JPH03277281A - アリールアシルアミダーゼ - Google Patents
アリールアシルアミダーゼInfo
- Publication number
- JPH03277281A JPH03277281A JP2076794A JP7679490A JPH03277281A JP H03277281 A JPH03277281 A JP H03277281A JP 2076794 A JP2076794 A JP 2076794A JP 7679490 A JP7679490 A JP 7679490A JP H03277281 A JPH03277281 A JP H03277281A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hydrolyzing
- enzyme
- molecular weight
- action
- aryl acylamidase
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- Pending
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、アニリド類をアミンとカルボン酸に加水分解
するアリールアシルアミダーゼに関する。
するアリールアシルアミダーゼに関する。
（従来の技術）
アニリド類（Ｎ−アシルアニリン類）の酵素脱アシル化
は長い間哺乳動物組織中や植物組織中で起こる事か知れ
ていた。しかし、微生物はそのような酵素のソースとし
てはそれ程広範には研究されなかった。微生物アミダー
ゼに関する研究の大部分は、脂肪族基質、特にホルムア
ミド、アセタミド、プロピオンアミドに関するものであ
った。
は長い間哺乳動物組織中や植物組織中で起こる事か知れ
ていた。しかし、微生物はそのような酵素のソースとし
てはそれ程広範には研究されなかった。微生物アミダー
ゼに関する研究の大部分は、脂肪族基質、特にホルムア
ミド、アセタミド、プロピオンアミドに関するものであ
った。
芳香族基質に特異な微生物アシルアミダーゼの存在は比
較的狭い範囲で研究された。そのような報告の大部分は
除草剤の変換に関するものであった。
較的狭い範囲で研究された。そのような報告の大部分は
除草剤の変換に関するものであった。
（発明か解決しようとする課題）
本発明はアニリド類のみならず広範囲のアミド酸を加水
分解する新規の酵素を提供することにある。
分解する新規の酵素を提供することにある。
（課題を解決するための手段および作用）本発明のアリ
ールアシルアミダーゼは、次の性質を有する。
ールアシルアミダーゼは、次の性質を有する。
■作用および基質特異性、（ａ）アニリド類はアニリン
類と脂肪酸アニオンへ加水分解する。
類と脂肪酸アニオンへ加水分解する。
（ｂ）芳香族アミド及び脂肪族アミドをアミン類とカル
ボン酸へ加水分解する。（ｃ）安息香酸アルキルエステ
ルを安息香酸とアルキルアルコールへ加水分解する。（
ｄ）脂肪酸のフェノールエステルを脂肪酸とフェノール
へ加水分解する。アニリド類からアニリンへのアシル基
の転位。
ボン酸へ加水分解する。（ｃ）安息香酸アルキルエステ
ルを安息香酸とアルキルアルコールへ加水分解する。（
ｄ）脂肪酸のフェノールエステルを脂肪酸とフェノール
へ加水分解する。アニリド類からアニリンへのアシル基
の転位。
■作用および基質特異性：アニリド類、芳香族及び脂肪
族アミド類、エステル類を加水分解し、また、アニリン
をアシル受容体とするアシル基転位反応を触媒する。
族アミド類、エステル類を加水分解し、また、アニリン
をアシル受容体とするアシル基転位反応を触媒する。
■至適ｐｌ・３５℃において９．５である。
■安定ｐＨ： ５０℃において８．５〜９．５である。
■作用適温の範囲：至適温度は４５℃である。
■熱安定性・ｐＨ９，５において１０分間保持した場合
５０℃まて安定である。
５０℃まて安定である。
■分子量：ソジウムドデシルサルフェイト電気泳動法に
よりサブユニット分子量５２．０００ＫＳＦ −ＧＥＬ
