約１８００の平均
分子量を有するポリエチレンイミノプロピルトリメトキ
シシランの低級アルカノール性溶液と約２〜約５０時間
環境温度〜還流温度で反応させ、 Ｂ　生じる固体フラクションを反応混合物から回収し、 Ｃ上記固体フラクションを乾燥し且つシランをそれぞれ
シリカゲル又は孔の制御されたガラスに完全に結合する
のに十分な温度及び時間で加熱する。
本明細書で使用する「共有結合」又は「共有結合された
」という用語は、ＰＥ１部分がシリカゲル又は孔の制御
されたガラスに化学的相互作用によって共有的に結合さ
れていて、プロピル−シリル（Ｐｒ−５ｉ）の結合を生
じていることを意味し、「非架橋」という用語は隣接す
る共有結合したＰＥ１部分上のイミノ及びアミノ基が架
橋していない又は架橋剤と反応し、重合層を形成してい
ないことを意味する。
次に通りになるとは限らないが反応は次のように２段階
で完了すると考えられる。
段階１　シラン上のシリカヒドロキシル及びメトキシ基
が反応して５ｉ−０−５ｉ結合及び遊離メタノールを形
成し、幾らかの残留メトキシ基が未反応のままでいる。
段階２　残留メトキシ基との反応の完結がａ）及びｂ）
による熱硬化の間に行なわれる。
無定形のシリカからなるシリカゲルは、不規則及び球状
（好ましい）の微粒形で市販されており、また幾つかの
商品等級で得られ、メツシュ寸法が３−３−３２５（Ａ
ＳＴの範囲である。数字的なメツシュ寸法の表示に頼る
よりも、本発明の為のより正確な指標はシリカゲルの微
粒の平均粒径及び平均孔寸法が夫々約３〜７０ミクロン
及び約５０〜約１０００、好ましくは約２５０〜５００
オングストローム単位のものである。　ＨＰＬＣクロマ
トグラフカラム充填に使用する最終製品のためには、約
３〜約ｌＯミクロンのシリカゲル出発物質が好ましく、
低圧クロマトグラフィーカラム充填用には約４０〜約７
０ミクロンがこのましい。
液体クロマトグラフィーに使用する為に化学的にシリカ
に似ているシリケート含有支持物質であるところの孔の
制御されたガラス（ＣＰＧ）は市販されており、例えば
ピアースケミカルカンパニー、ロックフォード、イリノ
イから得ることが出来、平均粒径が３０〜１７７ミクロ
ンそして平均孔寸法が４０〜１０００オングストローム
、好ましくは４０〜５００オングストロームである。
シリカゲル又はＣＰＧスラリーを調製するのに適した不
活性有機溶媒のなかで脂肪族炭化水素例えば、ヘキサン
、ヘプタンなど、芳香族炭化水素例えば、ベンゼン、ト
ルエン、キシレンなど、低級アルカノール類例えば、エ
タノール、イソプロパツール、ブタノールなど、塩素化
メタン、例えば塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭
素などく注意そのようなりロロ溶媒は高温で反応するか
もしれない）、及びテトラヒドロフラン、グライム（グ
リコールジメチルエーテル）、ジグライム（ジエチレン
グリコールジメチルエーテル）などの他の不活性溶媒が
適している。一般に溶媒ｍ１に対しシリカゲル又はＣＰ
Ｇのグラムｌ：５の比が適当なスラリーを与える。シリ
カゲル及びＣＰＧ微粒の細かく不溶性である性質の為に
真の溶液でなくスラリーが得られる。
（Ｎ−トリメトキシシリルプロピル）−ポリエチレンイ
ミンとしても知られているポリエチレンイミノプロピル
トリメトキシシランはポリエチレンイミンとアミノプロ
ピルトリメトキシシランとの反応生成物で次の式によっ
て記載される。
Ｍｅ ＭｅＯ−５ｉ−（ｊ１２ｃｌ−１２Ｃ）１２−ＮＨ−（
Ｃ）１２Ｃ８２Ｎ）Ｉ）ｎ−Ｃ）Ｉ２ＣＨ２−ＮＪＭｅ ここで本発明の目的にはｎは約４〜３７の整数又は平均
分子量で表現すると約４００〜１８００である。
シラン（１）は反応中でシリカゲルまたはＣＰＧとの反
応中に於いてシランを可溶化させる為の十分なアルカノ
ールを使用して低級Ｃ１〜Ｃ６アルカノール溶液の形で
