JPH0346114B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

＜産業上の利用分野＞ 本発明は、発酵法によるＬ−スレオニンの製造
方法に関するものである。 ＜従来の技術＞ プロビデンシア属に属する微生物を用いた発酵
法によるＬ−スレオニンの製造法としては、Ｌ−
エチオニンに耐性を有する変異株を用いる方法
（特開昭61−216698号公報）、Ｌ−ロイシン要求性
を持つ変異株を用いる方法（特開昭61−260891号
公報）、ピルベートキナーゼ低下変異株を用いる
方法（特開昭62−44191号公報）、アスパラギン酸
代謝拮抗物質に耐性を有する変異株を用いる方法
（特開昭62−44192号公報）、イソロイシン代謝拮
抗物質に耐性を有する変異株を用いる方法（特開
昭62−44193号公報）などが知られている。また
バージーのマニユアル・オブ・システマチイクバ
クテリオロジー第１巻（1984年）で、一部プロビ
デンシア属に分類変更された旧プロテウス属に属
する微生物を用いた発酵法によるＬ−スレオニン
の製造方法としては、Ｌ−イソロイシン要求性株
を用いる方法（特公昭43−4440号公報）やα−ア
ミノ−β−ヒドロキシ吉草酸に耐性を有しかつＬ
−イソロイシン要求性を有する微生物を用いる方
法（日本農芸化学会講演旨集９頁（1970））など
が知られている。 ＜発明が解決しようとする問題点＞ しかしながら、従来の方法はいずれも多量のア
ラニンおよびバリンを副生するため、Ｌ−スレオ
ニンの精製収率が低下し、また高純度のＬ−スレ
オニンを得るためには煩雑な精製工程を要し、工
業的に実用化するには不利であつた。 ＜問題点を解決するための手段および作用＞ 本発明者らは、Ｌ−スレオニンの高い生産性を
維持すると同時にバリンの副性を抑制する方法に
ついて鋭意検討した結果、プロビデンシア属に属
し、Ｌ−スレオニン生産能を有する微生物のうち
アセトヒドロキシ酸合成酵素阻害剤に感受性を有
する変異株を使用することにより顕著にバリンの
副生が抑制されることを見い出し本発明に到達し
た。 すなわち、本発明のプロビデンシア属に属し、
Ｌ−スレオニン生産能を有し、かつアセトヒドロ
キシ酸合成酵素阻害剤に感受性を有する変異株を
培養し、培養液中にＬ−スレオニンを生成蓄積せ
しめ、前記培養液よりＬ−スレオニンを採取する
ことを特徴とする発酵能によるＬ−スレオニンの
製造方法である。 ここで、アセトヒドロキシ酸合成酵素阻害剤と
しては、たとえば、（メチル２−〔〔〔〔（４，６−ジ
メチル−２−ピリミジニル）−アミノ〕カルボニ
ル〕アミノ〕スルホニル〕ベンゾエート（以下、
スルホメチユロンメチルと称する）、２−チアゾ
ールアラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシンな
どが挙げられる。その中、スルホメチユロンメチ
ルが好ましく用いられる。 本発明で用いられる微生物は、プロビデンシア
属に属し（バージーのマニユアル・オブ・システ
マテイツク・バクテリオロジー第１巻（1984）第
475〜496頁に従う）アセトヒドロキシ酸合成酵素
阻害剤に感受性を有する微生物である。かかる性
質を有していれば、いかなる要求性、いかなる薬
剤耐性を持つものでも本発明の範囲に含まれる。
特に、アセトヒドロキシ酸合成酵素阻害剤に加
え、Ｌ−イソロイシンまたはＬ−ロイシンに対す
る栄養要求性ないしleaky型要求性、α−アミノ
−β−ヒドロキシ吉草酸などスレオニンアナロー
グに対する耐性およびエチオニンなどメチオニン
アナローグに対する耐性はＬ−スレオニン生成能
に有効に作用するので、これらのいくつかの特性
ないしはすべての特性をあわせ持つ微生物がより
好ましく用いられる。 本発明で用いられる変異株の代表的なものとし
ては、たとえば、プロビデンシア・レトゲリ
SVSS−29（FERM Ｐ−9349）が挙げられる。 この変異株はプロビデンシア・レトゲリ
OTR28−31（α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸
耐性、Ｌ−イソロイシン要求性、Ｌ−エチオニン