Ｇ３０００ＳＷカラムによる分子量１２６．０００
、従って同一サブユニット２つからなる分子量１２６．
０００の蛋白質。
よりサブユニット分子量５２．０００ＫＳＦ −ＧＥＬ
Ｇ３０００ＳＷカラムによる分子量１２６．０００
、従って同一サブユニット２つからなる分子量１２６．
０００の蛋白質。
１々Ｃ鴎騎ｎ（こ差トｒるミ／Ｕリヌ屓３ｂＮｍｌ直、
及び嘴【入選■八賞ａＸ値本発明のアリールアシルアミ
ダーゼは、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属に属し
、アリールアシルアミダーゼ生産能を有する菌株を栄養
培地中で培養し、次いで得られた菌体を、アリールアシ
ルアミダーゼ誘導用培地中で培養し、アリールアシルア
ミダーゼを生成蓄積せしめ、次いで該酵素を単離するこ
とにより得ることかできる。
及び嘴【入選■八賞ａＸ値本発明のアリールアシルアミ
ダーゼは、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属に属し
、アリールアシルアミダーゼ生産能を有する菌株を栄養
培地中で培養し、次いで得られた菌体を、アリールアシ
ルアミダーゼ誘導用培地中で培養し、アリールアシルア
ミダーゼを生成蓄積せしめ、次いで該酵素を単離するこ
とにより得ることかできる。
該菌株の一例としてはノカルディアグロベルラ（Ｎｏｃ
ａｒｄｉａ ｇｌｏｂｅｒｕｌａ） ｒＦｏ １３５１
０株かあげられる。
ａｒｄｉａ ｇｌｏｂｅｒｕｌａ） ｒＦｏ １３５１
０株かあげられる。
培養条件
上記菌株の培地は格別である必要はなく、通常の培地か
用いられる。
用いられる。
炭素源としては、グルコース、ラクトース、スターチ、
デキストリン、マルトース等の糖類あるいは、グルタミ
ン酸等のアミノ酸類、窒素源としてポリペプトン、酵母
エキス、大豆粉加水分解物等の天然Ｎ源、無機塩酸とし
て、食塩、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等また微
量金属成分として、硫酸第一鉄、塩化アルミニウム、塩
化バリウム、塩化マグネシウム等を使用することかでき
る。例えば、次の培地が好適に用いられる。
デキストリン、マルトース等の糖類あるいは、グルタミ
ン酸等のアミノ酸類、窒素源としてポリペプトン、酵母
エキス、大豆粉加水分解物等の天然Ｎ源、無機塩酸とし
て、食塩、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等また微
量金属成分として、硫酸第一鉄、塩化アルミニウム、塩
化バリウム、塩化マグネシウム等を使用することかでき
る。例えば、次の培地が好適に用いられる。
培養ｐＨは約６．５〜約８．５、好ましくは７．０、培
養温度は約２５〜４０℃１好ましくは約２８℃てあり、
約３日間好気的に攪拌または振盪しなから培養を行う。
養温度は約２５〜４０℃１好ましくは約２８℃てあり、
約３日間好気的に攪拌または振盪しなから培養を行う。
本発明のアリールアシルアミダーゼは誘導酵素であり、
上記培養液から得られた菌体をｐＨ約６〜約８の緩衝液
例えば０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に湿菌体
を懸濁させ、栄養不足、特にＮ源の不足下好ましくはＮ
源の欠損下に、基質例えば、酸アミド類又はカルボン酸
エステル（例えば芳香族又は脂肪族カルボン酸低級アル
キルエステル）の存在下に培養し、該酵素を生成蓄積さ
せた後、該酵素を単離することにより得ることかできる
。例えば、湿菌体重量で、０．５〜ｌＯ％好ましくは１
〜５％より具体的には２％になるように懸濁し、この懸
濁液に１〜１５％好ましくは２〜ｌＯ％より具体的には
約５％の炭素源例えばグルコースと、菌体を死滅させな
い範囲例えば約０．０５〜約２％程度好ましくは約０．
１〜約１％程度の基質例えば０．２％の２−メチルアセ
トアニリドを添加し、約１２時間２８℃て振盪培養を行
う。
上記培養液から得られた菌体をｐＨ約６〜約８の緩衝液