使用される。５０Ｘ（ｗ／ｗ）のイソプロパツール溶液
が好ましい。一般に約２５〜＋０００３のシラン又はこ
れに代わって約５０〜２００　ｍｌの５０Ｘ（Ｗ／讐）
シランのアルカノール溶液が各１００　ｇのシリカゲル
又はＣＰＧと反応するのに使用される。反応は環境温度
で実施できるが反応溶媒系の還流までの高温を反応速度
を強めるために使用することが出来る。反応は実質的な
完了（段階１）迄に容易に２〜５０時間内に進行する。
反応体の混合中に攪はんをするのが有利であるが、その
後の反応は更に攪はんすることなしに続き得る。無水の
条件は臨界的でなく、小量の水即ち約０．１〜１．０１
／スラリ一溶媒５０ｍ１の存在が反応に悪影響を与えな
いことが見いだされている。
生じる固体フラクションは反応混合物から慣用の物理的
手段例えばろ過、遠心分離などによって回収される。一
般にろ過半段は粒径５ミクロンを保持するのに十分なも
のであるのに対し、遠心は３ミクロンの粒子寸法に適し
ている。
回収された固体フラクションは次に、乾燥、モしてシラ
ンとシリカゲル又はＣＰＧの完全な共有結合に十分な温
度及び時間で熱硬化される。一般に約４０〜１２０℃に
於ける　１−４時間が十分であることが分かった。この
ようにして得られた共有結合し、非架橋の最終生成物は
好ましくは約０．５〜約３、Ｎ％の窒素を含有している
。
［以上で特開昭６０−１３５７６１の抜粋終り］本発明
に於てラムスデンの上記の非架橋、共有結合されたＰＥ
ｌ−Ｐｒ５ｉ−シリカゲルとＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−ＣＰＧ
生成物のイミノ及びアミノ官能基がアシル化剤として適
当な酸ハロゲン化物及び酸無水物でＮ−アシル化出来、
式Ｒ−ＣＯ−（式中Ｒは０１〜Ｃ８アルキル、フェニル
、アラルキル、及び０１〜Ｃ４アルキル、０１〜Ｃ４ア
ルコキシ、ハロ及びニトロからなる群から選ばれるｌ又
はそれ以上の置換基で置換されたフェニルからなる群か
ら選ばれる一員である）を有するアシル官能基を提供で
きることが分かった。「ハロ」という用語はブロモ、ク
ロロ、フルオロ及びヨードを含む。「アラルキル」とい
う用語はベンジル、１−フェネチル、２−フェネチル、
α−ナフチル等を含む。
慣用の元素分析によって容易に決定することができるＰ
Ｅｌ−Ｐｒ５ｉ−シリカゲル又はＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−Ｃ
ＰＧ基質中の窒素％はＰＥ１部分上のイミノ及びアミノ
官能基の相対的な一緒にした合計を示すものである。
十分なアシル化剤をＰＥ１部分のイミノ及びアミノ官能
基の実質的な全てと反応させるのに使用する。
一般にＮ−アシル化段階は不活性の中性有機溶媒中で当
量又は僅かに過剰のアシル化剤で容易に達成できる。典
型的なアシル化剤には塩化アセチル、無水酢酸、塩化プ
ロピオニル、無水プロピオン酸、塩化ブチリル、塩化ヘ
キサノイル、塩化オクタノイル、塩化ベンゾイル、ｐ−
ニトロベンゾイルクロライド、３，５−ジニトロベンゾ
イルクロライド、０−ｌｍ−及びｐ−メトキシベンゾイ
ルクロライド、０−１閑−及びｐ−クロロベンゾイルク
ロライド、２．４．６−ドリクロロペンゾイルクロライ
ド、０−１■−及びｐ−メチルベンゾイルクロライド、
フェニルアセチルクロライドその他が含まれる。典型的
な中性溶媒には芳香族炭化水素、例えばベンゼン、トル
エン、キシレンなど、エーテル、例えばテトラヒドロフ
ラン、ジオキサンなど、及び脂肪族炭化水素、例えばヘ
キサン、ヘプタンなどが含まれる。
当量又は僅かに過剰の酸スカベンジヤー例えば第三級ア
ミン、好ましくは第三級アルキルアミンを使うのが有利
で、アシル化反応中に放出された酸を取上げる。
従って本発明はシリカゲル又は孔が抑制されたガラスに
