JPS632253B2

JPS632253B2 -

Info

Publication number: JPS632253B2
Application number: JP18292780A
Authority: JP
Inventors: Takayuki Shioiri; Yasumasa Hamada; Mitsuo Murata
Original assignee: Daiichi Kagaku Yakuhin Co Ltd
Current assignee: Daiichi Kagaku Yakuhin Co Ltd
Priority date: 1980-12-25
Filing date: 1980-12-25
Publication date: 1988-01-18
Also published as: JPS57108048A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は酵素活性の測定に有用なアミノ酸アニ
リド類の新規製造法に関するものである。アミノ
酸アニリド類がアミノ酸に特定の酵素によりアニ
リド結合を加水分解される性質を利用し、酵素作
用により遊離したアニリン誘導体を適当な発色系
に導いて定量することにより酵素力価を測定する
方法は、臨床検査分野で広く行なわれて治療上重
要な役割を果している。また動植物より分離した
酵素の力価測定も同様に行なうことができ、この
ような測定に使用するペプチドを含めたアミノ酸
のアニリド誘導体を発色性合成基質と呼んでい
る。発色性合成基質の製造法はアミノ酸あるいは
ペプチドのＣ末端と芳香族アミノ化合物を反応さ
せアニリド化合物を合成する方法であり、通常の
ペプチド合成法を応用して製造することができ
る。即ち、Ｎ末端およびペプチド合成において通
常行なわれる活性基の保護を行なつたアミノ酸あ
るいはペプチドのＣ末端基と例えばｐ−ニトロア
ニリンを反応させた後、適宜脱保護基としてｐ−
ニトロアニリド系の発色性合成基質を製造するこ
とができる。ｐ−ニトロアニリド系の発色性合成基質の
λmaxは300nｍであるが酵素作用により遊離した
ｐ−ニトロアニリンのλmaxは405nｍであるから
405nｍの吸光度の変化を測定することにより容
易に酵素力価を測定することができる。また芳香
族アミノ化合物類は種々の定量的測定法が既知で
あるから、各種の芳香族化合物を選ぶことにより
種々の発色性合成基質を合成することができる。
既にｐ−ジメチルアミノアニリド、ｐ−ハイドロ
オキシアニリド等の発色性合成基質が市販され発
色系の改良を行なつているが酵素力価の測定原理
はｐ−ニトロアニリド系の発色性合成基質と同一
であるのみならず、その合成法もｐ−ニトロアニ
リド系発色性合成基質と同様方法で合成されるの
で、以下その代表としてＮ−保護アルギニンより
そのｐ−ニトロアニリドの従来公知の製造法を説
明する。即ち、N^d−カルボベンゾキシN〓−ニト
ロアルギニンとｐ−ニトロアニリンをジメチルホ
ルムアミド中ジシクロヘキシルカルボジイミドに
より縮合させる方法（特開昭52−146694実施例１
(3)、特開昭49−49695、実施例１(3) 特開昭51−
29998 実施例１(a)(3)）また縮合剤としてクロル
蟻酸イソブチルエステルとトリエチルアミンを使
用する方法（特開昭51−29998実施例１(a)(2)、特
開昭52−146694実施例１(2)、特開昭49−49695実
施例１(2)）が公知であるが何れも収率が低く工業
的に満足し難いものである。またｐ−ニトロアニリンの代りに、これより更
に反応性の高いｐ−ニトロフエニルイソシアナー
トを使用する方法として、N^d−カルボベンゾキ
シ N〓−ニトロアルギニンとｐ−ニトロフエニ
ルイソシアナートをヘキサメチル隣酸トリアミド
中トリエチルアミンの存在下縮合させN^d−カル
ボベンゾキシ N〓−ニトロアルギニン−ｐ−ニ
トロアニリドを製造する方法も提出されているが
取扱いにくく且高価な試薬を必要とする欠点があ
る。（特開昭49−42396実施例１−(a)、特開昭49−
49695実施例１(1)、特開昭51−29998実施例１(a)
(1)、特開昭52−146694実施例１−(1)）。以上の如く公知方法は収率が低く、あるいは高
価な試薬を必要とするなど工業的に満足し難い方
法である。そこで本発明者等は種々研究を行なつ
た結果、安価且入手の容易なｐ−ニトロ安息香酸
とＮ−保護アミノ酸およびDPPA（ジフエニルホ
スホリルアジド）より高収率でＮ−保護アミノ酸
のｐ−ニトロアニリドを合成する新規な製造法を
発見し本発明を完成した。本発明方法を化学式によつて一般的に表わすと
下式のとおりである。 DPPA：