例えば０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に湿菌体
を懸濁させ、栄養不足、特にＮ源の不足下好ましくはＮ
源の欠損下に、基質例えば、酸アミド類又はカルボン酸
エステル（例えば芳香族又は脂肪族カルボン酸低級アル
キルエステル）の存在下に培養し、該酵素を生成蓄積さ
せた後、該酵素を単離することにより得ることかできる
。例えば、湿菌体重量で、０．５〜ｌＯ％好ましくは１
〜５％より具体的には２％になるように懸濁し、この懸
濁液に１〜１５％好ましくは２〜ｌＯ％より具体的には
約５％の炭素源例えばグルコースと、菌体を死滅させな
い範囲例えば約０．０５〜約２％程度好ましくは約０．
１〜約１％程度の基質例えば０．２％の２−メチルアセ
トアニリドを添加し、約１２時間２８℃て振盪培養を行
う。
酵素の採取法
上記培養液から本発明酵素を採取、精製するには既知の
精製法か単独もしくは併用して利用されうる。例えば、
培養液を遠心分離にかけ菌体を集め、これを超音波処理
により菌体を破砕した後、遠心分離により無細胞抽出液
を得る。さらに硫安などによる塩析を行った後、フェル
セファロースカラム、ＤＥＡＥ−セファセルカラム、セ
ファデックスＧ−１５０カラム、モノーＱカラム、硫安
塩析、スーパーロースカラムなとて精製を行う。精製法
の一例を次に示す。
精製法か単独もしくは併用して利用されうる。例えば、
培養液を遠心分離にかけ菌体を集め、これを超音波処理
により菌体を破砕した後、遠心分離により無細胞抽出液
を得る。さらに硫安などによる塩析を行った後、フェル
セファロースカラム、ＤＥＡＥ−セファセルカラム、セ
ファデックスＧ−１５０カラム、モノーＱカラム、硫安
塩析、スーパーロースカラムなとて精製を行う。精製法
の一例を次に示す。
（１）菌体の超音波破砕物より遠心分離により無細胞抽
出液を得る。
出液を得る。
（２）硫酸アンモニウムて塩析を行う（飽和度２５〜６
０％）。塩析により得られた活性画分に１０％飽和の硫
安を加え （３）フェニルセファロースＣＬ−４Ｂクロマトグラフ
ィーにかけ、１ｍＭジチオスレイトールを含む０．１Ｍ
リン酸カリウム緩衝液で溶出を行う。
０％）。塩析により得られた活性画分に１０％飽和の硫
安を加え （３）フェニルセファロースＣＬ−４Ｂクロマトグラフ
ィーにかけ、１ｍＭジチオスレイトールを含む０．１Ｍ
リン酸カリウム緩衝液で溶出を行う。
（４）更に、ＤＥＡＦセファセルクロマイトグラフィー
にかけ１ｍＭジチオスレイトール、０．２Ｍ ＫＣＩを
含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液により溶出を行う。
にかけ１ｍＭジチオスレイトール、０．２Ｍ ＫＣＩを
含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液により溶出を行う。
（５）次に１ｍＭジチオスレイトールを含む０．１Ｍリ
ン酸カリウム緩衝液とＫＣＩによりＯ−０，５Ｍ ＫＣ
Ｉ（７）濃度勾配溶ａ法で（４）に準じてＤＥＡＥセフ
ァセルクロマトグラフィーにかける。
ン酸カリウム緩衝液とＫＣＩによりＯ−０，５Ｍ ＫＣ
Ｉ（７）濃度勾配溶ａ法で（４）に準じてＤＥＡＥセフ
ァセルクロマトグラフィーにかける。
（６）続いて０．０１Ｍリン酸カリウム／１ｍＭジチオ
スレイトール１０．２ＭＫＣｌを含む緩衝液（ｐＨ８，
０）を溶媒として用いるセファデックスＧ−１５０のゲ
ル口過を行う。
スレイトール１０．２ＭＫＣｌを含む緩衝液（ｐＨ８，
０）を溶媒として用いるセファデックスＧ−１５０のゲ
ル口過を行う。
（７）次にＦＰＬＣを用いたモノＱクロマトグラフィー
を行い、２０ｍＭモノエタノールアミン／ｌ［１１Ｍジ
チオスレイトールを含む緩衝液（ｐＨ９，５）中てＮａ
Ｃ１の濃度勾配を０〜０．７Ｍと変化させ溶出を行う。
を行い、２０ｍＭモノエタノールアミン／ｌ［１１Ｍジ
チオスレイトールを含む緩衝液（ｐＨ９，５）中てＮａ
Ｃ１の濃度勾配を０〜０．７Ｍと変化させ溶出を行う。
