JPH0341098A - 磁性蛋白質接合体およびその製造方法 - Google Patents
磁性蛋白質接合体およびその製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、式■
Ｍ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨｚ）。−５−５−Ｐ １
（式中、ｎは１〜６、好ましくは２または３であり、Ｍ
は分散性の、磁気に反応する、アミノ基を有する物質ま
たは粒子であり、Ｐは蛋白質である）で示される１２ｉ
ｉ蛋白質接合体に関する。
（式中、ｎは１〜６、好ましくは２または３であり、Ｍ
は分散性の、磁気に反応する、アミノ基を有する物質ま
たは粒子であり、Ｐは蛋白質である）で示される１２ｉ
ｉ蛋白質接合体に関する。
ＰはＩにおける結合に必要なスルフヒドリル基が、天然
に存在するかまたはジスルフィド結合の還元によって発
生させるかもしくは化学反応によって導入される蛋白質
である。
に存在するかまたはジスルフィド結合の還元によって発
生させるかもしくは化学反応によって導入される蛋白質
である。
Ｐはとくに、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン残基
、好ましくはモノクローナル抗体またはＦａｂ、 Ｆａ
ｂ’もしくはＦ（ａｂ’）、フラグメント、抗原マたは
酵素、ホルモン、レクチンもしくは成長因子の残基であ
る。
、好ましくはモノクローナル抗体またはＦａｂ、 Ｆａ
ｂ’もしくはＦ（ａｂ’）、フラグメント、抗原マたは
酵素、ホルモン、レクチンもしくは成長因子の残基であ
る。
Ｐは好ましくはＩｇＧまたはＩｇＭクラスのモノクロー
ナル抗体であり、とくに塩水溶液中もしくは体液中に溶
解型で存在する抗原に対するモノクローナル抗体、また
は細胞上に発現される抗原に対するモノクローナル抗体
であり、この場合細胞はとくに骨髄系もしくはリンパ系
の細胞、または末梢血液の細胞とくにＢリンパ球、Ｔリ
ンパ球もしくはそれらの前駆体細胞、または腫瘍細胞と
くに骨髄のＨ２Ｎ胞である。これらの細胞は赤血球、細
菌、マイコグラズマまたは原生動物であってもよい。ま
た、ウィルスも本発明の範囲内での細胞とみなすことが
できる。
ナル抗体であり、とくに塩水溶液中もしくは体液中に溶
解型で存在する抗原に対するモノクローナル抗体、また
は細胞上に発現される抗原に対するモノクローナル抗体
であり、この場合細胞はとくに骨髄系もしくはリンパ系
の細胞、または末梢血液の細胞とくにＢリンパ球、Ｔリ
ンパ球もしくはそれらの前駆体細胞、または腫瘍細胞と
くに骨髄のＨ２Ｎ胞である。これらの細胞は赤血球、細
菌、マイコグラズマまたは原生動物であってもよい。ま
た、ウィルスも本発明の範囲内での細胞とみなすことが
できる。
Ｍは金属酸化物核と、アミノ基を有する外皮コートから
なる分散性粒子であることが好ましく、一群の常磁性物
質を金属酸化物核に組込むことができて、直径的０．１
〜約１００μ、好ましくは約０．１−１．５μの粒子で
ある。
なる分散性粒子であることが好ましく、一群の常磁性物
質を金属酸化物核に組込むことができて、直径的０．１
〜約１００μ、好ましくは約０．１−１．５μの粒子で
ある。
本発明はまた、式■で示される磁性蛋白質接合体の製造
方法ならびに塩水溶液または体液から、溶解した抗原、
受容体、基質、補因子または炭水化物決定基を特異的に
除去するための式Ｉの磁性蛋白質接合体の使用、および
診断補材の一部としてもしくは診断補材として、とくに
骨髄細胞の枯渇またはＨＬＡ型判定のための使用に関す
る。
方法ならびに塩水溶液または体液から、溶解した抗原、
受容体、基質、補因子または炭水化物決定基を特異的に
除去するための式Ｉの磁性蛋白質接合体の使用、および
診断補材の一部としてもしくは診断補材として、とくに
骨髄細胞の枯渇またはＨＬＡ型判定のための使用に関す
る。
骨髄移植は多くの場合、とくにある種の白血病および汎
骨髄機能性障害（汎骨髄瘍）の処置に際しての唯一の治
療手段である。
骨髄機能性障害（汎骨髄瘍）の処置に際しての唯一の治
療手段である。
白血病およびある種のリンパ性腫瘍の患者は、きわめて
高用量の全身放射線照射および／または侵襲性の化学療
法が時にある。この種類の治療は、すべての血球の前駆
体である骨髄の正常幹細胞の完全な破壊を招来する。し
たがって患者は、適当な供血者から骨髄の再輸注を受け
る。
高用量の全身放射線照射および／または侵襲性の化学療
法が時にある。この種類の治療は、すべての血球の前駆
体である骨髄の正常幹細胞の完全な破壊を招来する。し
たがって患者は、適当な供血者から骨髄の再輸注を受け
る。
それによって受血者の骨髄腔に細胞が転移増殖し、造血
系および免疫系の再生が可能になる。
系および免疫系の再生が可能になる。
この方法は、同種骨髄移植と呼ばれる。
同種骨髄移植に伴う高率の危険はとくに、骨髄再輸注で
患者に移入される供血者のＴリンパ球が受血者の細胞を
異物として認識して攻撃、破壊することが原因になる。
患者に移入される供血者のＴリンパ球が受血者の細胞を
異物として認識して攻撃、破壊することが原因になる。
この骨髄不耐性は患者にとって致命的となる場合が多く
、移植片対宿主反応または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）
と呼ばれる。この移植片対宿主病に伴う危険は、一方で
は、とくに適合した受血者、通常は血縁者からの正確に
型の一致した骨髄を患者へ再輸注することによって減少
させることができる。まＩ；他方では、患者への輸注前
に、たとえば受血者の骨髄中のＴリンパ球に代表される
ような望ましくない細胞集団の選択的除去によっても危
険を減少させることができる。この受血者のＴ細胞の除
去はたとえば、補体の存在下における除去すべき細胞の
選択的溶解もしくはいわゆる免疫トキシンを用いたＴ細
胞の選択的傷害、または他の方法たとえば骨髄の磁性細
胞枯渇によって行うことができる。
、移植片対宿主反応または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）
と呼ばれる。この移植片対宿主病に伴う危険は、一方で
は、とくに適合した受血者、通常は血縁者からの正確に
型の一致した骨髄を患者へ再輸注することによって減少
させることができる。まＩ；他方では、患者への輸注前
