JPH0332680A - Ｔリンパ球の分離材および分離装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分軒） 本発明は、Ｔリンパ球の分離材および分離装置に関する
ものである。詳しく述べると、本発明は免疫監視機構で
重要な役割を果す細胞のうち、Ｔリンパ球を選択的に捕
捉可能な分離材およびこれを充填したカラムを有する分
離装置に関するものである。また本発明は細胞性免疫に
深く係わるＴリンパ球を選択的に捕捉することで各押免
疫疾患の診断や治療に応用可能なＴ　リンパ球の分離材
および分離装置に関するものである。

（従来の技術） 免疫担当細胞の中心をなすのは、抗原特異的レセプター
を備えて抗原を認識し、体液性、細胞性の特異抗体を産
生ずるエフェクター細胞まで分化する能力をもつリンパ
球であり、免疫適格細胞（１ｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅ
ｎｔ　ｃｅｌｌ）と呼ばれる細胞である。

しかしながら、生体内での免疫応答をリンパ球のみで行
なうことは不可能であり、抗原を処理してリンパ球に提
示する免疫反応の上行脚では、マクロファージ亜群の樹
状細胞が必要である。また、抗原抗体反応の最終効果で
ある異物処理や、血管反応を中心とした炎症反応は、免
疫応答の平行脚にあたり、マクロファージのばか顆粒球
、肥満細胞などが関与している。

多様な免疫担当細胞は、複雑な免疫反応の要求に対して
、局所への動員と増殖により速やかに対応することが特
徴であり、刺激に対する増殖と分化は、生体の他の細胞
系における機能調節にあたる役割をもっている。

リンパ球は大きく別けて、胸腺の影響を受けて成熟する
Ｔリンパ球と、ファブリキウス嚢、あるいは哺乳類では
これに相当する器官（肝、骨髄などの造血巣）の影響を
受けて成熟するＢリンパ球に分別されるが、Ｂリンパ球
の場合、抗原刺激を受けた後は抗体産生細胞への分化増
殖と抗体の産生といういわば単一方向への変化を示すの
に対し、Ｔリンパ球のそれは単一ではなく、１つの抗原
刺激によって数種類の種々の機能を持つＴリンパ球に変
化が起り、あるものはエフェクター細胞へ、またあるも
のは制御（分化増殖の促進または抑制）細胞として機能
する。すなわち、Ｔリンパ球には、その機能面において
サブセットが存在すると考えられている。いわゆるヘル
パー下リンパ球（Ｔ、、）、キラー（細胞障害性、ｃｙ
ｔｏｔｏｘｉｃ　）　Ｔリンパ球（Ｔｃ）、サプレッサ
ーＴリンパ球（Ｔｓ）、遅延型アレルギーに関与するＴ
リンパ球（ＴＤＴＩ＋）などのサブセットである。これ
らサブセットの存在は、これらサブセットのマーカーと
なる表面抗原に対する抗体（モノクローナル抗体）によ
るＴリンパ球の分類とその機能との相関によって示され
ている。

近年、このように重要な機能を有するリンパ球を分離、
分画し、免疫科学的基礎研究あるいは各種の診断や治療
に利用する試みがなされているが、従来、リンパ球の分
離法としては以下に述べるような種々の方法が知られて
いる。

すなわち、（１）細胞の大きさの差を利用した速度沈降
法などの方法、（２）細胞の比重差を利用した比重遠心
法などの方法、（３）細胞表面電荷量の差を利用した細
胞電気泳動法などの方法、（４）負負活性を利用したカ
ルバニール鉄による単球の除去、（５）細胞の非特異的
付着活性の差を利用した、ナイロンウール、ガラスウー
ルなどを充填したカラムを用いる、あるいはガラス、プ
ラスチックなどのシャーレを用いるなどの方法、（６）
細胞の特異的結合能を利用したアフィニティークロマト
グラフィー　（７）細胞のロゼツト形成を指標とするロ
ゼツト沈降法、（８）細胞膜表面の特異抗原、免疫グロ
ブリンと標識抗体との反応を利用したフルオレセインア
クチベイテッドセルソーター（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃ
ｅ　Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　Ｃｅ１ｌ　Ｓｏｒｔｌｎｇ
、　Ｆ　Ａ　ＣＳ　）法などである（例えば、矢１０純
−１藤原道夫編著、新リンパ球機能探索法、１９８７年
、中外医学社などを参照のこと。）。また、支持体や固
定相を使用しない多段分離の手段として（９）フィール
ドフローフラクショネーション（Ｐｅｉｌｄ−Ｐｌｏｗ
　［’ｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ、　Ｆ　Ｆ　Ｆ）法が
検討されている。