プロピルシリル（Ｐｒ−Ｓｉ−）結合によって共有結合
された非架橋ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）官能基を提
供し、ここで実質的に全て、即ち８０χを越える、そし
て好ましくは９０χを越えるＰＥ１部分のイミノ及びア
ミノ官能基が前に定義した通りの式Ｒ−ＣＯ−を有する
アシル官能基でアシル化されている。
より詳しくは本発明は平均粒径約３〜約７０ミクロン及
び平均孔寸法約５０〜約１０００オングストローム単位
を有する微粒シリカゲル又は平均粒径約３７〜約１７７
ミクロン及び平均孔寸法約４０〜約１０００オングスト
ローム単位を有する微粒状の孔の抑制されたガラスと、
約４００〜約１８００の平均分子量を有するポリエチレ
ンイミノプロピルトリメトキシシランとのＮ−アシル化
された共有結合、非架橋ポリエチレンイミン反応生成物
［但し、Ｎ−アシル官能基が式Ｒ−ＣＯ−を有し、ここ
でＲは０１〜Ｃ８アルキル、フェニル、アラルキル及び
Ｃ！〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、ハロ及び
ニトロからなる群から選ばれるｌ又はそれ以上の置換基
で置換されたフェニルからなる群から選ばれる一員であ
る］を提供する。
本発明のＮ−アシル化されたＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−シリカ
ゲル又はＰＥ　ｌ　−ＰｒＳ　１−ＣＰＧ生成物はカラ
ムクロマトグラフィによる蛋白質の精製及び分離の為の
新規でかつ有用な結合相を構成し、そして近代的ＨＰＬ
Ｃ装置とともに使用するのに特に適している。充填材は
種々のメツシュ寸法のもの、例えば約５０〜約６００メ
ツシユのものでよい。
好ましいＮ−アシル化されたＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−シリカ
ゲル生成物は平均粒寸法約５〜約４０ミクロン及び平均
孔寸法約５０〜約３３０オングストローム単位を有する
微粒状のシリカゲルと、平均分子量約４００〜約６００
を有するポリエチレンイミノプロピルトリメトキシシラ
ンとの反応生成物から得られるもの及び、平均及び平均
粒寸法約４０〜約６２μ及び平均孔寸法約２５０〜約５
００オングストローム単位を有する微粒状のシリカゲル
と平均分子量約１０００を有するポリエチレンイミノプ
ロピルトリメトキシシランから得られるものである。
本発明のＮ−アシル化されたＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−シリカ
ゲル及びＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−ＣＰＧ生成物は弱い疎水相
互作用に基づいて蛋白質を分離すると信じられる。これ
に基づいて分離する現在入手可能なりロマトグラフィー
マトリックスは貧弱な選択性を有する巾の広いピーク、
そして蛋白質の定量的でない回収を一般に与えるから、
本発明の製品で蛋白質を分離する顕著な利点は驚くべき
もの及び普通でないものと看される。現在入手可能なも
のに対して、本発明のクロマトグラフィーマトリックス
は良好な選択性と、蛋白質の量の損失、そして酵素分離
の場合には酵素活性の重大な損失なしに定量的な回収と
をもって鋭い良く決定できるピークを与える。
このような高いイオン強度の水性溶液中では、シリカの
固有の溶解特性の為に、疎水相互作用のクロマトグラフ
ィについて使用される水性の高いイオン強度移動相中で
、ここに記載されるクロマトグラフィマトリックスが加
水分解に不安定なことが通常は予想されることに鑑みて
、本発明は更にもっと驚異的なものである。このように
シリカに基づくマトリックスが短いカラム寿命を必然的