に、たとえば受血者の骨髄中のＴリンパ球に代表される
ような望ましくない細胞集団の選択的除去によっても危
険を減少させることができる。この受血者のＴ細胞の除
去はたとえば、補体の存在下における除去すべき細胞の
選択的溶解もしくはいわゆる免疫トキシンを用いたＴ細
胞の選択的傷害、または他の方法たとえば骨髄の磁性細
胞枯渇によって行うことができる。
この種類の骨髄細胞枯渇は、比較的簡単な方法たとえば
骨髄のＴ細胞に対して特異的で、その結果そのＴ細胞に
のみ結合するマウスモノクローナル抗体とともに骨髄を
インキュベートすることにより実施できる。マウスモノ
クローナル抗体に負荷されたこのＴ細胞は、第二工程に
おいてそれをたとえば磁性粒子に結合させたウサギ抗−
マウス免疫グロブリンとインキュベートするとＴりンパ
球は磁性材料に特異的に負荷され、したがって磁石を用
いて骨髄からの除去が可能になる（これに関してはＶａ
ｒＬｄａｌら：Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、
４３． ３６６−３７１． １９８７およびそれに引用
された文献参照）。
骨髄のＴ細胞に対して特異的で、その結果そのＴ細胞に
のみ結合するマウスモノクローナル抗体とともに骨髄を
インキュベートすることにより実施できる。マウスモノ
クローナル抗体に負荷されたこのＴ細胞は、第二工程に
おいてそれをたとえば磁性粒子に結合させたウサギ抗−
マウス免疫グロブリンとインキュベートするとＴりンパ
球は磁性材料に特異的に負荷され、したがって磁石を用
いて骨髄からの除去が可能になる（これに関してはＶａ
ｒＬｄａｌら：Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、
４３． ３６６−３７１． １９８７およびそれに引用
された文献参照）。
同様の方法で骨髄から他の細胞集団たとえばｍ癌細胞を
除去することも可能で、これはいわゆる自家骨髄移植の
場合に重要である（これに関しては、Ｋｖａｌｈｅｉｎ
＋ら： Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、 ４７゜８
４６〜８５１．１９８７およびそれに引用された文献参
照）。これはＫｖａｌｈｅｉｍら（前出）によって記述
されているように、腫瘍細胞を認識するモノクローナル
抗体を直接磁性粒子に結合させることもできて、この場
合には上述の第二の抗体（ウサギ抗−マウス抗体）は不
要に沈る。
除去することも可能で、これはいわゆる自家骨髄移植の
場合に重要である（これに関しては、Ｋｖａｌｈｅｉｎ
＋ら： Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、 ４７゜８
４６〜８５１．１９８７およびそれに引用された文献参
照）。これはＫｖａｌｈｅｉｍら（前出）によって記述
されているように、腫瘍細胞を認識するモノクローナル
抗体を直接磁性粒子に結合させることもできて、この場
合には上述の第二の抗体（ウサギ抗−マウス抗体）は不
要に沈る。
磁性粒子に結合されるモノクローナルまたはポリクロー
ナル抗体を用いる上述の骨髄枯渇方法はまだきわめて新
しく、今後の開発と試験を要するものである。この目的
に適当な磁性粒子は現在様々の形態で市販されていて、
その製造方法もいくつかの特許文献に記載されている〔
たとえばＣｈａｇｎｏｎら： ＥＰ ０１２５９９５
Ａ２号（１９８３午５月１２日付米国特許出願第４９３
９９１号による優先権主張）、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａ
ｇｎｅＬｉｃｓまたはＵｇｈｅｌｓＬａｄら： Ｗｏ
８３０３９２０号、 １９８３午１１月ＩＯ日、 ５
ＩＮＴＥＦ参照）。これらの磁性粒子としては、常磁性
物質を組込むことができる金属酸化物核から構成され、
その核がたとえば蛋白質とのカップリングに使用できる
アミノフェニル、アミノ、カルボキシル、ヒドロキシル
またはスルフヒドリル基のような反応性の基をもつこと
ができる上皮コートによって取囲まれている粒子が知ら
れている（Ｃｈａｇｎｏｎら： ＥＰ ０１２５９９５
Ａ２号）。
ナル抗体を用いる上述の骨髄枯渇方法はまだきわめて新
しく、今後の開発と試験を要するものである。この目的
に適当な磁性粒子は現在様々の形態で市販されていて、
その製造方法もいくつかの特許文献に記載されている〔
たとえばＣｈａｇｎｏｎら： ＥＰ ０１２５９９５
Ａ２号（１９８３午５月１２日付米国特許出願第４９３
９９１号による優先権主張）、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａ
ｇｎｅＬｉｃｓまたはＵｇｈｅｌｓＬａｄら： Ｗｏ
８３０３９２０号、 １９８３午１１月ＩＯ日、 ５
ＩＮＴＥＦ参照）。これらの磁性粒子としては、常磁性
物質を組込むことができる金属酸化物核から構成され、
その核がたとえば蛋白質とのカップリングに使用できる
アミノフェニル、アミノ、カルボキシル、ヒドロキシル
またはスルフヒドリル基のような反応性の基をもつこと
ができる上皮コートによって取囲まれている粒子が知ら
れている（Ｃｈａｇｎｏｎら： ＥＰ ０１２５９９５
Ａ２号）。
たとえばカルボキシル基を有する粒子は縮合剤の存在下
に、蛋白質のアミノ基と反応できることが知られている
（ Ｃｈａｇｎｏｎら： ＥＰ ０１２５９９５Ａ２号
）。
に、蛋白質のアミノ基と反応できることが知られている
（ Ｃｈａｇｎｏｎら： ＥＰ ０１２５９９５Ａ２号
）。
さらにまたアミノ基を有する磁性粒子をグルタルアルデ
ヒドを用いて蛋白質にカップリングさせることも知られ
ている。この場合、カップリングはそれぞれのアミノ基
を介して起こる（Ｃｈａｇｎｏｎら： ＥＰ ０１２５
９９５ Ａ２号）。
ヒドを用いて蛋白質にカップリングさせることも知られ
ている。この場合、カップリングはそれぞれのアミノ基
を介して起こる（Ｃｈａｇｎｏｎら： ＥＰ ０１２５
９９５ Ａ２号）。
さらにまた、ヒドロキシル基を有する粒子はｐ−）ルエ
ンスルホニルクロリドとの反応によって活性化すること
ができ、この方法で活性化された粒子は蛋白質のアミノ
基と反応できることも知られている（Ｋｖａｌｈｅｉｍ
ら： Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、 ４７．８４
６−８５１．１９８７）。
