JPH03271299A

JPH03271299A - ペプチダーゼ合成基質の製造法

Info

Publication number: JPH03271299A
Application number: JP2070338A
Authority: JP
Inventors: Toru Eguchi; 徹江口; Kazuyoshi Kita; 一吉喜多; Koichi Nakajima; 光一中島; Shoichi Nakamura; 正一中村; Kenji Hasegawa; 健二長谷川; Kuniaki Tatsuta; 邦明竜田
Original assignee: Sunstar Inc
Current assignee: Sunstar Inc
Priority date: 1990-03-20
Filing date: 1990-03-20
Publication date: 1991-12-03
Anticipated expiration: 2010-05-10
Also published as: JPH0742312B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】吏果圭史剋里公藪本発明は臨床検査の分野で広く用いられているペプチダ
ーゼの酵素活性測定に好適なペプチダーゼ合成基質の効
率のよい改良製造法に関する。

逆坐芝垣旦主プ塁じペプチダーゼ合成基質は、ペプチダーゼによりＣ−末端
が切断され、発色基を遊離し、発色に関与するので、ペ
プチダーゼ酵素の活性に基づく臨床検査の分野では広く
用いられている。

かかるペプチダーゼの合成基質の代表的なものとして、
−数式（Ｒ，はα−アミノ保護基、Ｒ，およびＲ１はグリシル基、アラニル基、）くリル基
、ロイシル基またはインロイシル基、ＸおよびＹはハロ
ゲン原子を意味する）で示されるペプチドが挙げられる
。

−数式（■）で表わされる化合物、例えば、Ｎ−ベンジ
ルオキシカルボニル−グリシル−グリシル−Ｌ−アルギ
ニル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリン［式
（Ｉ）中、Ｒ３は（□ＣＨ，０ＣＯ− Ｒ１およびＲ，：　−ＮＨＣＨ，Ｃ０−ＸおよびＹはＢ
ｒを意味する］は、ペプチダーゼ酵素の作用により発色
基である３、５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリン（
Ｄ　Ｂ　ＨＡ）を遊離し、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチ
ルフェニル）−Ｎ”−スクシニルエチレンジアミン（Ｅ
ＭＳＥ）とカップリングし、緑色色素を生じる。かくし
て、その吸光度を測定することにより酵素活性を知るこ
とができる。

このように−数式（１）で表わされる合成基質は非常に
重要であるが収率よく高純度な合成基質を得ることは困
難である。

従来、−数式（Ｉ）のペプチドは、−数式１１Ｃ＝Ｎ（Ｎｏｔ）ＮＨ。

（式中、Ｒ１，Ｒ１、Ｒ１、ＸおよびＹは前記と同じで
ある）で示される保護ペプチドを一般に、パラジウム−炭素やラネーニ・ノケル触媒で還元して製
造されている［（ストライドライザー著、監訳、湯用泰
秀、有機化学解説■、９７６頁、広１書店（昭和５４年
）コしかしながら、パラジウム−炭素やラネーニ・７ケルを
触媒として還元したとき、発色基中の７％ロゲン原子が
変化し、酵素の作用が不十分となる。

また、水素化ホウ素ナトリウムや水素化リチウムアルミ
ニウムを用いて還元することも知られているが、式（Ｉ
Ｉ）のペプチドに含まれるニトロ基が十分に脱離しない
。

本発明者らは、このような問題点を解決し、効率のよい
製造法を見出すため種々の還元剤を検討した結果、式（
ｎ）のペプチドを酸性下、錫あるいは亜鉛あるいはこれ
らの塩の存在下で還元することにより、目的とする式（
１）のペプチドを容易ビ高収率、高純度でかつ経済的に
得ることができることを見出した。

課題を解決するための手段本発明は、−数式（ｎ）で示される保護ペプチドを錫あ
るいは亜鉛化合物の存在下で還元することにより、Ｎ−
末端のα−アミノ保護基、ＸおよびＹを脱離することな
く一般式（１）で示されるペプチドを得るペプチダーゼ
合成基質の製造法を提供するものである。

さらに詳しくは、例えば式（ＩＩ）のペプチドをギ酸、
塩酸等の酸に溶解し、過剰の錫あるいは亜鉛化合物を加
え、３０〜６０’Ｃで３０分〜５時間反応させることに
より、６０％以上の収率で式（Ｉ）のペプチドを得るこ
とができる。用途によりトリフルオロメタンスルホン酸
等の酸で処理することにより種々の塩の形の式（１）の
ペプチドを得ることも可能である。

出発物質として用いる式（Ｉ［）のペプチドは通常のペ
プチド合成の手法で製造できる。例えば、グリシル−グ
リシンのＮ−末端αアミ７基をベンジルオキシカルボニ
ル基で保護し、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−グリシ
ル−グリシンを得る。