【式】 R₁：−NO₂、

【式】 −Ｎ（CH₃）₂、−OH等を表わす。 R₂：Ｎ−保護アミノ酸の残基を表わす。化学式〔〕においてR₁は前述の如く発色系
に導いて測定するための置換基であり、公知のア
ニリド系発色性合成基質の全てを抱含するもので
ある。R₂はＮ−保護アミノ酸の残基でありペプ
チド合成において通常使用されるＮ−保護方法即
ちカルボベンゾキシ基、第三ブトキシカルボニル
基その他の方法によりアミノ基の活性を封じられ
た公知のＮ−保護アミノ酸の残基でＮ末端基を保
護された公知のペプチド化合物をも抱含するもの
である。本発明を実施するに当つては適当な発色性基を
有する安息香酸誘導体とDPPA、トリエチルアミ
ンを無水の溶媒中で混合し反応させたのちＮ−保
護アミノ酸を添加してＮ−保護アミノ酸アニリド
誘導体を生成させる。この際使用する溶媒は１・
２−ジクロロエタン、トルエン、トリクレン、ジ
メチルフオルムアミド等を使用できるが１・２−
ジクロロエタン、トルエンが適当である。反応温度は室温より溶媒の沸点の範囲を適宜選
択できるが通常室温程度で試薬を添加しその後短
時間加熱して反応完結させれば充分である。反応終了後溶媒を一旦溜去したのち生成物を適
宜の溶媒、例えば酢酸エチル−ベンゼン（４：
１）等に溶解し、水、クエン酸溶液、飽和炭酸水
素ナトリウム溶液、飽和食塩水等で洗浄したのち
乾燥し溶媒を溜去すると粗製のＮ−保護アミノ酸
アニリド誘導体を得るので、これを再結晶あるい
はクロマトグラフイーにより精製すれば良い。以上の如く本発明の方法はＮ−保護アミノ酸ア
ニリド類を入手の容易な安息香酸誘導体を使用し
簡単な操作で高収率で製造する新規な一般的方法
を提供するもので、以下実施例を以て本発明を説
明するが、本発明の範囲がこれにより限定される
ものではない。なお文中の略号はそれぞれ下記の
意味を表わすものとする。 Leu：Ｌ−ロイシン残基 Lys：Ｌ−リジン残基 Arg：Ｌ−アルギニン残基 Boc：第三ブトキシカルボニル基Ｚ：カルボベンゾキシ基 Mts：メシチレン−２−スルホニル基 PNA：ｐ−ニトロアニリド基 DPPA：ジフエニルホスホリルアジド実施例１ Boc−Leu−pNAの合成 20ml三頚フラスコへ無水条件下、ｐ−ニトロ安
息香酸334mg（２ｍmol）、無水１・２−ジクロロ
エタン５mlを加えておき、DPPA550mg（２ｍ
mol）−無水１・２−ジクロロエタン１mlの溶液
を滴下、次いでトリエチルアミン202mg（２ｍ
mol）−無水１・２−ジクロロエタン１mlの溶液
を滴下、以後室温で２時間撹拌する。次に反応溶
液を約15分間加熱還流し、Boc−Leu−OH231mg
（１ｍmol）−無水１・２−ジクロロエタン2.5ml
の溶液を滴下し、さらに１時間加熱還流する。反
応終了後反応溶液を減圧下濃縮し、酢酸エチル−
ベンゼン（４：１）100mlを加え、10％クエン酸
水溶液100ml、水100ml、飽和炭酸水素ナトリウム
水溶液100ml、水100ml、飽和食塩水100mlの順に
洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後溶媒
を減圧下留去すると黄色カラメル549mgを得る。
エーテル100mlを加え、不溶物をろ過し、減圧下
留去して黄色カラメル419mgを得る。これをシリ
カゲルカラムクロマトグラフイー（Merck
Kieselgel60 Art7734 42ｇ、エーテル・ｎ−ヘキ
サン；１：２）で精製し、淡黄色のBoc−Leu−
pNA335mg（95.3％）を得た。これをエーテル・
ｎ−ヘキサンより再結晶し白色結晶を得た。 m.p.；91〜96℃ 元素分析 C₁₇H₂₅N₃O₅ mol.wt.351.45 計算値（％） C58.10、H7.19、N11.96 実測値（％） C58.16、H7.23、N12.04 〔α〕²⁰ _D＝−31.5゜（Ｃ＝1.00、メタノール）実施例２ Boc−Lys（Ｚ）−pNAの合成実施例１と同様にｐ−ニトロ安息香酸334mg