ンスルホニルクロリドとの反応によって活性化すること
ができ、この方法で活性化された粒子は蛋白質のアミノ
基と反応できることも知られている（Ｋｖａｌｈｅｉｍ
ら： Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、 ４７．８４
６−８５１．１９８７）。
これらのカップリング方法はすべて、蛋白質をその遊離
アミノ基を介してそれぞれ粒子に付着させる点で共通し
ている。しかしながら、アミノ基を介するこのようなカ
ップリングは、抗体の特異的および反応性を時に損なう
ことがあるので、モノクローナル抗体の場合、かなりの
欠点となる。これは、抗体内のアミ７基は全分子にわた
っていわばランダムに分布し、すなわちＦａｂフラグメ
ントの抗原結合部位にも存在するという事実によるもの
で、これらのアミノ基を介するカップリングにより特異
性の喪失を招くからである。
アミノ基を介してそれぞれ粒子に付着させる点で共通し
ている。しかしながら、アミノ基を介するこのようなカ
ップリングは、抗体の特異的および反応性を時に損なう
ことがあるので、モノクローナル抗体の場合、かなりの
欠点となる。これは、抗体内のアミ７基は全分子にわた
っていわばランダムに分布し、すなわちＦａｂフラグメ
ントの抗原結合部位にも存在するという事実によるもの
で、これらのアミノ基を介するカップリングにより特異
性の喪失を招くからである。
また、粒子が酸化鉄を含むスチレン／ジビニルベンゼン
共重合体から構成されている場合、蛋白質はポリスチレ
ンに非特異的に結合することから、抗体は化学的結合に
よらず、純粋に吸着によって磁性粒子上に捕捉されるこ
とが知られている。
共重合体から構成されている場合、蛋白質はポリスチレ
ンに非特異的に結合することから、抗体は化学的結合に
よらず、純粋に吸着によって磁性粒子上に捕捉されるこ
とが知られている。
しかしながら、抗体の特異性および反応性の損傷はこの
方法の場合も考えなければならない。
方法の場合も考えなければならない。
この方法のもう一つの重大な欠点は、吸着によっで結合
した抗体が骨髄枯渇時に再び脱着し、枯渇骨髄の再輸注
に際して患者にまた投与されることになり、これが、と
くにモノクローナル抗体で以前に治療が試みられていた
場合に重篤な副作用を招くことが考えられる。しかしな
がら、この問題は、磁性粒子へ抗体を共有結合で付着さ
せることで解決できることが知られている。
した抗体が骨髄枯渇時に再び脱着し、枯渇骨髄の再輸注
に際して患者にまた投与されることになり、これが、と
くにモノクローナル抗体で以前に治療が試みられていた
場合に重篤な副作用を招くことが考えられる。しかしな
がら、この問題は、磁性粒子へ抗体を共有結合で付着さ
せることで解決できることが知られている。
また、ポリスチレン基剤の磁性粒子には、細胞に侵襲を
与える傾向があるほか、さらにそれら自体が細胞に非特
異的に付着するという重大な欠点が知られている。
与える傾向があるほか、さらにそれら自体が細胞に非特
異的に付着するという重大な欠点が知られている。
このような技術水準に出発し、本発明の目的は、モノク
ローナル抗体をａ）共有結合により、ｂ）それらのアミ
ノ基を介することなく、磁性粒子にカップリングさせる
方法を開発することにある。換言すれば、本発明の目的
は、抗体の抗原結合部位を変化させないカップリング方
法または抗体のカップリングが抗体結合部位から離れた
位置で起こる力・ンプリング方法を見出すことにある。
ローナル抗体をａ）共有結合により、ｂ）それらのアミ
ノ基を介することなく、磁性粒子にカップリングさせる
方法を開発することにある。換言すれば、本発明の目的
は、抗体の抗原結合部位を変化させないカップリング方
法または抗体のカップリングが抗体結合部位から離れた
位置で起こる力・ンプリング方法を見出すことにある。
本発明の目的は弐〇の磁性蛋白質接合体を製造すること
によって達成された。
によって達成された。
アミノ基をもつ磁性粒子を、反応性の基としてマレイミ
ド官能基を有する磁性粒子に変換し、この基をスルフヒ
ドリル基を有する蛋白質と接合させることはすでに提案
されている。この場合の蛋白質中のスルフヒドリル基は
すでに天然に存在するもの、また化学的手段によって導
入されるものもしくは存在するジスルフィド結合の還元
によって発生させるもののいずれでもよい 表面に遊離のアミノ基をもつＢｉｏＭａｇＩＩｉ性粒子
は、２−イミノチオラン（２−１ｔ）との反応で活性化
され、単に抗体とインキュベーションするだけで抗体と
共有結合できることが見出された。
ド官能基を有する磁性粒子に変換し、この基をスルフヒ
ドリル基を有する蛋白質と接合させることはすでに提案
されている。この場合の蛋白質中のスルフヒドリル基は
すでに天然に存在するもの、また化学的手段によって導
入されるものもしくは存在するジスルフィド結合の還元
によって発生させるもののいずれでもよい 表面に遊離のアミノ基をもつＢｉｏＭａｇＩＩｉ性粒子
は、２−イミノチオラン（２−１ｔ）との反応で活性化
され、単に抗体とインキュベーションするだけで抗体と
共有結合できることが見出された。
このようにして製造される磁性抗体は新規である。
表面に遊離アミノ基をもつＢｉｏＭａｇ″″磁性粒子は
よに、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ
）プロピオネート（ＳＰＤＰ）との反応ついでジチオス
レイト−ルまたはメルカプトエタノールを用いたジスル
フィド結合の還元的開裂によって活性化することができ
、抗体と単にインキュベートするだけで抗体に共有結合
できることがさらに明らかにされた。このようにして製
造された磁性抗体接合体は同様に新規である。
よに、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ
）プロピオネート（ＳＰＤＰ）との反応ついでジチオス
レイト−ルまたはメルカプトエタノールを用いたジスル
フィド結合の還元的開裂によって活性化することができ
、抗体と単にインキュベートするだけで抗体に共有結合
できることがさらに明らかにされた。このようにして製
造された磁性抗体接合体は同様に新規である。
上述の磁性粒子はまた、５ＰＤＰとの反応後、遊離ＳＨ
基をもつ抗体とインキュベートすることによって抗体と
共有結合できることもさらに明らかにされた。この場合
、５ＰＤＰとの反応で修飾された磁性粒子は、ジチオス