しかしながら、（１）〜（３）におけるような物理的な
細胞分離法は、Ｔリンパ球とＢリンパ球との間に比重、
密度等の物理的諸物性に際だった差がないため、分離回
収された細胞の収率あるいは純度に高い精度が要求でき
ないものであり、さらに（２）の比重遠心法においては
、媒体の価格が高価になってしまうか、あるいは安い場
合でも操作に熟練を要する、また（３）の細胞電気泳動
法においては、細胞の成熟度によって移動度が異なる、
細胞機能に与える電場の影響が解明されていない、大量
処理の国難であるといった欠点も古するものであった。

また、（６）〜（８）におけるような細胞膜表面の特異
抗原、レセプター、免疫グロブリンなどを指標とする細
胞分離法は、いずれも処理細胞が生物学的に特異性の高
い強固な結合や刺激を受けるため、インタクトな状態で
回収するのが難しく、かつ大量処理に向かないものであ
り、さらに（６）のアフィニティークロマトグラフィー
は、高価な抗体を必要とし、また（８）のＦＡＣ３法は
、細胞を標識する等の前処理が煩雑であり、高価な抗体
と装置を必要とするといった欠点を有するものであった
。

また（９）のＦＦＦ法は、回転軸を介して溶離液を連続
的に流入、流出する装置的な困難さと共に、ローター状
分離セルと流路の材質が細胞の接着を招くために、細胞
の相互分離を実用化するところまでには至っていない。

これに対し、（５）の細胞の非特異的付着特性を利用し
た方法は、処理細胞の機能を損傷する虞れが少なく、ま
た価格、操作性、および大量処理性の面でも適当なもの
であるが、目的細胞に対する選択性および回収率の面で
は不十分なものであり、さらに前記したカラム法などに
おいては、分離操作を行う場合の経験的技術的習熟が必
須であるという大きな課題も存在しているものであった
。

このような非特異的付着特性を利用する分離相および分
離方法としては、疎水性材料（特公昭５９−１７３８７
号、同５９−３６９６３号、同６２−４５２０６号、特
開昭５７−２０４４５４号）、酸性官能基を右する材料
（特公昭５９−３６９６１号、特開昭５６−１４０８８
６号、同５６−１５２７４０号）、塩基性官能基を含有
する重合体（特開昭５９−２１６５８４号、同６０−１
０５４９０号）、ヒドロキシアパタイト繊維（特開昭６
３−２８４号）、特定の高分子体（特開昭６１−２２１
１２３号、同６４−３４２８５号）を用いることも提喝
されているが、これらのものにおいても目的細胞に対す
る選択性および回収率の面では未だ十分なものではなか
った。

（発明が解決しようとする課ａ） 従って、本発明は新規なＴリンパ球の分離材および分離
装置を提供することを目的とするものである。本発明は
また、免疫担当細胞のＴリンパ球を効率よく分離でき、
かつ細胞機能を損なうことなく細胞を回収できるＴリン
パ球の分離材および分離装置を提供することを目的とす
るものである。

本発明はさらに、操作が簡便でかつ特殊な装置を必要と
せず効率よくＴリンパ球を分離できるＴリンパ球の分離
材および分離装置を提供することを目的とするものであ
る。本発明はさらに臨床検査だけでなく、免疫疾患治療
、細胞培養などにも適用できる広い応用性を有するＴリ
ンパ球の分離材および分離方法を提供することを目的と
するものである。

（課題を解決するための手段） 」二記諸目的は、Ｔリンパ球に親和性を有するペプチド
を水不溶性固体物質へ固定化したことを特徴とするＴリ
ンパ球の分離材によって達成される。

本発明はまた、Ｔリンパ球に親和性を有するペプチドが
胸腺ホルモンであるＴリンパ球の分離材を示すものであ
る。本発明はまた、Ｔリンパ球に親和性を有するペプチ
ドが胸腺ホルモンの生物活性部位であるＴリンパ球の分
離材を示すものである。本発明はさらに、胸腺ホルモン
がサイモシン分画５、サイモポイエチン、胸腺体液性因
子、サイモスチムリンおよび胸腺血清目子からなる群か
ら選ばれたものであるＴリンパ球の分離材を示すもので
ある。本発明はまた、Ｔリンパ球に親和性を有するペプ
チドが、ＨＩＶ皮膜タンパク（ｇｐ１２０）とＥＢＶ遺
伝子の相同部分であるペプチドＴであるＴリンパ球の分
離材を示すものである。

上記諸口的はまた、Ｔリンパ球に親和性を有する脂質を
水不溶性固体物質へ固定化したことを特徴とするＴリン
パ球の分離材によっても達成される。

本発明はまた、Ｔリンパ球に親和性を有する脂質が複合
脂質であるＴリンパ球の分離材を示すものである。本発
明はさらに、複合脂質がリン脂質または糖脂質であるＴ
リンパ球の分離材を示すものである。本発明はさらにま
た、リン脂質がイノシトールリン脂質であるＴリンパ球
の分離材を示すものである。