に生じることが通常は予想されが、本発明のＮ−アシル
化されたＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−シリカゲル及びＰＥｌ−Ｐ
ｒ５ｉ−ＣＰＧ生成物についてはこの逆となる。
実施例１７に説明されるように本発明のクロマトグラフ
ィーマトリックスを充填した）ＩＰＬＣカラムはカラム
の性能品質における非常に少ない変化しか生じずに移動
緩衝液相で１０００時間を越えて使用可能である。
従って本発明に従って、平均粒ｉ径約３〜７０ミクロン
及び平均孔寸法約５０−１０００オングストローム単位
を有する微粒状のシリカゲル、又は又は平均粒径約３７
〜約１７７ミクロン及び平均孔寸法約４０〜約１０００
オングストローム単位を有する微粒状の孔の抑制された
ガラスと、約４００〜約１８００の平均分子量を有する
ポリエチレンイミノプロピルトリメトキシシランとのＮ
−アシル化された共有結合、非架橋ポリエチレンイミン
反応生成物であって、Ｎ−アシル化された部分が上に定
義された式Ｒ−ＣＯ−を有するもので充填した液体クロ
マトグラフィに適したクロマトグラフィカラムが提供さ
れる。
次の実施例は例示の為に提供され本発明を制限するもの
ではない。
実施例１ ジエーティーベーカーケミカルカンパニー、フィリップ
スパーク、ニューシャーシーにより、「シリカゲルｌｌ
７０２４Ｊとして不規則形で市販されている平均粒径４
０ミクロン及び平均孔寸法６０オングストロームを有す
るシリカゲル１０ｇの５０ｍ１）ルエン中のスラリーに
、攪はんしながら平均分子量４００〜６００（推定５０
０）を有しペトラルチシステムインコーボレーテッド、
ブリストル、ＰＡ、から”Ｎ−トリメトキシシリルブロ
ビル）−ポリエチレンイミンＰＳＯ７Ｂ”として市販さ
れているポリオキシエチレンイミノプロピルトリメトキ
シシランの５０χ（Ｗ／Ｖ）イソプロパツール溶液１９
．７１　ｇを加える。
混合物を室温（２５℃）で約１時間１ｏ分攪はんし次に
一夜（１７時間）攪はんなしに放置する。攪はんを再度
更に５時間４０分室温で開始し、次に再度混合物を一夜
放置する。混合物を次に中程度にフリット化されたガラ
スフィルター上でろ過する。ろ液を５（１ｍｌのトルエ
ンで２度そして５０１メタノールで２度洗浄しいかなる
過剰のシラン反応体も確実に除去し、次に８０〜８５℃
で約３時間３０分オーブン乾燥し、約１２ｇの共有結合
したＰＥｌ−シリカゲル製品的３．９＄　Ｎを生成する
。
Ｂ、実施例ＩＡの手順を繰り返すが但し１１の水をシリ
カゲル／シラン混合物に加える。ＰＣＩ結合シリカゲル
製品の収量は約１３．３　ｇ；約５．５１Ｎ。
実施例２ 平均粒径５．２５ミクロン及び平均孔寸法３３０オング
ストロームを有し、カリフォルニア州へスベリアのザセ
ップＡ　Ｒａタイオンズグループから商品名”Ｖｙｄａ
ｃ　Ａ”カタログＮｏ、　１０１ＴＰＢ５の商品名で球
状のシリカとして市販されている２０　ｇのシリカゲル
の１００ｍ１）ルエン及び２ｍｌの水中のスラリーを調
製しそして１０分間室温で攪はんする。これに攪はんし
ながら３９．４　ｇの平均分子ｆｉ５００を有するポリ
エチレンイミノプロピルトリメトキシシランの５ｏｚ（
冒／ｗ）　　イソプロパツール溶液３９．４　Ｋを加え
、混合物をさらに５分間攪はんする。混合物を次に室温
で一夜放置する。混合物を次に１．０ミクロンフィルタ
ーのろうとを使用しろ過する。
ろ液を５０ｍ１のトルエンで２回、５０１のメタノール
で２回洗い次にろうと上で空気乾燥し最後に８０〜８５
℃で約３時間３０オーブン乾燥しＰＥＩ結合されたシリ
カゲル製品的２、Ｎ５Ｘ　Ｎを生成する。
実施例３ 平均粒径４０〜６３ミクロンと平均孔寸法４２０．オン
グストロームを有しＥ、メルクリエージエンツ、西ドイ
ツから商品名”Ｆｒａｃｔｏｓｉｌ　５００”の名で市
販されている２３０−４００メツシユ（ＡＳＴＭ）のシ