レイト−ルまたはメルカプトエタノールを用いて前もっ
て活性化する必要がない。このようにして製造された磁
性抗体接合体は同様に新規である。
基をもつ抗体とインキュベートすることによって抗体と
共有結合できることもさらに明らかにされた。この場合
、５ＰＤＰとの反応で修飾された磁性粒子は、ジチオス
レイト−ルまたはメルカプトエタノールを用いて前もっ
て活性化する必要がない。このようにして製造された磁
性抗体接合体は同様に新規である。
磁性粒子の抗体による負荷は、驚くべきことに、カップ
リング工程後になおスルフヒドリル基が存在する場合に
はこれをＮ−エチルマレイミドまたはヨードアセトアミ
ドとの反応で飽和させると増大できることが見出された
。驚くべきことに、これはまた、製造された磁性抗体接
合体の安定性も増大させる。
リング工程後になおスルフヒドリル基が存在する場合に
はこれをＮ−エチルマレイミドまたはヨードアセトアミ
ドとの反応で飽和させると増大できることが見出された
。驚くべきことに、これはまた、製造された磁性抗体接
合体の安定性も増大させる。
とくに各場合、磁性粒子と抗体の間に生じたジスルフィ
ド結合はジチオスレイトールまたはメルカプトエタノー
ルによる還元で再び切断できることが明らかにされた。
ド結合はジチオスレイトールまたはメルカプトエタノー
ルによる還元で再び切断できることが明らかにされた。
このようにして切断できる磁性粒子抗体接合体は同様に
新規であり、このスペーサーが切断可能なことおよびス
ペーサー長の可変性が本発明に特異的な２つの利点をも
たらすことに収る。すなわち、１）磁性粒子にカップリ
ングした抗体によって認識される抗原または細胞の正の
選択が、切断可能なスペーサーにより、単純な磁気によ
る分離で特異的に実施可能になる。磁性粒子は再び還元
し、磁石を用いて除去することによって、枯渇した抗原
または細胞から除くことができる。
新規であり、このスペーサーが切断可能なことおよびス
ペーサー長の可変性が本発明に特異的な２つの利点をも
たらすことに収る。すなわち、１）磁性粒子にカップリ
ングした抗体によって認識される抗原または細胞の正の
選択が、切断可能なスペーサーにより、単純な磁気によ
る分離で特異的に実施可能になる。磁性粒子は再び還元
し、磁石を用いて除去することによって、枯渇した抗原
または細胞から除くことができる。
２）スペーサー長を変動できることから、抗体と磁性粒
子の間の距離を、ある限界内で変動させ、特定のカップ
リングまたは分離もしくは枯渇条件に適合させることが
可能になる。このような選択が可能なことはとくに様々
なサイズの粒子を用いる場合、また様々なりラスもしく
はアイソタイプの抗体をカップリングさせる場合に有利
である。
子の間の距離を、ある限界内で変動させ、特定のカップ
リングまたは分離もしくは枯渇条件に適合させることが
可能になる。このような選択が可能なことはとくに様々
なサイズの粒子を用いる場合、また様々なりラスもしく
はアイソタイプの抗体をカップリングさせる場合に有利
である。
ジスルフィド結合または上述のスペーサーを介して磁性
粒子にカップリングさせた抗体の特異性および反応性は
、驚くべきことに、完全に保持されていることが見出さ
れた。抗体の蝶番領域を介したカップリングは抗原結合
部位に変化も傷害も与えないことを意味している。この
点に、先に述べたような、純粋な吸着でもアミノ基との
反応を介してでも、磁性粒子に抗体が捕捉されると、接
合された抗体の特異性および反応性の両者が損なわれる
可能性があった従来のカップリング方法と比較して、本
発明がとくに有利な理由がある。しかも、本発明では抗
体が磁性粒子に化学的に結合しているので吸着によるカ
ップリングに比較して有利である。
粒子にカップリングさせた抗体の特異性および反応性は
、驚くべきことに、完全に保持されていることが見出さ
れた。抗体の蝶番領域を介したカップリングは抗原結合
部位に変化も傷害も与えないことを意味している。この
点に、先に述べたような、純粋な吸着でもアミノ基との
反応を介してでも、磁性粒子に抗体が捕捉されると、接
合された抗体の特異性および反応性の両者が損なわれる
可能性があった従来のカップリング方法と比較して、本
発明がとくに有利な理由がある。しかも、本発明では抗
体が磁性粒子に化学的に結合しているので吸着によるカ
ップリングに比較して有利である。
さらに、本発明による磁性抗体接合体は、その高い特異
性のため、たとえば骨髄枯渇に際してとくに有利である
ことが明らかにされた。
性のため、たとえば骨髄枯渇に際してとくに有利である
ことが明らかにされた。
さらに、本発明による磁性抗体接合体は、その高い特異
性により、診断方法の一部としてまたは診断補材として
、たとえば、とくにＨＬＡ型の判定に有利なことが明ら
かにされた。
性により、診断方法の一部としてまたは診断補材として
、たとえば、とくにＨＬＡ型の判定に有利なことが明ら
かにされた。
とくに、本発明の磁性抗体接合体は、スペーサーのジス
ルフィド結合の還元的開裂後に、磁石または遠心分離を
用いて、単離された抗原または細胞から再び分離できる
ので、抗原または細胞の正の選択に適している。
ルフィド結合の還元的開裂後に、磁石または遠心分離を
用いて、単離された抗原または細胞から再び分離できる
ので、抗原または細胞の正の選択に適している。
本発明の磁性抗体接合体の製造は、以下に骨髄細胞に対
する各種モノクローナル抗体およびポリクローナルウサ
ギ免疫グロブリンについての実施例によって説明するが
、これらの実施例は本発明を限定するものではない。さ
らに、本発明によって製造された磁性抗体接合体例の骨
髄細胞の枯渇への使用を同様に実施例として説明するが
、本発明の使用もこの実施例に限定されるものではない
。
する各種モノクローナル抗体およびポリクローナルウサ
ギ免疫グロブリンについての実施例によって説明するが
、これらの実施例は本発明を限定するものではない。さ
らに、本発明によって製造された磁性抗体接合体例の骨
髄細胞の枯渇への使用を同様に実施例として説明するが
、本発明の使用もこの実施例に限定されるものではない
。
式■の磁性蛋白質接合体の製造方法：
ａ）アミノ基をもつ磁性粒子Ｍを適当な溶媒中で、アミ
ノ基と反応し、式■ （式中、ｎは１〜６である）で示される化合物と反応さ
せると、アミド結合を形成して弐■の化合物が得られる