上記諸口的はさらに、Ｔリンパ球に親和性を有するペプ
チドを水不溶性固体物質へ固定化したことを特徴とする
分離材、あるいはＴリンパ球に親和性を有する脂質を水
不溶性固体物質へ固定化したことを特徴とする分離材を
充填したカラムを有することを特徴とするＴリンパ球の
分離装置によっても達成される。

本発明はまた、温熱滅菌、ガス滅菌または放射線滅菌処
理されたものであるＴリンパ球の分離装置を示すもので
ある。

（作用） しかして、本発明に係わるＴリンパ球の分離材は、Ｔリ
ンパ球に親和性を有するペプチドあるいは脂質を水不溶
性固体物質へ固定化したことを特徴とするものであるか
ら、Ｔリンパ球膜表面抗原レセプターに対するペプチド
あるいは脂質の高い親和力を利用して、血液などの体液
、あるいは組織中のＴリンパ球を高い選択性を持ってか
つ収率良く他の細胞から分離できるものである。

この作用をより詳しく説明すると、Ｔリンパ球は前述し
たように、胸腺の影響を受けて成熟するので、胸腺内の
上皮細胞が産生ずる胸腺ホルモン（胸腺体液性因子）に
対するレセプターあるいは認識機構を細胞膜に保有して
いると考えられる。

また細胞膜表面抗原レセプターは、糖タンパク質、糖脂
質、タンパク質、脂質で構成されているので、特定のペ
プチドあるいは脂質は細胞膜表面に強い親和性を有して
いると考えられる。これらの特異的相互作用力を物理化
学的に解析すると、Ｔリンパ球に親和性を右するペプチ
ドあるいは脂質と細胞膜表面とは、ファン◆デル・ワー
ルス力（この力の中身として、配向効果、誘電効果およ
び分散効果の三つの効果が考えられている。）を基本に
して、水素粘合、イオン粘合（クーロン力）、イオン−
双極子開力、配位結合および疎水結合の分子間力が組み
合さって相互作用し、さらに表面分子が形成する空間的
構造が鍵と鍵穴の如く、立体的に適合しているものと推
測されるものである。

ざらにＴリンパ球は前述したように、免疫担当細胞とし
て細胞性免疫を担い、種々の免疫疾患に密接な係わりを
６している。したがって、上述のごとくＴリンパ球を選
択的かつ効率よく分離できれば、６押の診断や治療に役
立つものと考えられる。

以下、本発明を実施態様に基づきより詳細に説明する。

本発明の第１のＴリンパ球分離材は、Ｔリンパ球に親和
性を存するペプチドを水不溶性固体物質へ固定化したこ
とを特徴とするものである。

本発明の第１のＴリンパ球分離材において用いられるＴ
リンパ球に親和性をｒｆするペプチドとは、２〜１００
個のアミノ酸が、ペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）によ
り結合した形の有機化合物であるが、これらのペプチド
のうち、特にＴリンパ球の成熟に係わる胸腺ホルモン、
さらに胸腺ホルモンの生物活性部ｆ：１．　、あるいは
ペプチドＴなどが好ましいものとして挙げることができ
る。

ここで胸腺ホルモンとしては、３０以上の成分を含み分
子量１０００〜１５０００で、約８０°Ｃまで安定な酸
性ポリペプチドであるサイモシン分画５　（Ｔｈｙｍｏ
ｓｉｎ　Ｐｒ−５）、分子量５５６２で妨安定性が畠＜
、等電点が５．２で、４９アミノ酸残基を含むサイモポ
イエチン（１”ｈｙｍｏｐｏｉ　ｅｔ　ｉｎ）、分子量
３２００で、等電点が５．７〜５．９で、３１アミノ酸
残基を含む酸性ポリペプチドである胸腺体液性因子（Ｔ
ｈｙｉｉｃ　ｈｕｍｏｒａｌ　ｆａｃｔｏｒ、　Ｔｌ１
ｌ’）、分子量８５７で、等電点が７．３で、９アミノ
酸残基を含む胸腺血清因子（Ｓｅｒｕｍ　ｔｈｙｍｉｃ
　ｆａｃｔｏｒ）、および分子！１２０００以下で、等
電点が８．３０すイモスチムリン（ＴｈｙｍｏｓｔｉＩ
Ｉｌｕｌｉｎ、　ＴＳ）などがある。