一方、ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−ニトロアルギニン
と３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリンをＮ−メ
チルモルホリン、インブチルクロロホルメート存在下、
縮合し、ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−ニトロアルギニ
ル−３，５−ジブロモ−４−ビトロキシアニリンを得る
。ついで、トリフルオロ酢酸で処理し、トリフルオロ酢
酸り一ニト亡アルギニルー３．５−ジブロモ−４−ヒド
ロキシアニリンを得る。これを前記のＮ−ベンジルオキ
シカルボニル−グリシル−グリシンとＮ−メチルモルホ
リン、インブチルクロロホルメート、トリエチルアミン
の存在下で縮合させ、目的とす６Ｘ（１）のＮ−ベンジ
ルオキシカルボニル−グリシル−グリシル−し−ニトロ
アルギニル−３゜５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリ
ンを得る。

用いる錫あるいは亜鉛化合物としては、例えば、錫粉末
、塩化錫、酢酸錫、亜鉛粉末、亜鉛アマルガムなどが挙
げられる。これらは一般に、式（ＩＩ）にペプチドに対
して５倍モル以上、好ましくは、８〜１０倍モル程度で
用いられる。

得られた式（【）のペプチドは、例えば、常法に従って
クロマトグラフィー、再結晶、再沈澱などにより精製さ
れる。

式（Ｉ）のペプチドはトリプシン、プラスミン、ブｃナ
ーゼ、フィシン、コラゲナーゼ等のペプチダーゼにより
Ｃ末端が切断され、発色基を遊離する。この現象は、臨
床診断薬に広く応用できる。

哀塵悉以下、参考例、実施例を挙げて具体的に説明するが、こ
れには本発明を限定するものではない。

参考例１１ｊＫ法で得たＮ−ベンジルオキシカルボニル−グリシ
ル−グリシン５．１８９（１９，５ミリモル）を無水ジ
メチルホルムアミド（ＤＭＦ）ｌｏ４ｘ１２に溶解し、
冷却下（−１５°Ｃ）、これにＮ−メチルモルホリン２
．１４１０とインブチルクロロホルメート２．６５ｘ（
ｌを加えた。ついで、トリフルオロＤＭＬ−ニトロアル
ギニル３．５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリン１１
．９９の無水ＤＭＦ８３ｚ（ｌ溶液にトリエチルアミン
２．８５ｘ（ｌを加えた溶液を、冷却下（−１５℃）、
滴下した。滴下終了後、室温で２時間反応させた。反応
終了後、減圧濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフ
ィー（クロロホルム：メタノール＝５　：　１）で精製
し、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−グリシル−グリシ
ル−し−ニトロアルギニル−３，５−ジブロモ−４−ヒ
ドロキシアニリン１１．６９（収率８３％）を得た。

実施例１参考例１で得たＮ−ベンジルオキシカルボニル−クリシ
ル−グリシル−し−ニトロアルギニル−３，５−ジブロ
モ−４−ヒドロキシアニリン１１゜２９（１５，７ミリ
モル）を６０％ギ酸２２５ＲＱに溶解し、塩化錫２３．
９９を加え５０℃で１時間撹拌し、反応させた。

反応終了後、濾過し、濾液を水２２５ｍ１２で希釈し、
硫化水素ガスを吹き込み沈殿を生成させ、濾去した。濾
液を減圧濃縮した後、メタノール−水、さらにメタノー
ル−酢酸エチルより再結晶させ、Ｎ−ベンジルオキシカ
ルボニル−グリシル−グリシル−し−アルギニル−３，
５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリンの白色結晶７．
１９（収率６４％）を得た。

融点：１３０−１３４℃ ［αコ　Ｄ”ニー１４．３°（ｃ＝１．０．　　メタノ
ール）元素分析：実測値（％）　　Ｃ：４０．７３．　Ｈ：４．２７．　
Ｎ：１３．８５計算値（％）　　Ｃ：４０．７１．　Ｈ
：４．２６．　Ｎ：Ｌ３．２５ＮＭＲ（ＣＤ、ＯＤ）： δ　１．５３〜２．０７（ｍ、４Ｈ）、３．２１（ｔ。

２Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ）、３．８２　（ｓ、２Ｈ）、３
゜９２　（ＡＢｑ、２Ｈ，Ｊ＝１７．６Ｈｚ、　Δ、Ａ
Ｂ＝２６．０Ｈｚ）、４．４８　（ｄｄ、ＬＨ，Ｊ＝４
．６゜８．４Ｈｚ）、５．０７　（ｓ、２Ｈ）、７．３
２（ｓ。

５Ｈ）、７．８１　（ｓ、２Ｈ）参考例２常法で得たメトキシカルボニル−グリシル−グリシン１
．７９を２４ｘ（ｌの無水ＤＭＦに溶解し、これに、冷
却下（−１５℃）でＮ−メチルモルホリン２．２＊（！
とイソブチルクロロホルメート２．６ｘＱを加えた。