（２ｍmol）、DPPA550mg（２ｍmol）、トリエチ
ルアミン202mg（２ｍmol）を無水１・２−ジク
ロロエタン溶液中、室温で２時間撹拌し、次に約
17分間加熱還流する。 Boc−Lys（Ｚ）−OH380mg（１ｍmol）−無水
１・２−ジクロロエタン2.5mlの溶液を滴下し、
さらに４時間加熱還流する。反応終了後実施例１
と同様に後処理し、黄かつ色泥状物900mgを得る。
酢酸エチル100mlを加え不溶物をろ過し減圧下留
去して黄色カラメル608mgを得る。これをシリカ
ゲルカラムクロマトグラフイー（シリカゲル60
ｇ、酢酸エチル−ｎ−ヘキサン；１：２）で精製
し、淡黄色のBoc−Lys（Ｚ）−pNA378mg（75.5
％）を得た。これを酢酸エチル・ｎ−ヘキサンよ
り再結晶し、微黄色結晶を得た。 m.p.；113〜116℃ 元素分析 C₂₅H₃₂N₄O₇ mol.wt.500.54 計算値（％） C59.99、H6.44、N11.19 実測値（％） C59.55、H6.42、N11.67 〔α〕²⁰ _D＝−8.3゜（Ｃ＝1.00、メタノール）実施例３ Boc−Arg（Mts）−pNAの合成実施例１と同様にｐ−ニトロ安息香酸334mg
（２ｍmol）DPPA550mg（２ｍmol）、トリエチル
アミン202mg（２ｍmol）を無水１・２−ジクロ
ロエタン中、室温で２時間撹拌し、次に約13分間
加熱還流する。Boc−Arg（Mts）−OH457mg（１
ｍmol）−無水１・２−ジクロロエタン2.5mlの溶
液を滴下し、さらに４時間加熱還流する。反応終
了後実施例１と同様に後処理し黄色泥状物689mg
を得る。酢酸エチル100mlを加え、不溶物をろ過
し、減圧下留去して黄色カラメル541mgを得る。
これをシリカゲルカラムクロマトグラフイー（シ
リカゲル54ｇ、酢酸エチル・ｎ−ヘキサン；３：
２）で精製し、淡黄色のBoc−Arg（Mts）−
pNA286mg（49.7％）を得た。シリカゲルカラム
クロマトグラフイーで精製をくり返してもm.
p.105〜（不明瞭）の無定形粉末である。元素分析 C₂₆H₃₆N₆O₇S mol.wt.575.71 計算値（％） C54.14、H6.30、N14.58 実測値（％） C54.27、H6.42、N14.26 〔α〕²⁰ _D＝＋3.9゜（Ｃ＝1.00、メタノール）実施例４の合成実施例１と同様に、ｐ−メチルレツド（４−ジ
メチルアミノ−アゾベンゼン−4′−カルボン酸）
539mg（２ｍmol）、DPPA550mg（２ｍmol）、ト
リエチルアミン202mg（２ｍmol）を無水１・２
−ジクロロエタン溶液中、室温で２時間撹拌し、
次に約15分間加熱還流する。Boc−Leu−OH231
mg（１ｍmol）−無水１・２−ジクロロエタン2.5
mlの溶液を滴下し、さらに４時間加熱還流する。
反応終了後実施例１と同様に後処理し（不溶物が
析出した場合は、適時ろ別する。）赤橙色泥状物
683mgを得る。酢酸エチル100mlを加え不溶物をろ
過し、減圧下留去して赤橙色カラメル528mgを得
る。これをシリカゲルカラムクロマトグラフイー
（シリカゲル53ｇ、エーテル・ｎ−ヘキサン；
１：１）で精製し、赤かつ色のの粗結晶240mg（52.9％）を得た。これを酢酸エ
チル・ｎ−ヘキサンより再結晶し、黄橙色針状晶
を得た。 m.p.；190〜193℃ 元素分析 C₂₅H₃₅N₅O₃ mol.wt.453.57 計算値（％） C66.20、H7.78、N15.44 実測値（％） C66.48、H7.73、N15.51 〔α〕²⁰ _D＝−53.2゜（Ｃ＝0.20、メタノール）

Claims

【特許請求の範囲】１一般式（式中R₁はニトロ基、アゾ基、ジメチルアミノ
基、水酸基等を表わす）に示す安息香酸誘導体に
ジフエニルホスホリルアジドとＮ−保護アミノ酸
を反応させることを特徴とする一般式（式中R₁は一般式〔〕と同様R₂はアミノ基の
反応性を封じたアミノ酸の残基を表わす）に示す
アミノ酸アニリド類の製造法。