JPH0347199A - 熱処理された因子８のゲル濾過 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト血漿から抗血友病因子（Ａ　ＨＦ　）を
製造する方法に関する。ＡＨＦは、種々の成分から成る
ことが知られており、血友病の治療に活性な成分は因子
■：Ｃである。

本発明を要約すれば、ＰＥＧ沈でん工程、ゲルー過工程
及び熱地理ウィルス不活性化工程を含む方法により、高
度に精製された抗血友病因子が製造される。室温で行な
われるＡ　Ｉ（ＯＨ）３吸着及びＰＥＧ沈でんは、処理
を直接ゲル濾過工程に進めることを可能とする。

ヒト血漿の分別の一部としてＡＨＦ濃厚物の製造に関す
る多数の特許及び刊行物がある。このような方法は約２
０年間にわたり商業的に使用されてきており、多数の処
理方法が記載されており、この大部分はこのような方法
における固有の問題、即ち、ウィルス安全性、収率及び
得られる濃厚物の特異的活性に焦点を当てている。特異
的活性は、最近承認された標準に従えば、全タンパク質
１＋ａｇ当たりの国際単位で表された因子■の凝固活性
を指す。

チンマーマン等のＲｅ、３２０１１（米国特許第４．３
６１，５０９号）に記載の如きアフィニティークロマト
グラフィーを除いては、ゲル濾過又はクロマトグラフィ
ーは、本発明者の知る限りでは、最近商業的には使用さ
れていないけれども、幾つかのクロマトグラフィー法が
述べられている。すべてのアフィニティークロマトグラ
フィー又はｒＤＮＡ法は、検出可能な量の非ヒトタンパ
ク質を有するＡＨＦをもたらすことに留意することは重
要である。

例えば、ＰＣＴ出願公開Ｎｏ、ＷＯ３６，０４４８６は
、“水和添加剤”により、即ち、糖、ポリオール、アミ
ノ酸又は塩の存在下にカラムクロマトグラフィーを使用
して、ＡＨＦを精製する方法を開示している。先行技術
のりａマドグラフィー法の低い収率が記載されている。

水和添加剤は、ＡＨＦを安定化する作用がある。低温性
でん物を緩衝液に溶解し、水酸化アルミニウムを加えそ
して上澄液を集めることができる。次いで、ＱＡＥセフ
ァデックスＡ−２５、ＱＡＥ−セファロース４Ｂ又はア
ミノへキシル（Ａ−Ｈ）セファロースなどの樹脂を使用
してｌ又は２カラムクロマトグラフイー工程を行う。第
１のクロマトグラフィー工程はアニオン交換に基づいて
おり、第２工程は疎水性アフィニティーに基づいている
。

アンダーソンのＥＰＩ　９７９０１は、イムノアフィニ
ティークロマトグラフィーに統いてアニオン交換吸着剤
でのＨＰＬＣを使用してＡＨＦの断片を製造する方法を
開示している。アニオン交換吸着剤はモノＱゲル（Ｍｏ
ｎｏ　Ｑ　ｇｅｌ）又はＴＳＫ　　ＤＥＡＥ５ＰＷゲル
であることができる。次いでトロンビンとのインキュベ
ーションにより断片が得られる。

ジョンソンの米国特許第４．３９７．８４１号は、ヘパ
リンの存在下に高分子電解質コポリマーを使用する一連
の吸着工程による血漿の分別による因子■：Ｃの製造を
開示している。適当な樹脂はエチレンと無水マレイン酸
のコポリマーである。

シャビン等の米国特許第４，４９５，１７５号は、ＡＨ
Ｆ濃厚物からの高度に精製したＡＨＦの製造を開示して
いる。この濃厚物は、ストークスの半径に基づく分離に
付される。これは、例えば、架橋アガロース（バイオゲ
ル（Ｂｉｏｇｅｌ）Ａ　−１５Ｍ又はセファロースＥＬ
−４Ｂなどの）でのゲル浸透クロマトグラフィーにより
達成することができる。

次いでプールを沈でん又はダイアフィルトレージｊン（
ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）により濃縮し、カルシウ
ム又はマグネシウムカチオンを加えてストークスの半径
を減少させ、ストークスの半径に基づく分離を再び行う
。