また胸腺ホルモンの生物活性部位とは、ペプチドの合成
が比較的容易なオリゴペプチドであり、ＩＦＩえば、サ
イモシン分画５に属するサイモシンαの２３〜２８アミ
ノ酸残基（具体的には、Ｖａｔ−Ｇｌｕ　−Ｇｌｕ　−
Ａｌａ　−Ｇｌｕ　−Ａｓｎ　）　、サイモポイエチン
に属するサイモポイエチンＩの３２〜３６アミノ酸残基
（具体的にはＡｒｇ−Ｌｙｓ　−Ａｓｐ　−Ｖａｌ　−
１’ｙｒ　）　、および胸腺血浴因子の内の中性の９ア
ミノ酸残基（具体的には、Ｇｌｕ　−Ａｌａ　−Ｌｙｓ
　−８ｃｒ　−Ｇｉｎ　−Ｇｌｙ　−Ｇｌｙ　−３ｃｒ
　−Ａｓｎ）などがある。

さらに、本発明の第１のＴリンパ球分離利において好適
なペプチドとして用いられるペプチドＴは、ヒト免疫不
全症ウィルス（ｌｌｕａ＋ａｎ　１ｍａ＋ｕｎｏｄｃｌ
’１ｃｉｃｎｅｙ　ｖｉｒｕｓ、　ＩＩＩＶ）皮膜タン
パク（ｇｐ１２０）とエプスタイン−バールウィルス（
ｌＥｐｓｔｅｉｎ−ＢａｒｒＶｌｒｕｓ、　ＥＢＶ）遺
伝子の相同性部分である。すなわちＡＩＤＳ（後天性免
疫不全症蚊群）の属目ウィルスであるＨＩＶは、Ｔ４細
胞（ヘルハー／インデューサーＴ細胞）に感染するが、
ＨＩＶの皮膜タンパク質であるｇｐ１２０がＴ４細胞の
ＣＤ４抗原に結合することにより感染が成立する。した
がって、好リンパ性であるＥＢＶ遺伝子とｇｐ１２０と
の相同性部分であるペプチドＴは、Ｔリンパ球に親和性
を有していると推測されるものである。ペプチドＴの１
次構造は、Ａｌａ　−８ｃｒ　−１”ｈｒ−Ｔｈｒ　−
１”ｈｒ　−Ａｓｎ　−Ｔｙｒ−Ｔｈｒであり、１゛ｈ
「が多いのでペプチドＴと呼ばれている。

本発明の第１のＴリンパ球の分離相において、このよう
なＴリンパ球に親和性を６するペプチドを固定化させる
担体としての水不溶性固体物質としては、親水性のもの
であっても、あるいは疎水性のものであってもよく、具
体的には例えば、アガロース系、デキストラン系、キト
サン系、セルロース系などの多糖類、ポリアクリルアミ
ド系、ポリビニルアルコール系、ポリビニルピロリドン
系、ポリアクリロニトリル系、スチレン−ジビニルベン
ゼン共重合体、ポリスチレン系、アクリル酸エステル系
、メタクリル酸エステル系、ポリエチレン系、ポリプロ
ピレン系、ポリ４−フッ化エチレン系、エチレン−酢酸
ビニル共重合体系、ポリアミド系、ポリカーボネート系
、ポリフッ化ビニリデン系、ポリビニルホルマール系、
ボリアリレート系、ポリエーテルスルフォン系などの゛
Ｇ機合合皮分子、ガラス系、チタン系、活性炭系、ある
いはアルミナ、シリカ、ヒドロキシアパタイト等の各種
セラミックス系などの無機物などが挙げられるが、通常
、固定化酔素法、アフィニティークロマトグラフィーな
どにおいて用いられる公知の担体は特別の出足なく使用
することができる。

このような水不溶性固体物質の形態としては、特に比定
されず、粒子状、繊維状、中空糸状、膜状、あるいは平
板状等の公知のいずれの形状のものも用いることができ
るが、体液ないしは細胞懸濁液の通液性、分離材調製時
の取扱い簡便性などの点から、粒子状のものが好ましく
、特に粒径が０．０５〜５ｍｍの粒子状のものが有効表
面積および通液性などの面から望ましい。さらに粒子形
状は細胞に物理的な損傷を与えにくいことクダケ、カケ
などが生じにくいこと、均一な粒子を得やすい等の点か
ら球形のものが好ましい。また、このような担体は、多
孔質あるいは緻密質のいずれであってもよい。　本発明
のＴリンパ球の分離材において、上記のごとき水不溶性
固体物質表面に前記のごときＴリンパ球に親和性を存す
るペプチドを固定化する方法としては、共何結合、イオ
ン結合、物理的吸着、疎水結合、生化学的特異結合など
の担体結合法、あるいは架橋法、包括法、複合法などあ
らゆる公知の方法を用いることができるが、体液ないし
は細胞懸ｆＡ液中での安定性の点から、北ａ粘合または
疎水結合により固定することが好適である。