リカゲル２０　ｇの５０１のメタノールおよび１１の水
中のスラリーを調製し５分間室温で攪はんする。平均分
子量１８００を有するポリエチレンイミノプロピルトリ
メトキシシランの５０χ（誓へ）イソプロパツール溶液
１１．２　ｇの１００１メタノール中の別の溶液も調製
する。シラン溶液を次にシリカゲルスラリーに５分間か
けて攪はんしながら加える。追加が完了した後攪はんを
止め、混合物を室温で５０時間放置する。混合物を次に
中程度の寸法の焼結ガラス上でろ過する。ろ液を３　ｘ
　５０　ｍｌのメタノールで真空で下で洗浄し次に８０
〜８５℃で約４時間オーブン乾燥しＰＥｌ−結合のシリ
カゲル製品的１．１Ｘ　Ｎを生成する。
実施例４ 次の反応混合物が前の実施例の教えに従って製造された
。
直立−ｍ−」」　　　ニ シリカゲル（５ミクロン、　ｔｏ　ｇ　　ｔｏ　ｇ　　
ｔｏ　ｇ３３０オングストローム） イソプロパツール　　　５０ｍ１　５０ａ＋ｌ　　５０
ｍ１水　　　　　　　　　　０．５ｍｌ　、２５ｍ１０
．１ｉｌＰＥＩＰｒ−ｔｒｉＭｅｏ−シラン （Ｍ、讐、＝６００）、　５０χ（誓／讐）の１−Ｐｒ
ＯＨ溶液として　　９．９ｇ　　４．９５ｇ　　２ｇ各
反応混合物を５分間室温で攪はんし次に攪はんなしで４
１時間３０分放置した。各混合物をろ過し。
５０１のイソプロパツールで１度そして５０１１のメタ
ノールで２度洗浄した。各ろ液を８０〜８５℃で約３時
間１２分オーブン乾燥しそれぞれのＰＥＩ結合Ｌ／しタ
シ＋）　力）ｆ　Ｊｌ／製品　Ａ：　１．２＄　　Ｎ、
　Ｂ：　１．ＯＸ　Ｎ。
Ｃ：　０．９％　Ｎを生成した。
実施例５ Ａ、平均粒径４０ミクロン及び平均孔寸法５０オングス
トロームを有する５０ｍ１ヘキサン中の１０　ｇのシリ
カゲルのスラリーに平均分子量５００を有するＰＥＩＰ
ｒ−ｔｒｉＭｅＯ−シランの５０％（ｗ／ｗ）　１Ｐｒ
Ｏ）１溶液１９．７１ｇを加える。混合物を５分間室温
で攪はんし、次に還流温度に約２時間加熱した。混合物
を室温に放冷し、ろ過し５０ｍ１のヘキサンで２回そし
て５０ｍ１のメタノールで２回洗浄した。ろ液を次に８
０〜８５℃で３時間オーブン乾燥しＰＥＩ結合シリカゲ
ル製品を生成した。
Ｂ、実施例５Ａの手順を繰り返したが、但し等量の孔の
制御されたガラス１２５ミクロン、２４０オングストロ
ーム）をそこで使用したシリカゲルと置き換え、対応す
る共有結合された非架橋ＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−ＣＰＧ製品
を生成した。
実施例６ ２５１のトルエン中の実施例２０５ｇのＰＥｌ−Ｐｒ５
ｉ−シリカゲル製品、（約５ミクロン、約３３０オング
ストローム、約３１Ｎ）に２ｍｌのトリエチルアミンを
加え、続いて０．６ｍｌの無水酢酸を加えた。混合物を
均一まで振とうし、時々振とうしながら一夜放置した（
約１７．５時間）。Ｎ−アシル化された生成物をろ去し
、連続してトルエン、メタノール、５０１５０　ＭｅＯ
Ｈ／ＨＯＨ，水、そして３回メタノールで洗浄した。こ
れを次に８０〜８５℃でオーブン乾燥し、乾固した。生
成物収量は５ｇであった。分析８．５２２Ｃ１２，０１
＄Ｈ１２，８１ＸＮ。
実施例７ 実施例６０手順を繰り返したが、但し無水酢酸の代りに
ブチリルクロライドの当量を用いた。対応するＮ−ブタ
ノイル生成物の収量は約５．０４ｇであった。分析９．
１２＄Ｃ，２，２１＄Ｈ，２，６２ＸＮ。
実施例８ 実施例２０手順を繰り返したが、但し無水酢酸の代りに
０、Ｎ１の塩化ヘキサノイルを用いた。対応するＮ−ヘ
キサノイル生成物の収量は約５．０５ｇでアッタ。分析
９．５９ＸＣ、２，２６ＸＨ、２，５８ＸＮ。
実施例９ ２０ｇのＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−シリカゲル（約１５〜２０