本発明の方法では、先行技術に開示されたような種々の
他の工程が使用される。しかしながら、下記するように
、新規で且つ予想されなかった結果及び修正は本発明に
より包含される。

リュー等の米国特許第４．１７０．６３９号は、例えば
、再溶解した低温性でん物を酸性ｐＨ及び４°Ｃでの水
酸化アルミニウム吸着、濾過及び随意に限外−過に付す
工程を含む、ＡＨＦの製造方法を開示している。

ラスムラセン（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ）等は、米国特許第
４゜６５０．８５８号は、１８−２２℃で４％ＰＥＧ沈
でんを用いてフィブリノーゲンを除去する、ＡＨＦの製
造方法を開示している。この後、２Ｍグリシンのような
アミノ酸の存在下に１２％のＰＥＧでＡＨＦを沈でんさ
せる第２ＰＥＧ沈でん工程が絖く。

シャンブロム（Ｓｈａｎｂｒｏｍ）の米国特許第４．０
６９．２１６号は、先行技術、例えば彼の第３，６３１
．０１８号に開示されているＰＥＧ沈でんを検討してお
り、それによれば室温法でんは、ＰＥＧが高濃度（１０
−１２％）で使用されるので、その後の洗浄及び／又は
グリシン又はアルコール沈でん工程を必要とする。低濃
度のＰＥＧ（２１／２％）を使用する冷沈でん（ｃｏｌ
ｄ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）は純度の低い生成物
をもたらす。

リアウタウド（Ｌｉａｕｔａｕｄ）等の米国特許環４，
３８７．０９２号は、フィブリノーゲン沈でん工程を４
％より少ないポリオールで１５°Ｃ以下で行うシャンブ
ロムの米国特許環４．０６９．２１６号に対する改良を
開示している。

ボルソン（Ｐｏ１ｓｏｎ）の米国特許環３．４１５．８
０４号は、２０℃付近の室温でＰＥＧによる血漿分別を
開示している。０−４％ＰＥＧではフィブリノーゲンが
沈でんし、４−８％ではγグロブリンが沈でんし、８−
１２％ではβグロブリンが沈でんし、１２％より多いＰ
ＥＧではσ−１及びα−２グロブリン及びアルブミンが
沈でんした。

最後に＜Ａ　ＨＦ濃厚物のウィルス不活性化に関して関
連のある米国特許が存在する〉 ニューラス（ＮＥＵＲＡＴＨ）等の米国特許環４゜５４
０．５３７号は、トリー（ｎ−ブチル）ホスフェート（
ＴＮＢＰ）ＴＮＢＰの使用による因子■生産のウィルス
感染を開示している。ＴＮＢＰを血漿プールに加えるこ
とができ、そしてＡＨＦはグリシンによるなどの再沈で
ん工程によりＴＮＢＰから分離することができる。実施
例では、ＴＮＢＰは８−１０　ｕ／　ｍ１２Ｆ■活性を
持ったＡＨＦ溶液に加えられる。

レンバッハ（Ｌｅｍｂａｃｈ）の米国特許環４，５３４
゜９７２号は、ＡＨＦ製造のためのウィルス不活性化に
銅７エナントロリンの使用を開示している。

この物質は分別の後に加えられそしてダイアフィルトレ
ージョンにより除去することができる。

ウィルス不活性化のための熱処理及びゲルー過と組み合
わせた温和な処理工程を使用して、高収率の抗血友病因
子（ＡＨＦ）を達成して、治療的活性又は免疫学的活性
を実質的に損失することなく、感染作用物質を実質的に
含まない高度に精製されたＡＨＦを得ることができる。

本発明の１つの特定の観点では、新鮮な凍結ヒト血漿の
解凍したプールから遠心分離により低温沈でん物を回収
する。外来の非ＡＨＦタンパク質は、非ＡＨＦタンパク
質の高度の沈でんを生じる条件下に酸沈でん及びＡＩ（
○Ｈ）３による吸着及びＰＥＧ沈でんにより除去される
。結果として、急冷工程は必要ではない。次いでＡＨＦ
をグリシン及び塩化ナトリウムで沈でんさせる。可溶化
したＡＨＦ濃厚物を次いで処理して、追加の不純物を除
去し、ウィルス不活性化のために熱処理し、次いでゲル
濾過する。好ましいゲルは、５百万ダルトンのカットオ
フ及び２００−４００メツシユを有する。