Ｔリンパ球に親和性を右するペプチドを水不溶性固体物
質の表面に共ｈ゛結合るためには、両者の官能基に応じ
て、秤々の方法が用いられる。例えば、臭化シアン活性
化法、カルボジイミド試藁などを用いる縮合拭楽法、酸
アジド誘導体法、ジアゾ法、アルキル化法、ジアルデヒ
ドやビスエポキシド、ジイソシアネートなどを用いる担
体架橋法、γ−グリシドキシブロビルトリメトキシシラ
ンやβ−（３，４−エポキシンクロヘキシル）エチルト
リメトキシシランなどを用いるシランカップリング剤活
性化法などが使用される。また必要に応じて、Ｔリンパ
球に親和性を有するペプチドと水不溶性固体物質表面と
の間に任意の長さのスペーサ分子を導入して使用するこ
とも可能である。

このスペーサー分子としては、ヘキサメチレンジアミン
などのジアミン類、ヘキサメチレングリコールなどのジ
オール類などが好ましいものとして挙げることができる
。

またＴリンパ球に親和性を有するペプチドを水不溶性固
体物質表面に疎水粘合する方法としては、例えばポリス
チレン、ポリプロピレンなどの疎水性重合体へ直接結合
させる方法、また上述の共有結合法により担体へ分子内
に疎水基を−ａするカップリング剤を結合させた後に疎
水結合させる方法などがある。分子内に疎水基をＨする
カップリング剤としては、オクタデシルジメチル［３−
（）リメトキシシリル）プロピル］アンモニウムクロラ
イド、オクタデシルトリクロロシラン、フェニルトリク
ロロシランなどがある。

本発明の第２のＴリンパ球の分離材は、Ｔリンパ球に親
和性ををする脂質を水不溶性固体物質に固定化したこと
を特徴とするものである。

本発明の第２のＴリンパ球分離材において用いられるＴ
リンパ球に親和性を有する脂質としては、単純脂質、複
合脂質および誘導脂質が含まれるが、このうち特に細胞
間相互作用において重要な段別を示す複合脂質が好まし
い。さらに複合脂質の中でも細胞膜表面の糖脂質の構成
脂質であるリポシトール、ジホスホイノシチド、モノホ
スホイノシチドなどのイノシトールリン脂質、あるいは
セレブロシド、ガングリオシドなどの糖脂質がより一層
強い相互作用力を右していると考えられるためにより好
ましい。

本発明の第２のＴリンパ球の分離材において、このよう
なＴリンパ球に親和性を６する脂質を固定化させる担体
としての水不溶性固体物質としては、前記第１のＴリン
パ球の分離材において用いられるものと同様のものを用
いることができ、また固定化方法としても同様のもので
あるために説明を省略する。

上記したようなＴリンパ球に親和性を有するペプチドを
水不溶性固体物質に固定化してなる本発明の第１のＴリ
ンパ球の分離材、あるいはＴリンパ球に親和性をａする
脂質を水不溶性固体物質に固定化してなる本発明の第２
のＴリンパ球の分離材を用いて、Ｔリンパ球分離撮作を
行なうには、これらの分離材を体液あるいは細胞懸濁液
に浸漬するなどにより接触させて、Ｔリンパ球を回分式
に吸着採取することも可能であるが、より好ましくは、
上記のごときＴリンパ球の分離材の表面上に存在して細
胞吸着に作用するペプチドあるいは脂質の絶対量や十分
な細胞吸着スペースを獲得するという点から、粒子状の
Ｔリンパ球の分離材を充填してなるカラムを有する分離
装置を用いて接触させることが望ましい。

すなわち、本発明の分離装置は、Ｔリンパ球に親和性を
有するペプチドを水不溶性固体物質へ固定化したことを
特徴とする本発明の第１の分離材、あるいはＴリンパ球
に親和性を有する脂質を水不溶性固体物質へ固定化した
ことを特徴とする本発明の第２の分離材を充填したカラ
ムを有することを特徴とするものである。

このＴリンパ球の分離装置において、カラム容器を構成
する材質としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポ
リカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレ
ート等の合成樹脂、ガラスおよびステンレス等の金属な
どが使用できるが、オートクＬ／−ブ滅菌が可能で取り
扱いやすいポリプロピレンやポリカーボネート等が特に
好ましい。

またこのＴリンパ球の分離装置のカラムの出入口とＴリ
ンパ球の分離材を充填した分離材層との間には、血球浮
遊液中の細胞成分は通過するが分離材は通過できない網
目を有するフィルターを備えていることが好ましく、こ
のフィルターを構成する材質としては、生理学的に不活
性で強度の高いものであればよいが、特にポリエステル
、ポリアミドであることが奸まれる。

第１図は本発明のＴリンパ球の分離装置の−実施態様の
構造を模式的に示す断面図である。第１図に示す実施態
様におけるＴ　リンパ球の分離装置１においては、流体
導入口２および流体導出口３を備えてなるカラム容器４
に祉子状の本発明に係わるＴリンパ球の分離材５が充填
されており、この分離材５は流体導入口２および流体導
出口３の近傍に設けられたフィルター６ａ、６ｂによっ
てカラム容器４内に保持されている。