（８）再度（７）と同様の操作をもう一度繰り返し行う
。
。
（９）次にステップ（２）で行う硫酸アンモニウムによ
る塩析を３５〜４５％飽和で行う。
る塩析を３５〜４５％飽和で行う。
（１０）最後に０．０５Ｍリン酸カリウム／１ｍＭジチ
オスレイトール１０．１５ＭＮａＣｌを含む緩衝液（ｐ
Ｈ７，６）を溶媒として用いるＦＰＬＣによるスーパー
ロースＴＭ１２のゲル口過を行う。
オスレイトール１０．１５ＭＮａＣｌを含む緩衝液（ｐ
Ｈ７，６）を溶媒として用いるＦＰＬＣによるスーパー
ロースＴＭ１２のゲル口過を行う。
このような方法で精製したときの各ステップにおける酵
素の純化の重合を表１に示す。表１における活性は後述
の活性測定法により測定した値である。このようにして
、ステップ１０では２６．７単位／ｍｇ蛋白質の（当初
の酵素液に比較して２０９倍に純化された）精製酵素が
得られる。以下、後述の酵素の性質は、この精製酵素を
用いて調べられた。
素の純化の重合を表１に示す。表１における活性は後述
の活性測定法により測定した値である。このようにして
、ステップ１０では２６．７単位／ｍｇ蛋白質の（当初
の酵素液に比較して２０９倍に純化された）精製酵素が
得られる。以下、後述の酵素の性質は、この精製酵素を
用いて調べられた。
夷
活性測定法
１００ｍＭのグリシンを含有するグリソンバッフ７−
（ｐＨ９，５）に基質として２−メチル−アセトアニリ
ドか１０ｍＭとなるように添加し、これに活性か未知の
酵素液１０μｍを加え、総量を１．０−とする。
（ｐＨ９，５）に基質として２−メチル−アセトアニリ
ドか１０ｍＭとなるように添加し、これに活性か未知の
酵素液１０μｍを加え、総量を１．０−とする。
これを３５℃て２０分間インキュベー） Ｌ、 ｌＮＨ
Ｃｌ 、０．２イの添加て反応を止め生成した２−メチ
ルアニリンをＨＰＬＣで定量する。酵素の１単位は、１
分間に１μｍｏｌの２−メチルアニリンを生成する酵素
量となる。ＨＰＬＣの容性を以下に示す。
Ｃｌ 、０．２イの添加て反応を止め生成した２−メチ
ルアニリンをＨＰＬＣで定量する。酵素の１単位は、１
分間に１μｍｏｌの２−メチルアニリンを生成する酵素
量となる。ＨＰＬＣの容性を以下に示す。
カラム Ｍ＆Ｓパッバッ、、 （φ４．６ ｘ１５０ｍ
ｍ）溶媒・アセトニトリル：１％に８２ＰＯ４ｐ８５．
３＝３０・７０検出・２４０ｎｍによる吸光度 流速： １．０ ｍｌ／ｍｉｎ 温度：室温（２０〜２５℃） 酵素の性質 本発明酵素の理化学的性質を以下に示す。
ｍ）溶媒・アセトニトリル：１％に８２ＰＯ４ｐ８５．
３＝３０・７０検出・２４０ｎｍによる吸光度 流速： １．０ ｍｌ／ｍｉｎ 温度：室温（２０〜２５℃） 酵素の性質 本発明酵素の理化学的性質を以下に示す。
■作用および基質特異性
■−１基質特異性及びＫｍ値
種々の濃度の下記基質を含有するグリ
シンバッファーにそれぞれ本酵素を加えて活性測定法に
準じて酵素反応を行い、生じた生成物あるいは減少した
基質のモル数を測定した。種々の基質を用いた実験を行
った結果を表２に示す。
準じて酵素反応を行い、生じた生成物あるいは減少した
基質のモル数を測定した。種々の基質を用いた実験を行
った結果を表２に示す。
表
表２において、プロピオンアミド、ｎ−ブチルアミドに
ついて（友生成してくるアンモニアをネマラー試薬によ
り定量を行う。
ついて（友生成してくるアンモニアをネマラー試薬によ
り定量を行う。
さら１ｍよアニリンをアシ）ＩＩＰン印本とするアシ／
ＩａｌｌｉｌｅＦｊＥｒも行うことが出来も ■至適ｐｌ（および安定ｐＨ範囲 本酵素を用い、ｐＨ６，３〜１１．８の範囲のｐＨ条件
下で活性測定法の方法に準じて酵素反応を行った。但し
、使用したバッファーはｐＨ６，３〜８．４（−・−）
の範囲では５０ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ６，
５〜８．５（−ム−）の範囲では５０ｍＭ トリエタノ
ールアミンバッファー、ｐＨ６，７〜８．８（−△−）
の範囲では５０ｍＭＴｒｊｓバッファー、ｐＨ８，６〜