次いでＡＨＦをアルブミンの存在下に無菌濾過の後凍結
乾燥する。

実施例１ 血漿交換した（ｐｌａｓ＋＋＋ａｐｈｅｒｉｓｅｄ）提
供者の正常な血漿プールからの低温沈でん物（ｃｒｙｏ
ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）［クライオ（ｃｒｙｏ）と呼
ぶ］を、クライオ１Ｋｇ当ｔ；す３ＫｇのＷＦＩを加え
ることにより溶解した。

ＷＦＩは、クライオを加える前に５Ｑｕ／ｍ１２以下の
ヘパリンナトリウムを含むことができる。３０゜２Ｋｇ
のクライオを２７℃の温度で９０．５ＫｇのＷＦＩに加
え、混合してクライオを溶解した。ＷＦｌの温度範囲は
１７−３７°Ｃであり、最も好ましくは２４−３０℃で
ある。フライ第１部／ＷＦ■３部の割合を実施例１では
使用するけれども、同じ結果を得るのにフライ第１部／
ＷＦ　１４部を使用することができる。

クライオ／ＷＦＩ混合物を溶解するまで３０分間撹拌し
た。得られる温度は２１°Ｃであり、好ましい範囲は１
８−２５°Ｃであった。Ａｌ６゜は４１゜２であり、好
ましい範囲は３８−４４であり、ｐＨは７．７５であり
、好ましい範囲は７．６−８゜０であっ−た。

溶解したクライオ／ＷＦＩ溶液のｐＨをＩＮ酢酸２７０
ｍ１２の滴下による添加により７．０に調節し、好まし
い範囲は６．０−８．０、最も好ましくは６．８−７．
２であり、そして懸濁液を１５分間撹拌した。平均収率
は１１６％であり、収率の範囲は１１０−１２７％であ
った。見掛けの収率増加はＡＨＦアッセイを妨害するフ
ィブリノーゲン及び他の成分の除去による。前記の工程
を室温で行って急冷工程及び追加の沈でんを回避しそし
てタンパク質変性を回避することができる。

吸着工程では、水酸化アルミニウム、Ａ　Ｉ（ＯＨ）。

ゲル４８２６ｒｒｌを酸クライオ懸濁液に加えそして１
０分間撹拌してビタミンに依存性因子に結合させた。Ａ
ｌ（ＯＨ）３ゲルの量は出発クライオＫｇ当たり１６０
ｍＱのＡ　Ｉ（ＯＨ）１ゲルに相当し、好ましい範囲は
、Ａ　Ｉ（ＯＨ）３ゲル１００−２５０ｍ１２／　Ｋ　
ｇクライオである。この工程の平均収率は９４％であり
、収率の範囲は９０−１００％である。

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈でんでは、３．６
　ＫｇのＰＥＧ３３５０（３％ＰＥＧ）をＡ　Ｉ（ＯＨ
）、−酸クライオ懸濁液に加え、ｐＨを１Ｍ酢酸１６ｍ
１２により７．０６に調節した。ｐＨ範囲は６゜０−８
．０であり、更に好ましくは、６．８−７゜３である。

ＰＥＧの濃度は２．５−５％の範囲にあることができる
。懸濁液を遠心分離の前に２３分間撹拌した。懸濁液の
温度は２１，５℃、好ましくは１０℃以上であった。

上記懸濁液を、ウエストファリア（Ｗｅｓｔｐｈａｌｉ
ａ）ＢＫＡ−６遠心分離器を用いて４Ｑ／分の流速で遠
心分離した。好ましい範囲は２−６Ｑ／分である。流出
液温度は２０℃に維持した。好ましい範囲は１８−２５
℃であった。流入液温度は２１゜５℃とした。好ましい
範囲は２０−２５°Ｃである。