このＴリンパ球の分離装置１を用いて、免疫疾患の患者
に対して体外循環療法を行なうには、例えば第２図に示
すような回路中にこのＴリンパ球の分離装置ｄｌを組み
入れればよい。この第２図に示す体外循環回路を用いて
の体外循環療法を簡単に説明すると、患者からの血液は
、該回路の血液導入口７より回路内に導入され、血液ポ
ンプ８、および圧力ゲージ１０ａを備えたチャンバー９
ａを通って、一定流速にてＴ　リンパ球の分離装置１内
へ流体導入口２より導入され、カラム容器４内に収容さ
れた本発明に係わるＴリンパ球の分離材５で吸着処理さ
れた後、流体導出口３よりＴリンパ球の分離装に１外へ
導出される。このようにしてＴ　リンパ球の分離装置１
で処理された血液は、圧力ゲージ１０ｂを備えたチャン
バー９ｂを通って、色温槽１１で加温された後、気泡検
知器１２を通って、回路の血液導出口１３より患者の体
内へ戻されるものである。

なお、このような構成を有する本発明のＴリンパ球の分
離装置は、通常、その使用前に温熱滅菌、ガス滅菌ある
いは放射線滅菌などの滅閑法により滅菌処理をなされる
ものである。

（実施例） 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。

実施例１ 乾燥重量で約１ｇのクロロメチル化ポリスチレンビーズ
（ペプチド研究新製、粒径１００〜２００メツシユ、ジ
ビニルベンゼン１％、Ｃρ３量＝０．６８ミリ当量／ｇ
）にセシウム塩法で、１ｇのＢｏａ　−Ｌ−Ａｓｎ　−
ＯＨを結合し、トリフルオド酢酸でＢｏｅ（ｔ−ブトキ
シカルボニル）基をはずした後に、Ｎ、Ｎ＝−ジシクロ
へキシルカルボジイミドを用いて、Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ
（Ｏｃｌｌｃｘ）　−０Ｈをペプチド結合させた。この
末端に同様にして固相法で順次、Ｂｏｅ　−Ｌ−Ａｌａ
　−ＯＨ，Ｂｏｃ　−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯｅＨｃｘ）−ＯＨ
Ｓ　Ｂｏｃ　　−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｏｃｌｌｃｘ）　−０Ｈ
，Ｂｏｃ　　−Ｌ−Ｖａｌ−ＯＨを結合した後、トリフ
ルオロ酢酸およびパラジウム黒を用いた接触還元によっ
て保護基をはずすことによって１、サイモシンα１の２
３〜２８アミノ酸残基に相当するヘキサペプチドをポリ
スチレンビーズに結合したＴリンパ球分離材を得た。

この分離材をｐＨ７，４のリン酸緩衝化塩溶液（Ｐ　Ｂ
　Ｓ）に懸濁させ、先端内部にポリエステル不織布を入
れた容量１ｍｌのディスポーサブルシリンジ（テルモ■
製）へ、０．５ｍｌ充填した。

そしてこのシリンジ先端に２５Ｇ針および細胞回収容器
を付け、Ｔリンパ球の分離装置とした。

この分離装置を使用して細胞分離実験を行なった。すな
わち、分離装置を構成するシリンジの上端開口部よりＣ
ＰＤ加ヒト末梢血１　ｍ　ｌを添加し、流出してくる処
理曲成を凹状した。そしてこの処理能ｌ＆中の血球数を
、自動血球算定装置（ＥＬＴ−８、オルソーインスツル
メント社製）で１ｌ１１定した後、Ｔリンパ球をＦ　Ｉ
ＴＣ標識抗Ｌｅｕ−４抗体、Ｆ　ＩＴｃ標識抗Ｌｅｕ−
２ａ抗体、ＰＥＡ識抗Ｌｅｕ−３ａ抗体（いずれもベク
トン・ディッキンソン社製）で東色し、フローサイトメ
ーター（Ｃｙｔｏ　　Ａｃｅ−１００、口車分光ｒｍ製
）によって、Ｔ細胞（マイトジェン活性化）、キラー／
サプレッサーＴ細胞、ヘルパー／インデューサーＴ細胞
およびリンパ球の割合をそれぞれ求めた。

そして分ＡＩ　）ｒＡと接触する前の血球数およびリン
パ球、Ｔリンパ球、Ｔリンパ球サブセットの割合と比較
することにより、各細胞の接着率を算出した。

結果を第１表に示す。

実施例２〜４ 実施例１と同様の固相法により、サイモポイエチンＩの
３２〜３６アミノ酸残基に相当するペンタペプチド（実
施例２）、胸腺血清因子の９アミノ酸残基に相当するノ
ナペプチド（実施例３）、オクタペプチドであるペプチ
ドＴ（実施例４）の各々をポリスチレンビーズに結合さ
せ、Ｔリンパ球の分離材を作成した。