ミクロン約３００オングストローム、約１．２χＮ）を
８１のトリエチルアミン及び２．４１の塩化ブチリルで
実施例２０手順に従って処理したが、但し生じるＮ−ブ
タノイル生成物をトルエンで１回、次にメタノールで１
回洗浄した。生成物収量は１９．３ｇであった。
分析５．９６ＸＣ，１，６３ＸＨ，１，１７！Ｎであっ
た。
実施例１Ｏ 実施例２の手順を繰り返したが、但しＰＥｌ−ＰｒＳｉ
−シリカゲル生成物の代りに当量の実施例５ＢのＰＥ　
ｌ　−ＰｒＳ　１−ＣＰＧ生成物に置き換え、対応する
Ｎ−アセチル化されたＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−ＣＰＧゲル生
成物を生成した。
実施例１１ １０ｇのＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−シリカゲルの試料（約５ミ
クロン、約３００オングストローム、約１．７１χＮ）
を＋５０χ過剰の塩化ブチリル及び当量のトリエチルア
ミン（１，３８ｉｌ　ＢｕＯＣＩ、２．５４ｍ１　Ｅｔ
３Ｎ）で実施例９の手順に従ッテ処理した。収９１０．
２ｇ、分析６．６８＄Ｃ。
１．２６＄Ｈ，１，６５＄Ｎ。
実施例１２ ２０ｍ１のトルエン中の２０８のＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−シ
リカゲルの試料（約４０ミクロン、約２５０オングスト
ローム、約３．５χＮ）を１０．５ｇの塩化ベンゾイル
及び７．６ｇのトリエチルアミンで約１８時間処理した
。生じるベンゾイル化されたＰＣＩ−ＰｒＳｉ−シリカ
ゲル生成物を濾過し、次に連続して２００１１１のトル
エン、２００１のメタノール、２００ｍ　ｌの水及び３
回の２００１のメタノールで洗浄し、８０〜８５℃で乾
燥した。収１１２２．２ｇ、分析１６．７８ＸＣ，１，
９４ＸＨ，２，８７！Ｎ。
実施例１３ 実施例１２の手順を繰り返したが、７．０８のトリエチ
ルアミンの存在下でアシル化剤としてＩ＋、５ｇの３．
５ジニトロベンゾイルクロライドを使用し、対応する３
、５−ジニトロベンゾイル化されたＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−
シリカゲル生成物を生成した。
収！２３．６ｇ、分析１３．３３ＸＣ，１，６２ＸＨ，
３，３７ＸＮ。
実施例１４ 実施例１２の手順を繰り返したが、但しアシル化剤とし
てｌＯ，５ｇのｐ−アニソイルクロライドを７．６ｇの
トリエチルアミンの存在下で使用し、対応するｐ−アニ
ソイル化されたＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−シリカゲル生成物を
生成した。収量２２、Ｎｇ。
実施例１５ 実施例１２の手順を繰り返したが、但しアシル化剤とし
てｔ３．１８のｐ−クロロベンゾイルクロライドを、当
量のトリエチルアミンの存在下で使用し、対応するｐ−
クロロベンゾイル化されたＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−シリカゲ
ル生成物を生成した。収ｊｉ２６．５ｇ。
実施例１６ 実施例１２０手順を繰り返したが、但し、アシル化剤と
して、１１．６［のｐ−トルオイルクロライドを、１０
、Ｆｖｌ（７，６ｇ）のトリエチルアミンの存在下で使
用し、対応するｐ−１ルオイル化されたＰＥｌ−Ｐｒ５
ｉ−シリカゲル生成物を生成した。収！２２．０ｇ。
実施例１７ 標準の分析カラム（４，６ｍｍ内径に２５０Ｉ長さ）を
高圧（７０００ｐｓｉ）に於て、結合相として、実施例
１１から得たブチリル化されたＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−シリ
カゲル（約５ミクロン、約３００オングストローム）で