。これをジスルフィド結合の還元的開裂によって式■ Ｍ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−５ＨＩＶの化合物に変
換し、これを最後に、蛋白質を変性させない適当な塩含
有水性溶媒たとえば生理食塩溶液またはリン酸緩衝食塩
溶液中で、ジスルフィド結合を有する蛋白質Ｐと反応さ
せて式Ｉの化合物が得られる。
ノ基と反応し、式■ （式中、ｎは１〜６である）で示される化合物と反応さ
せると、アミド結合を形成して弐■の化合物が得られる
。これをジスルフィド結合の還元的開裂によって式■ Ｍ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−５ＨＩＶの化合物に変
換し、これを最後に、蛋白質を変性させない適当な塩含
有水性溶媒たとえば生理食塩溶液またはリン酸緩衝食塩
溶液中で、ジスルフィド結合を有する蛋白質Ｐと反応さ
せて式Ｉの化合物が得られる。
ｂ）アミノ基を有する粒子Ｍを適当な溶媒中、イミノチ
オランと反応させて弐■においてｎが３である化合物を
得、ついでこの式■の化合物を、ジスルフィド結合を有
する蛋白質と上述のようにして反応させる。または 。）アミノ基を有する粒子Ｍを上述のように反応させて
弐■の化合物を得、これを蛋白質を変性させない適当な
塩含有水性溶媒中、スルフヒドリル基を有する蛋白質Ｐ
たとえば還元抗体またはＦａｂもしくはＦａｂ’フラグ
メントと反応させて式Ｉの化合物を得、次に蛋白質Ｐと
磁性粒子の間のスペーサーでの結合を、必要に応じて、
適当なマレイミド誘導体たとえばＮ、−エチルマレイミ
ドの添加、またはヨードアセトアミドもしくはブロモア
セトアミドの添加によって安定化する。
オランと反応させて弐■においてｎが３である化合物を
得、ついでこの式■の化合物を、ジスルフィド結合を有
する蛋白質と上述のようにして反応させる。または 。）アミノ基を有する粒子Ｍを上述のように反応させて
弐■の化合物を得、これを蛋白質を変性させない適当な
塩含有水性溶媒中、スルフヒドリル基を有する蛋白質Ｐ
たとえば還元抗体またはＦａｂもしくはＦａｂ’フラグ
メントと反応させて式Ｉの化合物を得、次に蛋白質Ｐと
磁性粒子の間のスペーサーでの結合を、必要に応じて、
適当なマレイミド誘導体たとえばＮ、−エチルマレイミ
ドの添加、またはヨードアセトアミドもしくはブロモア
セトアミドの添加によって安定化する。
式■の化合物の磁性粒子へのカップリングに適当な溶媒
は、それぞれのカップリングに際して使用される磁性粒
子の物理的および磁気的性質を損なわないような構成で
なければならない。
は、それぞれのカップリングに際して使用される磁性粒
子の物理的および磁気的性質を損なわないような構成で
なければならない。
とくにサイズ、分散性および表面特性が使用される溶媒
によって損なわれてはならない。磁性粒子に適当な溶媒
の例としては、たとえばＥＰ０１２５９９５ Ａ２号ま
たはＷＯ８３０３９２０号に記載されているように、水
とジメチルホルムアミドの混合物を挙げることができる
。
によって損なわれてはならない。磁性粒子に適当な溶媒
の例としては、たとえばＥＰ０１２５９９５ Ａ２号ま
たはＷＯ８３０３９２０号に記載されているように、水
とジメチルホルムアミドの混合物を挙げることができる
。
カップリング度（抗体μｇ／鉄１１１１？）の測定鉄は
原子吸光によって測定し、窒素はキエルダール法によっ
て測定した。カップリングした蛋白質の窒素値は次の式
によって計算された。
原子吸光によって測定し、窒素はキエルダール法によっ
て測定した。カップリングした蛋白質の窒素値は次の式
によって計算された。
式中、Ｐ−Ｎは蛋白質窒素、Ｔｏｔ−Ｎは総窒素、Ｆｅ
は鉄である。
は鉄である。
粒子に結合した蛋白質量（蛋白質μｇ／鉄ｍｇ）は鉄Ｉ
ｍ９あたりの蛋白質窒素量に係数６２５を乗じて計算さ
れた。計算されたカップリング率を第１表にまとめる。
ｍ９あたりの蛋白質窒素量に係数６２５を乗じて計算さ
れた。計算されたカップリング率を第１表にまとめる。
細胞の枯渇方法
枯渇すべき細胞混合物の、塩含有溶液好ましくは生理的
水溶液または体液中懸濁液を式■の化合物と、適当な温
度たとえば０１〜４０℃で、好ましくは振盪しながら、
また好ましくは滅菌条件下に、適当な時間インキュベー
トし、ついで磁性粒子を適当な磁石を用いて溶液から除
去する。
水溶液または体液中懸濁液を式■の化合物と、適当な温
度たとえば０１〜４０℃で、好ましくは振盪しながら、
また好ましくは滅菌条件下に、適当な時間インキュベー
トし、ついで磁性粒子を適当な磁石を用いて溶液から除
去する。
適当な温度の例はｏ’ｃ、室温または３７°Ｃであるが
、室温が好ましい。インキュベーションの時間は各場合
の使用された温度、抗体の結合反応性によって変動する
が、たとえば数分からたとえば２時間までとすることが
できる。インキュベーションはたとえば室温で、たとえ
ば１０〜２０分の時間行うのが好ましい。
、室温が好ましい。インキュベーションの時間は各場合
の使用された温度、抗体の結合反応性によって変動する
が、たとえば数分からたとえば２時間までとすることが
できる。インキュベーションはたとえば室温で、たとえ
ば１０〜２０分の時間行うのが好ましい。
可溶性生体内分子の単離方法
この方法は、細胞の枯渇方法とほぼ同様である。
実施例：
以下の実施例は本発明を詳細に例示するものであって、
本発明を限定するものではない。
本発明を限定するものではない。
上述の方法でモノクローナル抗体と反応させた磁性粒子
は以下、「マグネトビーズ」と呼ぶこととし、それぞれ
特定の抗体量を前につけてその特異性を示す。
は以下、「マグネトビーズ」と呼ぶこととし、それぞれ
特定の抗体量を前につけてその特異性を示す。
実施例 １
式■においてｎが３である化合物の製造３ ｘ ３００
μａの市販磁性粒子の懸濁液（ＢｉｏＭａｇＩｌ。
μａの市販磁性粒子の懸濁液（ＢｉｏＭａｇＩｌ。
Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ）を３回、各回
１０ｍＱのリン酸緩衝食塩溶液、ｐＨ７，２（ＰＢＳ）
で洗浄し、それぞれＰＢＳ ２ｔｇＱ中に再懸濁した
。次にそれぞれにＰＢＳ中２−イミノチオラン塩酸塩の
溶液を加えＩこ 。
１０ｍＱのリン酸緩衝食塩溶液、ｐＨ７，２（ＰＢＳ）
で洗浄し、それぞれＰＢＳ ２ｔｇＱ中に再懸濁した
。次にそれぞれにＰＢＳ中２−イミノチオラン塩酸塩の
溶液を加えＩこ 。