このようにして得られたＴリンパ球の分離材を用いて実
施例１と同様にしてＴリンパ球の分離装置を作成し、Ｃ
ＰＤ加ヒト末梢血を用いた細胞分離実験を行なった。結
果を第１表に示す。

比較例１ クロロメチル化ポリスチレンビーズをそのままＴリンパ
球の分離材として使用する以外は、実施例１と同様にし
て細胞分離実験を行なった。結果を第１表に示す。

実施例５ 耐酸でｐＨ４に調製した２−プロパノールに溶解した２
％オクタデシルジメチル［３−（）リメトキシシリル）
プロピル］アンモニウムクロライド（東し　シリコーン
■製、ＡＹ４３−０２１）溶ｉｔへガラスピーズ（直径
０．１５ｍｍ）を入れ、室温で１５分間、ブラッドミキ
サー（萱垣医理科工業製、ＢＭ−１０１）を使用して攪
ｒ１！シた後、１１０℃のオーブンで１時間乾燥させて
、表面にＡＹ４３−０２１を共有結合させたガラスピー
ズを得た。これをクロロホルムに溶解した０、５％ホス
ファチジルイノシトール溶液（サーダリーリサーチ　ラ
ボラトリ−［：５ｅｒｄａｒｙ　Ｒｅｓ、　Ｌａｂ、コ
製、大豆如来）に添加し、ブラッドミキサーで１晩攪押
して、ホスファチジルイノシトールがＡＹ４３−〇２１
に疎水結合したガラスピーズをＴリンパ球の分離材とし
て得た。

このようにして得られたＴリンパ球の分離材を用いて実
施例１と同様にしてＴリンパ球の分離装置を作製し、Ｃ
ＰＤ加ヒト末梢而を面いた細胞分離実験を行なった。結
果を第１表に示す。

実施例６ ホスファチジルイノシトールに代えて、ガングリオシド
（シグマ社製、ウシ脳山来）を使用する以外は実施例５
と同様にしてＴリンパ球の分離相を作成し、以下、実施
例１と同様にしてＴリンパ球の分離装置を作製し、ＣＰ
Ｄ加ヒト末梢血を用いた細胞分離実験を行なった。結果
を第１表に示す。

比較例２ ガラスピーズをそのままＴリンパ球の分離相として使用
する以外は、実施例１と同様にして細胞分離実験を行な
った。結果を第１表に示す。

第１表に示す結果から明らかなように、本発明のＴリン
パ球の分離材の実施ＩＦＩである胸腺ホルモンの生物活
性部位に相当するオリゴペプチドを結合したポリスチレ
ンビーズ（実施例１〜３）、ペプチドＴを結合したポリ
スチレンビーズ（実施例４）、イノシトールリン脂質を
結合したガラスピーズ（実施例５）および糖脂質である
ガングリオシドを結合したガラスピーズ（実施例６）は
いずれも、ポリスチレンビーズをそのまま分離材とした
もの（比較例１）あるいはガラスピーズをそのまま分離
材としたもの（比較到２）と比較して、Ｔリンパ球、な
いしはＴリンパ球すブセットを選択的に捕捉するもので
あった。

（発明の効果） 以−に述べたように本発明は、Ｔリンパ球に親和性を−
６するペプチドを水不溶性固体物質へ固定化したことを
特徴とするＴリンパ球の分離材、およびＴリンパ球に親
和性を有する脂質を水不溶性固体物質へ固定化したこと
を特徴とするＴリンパ球の分離材であるから、細胞性免
疫に深く係わるＴリンパ球を選択的にかつ大量に効率良
く簡便に分離することが可能であり、免疫機能に関連し
たＴリンパ球の機能解析などの基礎技術、さらには各秤
免疫疾患の診断や治療に効果的に応用することができる
ものである。

さらに、本発明のＴリンパ球の分離材において、Ｔリン
パ球に親和性を有するペプチドが胸腺ホルモンまたは胸
腺ホルモンの生物活性部位であり、さらにはこの胸腺ホ
ルモンがサイモシン分画５、サイモポイエチン、胸腺体
波性凶子、サイモスチムリンおよび胸腺血清因子からな
る群から選ばれたものである、あるいは、Ｔリンパ球に
親和性を有するペプチドが、ＨＩＶ皮膜タンパク（ｇｐ
１２０）とＥＢＶｉｉ伝子の相同部分であるペプチドＴ
であると、分離材がＴ　ＩＪリンパ球膜表面抗原レセプ
タ一対してより高い親和性を示し、−層優れた効果が期
待できるものとなる。また本発明のＴリンパ球の分離材
において、Ｔリンパ球に親和性を有する脂質が複合脂質
である、さらには複合脂質がイノシトールリン脂質など
のリン脂質または穂脂質であると、分離材がＴリンパ球
とより強い相互作用を示し、−層優れた効果が期待でき
るものである。