得られる沈でんを回収し、重量を秤り、捨てた。

１０．７Ｋｇの沈でんは、出発クライオの３５．４％に
相当した。平均比でんは３２．４％であり、範囲は２９
．０−３６．３％であった。

ＰＥＧ流出液は、ｌ１６．６Ｋｇの重量であり、１０．
４のＡ２Ｂ。、２０°Ｃの温度で７．２６のｐＨを有し
ていた。温度範囲は、好ましくは２０−２３℃であり、
２０℃より低い温度を持ったＰＥＧ流出液の場合には必
要に応じて加温工程を加えることができる。ＰＥＧ工程
により回収されたＡＨＦの平均収率は７８％であり、範
囲は７４．３−８６．１％であった。

重要な利点は、ＰＥＧ沈でんに従来使用されていた急冷
工程をなくしたことに認められる。これは、急冷工程が
フィブリノーゲン、フイプロネク、チン等を沈でんさせ
るが、ＡＨＦも沈でんさせ、それにより収率を減少させ
る故に、有利である。

得られる最終ＡＨＦペーストは、ＡＨＦの損失又は高容
量のカラムゲルを回避するのに非常に良好な旭理ペース
ト重量（ｗｏｒｋｉｎｇ　ｐａｓｔｅ　ｗｅｉｇｈｔ）
である。ペースト重量が余りにも低いと、ＡＨＦの損失
が起こり、ペースト重量が余りにも高いと、ゲル濾過工
程に大容量のカラムゲルが必要である。

ＰＥＧ流出液に、１Ｍ水酸化ナトリウム２００ｍＱの添
加によりｐＨを７．０、好ましくは６．０−８．０に維
持しながら、固体Ｌ−グリシン（又は１３％グリシン）
１５．２Ｋｇを加えた。グリシンの添加はＰＥＧ流出液
の温度を約１５℃に低下させた。溶液を２０°Ｃに加温
した。好ましい範囲は２０−２３°Ｃである。溶液を溶
解するまで２０分間撹拌した。

グリシン−ＰＥＧ流出液溶液に、１ＭＮａＯＨ２００ｍ
ＱによりｐＨを７．０、好ましい範囲は６゜０−８．０
に維持しながら、固体ＮａＣＩ（又は１４％ＮａＣｉ）
１６．３　Ｋｇを加えた。最終温度を２０℃、好ましい
範囲は２０−２３°Ｃに調節した。最終ｐＨは７．０３
であり、その範囲は６．９−７．２であった。溶液を溶
解するまで２５分間撹拌した。

グリン７−ＮａＣＩ−ＰＥＧ流出液を２．ＯＱ１分の流
速で遠心分離してＡＨＦ相を除去した。入り口は２０℃
であり、好ましい範囲は２０−２３°Ｃであった。流出
液温度を２１−２２°０に維持し、好ましい範囲は１８
−２５℃であった。流出液のＡ、。を９１で測定し、そ
して流出液を捨てた。

回収されたＡＨＦペーストはＩ　、０３　Ｋｇの重量で
あった。これを７．０のｐＨ％好ましい範囲は６゜９７
、ｌのｐＨで、０．０２Ｍのし一ヒスチジン、０．１０
Ｍのギ酸アンモニウム、１．５％のマンニトール、０．
ＯＯＩＭのＣａＣ１，を含有する緩衝液に溶解した。緩
衝液は、０．２Ｍ以下のギ酸アンモニウム、０．０６Ｍ
のし一ヒスチジン、０．００３ＭのＣａＣ５及び３％の
マンニトールヲ含ムことができる。緩衝液は、タンパク
質の変性、即ち、銅フェナントロリンの非特異的結合を
最小にするべきである。別の緩衝液、例えば、注射用の
水（ＷＦ　Ｉ）：ＮａＣｌ　　Ｏ−１５Ｍ、　ＣａＣ１
ｚ　　０．００１Ｍ、ｐＨ７，２；　　イ゛ミダゾール
０．０５Ｍ、ｐＨ７゜０；又は　トリスＨＣｌ０．０５
Ｍ／ＮａＣｌ０．１５Ｍ、ｐＨ７，０又はＬ−ヒスチジ
７０．０２Ｍ、ＮａＣｌ０−１　５Ｍ、ＣａＣ１ｚＯ、
ＯＯＩＭ−ｐＨ７，２、を使用することができる。