スラリー充填した。スラリーは２５ｍ１のメタノール中
の３．６ｇのブチリル化されたＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−シリ
カゲルからなっていた。スラリーをカラムにポンプで送
ったのち、 追加の１００ｍ１のメタノールを次に同じ圧力でカラム
にポンプで通じた。カラムを高圧液体クロマトグラフィ
に取り付け、２５ｍ１のＫＨ２ＰＯ４、ｐ）ＩＴの溶液
を、安定なベースランが２８０ｍｍで観測されるまで、
＋２００ｐｓ　ｉで１ｍ１／分の流速に於てポンプで送
ってカラムに通じた。２モルの（Ｎ）１４）２Ｓ０４、
及び２５ｍ１のＫＨ２ＰＯ４、ｐ）ＩＴの溶液を次に凡
そ同じ流速で安定なベースラインが達成されるまでポン
プで送ってカラムに通じた。２モルの（Ｎｌ（４）２Ｓ
０４　＋　２５１１１Ｍのに）１２ＰＯ４から構成され
た高置緩衝液Ａに溶解した蛋白質混合物の溶液（１００
μｍ）をカラムに注入し、１ｍｌ／分に於て３０分間か
けて塩濃度を２５ｍＭのに８２ＰＯ４（緩衝液Ｂ）に減
少させることによって蛋白質成分を溶出した。
蛋白質の混合物は８５μｇのチトクロームＣ１３７７μ
ｇのミオグロビン、２０３８のりゾチーム、８５０μｇ
のオバルブミン、及び２３２μｇのα−キモトリプシン
Ａを含んでいた。濃縮バンドとして各蛋白質溶離物はお
互いに良く分離された。個々の蛋白質に対する典型的な
量の回収は最初の量の９０％より大きかった。例えばチ
トクロームＣに対し９５χ、ミオグロビンに対し９４χ
、リゾチームに対し９２％であフた。この実施例のカラ
ムは蛋白分離の為にｉｏｏ。
時間のクロマトグラフィ使用の後でさえも、クロマトグ
ラフィ性能に於けるどんな有意義な損失も示さなかった
。
出願人　ジェイ　ティー　ベーカー　ケミカルカンパニ
ー

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、平均粒径約３〜約７０ミクロン及び平均孔寸法約５
    ０〜約１０００オングストローム単位を有する微粒シリ
    カゲル又は平均粒径約３７〜約１７７ミクロン及び平均
    孔寸法約４０〜約１０００オングストローム単位を有す
    る微粒状の孔の抑制されたガラスと、約４００〜約１８
    ００の平均分子量を有するポリエチレンイミノプロピル
    トリメトキシシランとのＮ−アシル化された共有結合非
    架橋ポリエチレンイミン反応生成物［但し、Ｎ−アシル
    官能基が式Ｒ−ＣＯ−を有し、ここでＲはＣ＿１〜Ｃ＿
    ８アルキル、フェニル、アラルキル及びＣ＿１〜Ｃ＿４
    アルキル、Ｃ＿１〜Ｃ＿４アルコキシ、ハロ及びニトロ
    からなる群から選ばれる１又はそれ以上の置換基で置換
    されたフェニルからなる群から選ばれる一員である］。 ２、Ｎ−アシル部分がブチリルである特許請求の範囲第
    １項に記載の生成物。 ３、平均粒径約３〜約７０ミクロン及び平均孔寸法約５
    ０〜約１０００オングストローム単位を有する微粒シリ
    カゲルと、約４００〜約１８００の平均分子量を有する
    ポリエチレンイミノプロピルトリメトキシシランとのＮ
    −アシル化された反応生成物から本質的になるＮ−アシ
    ル化された共有結合非架橋ポリエチレンイミンクロマト
    グラフィー用カラム充填剤［但し、Ｎ−アシル官能基が
    式Ｒ−ＣＯ−を有し、ここでＲはＣ＿１〜Ｃ＿８アルキ
    ル、フェニル、アラルキル及びＣ＿１〜Ｃ＿４アルキル
    、Ｃ＿１〜Ｃ＿４アルコキシ、ハロ及びニトロからなる
    群から選ばれる１又はそれ以上の置換基で置換されたフ
    ェニルからなる群から選ばれる一員である］。 ４、Ｎ−アシル部分がブチリルである特許請求の範囲第
    ３項に記載のカラム充填剤。 ５、Ｎ−アシル部分がブチリルであり、微粒状シリカゲ