本発明はまた、Ｔリンパ球に親和性を有するペプチドを
水不溶性固体物質へ固定化したことを特徴とする分離材
、あるいはＴリンパ球に親和性を有する脂質を水不溶性
固体物質へ固定化したことを特徴とする分離材を充填し
たカラムを有することを特徴とするＴリンパ球の分離装
置であるから、上記のごとき優れた特性を存するＴリン
パ球の分離材と体液ないしは細胞懸濁液との接触をより
効率よく行なうことができ、例えば免疫疾患の体外循環
療法に応用した場合、患者の血液から所定のＴリンパ球
ないしはＴリンパ球のサブセットを短時間でかつ守備よ
く除去することが可能となり、より効率的な治療、ある
いは処理操作が期待できるものとなる。さらに、上記の
ごとく本発明のＴリンパ球の分離装置を体外循環療法に
適用した場合において、Ｔリンパ球を柿捉した分離材に
、リンホカイン、モノカイン、サイト力イン、細胞分化
因子あるいは免疫調節剤を作用させながら細胞培養した
後、Ｔリンパ球が産生したリンホカインを分取したり、
Ｔリンパ球を吸着拮抗剤で脱離させて患者の体内へ戻す
ことも可能であり、より多彩な治療が期待できるもので
ある。

さらに、本発明のＴリンパ球の分離装置は、温熱滅菌、
ガス滅菌または放射線滅菌処理しても性能の低下はみら
れず、安定したＴリンパ球の分離能を示すゆえに、正確
な診断、安全な治療を行なうことのできるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のＴリンパ球の分離装置の一実施態様
の構造を模式的に示す断面図であり、また第２図は、本
発明のＴリンパ球の分離装置を組いれた体外循環療法回
路の構成を示す図面である。 １・・・Ｔリンパ球の分離装置、２・・・流体導入口、
３・・・流体導出口、　　４・・・カラム容器、５・・
・Ｔリンパ球の分離材、 ６ａ、６ｂ・・・フィルター　　　７・・・血液導入口
、８・・・血液ポンプ、　　９ａ、９ｂ・・・チャンバ
ー１０ａ。 １０ｂ・・・圧力ゲージ、 １・・・恒温槽、 １２・・・気泡検知器、 １３・・・血液導出口。 特許出商人 テルモ株式会社

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｔリンパ球に親和性を有するペプチドを水不溶性
   固体物質へ固定化したことを特徴とするＴリンパ球の分
   離材。
2. （２）Ｔリンパ球に親和性を有するペプチドが胸腺ホル
   モンである請求項１に記載のＴリンパ球の分離材。
3. （３）Ｔリンパ球に親和性を有するペプチドが胸腺ホル
   モンの生物活性部位である請求項１に記載のＴリンパ球
   の分離材。
4. （４）胸腺ホルモンがサイモシン分画５、サイモポイエ
   チン、胸腺体液性因子、サイモスチムリンおよび胸腺血
   清因子からなる群から選ばれたものである請求項２また
   は３に記載のＴリンパ球の分離材。
5. （５）Ｔリンパ球に親和性を有するペプチドが、ヒト免
   疫不全症ウィルス（ＨｕｍａｎＩｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃ
   ｉｅｎｃｙＶｉｒｕｓ、ＨＩＶ）皮膜タンパク（ｇｐ１
   ２０）とエプスタイン−バールウィルス（Ｅｐｓｔｅｉ
   ｎ−ＢａｒｒＶｉｒｕｓ、ＥＢＶ）遺伝子の相同部分で
   あるペプチドＴである請求項１に記載のＴリンパ球の分
   離材。
6. （６）Ｔリンパ球に親和性を有する脂質を水不溶性固体
   物質へ固定化したことを特徴とするＴリンパ球の分離材
   。
7. （７）Ｔリンパ球に親和性を有する脂質が複合脂質であ
   る請求項６に記載のＴリンパ球の分離材。
8. （８）複合脂質がリン脂質または糖脂質である請求項７
   に記載のＴリンパ球の分離材。
9. （９）リン脂質がイノシトールリン脂質である請求項８
   に記載のＴリンパ球の分離材。
10. （１０）請求項１〜１０のいずれかに記載の分離材を充
    填したカラムを有することを特徴とするＴリンパ球の分
    離装置。
11. （１１）温熱滅菌、ガス滅菌または放射線滅菌処理され
    たものである請求項１０に記載のＴリンパ球の分離装置
    。