耐性、Ｌ−ロイシン要求性、チアイソロイシン耐
性、オキシチアミン耐性）を親株として通常の変
異処理方法によつて得られたもので、スルホメチ
ユロンメチルに感受性を示す変異株である。 変異株の誘導は通常の変異処理法によつて行な
うことができる。すなわちアセトヒドロキシ酸合
成酵素阻害剤に感受性を示す変異株を得るには、
紫外線を照射するか、あるいは、変異誘導剤（た
とえば、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソ
グアニジン、エチルメタンスルホン酸など）で処
理したのち、親株が生育できるような濃度のアセ
トヒドロキシ酸合成酵素阻害剤を含む固体培地で
親株に比べて有意に生育が不良な菌株を採取すれ
ばよい。 本発明におけるアセトヒドロキシ酸合成酵素阻
害剤感受性株とは親株よりアセトヒドロキシ酸合
成酵素阻害剤に対して強い感受性を示す株のこと
であり、たとえば、スルホメチユロンメチル感受
性株の場合は親株が生育可能である、スルホメチ
ユロンメチルを0.1mg／添加した培地でほとん
ど生育できないようなものを、スルホメチユロン
メチル感受性株という。 本発明におけるいＬ−スレオニン生産用の培地
は、炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応
じてその他の有機微量成分を含有する通常の培地
である。 炭素源としては、グルコース、フラクトース、
でん粉およびセルロースの加水分解物、糖蜜など
の糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸などの
ごとき有機酸、グリセロールのごときアルコール
類などを２〜15％、窒素源として、酢酸アンモニ
ウムのごとき有機アンモニウム塩、硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、
硝酸アンモニウムのごとき無機アンモニウム塩、
アンモニアガス、アンモニア水、尿素などを0.5
〜4.0％、有機微量栄養素としては、Ｌ−イソロ
イシンなどの被要求物質が0.001〜0.4％、または
必要に応じてコーステイープリカー、ペプトン、
酵母エキスなど０〜４％をそれぞれ適当量含有す
る培地が好適に用いられる。これらの他にリン酸
カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第１鉄７水和
物、硫酸マンガン４−６水和物などが微量成分と
して少量添加される。 培養は、好気的条件で行う。培養の間、培地の
PHは５から９に、温度は24〜37℃に調節し、48〜
120時間振とうまたは通気撹拌培養すれば好まし
い結果が得られる。 培養液よりＬ−スレオニンを採取するには、た
とえば菌体を除去した培養液をPH２に塩酸で調
製したのち、酸性カチオン交換樹脂に通液後、ア
ンモニア水で吸着成分を溶出し、脱アンモニア後
濃縮する。これにアルコールを添加し、冷却保存
下で生成した結晶を集め、Ｌ−スレオニンを得る
ことができる。 ＜実施例＞ 以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。 実施例 １ Ａ スルホメチユロンメチル感受性株の分離 プロビデンシア・レトゲリOTR28−31（α−
アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐性、Ｌ−イソ
ロイシン要求性、Ｌ−エチオニン耐性、Ｌ−ロ
イシン要求性、チアイソロイシン耐性、オキシ
チアミン耐性）の菌体を常法によりＮ−メチル
−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン処理
（300μｇ／ml、30℃で10分）したのち、この細
胞をスルホメチユロンメチル0.1mg／を添加
した寒天培地（グルコース0.5％、硫安0.1％、
リン酸第１カリウム0.3％、リン酸第２カリウ
ム0.7％、硫酸マグネシウム７水和物0.01％、
Ｌ−イソロイシン0.001％、Ｌ−ロイシン0.005
％、Ｌ−バリン0.02％を含む最少培地）に塗布
した。次に30℃で６〜８日培養し、生じたコロ