ａ） ＰＢＳ ０．５＋ＲＱ中２−１ｔ ＨＣＱ １
０１１１９の添加ｂ） ＰＢＳ ０．５ｍ１２中２−
Ｉｔ ＨＣＱ ２．５１＋９の添加ｃ） ＰＢＳ Ｏ
，Ｓｍｆｆ中２−１ｔ ＨＣｌ２０．６ｍ９の添加これ
らの懸濁液を室温でそれぞれ１時間振盪した。次に粒子
を３０００ Ｘ ９で遠心分離して除去し、それぞれ各
回１０ｍＱのＰＢＳで３回洗浄した。
０１１１９の添加ｂ） ＰＢＳ ０．５ｍ１２中２−
Ｉｔ ＨＣＱ ２．５１＋９の添加ｃ） ＰＢＳ Ｏ
，Ｓｍｆｆ中２−１ｔ ＨＣｌ２０．６ｍ９の添加これ
らの懸濁液を室温でそれぞれ１時間振盪した。次に粒子
を３０００ Ｘ ９で遠心分離して除去し、それぞれ各
回１０ｍＱのＰＢＳで３回洗浄した。
実施例 ２
弐■においてｎが２の化合物の製造
３Ｘ３００μＱの市販磁性粒子の懸濁液（ＢｉｏＭａｇ
”。
”。
Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ）を３回、各回
１０＋ｘ１２のＰＢＳ。
１０＋ｘ１２のＰＢＳ。
ｐＨ７，２で洗浄し、それぞれＰＢＳ ３ｒｔｒＱ中
に再懸濁した。次ｌこそれぞれに、２ＩＩ＋１２の乾燥
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中Ｎ−スクシンイミジ
ル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤ
Ｐ）５ｍｇの溶液を加え、混合物を室温で１時間振盪し
た。次に粒子を３０００ Ｘ ９で遠心分離して除去し
、それぞれ各回１０ｍＱのＰＢＳで３回洗浄した。
に再懸濁した。次ｌこそれぞれに、２ＩＩ＋１２の乾燥
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中Ｎ−スクシンイミジ
ル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤ
Ｐ）５ｍｇの溶液を加え、混合物を室温で１時間振盪し
た。次に粒子を３０００ Ｘ ９で遠心分離して除去し
、それぞれ各回１０ｍＱのＰＢＳで３回洗浄した。
実施例 ３
式■においてｎが２の化合物の製造
実施例２と同様にして製造した式■の粒子のサンプル３
個をそれぞれ２．４ｍＱのＰＢＳ中に再懸濁し、それぞ
れＰＢＳ Ｏ，１ｍＱに溶解したジチオスレイトール５
１１９を加え、混合物を穏やかに振盪しながら室温で３
０分間インキュベートした。次Ｊこ粒子を３０００ Ｘ
９で遠心分離して除去し、それぞれ各回１０ｍｆｆの
ＰＢＳで３回洗浄し、直ちにカンフリング反応に使用し
た。
個をそれぞれ２．４ｍＱのＰＢＳ中に再懸濁し、それぞ
れＰＢＳ Ｏ，１ｍＱに溶解したジチオスレイトール５
１１９を加え、混合物を穏やかに振盪しながら室温で３
０分間インキュベートした。次Ｊこ粒子を３０００ Ｘ
９で遠心分離して除去し、それぞれ各回１０ｍｆｆの
ＰＢＳで３回洗浄し、直ちにカンフリング反応に使用し
た。
実施例 ４
実施例１ａからの弐■においてｎが３の化合物への、抗
体量を様々に変動させた場合のポリクローナルウサギ抗
−マウス免疫グロブリン（ＲＡｌｉｌ）のカップリング 各場合ＢｉｏＭａｇ”の３００μａサンプルから実施例
１ａと同様にして製造した式■の粒子のサンプル４個を
、 ａ） ＰＢＳ ２．５ｍＱ ｂ） ＰＢＳ ２．４ｍ（１ ｃ） ＰＢＳ ２．３ｍＱ ｄ） ＰＢＳ ２．２ｔｔｒＱ に再懸濁し、この懸濁液を以下の量のＲＡＭａ）添加せ
ず ｂ） ＰＢＳ ０．１ｍｆｆ中ＲＡＭ ０．５ｍｇｃ
） ＰＢＳ ０．２ｍＱ中ＲＡＭ １．０１９ｄ）
ＰＢＳ ０．３ｒａＱ中ＲＡＭ １．５１ｇと混合し
た。
体量を様々に変動させた場合のポリクローナルウサギ抗
−マウス免疫グロブリン（ＲＡｌｉｌ）のカップリング 各場合ＢｉｏＭａｇ”の３００μａサンプルから実施例
１ａと同様にして製造した式■の粒子のサンプル４個を
、 ａ） ＰＢＳ ２．５ｍＱ ｂ） ＰＢＳ ２．４ｍ（１ ｃ） ＰＢＳ ２．３ｍＱ ｄ） ＰＢＳ ２．２ｔｔｒＱ に再懸濁し、この懸濁液を以下の量のＲＡＭａ）添加せ
ず ｂ） ＰＢＳ ０．１ｍｆｆ中ＲＡＭ ０．５ｍｇｃ
） ＰＢＳ ０．２ｍＱ中ＲＡＭ １．０１９ｄ）
ＰＢＳ ０．３ｒａＱ中ＲＡＭ １．５１ｇと混合し
た。
この混合物をそれぞれ、振盪しながら室温で１時間イン
キュベートした。次に粒子を３０００ Ｘ９で遠心分離
して除去し、各回１０ｍＱのＰＢＳで３回洗浄し、５ｍ
（！のＰＢＳ、 ｐＨ７，２に再懸濁し、Ｘ線で滅菌し
、４℃で保存した。分析データは第１表にまとめる。
キュベートした。次に粒子を３０００ Ｘ９で遠心分離
して除去し、各回１０ｍＱのＰＢＳで３回洗浄し、５ｍ
（！のＰＢＳ、 ｐＨ７，２に再懸濁し、Ｘ線で滅菌し
、４℃で保存した。分析データは第１表にまとめる。
実施例 ５
実施例１ａからの式■においてｎが３の化合物への、抗
体量を様々に変動させた場合のモノクローナル抗体ＢＭ
Ａ ０１１０ （抗−ＣＤ２ ； ＩｇＧ２ｂ）のカッ
プリング カップリングは実施例４と同様に以下の量のＢＭＡ ０
１１０に式■の粒子懸濁液ａ −ｄに加えて実施した。
体量を様々に変動させた場合のモノクローナル抗体ＢＭ
Ａ ０１１０ （抗−ＣＤ２ ； ＩｇＧ２ｂ）のカッ
プリング カップリングは実施例４と同様に以下の量のＢＭＡ ０
１１０に式■の粒子懸濁液ａ −ｄに加えて実施した。
ａ）添加せず
ｂ） ＰＢＳ Ｏ，１ｍｒｌ中０．５ｒｒｒ９のＢＭ
Ａ ０１１０ｃ） ＰＢＳ ０．２ｒａｒｌ中１．０
１１９のＢＭＡ ０１１０ｄ） ＰＢＳ Ｏ，３ｍｍ
中１．５１１９のＢＩＪＡ ０１１０以後の処理は実施
例４と同様に行った。分析データは第１表にまとめる。
Ａ ０１１０ｃ） ＰＢＳ ０．２ｒａｒｌ中１．０
１１９のＢＭＡ ０１１０ｄ） ＰＢＳ Ｏ，３ｍｍ
中１．５１１９のＢＩＪＡ ０１１０以後の処理は実施
例４と同様に行った。分析データは第１表にまとめる。
実施例 ６
実施例１ｂからの式■においてｎが３の化合物への、抗
体量を様々に変動させた場合のモノクローナル抗体ＢＭ
Ａ ０１１０ （抗ＣＤ２ ； ＩｇＧ２ｂ）のカッ７
リング カップリングは、実施例１ａに代えて実施例１ｂからの
式■の化合物に出発するほかは、実施例５の場合と同様
にして実施した。
体量を様々に変動させた場合のモノクローナル抗体ＢＭ
Ａ ０１１０ （抗ＣＤ２ ； ＩｇＧ２ｂ）のカッ７
リング カップリングは、実施例１ａに代えて実施例１ｂからの