１０．２（−ロー）の範囲では５０ｍＭグリシンバファ
＝、Ｉ）８９．７〜１０．８ （−マー）の範囲では５
０ｍＭ炭酸水素ナトリウムバッファ、そしてｐＨ１０，
６〜１１．８（−一一）の範囲では５０ｍＭリン酸水素
ナトリウムバッファーであります。その相対活性を第１
図に示す。第１図から至適ｐＨは３５℃において約９．
５であることかわかる。
ＩａｌｌｉｌｅＦｊＥｒも行うことが出来も ■至適ｐｌ（および安定ｐＨ範囲 本酵素を用い、ｐＨ６，３〜１１．８の範囲のｐＨ条件
下で活性測定法の方法に準じて酵素反応を行った。但し
、使用したバッファーはｐＨ６，３〜８．４（−・−）
の範囲では５０ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ６，
５〜８．５（−ム−）の範囲では５０ｍＭ トリエタノ
ールアミンバッファー、ｐＨ６，７〜８．８（−△−）
の範囲では５０ｍＭＴｒｊｓバッファー、ｐＨ８，６〜
１０．２（−ロー）の範囲では５０ｍＭグリシンバファ
＝、Ｉ）８９．７〜１０．８ （−マー）の範囲では５
０ｍＭ炭酸水素ナトリウムバッファ、そしてｐＨ１０，
６〜１１．８（−一一）の範囲では５０ｍＭリン酸水素
ナトリウムバッファーであります。その相対活性を第１
図に示す。第１図から至適ｐＨは３５℃において約９．
５であることかわかる。
本酵素を所定のｐＨのバッファーに溶解し、５０℃で１
０分間保持した後、残存活性を測定した。ｐＨは６．２
〜８．５（−・−）の範囲ではリン酸バッファー、ｐＨ
６，４〜８．６（−ム−）の範囲てはトリエタノールア
ミンバッファー、ｐＨ６，４〜８．７（−△−）の範囲
ではＴｒｉｓバッファ、 ｐＨ８，３〜１０．０（−ロ
ー）の範囲ではグリシンバッファー、ｐＨ９，３〜１０
．５（−ム−）の範囲では炭酸水素ナトリウムバッファ
ー、そしてｐＨ１０，６〜１１．５（−■−）の範囲で
はリン酸水素ナトリウムバッファーである。それぞれの
残存活性を第２図に示す。第２図から安定ｐＨ範囲は５
０℃では８．５〜９．５であることかわかる。
０分間保持した後、残存活性を測定した。ｐＨは６．２
〜８．５（−・−）の範囲ではリン酸バッファー、ｐＨ
６，４〜８．６（−ム−）の範囲てはトリエタノールア
ミンバッファー、ｐＨ６，４〜８．７（−△−）の範囲
ではＴｒｉｓバッファ、 ｐＨ８，３〜１０．０（−ロ
ー）の範囲ではグリシンバッファー、ｐＨ９，３〜１０
．５（−ム−）の範囲では炭酸水素ナトリウムバッファ
ー、そしてｐＨ１０，６〜１１．５（−■−）の範囲で
はリン酸水素ナトリウムバッファーである。それぞれの
残存活性を第２図に示す。第２図から安定ｐＨ範囲は５
０℃では８．５〜９．５であることかわかる。
■作用適温の範囲
本酵素を用い、２０〜５０℃の範囲において８種類の温
度条件下で、活性測定法に準じて酵素反応を行った。そ
の相対活性を第３図に示す。
度条件下で、活性測定法に準じて酵素反応を行った。そ
の相対活性を第３図に示す。
第３図から至適温度は４５℃であることがわかる。
■阻害剤
本酵素を用い、各種金属イオンや試薬を存在させた溶液
中で活性測定法に準じて酵素反応をの行った。その相対
活性を表３に示す。
中で活性測定法に準じて酵素反応をの行った。その相対
活性を表３に示す。
表３から本酵素はＨｇｔ−て強く阻害されＰＣＭＢ、４
−フェニルセミカルバジド、８−ヒドロキシキノリンで
も活性の阻害されることかわかる。
−フェニルセミカルバジド、８−ヒドロキシキノリンで
も活性の阻害されることかわかる。
■分子量
ソジウムドテシルサルフエイト（５ＤＳ）電気泳動法に
よる分子量は約５２．０００である。本酵素をゲル口過
にかけると分子量約１２６．０００の物質か確認される
。そのため、本酵素は分子量約５２．０００のサブユニ
ットから３個結合した形で存在すると考えられる。
よる分子量は約５２．０００である。本酵素をゲル口過
にかけると分子量約１２６．０００の物質か確認される
。そのため、本酵素は分子量約５２．０００のサブユニ
ットから３個結合した形で存在すると考えられる。
実施例