ついで、さらに、トリフルオロ酢酸Ｌ−ニドＣアルギニ
ル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリン６．０
９を無水ＤＭＦ６０ｆｆｉ！２に溶解し、トリエチルア
ミン４．２ｚ（ｌを加えた溶液を冷却下（−１５℃）滴
下した。滴下終了後、室温で１時間反応させた。

反応終了後、減圧濃縮後、残渣をシリカゲルカラムで精
製し、メトキシカルボニルーグリシルーグワシルーし一
ニトロアルギニルー３．５−ジブロモ−４−ヒドロキシ
アニリン１．２８ｙ（収率２０％）を得た。

Ｘ塵廻１参考例２で得たメトキシカルボニル−グリシル−グリシ
ル−Ｌ−ニトロアルギニル−３，５−ジブａモー４−ヒ
ドロキシアニリン１．０９を６０％ギ酸２０ｍ１！に溶
解し、塩化錫（ｆｆ）２．３７９を加え、５０℃で３時
間撹拌して反応させた。反応衿了後、濾過し、濾液に硫
化水素を吹き込み、濾液を減圧濃縮後、メタノール−酢
酸エチルで再沈澱させた。シリカゲルカラムで精製し、
メトキシカルボニル−グリシル−グリシル−Ｌ−アルギ
ニル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリン０゜
６１９（収率６２％）を得た。

ＮＭＲ（ＣＤ、≠ＯＤ）： δ　１．３５〜２．２９　（ＩＩ＋、４Ｈ）　、　　３
．２３　（２Ｈ）、３．６８　（ｓ、３Ｈ）、３．８４
　（ｓ、２Ｈ）。

３．９５　（ｓ、２Ｈ）、４．５１　（ｎ、ＩＨ）、７
．８１　（Ｓ、２Ｈ）参考例３常法で得たＮ−ペンジルオ亭ジカルボニルーβ−アラニ
ル−グリシン２．８９を５６１４の無水ＤＭＦに溶解し
、これに冷却下（−１５℃）でＮ−メチルモルホリン１
１１１２とインブチルクロロホルメ−）１３．８１１１
２を加えた。ついで、トリフルオロ酢ＭＬ−ニトロアル
ギニル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリン６
、Ｏｆを無水ＤＭＦ６０１１１２に溶解し、トリエチル
アミン４．２Ｍσを加えた溶液を冷却下（−１５℃）で
滴下した。滴下終了後、室温で１時間反応させた。反応
終了後、減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムで精製し
、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−β−アラニル−グリ
シル−Ｌ−ニトロアルギニル−３，５−ジブロモ−４−
ヒドロキシアニリン４．０９（収１５５％）を得た。

実施ｆ１１３参考例２で得たＮ−ベンジルオキシカルボニル−β−ア
ラニル−グリシル−し−ニトロアルギニル−３，５−ジ
ブロモ−４−ヒドロキシアニリン２．０９を６０％ギ酸
４０ＩＱに溶解し、塩化錫（ｎ）４．１６ｇを加え、５
０℃で２時間攪拌し、反応させた。反応終了後、濾液に
硫化水素を吹き込み沈殿を生成させ濾去した。濾液を減
圧濃縮後、メタノール酢酸エチルで再沈澱させ、シリカ
ゲルカラムで精製し、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−
β−アラニル−グリシル−Ｌ−ニトロアルギニル−３，
５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリン１．１９９（収
率６０％）を得た。

ＮＭＲ（ＣＤ、ＯＤ）： δ　ｌ、４７〜２．２５（園、４Ｈ）、２．５１（ｔ。

２Ｈ，Ｊ＝６．１Ｈｚ）、３．２２（２Ｈ）、３．４５
　（ｔ、２Ｈ，Ｊ＝６．１Ｈｚ）、３．８９　（ｓ、２
Ｈ）、４．５２　（ｍ、ＬＨ）、５．０９（ｓ、２Ｈ）
。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１はα−アミノ保護基、Ｒ＿２およびＲ＿３はグリシル基、アラニル基、バリル
基、ロイシル基またはイソロイシル基、ＸおよびＹはハロゲン原子を意味する）で示される保護ペプチドを錫あるいは亜鉛化合物の存在
下で還元して、Ｎ−末端のα−アミノ保護基、Ｘおよび
Ｙを脱離することなしに、一般式で示される ▲数式、化学式、表等があります▼ （Ｒ＿１：式中、Ｒ＿１、Ｒ＿２、Ｒ＿３、ＸおよびＹ
は前記と同じである）で示されるペプチドを得ることを特徴とするペプチダー
ゼ合成基質の製造法。