式■の化合物に出発するほかは、実施例５の場合と同様
にして実施した。
実施例 ７
実施例１ａ、 ｌｂおよびｌｃからの式■においてｎが
３の化合物への、同一抗体濃度を用いた場合のモノクロ
ーナル抗体ＢＭＡ ０３０ （抗−ＣＤ３、ＩｇＧ２ａ
）のカップリング 実施例１ａ、 ｌｂおよびｌｃと同様にして製造した粒
子のサンプル４個をそれぞれＰＢＳ ２．Ｏｍ。に再懸
濁し、ＰＢＳ中ＢＭＡ ０３０溶液０．５ｍｍ （各場
合ＰＢＳＯ，Ｓｍｆｆ中１ｍｇのＢＭＡ ０３０に相当
）をそれぞれ加え、以下実施例４の場合と同様に処理す
る。分析ブタは第１表にまとめる。
３の化合物への、同一抗体濃度を用いた場合のモノクロ
ーナル抗体ＢＭＡ ０３０ （抗−ＣＤ３、ＩｇＧ２ａ
）のカップリング 実施例１ａ、 ｌｂおよびｌｃと同様にして製造した粒
子のサンプル４個をそれぞれＰＢＳ ２．Ｏｍ。に再懸
濁し、ＰＢＳ中ＢＭＡ ０３０溶液０．５ｍｍ （各場
合ＰＢＳＯ，Ｓｍｆｆ中１ｍｇのＢＭＡ ０３０に相当
）をそれぞれ加え、以下実施例４の場合と同様に処理す
る。分析ブタは第１表にまとめる。
実施例 ８
実施例１ａ、 Ｉｂおよびｌｃからの式■においてｎが
３の化合物への、同一抗体濃度を用いた場合のモノクロ
ーナル抗体ＢＭＡ ０８１（抗−ＣＤ８ ； ＩｇＧ２
ａ）のカップリング 反応は実施例５と同様に実施した。分析データは第１表
に示す。
３の化合物への、同一抗体濃度を用いた場合のモノクロ
ーナル抗体ＢＭＡ ０８１（抗−ＣＤ８ ； ＩｇＧ２
ａ）のカップリング 反応は実施例５と同様に実施した。分析データは第１表
に示す。
実施例 ｌＯ
実施例２からの弐■においてｎが２の化合物への、抗体
量を様々に変動させた場合のポリクローナルウサギ抗−
マウス免疫グロブリン（ＲＡＭ）のカップリング ＰＢＳ ０．４ｔｓｒｌ中ＲＡＭ ２ ｒａ９ｆ）溶
液ヲシチオスレイトール２ｍｇと混合し、室温で３０分
間インキユベートシた。還元された抗体をＰＢＳ ｐ
Ｈ７，２中５ｅ−ｐｈａｄｅｘ Ｇ２５上ゲルが過によ
り、溶出容ｆ１４．２ｍＱ中に単離した。
量を様々に変動させた場合のポリクローナルウサギ抗−
マウス免疫グロブリン（ＲＡＭ）のカップリング ＰＢＳ ０．４ｔｓｒｌ中ＲＡＭ ２ ｒａ９ｆ）溶
液ヲシチオスレイトール２ｍｇと混合し、室温で３０分
間インキユベートシた。還元された抗体をＰＢＳ ｐ
Ｈ７，２中５ｅ−ｐｈａｄｅｘ Ｇ２５上ゲルが過によ
り、溶出容ｆ１４．２ｍＱ中に単離した。
実施例２と同様にして製造した弐■の粒子のサンプルを
次のように再懸濁した。
次のように再懸濁した。
ａ） ＰＢＳ ４．３ｍ１２中
ｂ） ＰＢＳ ３．６ｒｎＱ中
Ｃ） ＰＢＳ ２．９ｍｍ中
これらの懸濁液を以下のように還元抗体と混合した。
ａ） ０．７ｍ（ｌ添加（蛋白質的１）、３＋１１９
）ｂ） １．４ｍＱ添加（蛋白質的０．６１１１ｇ）
ｃ） ２．１ｍ（２添加（蛋白質的０．９ｍｇ）混合
物（各５ ｍＯ，）をそれぞれ、振盪しながら、室温で
１時間インキュベートシタ。粒子ヲ３ｏｏ。
）ｂ） １．４ｍＱ添加（蛋白質的０．６１１１ｇ）
ｃ） ２．１ｍ（２添加（蛋白質的０．９ｍｇ）混合
物（各５ ｍＯ，）をそれぞれ、振盪しながら、室温で
１時間インキュベートシタ。粒子ヲ３ｏｏ。
×９で遠心分離して除去し、各回１０＋ａＱのＰＢＳで
３回洗浄し、５ＴＲＱのＰＢＳ、 ｐＨ７，２に再懸濁
し、Ｘ線で滅菌し、４℃で保存した。分析データは第１
表にまとめる。
３回洗浄し、５ＴＲＱのＰＢＳ、 ｐＨ７，２に再懸濁
し、Ｘ線で滅菌し、４℃で保存した。分析データは第１
表にまとめる。
実施例 ｌｌ
実施例３からの式■においてｎが２の化合物への、抗体
量を様々に変動させた場合のポリクローナルウサギ抗−
マウス免疫グロブリン（ＲＡＭ）のカンブリング 実施例３と同様にして製造した式■の粒子のサンプルを
４個準備し、次のように再懸濁しｌこ 。
量を様々に変動させた場合のポリクローナルウサギ抗−
マウス免疫グロブリン（ＲＡＭ）のカンブリング 実施例３と同様にして製造した式■の粒子のサンプルを
４個準備し、次のように再懸濁しｌこ 。
ａ） ＰＢＳ ２．５ｉ１２
ｂ） ＰＢＳ ２．４ｔａＱ
ｃ） ＰＢＳ ２−３ｍ１２
ｄ） ＰＢＳ ２．２ｍ（２
これらの懸濁液を以下の量のＲＡＭと混合した。
ａ）添加せず
ｂ） ＰＢＳ ０．１ｒｇＱ中０．５＋ｎｇｃ）
ＰＢＳ ０．２ｍＱ中１．０ｍｇｃ） ＰＢＳ ０．
３ｒｔｒＱ中１．５ｎ＋９混合物（各２．５ａＩ２）を
それぞれ、振盪しながら、室温で１時間インキュベート
した。ついで粒子を３０００ Ｘ ｙで遠心分離して除
去し、各回１０＋ｍＱのＰＢＳで３回洗浄し、５ｍＱの
ＰＢＳ、 ｐＨ７，２に再懸濁し、Ｘ線で滅菌し、４°
Ｃで保存した。分析データは第１表にまとめる。
ＰＢＳ ０．２ｍＱ中１．０ｍｇｃ） ＰＢＳ ０．
３ｒｔｒＱ中１．５ｎ＋９混合物（各２．５ａＩ２）を
それぞれ、振盪しながら、室温で１時間インキュベート
した。ついで粒子を３０００ Ｘ ｙで遠心分離して除
去し、各回１０＋ｍＱのＰＢＳで３回洗浄し、５ｍＱの
ＰＢＳ、 ｐＨ７，２に再懸濁し、Ｘ線で滅菌し、４°
Ｃで保存した。分析データは第１表にまとめる。
実施例 １２
実施例３からの式■においてｎが２の化合物への、抗体
量を様々に変動させた場合のモノクローナル抗体ＢＭＡ
０１１０（抗−ＣＤ２； ＩｇＧ２ｂ）のカップリン
グ カップリングは実施例１１と同様にして実施した。分析
データは第１表に掲げる。
量を様々に変動させた場合のモノクローナル抗体ＢＭＡ
０１１０（抗−ＣＤ２； ＩｇＧ２ｂ）のカップリン
グ カップリングは実施例１１と同様にして実施した。分析
データは第１表に掲げる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）式 I Ｍ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ＿２）＿ｎ−Ｓ−Ｓ−Ｐ I （
式中、ｎは１〜６、好ましくは２または３であり、Ｍは
分散性で、磁気に反応し、アミノ基を有する物質または
粒子であり、Ｐは蛋白質である）で示される磁性蛋白質
接合体。 ２）蛋白質の１個または２個以上のスルフヒドリル基は
天然に存在するか、またはジスルフィド結合の還元によ
って発生させるかもしくは化学反応によって蛋白質に導
入する請求項１記載の磁性蛋白質接合体。 ３）Ｐはポリクローナル免疫グロブリンである請求項１