（Ａ ） Ｎｏｃａｒｄｉａ ｇｌｏｂｅｒｕｌａ Ｉ
Ｆ０１３５１０株の培養・グルコース５％、大豆粉加水
分解物０．２５％、酵母エキス０．５％、ＮａＣ１０，
５％、ＫｈｚＰＯ４０，１％、Ｋ２ＨＰＯ＜ ０．２％
、Ｆｅ５０＊−６Ｈ！ｏ ５０ｏ＋ｇ＃ ＳＬ−ヒスチ
ジン０．２％を含有する溶液（ｐＨ７，０）を培地とし
、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｇｌｏｂｅｒｕｌａ ＩＦｏ １
３５１０株の培養を行った。
Ｆ０１３５１０株の培養・グルコース５％、大豆粉加水
分解物０．２５％、酵母エキス０．５％、ＮａＣ１０，
５％、ＫｈｚＰＯ４０，１％、Ｋ２ＨＰＯ＜ ０．２％
、Ｆｅ５０＊−６Ｈ！ｏ ５０ｏ＋ｇ＃ ＳＬ−ヒスチ
ジン０．２％を含有する溶液（ｐＨ７，０）を培地とし
、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｇｌｏｂｅｒｕｌａ ＩＦｏ １
３５１０株の培養を行った。
培養は２８℃で約３日間レシプロ式振盪培養法により行
った。
った。
（Ｂ）酵素の誘導＝ （Ａ）項で得られた培養液６１を
遠心分離し、２３０ｇの湿菌体を得た。この湿菌体をＯ
，０１Ｍリン酸バッファーｐＨ７，０て３回洗浄を行い
、再度０．０１Ｍリン酸バッファーｐｉ（７，０１１に
懸濁した。２１容の坂ロフラスコに菌体懸濁液を６５ｍ
１ずつ分注し、さらに６５イの１０％グルコース、０．
４％の２−メチルアセトアニリドを含む０．０１Ｍリン
酸バッファーｐＨ７，０を加え、２８℃て１２時間レシ
プロ式振盪培養を行った。
遠心分離し、２３０ｇの湿菌体を得た。この湿菌体をＯ
，０１Ｍリン酸バッファーｐＨ７，０て３回洗浄を行い
、再度０．０１Ｍリン酸バッファーｐｉ（７，０１１に
懸濁した。２１容の坂ロフラスコに菌体懸濁液を６５ｍ
１ずつ分注し、さらに６５イの１０％グルコース、０．
４％の２−メチルアセトアニリドを含む０．０１Ｍリン
酸バッファーｐＨ７，０を加え、２８℃て１２時間レシ
プロ式振盪培養を行った。
（ｃ）酵素の採取および精製 （Ｂ）項で得られた培養
液を遠心分離し再び菌体を集めた。この湿菌体を０．１
Ｍリン酸バッファーで３回洗浄し、１ｍＭジチオスレイ
トールを含むＯ，１Ｍリン酸バッファー２５Ｏｒ！Ｌｌ
に懸濁し、７０ｒｎＩ！ずつに分けてｒＮｓＯＮＡＴＯ
Ｒ２０１Ｍ（ＫＬＩＢＯＴＡ社製）により超音波破砕を
行った。得られた破砕液を遠心分離にかけ菌体破片を除
き、無細胞抽出液を得た。これを硫酸アンモニウムて塩
析を行った。（飽和度２５〜６０％）。得られた沈殿を
１０％硫酸アンモニウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液／
ｌｄジチオスレイトールｐＨ７，０に溶解し、フエニル
ーセファロースＣＬ−４Ｂクロマトグラフィー（カラム
２．０φｘ２０ａｎ）にかけた。
液を遠心分離し再び菌体を集めた。この湿菌体を０．１
Ｍリン酸バッファーで３回洗浄し、１ｍＭジチオスレイ
トールを含むＯ，１Ｍリン酸バッファー２５Ｏｒ！Ｌｌ
に懸濁し、７０ｒｎＩ！ずつに分けてｒＮｓＯＮＡＴＯ
Ｒ２０１Ｍ（ＫＬＩＢＯＴＡ社製）により超音波破砕を
行った。得られた破砕液を遠心分離にかけ菌体破片を除
き、無細胞抽出液を得た。これを硫酸アンモニウムて塩
析を行った。（飽和度２５〜６０％）。得られた沈殿を
１０％硫酸アンモニウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液／
ｌｄジチオスレイトールｐＨ７，０に溶解し、フエニル
ーセファロースＣＬ−４Ｂクロマトグラフィー（カラム
２．０φｘ２０ａｎ）にかけた。
溶出は、０．１Ｍリン酸緩衝液／１ｍＭジチオスレイト
ールｐＨ７，０で行った。さらにＰＥＡＥ−セファセル
クロマトグラフィー（カラム２．０φｘ２０ｃｍ）にか
け０゜２ＭＫｃｌを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）／１ｍＭジチオスレイトールで溶出を行った。再