    ルが平均粒直径が約５〜約４０ミクロン及び平均孔寸法
    約５０〜約３３０オングストローム単位を有し、ポリエ
    チレンイミノプロピルトリメトキシシランが平均分子量
    約４００から約６００を有する特許請求の範囲第４項に
    記載の充填剤。 ６、Ｎ−アシル部分がブチリルであり微粒状シリカゲル
    が平均粒直径約４０〜約６２ミクロン及び平均孔寸法約
    ２１０〜約５２０オングストローム単位を有し、ポリエ
    チレンイミノプロピルトリメトキシシランが平均分子量
    約１０００を有する特許請求の範囲第４項に記載の充填
    剤。 ７、平均粒径約３〜約７０ミクロン及び平均孔寸法約５
    ０〜約１０００オングストローム単位を有する微粒シリ
    カゲル又は平均粒径約３７〜約１７７ミクロン及び平均
    孔寸法約４０〜約１０００オングストローム単位を有す
    る微粒状の孔の抑制されたガラスと、約４００〜約１８
    ００の平均分子量を有するポリエチレンイミノプロピル
    トリメトキシシランとの共有結合非架橋ポリエチレンイ
    ミン反応生成物をアシル化剤としての酸ハロゲン化物又
    は酸無水物でＮ−アシル化することからなり、但し、上
    記アシル官能基が式Ｒ−ＣＯ−を有し、ここでＲはＣ＿
    １〜Ｃ＿８アルキル、フェニル、アラルキル及びＣ＿１
    〜Ｃ＿４アルキル、Ｃ＿１〜Ｃ＿４アルコキシ、ハロ及
    びニトロからなる群から選ばれる１又はそれ以上の置換
    基で置換されたフェニルからなる群から選ばれる一員で
    ある、上記反応生成物のＮ−アシル化生成物を製造する
    方法。 ８、平均粒径約３〜約７０ミクロン及び平均孔寸法約５
    ０〜約１０００オングストローム単位を有する微粒シリ
    カゲル又は平均粒径約３７〜約１７７ミクロン及び平均
    孔寸法約４０〜約１０００オングストローム単位を有す
    る微粒状の孔の抑制されたガラスと、約４００〜約１８
    ００の平均分子量を有するポリエチレンイミノプロピル
    トリメトキシシランとのＮ−アシル化された共有結合非
    架橋ポリエチレンイミン反応生成物［但し、Ｎ−アシル
    官能基が式Ｒ−ＣＯ−を有し、ここでＲはＣ＿１〜Ｃ＿
    ８アルキル、フェニル、アラルキル及びＣ＿１〜Ｃ＿４
    アルキル、Ｃ＿１〜Ｃ＿４アルコキシ、ハロ及びニトロ
    からなる群から選ばれる１又はそれ以上の置換基で置換
    されたフェニルからなる群から選ばれる一員である］を
    充填した液体クロマトグラフィに適したクロマトグラフ
    ィカラム。 ９、Ｎ−アシル部分がブチリルである特許請求の範囲第
    ８項に記載のクロマトグラフィーカラム。 １０、Ｎ−アシル部分がブチリルであり、微粒状シリカ
    ゲルが平均粒直径が約５〜約４０ミクロン及び平均孔寸
    法約５０〜約３３０オングストローム単位を有し、ポリ
    エチレンイミノトリメトキシシランが平均分子量約４０
    ０から約６００を有する特許請求の範囲第８項に記載の
    クロマトグラフィーカラム。 １１、Ｎ−アシル部分がブチリルであり、微粒状シリカ
    ゲルが平均粒直径約４０〜約６２ミクロン及び平均孔寸
    法約２１０〜約５２０オングストローム単位を有し、ポ
    リエチレンイミノトリメトキシシランが平均分子量約１
    ０００を有する特許請求の範囲第８項に記載のクロマト
    グラフィーカラム。
JP61090202A 1985-04-22 1986-04-21 ポリエチレンイミン結合クロマトグラフ充填剤 Granted JPS61264254A (ja)

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