記載の磁性蛋白質接合体。 ４）Ｐはモノクローナル抗体またはＦａｂ、Ｆａｂ′も
しくはＦ（ａｂ′）＿２フラグメントである請求項１記
載の磁性蛋白質接合体。 ５）Ｐは抗原または酵素、ホルモン、レクチンもしくは
成長因子の残基である請求項１記載の磁性蛋白質接合体
。 ６）ＰはＩｇＧまたはＩｇＭクラスのモノクローナル抗
体である請求項４記載の磁性蛋白質接合体。 ７）Ｐは塩水溶液または体液中に溶解型で存在する抗原
に対するモノクローナル抗体である請求項４記載の磁性
蛋白質接合体。 ８）Ｐは細胞上、とくに骨髄系もしくはリンパ系の細胞
、末梢血液の細胞とくにＢリンパ球、Ｔリンパ球もしく
はそれらの前駆体細胞、または腫瘍細胞とくに骨髄の腫
瘍細胞上に発現する抗原に対するモノクローナル抗体で
ある請求項４記載の磁性蛋白質接合体。 ９）Ｐは細菌、マイコプラズマもしくは原性動物等、ま
たはウィルス上に発現する抗原に対するモノクローナル
抗体である請求項４記載の磁性蛋白質接合体。 １０）Ｐは抗原である請求項１記載の磁性蛋白質接合体
。 １１）Ｍは金属酸化物核とアミノ基を有する外皮コート
とからなる分散性粒子であり、一群の常磁性物質を金属
酸化物核に組込むことができる請求項１記載の磁性蛋白
質接合体。１２）粒子の直径は約０．１〜約１００μ、
好ましくは約０．１〜約１．５μである請求項１１記載
の磁性蛋白質接合体。 １３）式III ▲数式、化学式、表等があります▼III （式中、Ｍは請求項１において特定した意味を有する）
で示される化合物。 １４）式IV Ｍ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ＿２）＿ｎ−ＳＨIV（式中、Ｍ
は請求項１において特定した意味を有する）で示される
化合物。 １５）式 I Ｍ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ＿２）＿ｎ−Ｓ−Ｓ−Ｐ I で
示される磁性蛋白質接合体を製造するにあたり、アミノ
基を有する磁性粒子Ｍを、式 II ▲数式、化学式、表等があります▼II （式中、ｎは１〜６である）で表され、アミノ基と反応
する化合物と反応させることによりアミド結合を形成さ
せて式III ▲数式、化学式、表等があります▼III の化合物を得、これをジスルフィド結合の還元的開裂に
よって式IV Ｍ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ＿２）＿ｎ−ＳＨIVで示される
化合物に変換し、これをジスルフィド結合をもつ蛋白質
Ｐと最終的に反応させて式 I の化合物を得る方法。 １６）式 I の磁性蛋白質接合体を製造するにあたり、
アミノ基を有する磁性粒子Ｍをイミノチオランと反応さ
せて式IV Ｍ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ＿２）＿ｎ−ＳＨIV（式中、ｎ
は３である）で示される化合物を得、この式IVの化合物
をジスルフィド結合を有する蛋白質Ｐと反応させて式
I の化合物を得る方法。 １７）式 I で示される磁性蛋白質接合体を製造するに
あたり、アミノ基を有する磁性粒子Ｍを請求項１５に記
載したと同様に反応させて式IIIの化合物を得、これを
スルフヒドリル基を有する蛋白質Ｐと反応させて式 I
の化合物を得る方法。 １８）請求項１５、１６または１７の少なくともひとつ
に記載の磁性蛋白質接合体を製造するにあたり、蛋白質
Ｐおよび磁性粒子の間のスペーサーとの結合を、Ｎ−置
換マレイミド化合物の添加、好ましくはＮ−（Ｃ＿１〜
Ｃ＿６−アルキル）マレイミドの添加、とくに好ましく
はＮ−エチルマレイミドの添加により、あるいはマレイ
ミドカルボン酸の添加により、またはヨードアセトアミ
ドもしくはブロモアセトアミドの添加により安定化する
方法。 １９）塩水溶液または体液から、溶解した抗原、抗体、
受容体、基質、補因子または炭水化物決定基を除去する
方法において、その溶液を式 I の適当な磁性蛋白質接
合体とインキュベートして除去すべき成分を特異的に吸
着させたのち、磁性蛋白質接合体を磁気的手段によって
分離し、特異的に吸着した成分を適宜、磁性蛋白質接合
体から再び溶出させるかまたは式 I の化合物のスペー
サーのジスルフィド結合の還元により除去する方法。 ２０）塩水溶液または体液から細胞を除去する方法にお
いて、その細胞懸濁液を式 I の適当な磁性蛋白質接合
体とインキュベートして除去すべき細胞を特異的に吸着
させたのち、磁性蛋白質接合体を磁気的手段によって分
離し、特異的に吸着した細胞または粒子を適宜、磁性蛋
白質接合体から再び脱着させるかまたは式 I の化合物
のスペーサーのジスルフィド結合の還元により除去する
方法。 ２１）請求項１９記載の可溶性成分または請求項２０記
載の細胞の正の選択にあたり、スペーサーのジスルフィ
ド結合を還元的に開裂しついで磁石または遠心分離を用
いて磁性粒子を除去する方法。 ２２）塩水溶液または体液から、細胞または溶解した抗
原、受容体、基質、補因子もしくは炭水化物決定基を特
異的に除去するための請求項１記載の磁性蛋白質接合体
の使用、または診断方法の一部としてもしくは診断補材
としての使用。 ２３）請求項８または９記載の細胞の除去、とくに好ま
しくは骨髄細胞の枯渇またはＨＬＡ型判定のための、請
求項１記載の磁性蛋白質接合体の使用。 ２４）細胞または可溶性抗原、受容体、基質、補因子も
しくは炭水化物決定基の正の選択、とくに細胞の正の選
択、とくに請求項８記載の細胞の正の選択のための、請
求項１記載の磁性蛋白質接合体の使用。
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|---|---|
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20030047499A (ko) * | 2001-12-11 | 2003-06-18 | 김근상 | 다극용 플러그 및 잭 |
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|---|---|---|---|---|
| KR20030047499A (ko) * | 2001-12-11 | 2003-06-18 | 김근상 | 다극용 플러그 및 잭 |
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