度、同カラムてＯ，１Ｍリン酸緩衝液／１ｍＭジチオス
レイトールｐＨ７゜０を溶媒とし、０〜０．５Ｍ Ｋｃ
ｌの濃度勾配溶出法で溶出を行った。さらにセファデッ
クスＧ−１５０ゲルカラム（１，０φＸ８００１１）を
用い、１０ｍＭリン酸カリウム／１ｍＭジチオスレイト
ール１０．２ＭＫＣｌを含む緩衝液（ｐＨ８，０）を用
いゲル口過を行った。さらにＦＰＬＣによりＭｏｎｏ
Ｑ ＨＲ５１５カラム（Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ社製）を
用い、２０ｍＭモノエタノールアミン／１ｍＭジチオス
レイトールｐＨ９，５を溶媒とし、Ｏ〜０．７Ｍ Ｎａ
Ｃ１の濃度勾配溶出法で溶出を行った。この操作を再度
同条件で行った。次に、硫酸アンモニウムによる塩析を
行った（飽和度３５〜４５％）。最後に、ＦＰＬＣによ
り、５ｕｐｅｒｏｓｅ１２ ＨＲＩＯ／３０カラム（Ｐ
ｈａｒｍａｃ ｉａ社製）を用い、５０ｍＭリン酸カリ
ウム／１ｍＭジチオスレイトール１０．１５ＭＮａＣＩ
Ｉ）Ｈ７，６を含む緩衝液を用いゲル口過を行い精製酵
素を得た。
ールｐＨ７，０で行った。さらにＰＥＡＥ−セファセル
クロマトグラフィー（カラム２．０φｘ２０ｃｍ）にか
け０゜２ＭＫｃｌを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）／１ｍＭジチオスレイトールで溶出を行った。再
度、同カラムてＯ，１Ｍリン酸緩衝液／１ｍＭジチオス
レイトールｐＨ７゜０を溶媒とし、０〜０．５Ｍ Ｋｃ
ｌの濃度勾配溶出法で溶出を行った。さらにセファデッ
クスＧ−１５０ゲルカラム（１，０φＸ８００１１）を
用い、１０ｍＭリン酸カリウム／１ｍＭジチオスレイト
ール１０．２ＭＫＣｌを含む緩衝液（ｐＨ８，０）を用
いゲル口過を行った。さらにＦＰＬＣによりＭｏｎｏ
Ｑ ＨＲ５１５カラム（Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ社製）を
用い、２０ｍＭモノエタノールアミン／１ｍＭジチオス
レイトールｐＨ９，５を溶媒とし、Ｏ〜０．７Ｍ Ｎａ
Ｃ１の濃度勾配溶出法で溶出を行った。この操作を再度
同条件で行った。次に、硫酸アンモニウムによる塩析を
行った（飽和度３５〜４５％）。最後に、ＦＰＬＣによ
り、５ｕｐｅｒｏｓｅ１２ ＨＲＩＯ／３０カラム（Ｐ
ｈａｒｍａｃ ｉａ社製）を用い、５０ｍＭリン酸カリ
ウム／１ｍＭジチオスレイトール１０．１５ＭＮａＣＩ
Ｉ）Ｈ７，６を含む緩衝液を用いゲル口過を行い精製酵
素を得た。
（発明の効果）
本発明によれば、このようにノカルディア グロベルラ
ｒＦ０１３５１０ ’株から、新規アリールアシルアミ
ダーゼか得られる。この酵素は、基質として広範囲のア
ニリド類を加水分解するばかりでなく、芳香族アミド、
脂肪族アミド類にも作用し、さらにエステル類をも加水
分解する活性と、アニリンにアシル基を転位させる活性
を有する。これまでに知られていないアリールアシルア
ミダーゼである。
ｒＦ０１３５１０ ’株から、新規アリールアシルアミ
ダーゼか得られる。この酵素は、基質として広範囲のア
ニリド類を加水分解するばかりでなく、芳香族アミド、
脂肪族アミド類にも作用し、さらにエステル類をも加水
分解する活性と、アニリンにアシル基を転位させる活性
を有する。これまでに知られていないアリールアシルア
ミダーゼである。
第１図は本酵素の至適ｐＨを示すグラフ、第２図は本酵
素の安定ｐＨ範囲を示すグラフであり、第１図及び第２
図において、（１）はリン酸カリウムバッファー、（２
）はトリエタノールアミンバッファー（３）はＴｒｉｓ
バッファー（４）はグリシンバッファー （５）は炭酸
ナトリウムバッファー（６）はリン酸ナ ト リウムバッファー中でのもの である。 第３図は本酵素の至適温度を示すグラフである。
素の安定ｐＨ範囲を示すグラフであり、第１図及び第２
図において、（１）はリン酸カリウムバッファー、（２
）はトリエタノールアミンバッファー（３）はＴｒｉｓ
バッファー（４）はグリシンバッファー （５）は炭酸