ニーのうち小さなコロニーを釣菌分離した。分
離された菌株のうちスルホメチユロンメチル無
添加寒天平板培地で生育し、スルホメチユロン
メチル0.1mg／添加寒天平板培地で著しく生
育不良な株を選定し、スルホメチユロンメチル
感受性異変株を取得した。 Ｂ スルホメチユロンメチル感受性異変株の検定 下記第１表に示す菌株をブイヨン寒天培地で
24時間培養し、その菌体をごく微量かきとり、
スルホメチユロンメチル無添加およびスルホメ
チユロンメチル0.1mg／を添加した下記組成
の合成寒天平板培地にうすく塗布し、30℃で３
日間培養し、その生育の有無を観察した。 合成寒天培地 グルコース 0.5％ （NH₄）₂SO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.01％ KH₂PO₄ 0.3％ K₂HPO₄ 0.7％ Ｌ−イソロイシン 0.001％ Ｌ−ロイシン 0.005％ Ｌ−バリン 0.02％ 寒 天 2.0％ 結果は第１表に示すとおりであり、本発明方
法で使用するプロビデンシア・レトゲリSVSS
−29は親株のプロビデンシア・レトゲリ
OTR28−31との比較により明らかにスルホメ
チユロンメチル感受性を獲得している。

【表】 (注) ＋：生育あり −：生育なし
実施例 ２ （Ｌ−スレオニン生産菌の培養およびＬ−スレ
オニンの生産） 第２表に示す各菌株をそれぞれ液体ブイヨン培
地で30℃、16時間振盪して前培養したのち、あら
かじめ115℃、10分間蒸気滅菌した下記組成の主
発酵培地800mlをガラス型小型ジヤーフアーメン
ターに接種し、30℃、800rpm、通気量1vvmで通
気撹拌培養した。 発酵用培地 グルコース（別滅菌） ４％ （NH₄）₂SO₄ 0.5％ KH₂PO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.04％ Fe⁺⁺ 2ppm Mn⁺⁺ 2ppm Ｌ−イソロイシン 0.0025％ Ｌ−ロイシン 0.06％ PH 7.0（KOHで中和） PH調節および窒素源の供給は、25％アンモニア
水で行ない、PHは6.5〜8.0に維持した。グルコー
ス、KH₂PO₄、MgSO₄・7H₂O、Ｌ−ロイシンお
よびＬ−イソロイシンを適宜添加しながら、69時
間培養した。培養終了後、菌体および炭酸カルシ
ウムを除去した液中のＬ−スレオニン、アラニ
ン、バリンの濃度を自動アミノ酸分析計（日本電
子(株)製JLC300）で定量したところ第２表に示す
ような結果を得た。

【表】 第２表から明らかのように、本発明例によれ
ば、比較例に比べＬ−スレオニン蓄積濃度に有意
差はなく、かつバリンの副生が微量になつた。 培養後、各培養液より菌体を除き、その100ml
を強力カチオン交換樹脂“ダイアイオン”SKIB
（Ｈ型）のカラムに通した。各カラムを水洗後、
2Nアンモニア水でカラムの吸着成分を溶出し、
脱色後減圧濃縮し、結晶化させた。結晶を集めて
乾燥した結果、プロビテンシア・レトゲリ
OTR28−31株の培養液から純度92％のＬ−スレ
オニン結晶6.3ｇ、プロビデンシア・レトゲリ
SVSS−29株のものから純度98％のＬ−スレオ
ニン結晶5.8ｇを各々得た。 ＜発明の効果＞ 本発明により、バリンの副生を抑制し、高純度
のＬ−スレオニンの生産が可能となつた。バリン
の副生がないので、煩雑な精製工程が不要になり
工業的に実用化するのに有利である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ プロビデンシア（Providencia）属に属し、
   Ｌ−スレオニン生産能を有し、かつアセトヒドロ
   キシ酸合成酵素阻害剤に感受性を有する変異株を
   培養し、培養液中にＬ−スレオニンを生成蓄積せ
   しめ前記培養液よりＬ−スレオニンを採取するこ
   とを特徴とする発酵法によるＬ−スレオニンの製
   造方法。 ２ アセトヒドロキシ酸合成酵素阻害剤が（メチ
   ル２−〔〔〔〔（４，６−ジメチル−２−ピリミジニ
   ル）−アミノ〕カルボニル〕アミノ〕スルホニル〕
   ベンゾエートである特許請求の範囲第１項記載の
   発酵法によるＬ−スレオニンの製造方法。