ナトリウムバッファー（６）はリン酸ナ ト リウムバッファー中でのもの である。 第３図は本酵素の至適温度を示すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、次の性質を有するアリールアシルアミダーゼ ［１］作用および基質特異性： （ａ）アニリド類をアニリン類と脂肪酸アニオンへ加水
分解する。 （ｂ）芳香族アミド及び脂肪族アミドをアミン類とカル
ボン酸へ加水分解する。 （ｃ）安息香酸アルキルエステルを安息香酸とアルキル
アルコールへ加水分解する。 （ｄ）脂肪酸のフェノールエステルを脂肪酸とフェノー
ルへ加水分解する。アニリド類からアニリンへのアシル
基の転位。 ［２］至適ｐＨ：３５℃において９．５である。 ［３］安定ｐＨ：５０℃において８．５〜９．５である
。 ［４］作用適温の範囲：至適温度は４５℃である。 ［５］熱安定性：ｐＨ９．５において１０分間保持した
場合５０℃まで安定である。 ［６］分子量：ソジウムドデシルサルフェイト電気泳動
法によるサブユニット分子量５２，０００また、ＫＳＫ
−ＧＥＬＧ３０００ＳＷカラムによる分子量は１２６，
０００である。 ［７］アセトアニリドに対するミハエリス定数Ｋｍ値：
１．１９×１０＾−＾３Ｍ ２、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属菌から得られ
る特許請求の範囲第１項に記載のアリールアシルアミダ
ーゼ。 ３、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属に属するアリ
ールアシルアミダーゼ生産能を有する菌株を栄養培地中
で培養し、次いで得られた菌体を、アリールアシルアミ
ダーゼ誘導用培地中で培養し、アリールアシルアミダー
ゼを生成蓄積せしめ、次いで該酵素を単離することを特
徴とするアリールアシルアミダーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2076794A JPH03277281A (ja) | 1990-03-28 | 1990-03-28 | アリールアシルアミダーゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2076794A JPH03277281A (ja) | 1990-03-28 | 1990-03-28 | アリールアシルアミダーゼ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03277281A true JPH03277281A (ja) | 1991-12-09 |
Family
ID=13615541
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2076794A Pending JPH03277281A (ja) | 1990-03-28 | 1990-03-28 | アリールアシルアミダーゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03277281A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007097429A1 (ja) * | 2006-02-24 | 2007-08-30 | Kaneka Corporation | 新規アシルアミダーゼ遺伝子およびその利用法 |
-
1990
- 1990-03-28 JP JP2076794A patent/JPH03277281A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007097429A1 (ja) * | 2006-02-24 | 2007-08-30 | Kaneka Corporation | 新規アシルアミダーゼ遺伝子およびその利用法 |
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