得られる溶解したＡＨＦ濃厚物は３３．２のＡ　２　Ｂ
　６．３．８４Ｋｇの重量及び４３２　ｕ／　ｍ　Ｑの
力価を有していた。以前の実験において、平均力価は２
３２ｕ／ｍＱであり、範囲は１３０−２８７゜５ｕ／ｍ
Ｑであった。以前のＰＥＧ沈でん法に比べて、普通より
はるかに高い力価の故に、ウィルス不活性化のための化
学処理及びゲル濾過工程は限外濾過などの従来必要とさ
れた更なる濃縮工程を必要とすることなく行なわれる。

溶解したクライオに対するＡＨＦの単位の回収率は６３
．２％であった。平均は６７．３％であり、範囲は５６
．７−７１．８％であった。以前の実験において、溶解
したＡＨＦ濃厚物に対するＰＥＧ流出液からのＡＨＦの
収率は平均で７８．３％であり、回収率範囲は６８．３
−９０．０％であった。

可溶化されたＡＨＦは、−２０℃又はそれより低い温度
で凍結させることができ、そして−７０００で貯蔵する
か又は直ちに処理することができる。

凍結した（−７０°Ｏ）Ａ　ＨＦ濃厚物は、解凍したＡ
ＨＦ濃厚物の温度が２５．２℃となるまでほぼ４時間２
７°Ｃの水浴で解凍することができる。

随意の凍結工程までのすべての工程は室温で行なわれる
ことに留意することは重要である。

０．１Ｍヒスチジン１０ｒｒｌ、０．ＯＬＭ硫酸銅５水
塩８ｍＱ１０．５Ｍｌ、１０フ工ナントロリン８ｍ（２
を混合することにより４０倍濃縮の銅フェナントロリン
（ｃｕＰＨ）緩衝液を調製した。最終容積をＷＦＩで２
００ｍ＋２に調節した。ＣｕＰＨ緩衝液８７．５ｍ＋２
の容積をオートクレーブに入れた密閉した容器中でＡＨ
Ｆ濃厚物３５００ｍｆｆに加えた。密閉したＣｕＰＨ反
応器はすべての内表面をぬらすように端から端まで（ｅ
ｎｄ　ｔｏ　ｅｎｄ）で回転するように構成されている
。酸素添加は、反応器の内側のホルダのまわりに巻き付
けられた２５フイートのシラスチック（ｓｉｌａｓｔｉ
ｃ）医療銘柄チューブを通して拡散させることにより送
られる。反応中、２．５ｐｓｉの医療用銘柄の酸素を反
応器に送り、反応器を３　ｒｐｍの速度で回転させＩ；
。

ＣｕＰＨ反応は、前記米国特許第４．５３４，９７２号
に記載のように０．２Ｍ　　Ｌ−ヒスチジン３５ｒｒｌ
の添加により開始した。この特許に記載のように、０．
２Ｍ　　Ｌ−システィン塩酸塩１７．５ｍＱの第２の添
加物を最初の添加物が使い尽くされた後注入した。この
添加物も又は酸化された。

反応器を空にしそして洗浄する前に、反応器をウィルス
のない部屋に移し、反応器の外側を次亜塩素酸ナトリウ
ムで消毒した。ＣｕＰＨ反応混合物を３７℃以下に加温
しそして予備濾過しだ。予備濾過工程は、必要ではない
がゲル濾過カラムの寿命を保護するのに使用される。予
備濾過したＡＨＦをバイオゲルＡ−５Ｍ（１００−２０
０メツシユ）を充填しｆ：、４×■６Ｑファーマシア積
み重ねカラムに８．４Ｑ／時間でポンプで送った。負荷
範囲は、６−１２Ｑ／時間であった。

４つのファーマシアＫＳ３７０／１５積み重ね区域を直
列に接続しマスターフローポンプを使用して底部から頂
部に流した。

ＣｕＰＨ反応器から回収されたＡＨＦは、ＡＨＦ濃厚物
中のＡＨＦの９０％であった。平均は８８．３％であり
、範囲は８０．７−９３．５％であった。撹拌式ビーカ
ーなどの開放ＣｕＰＨ反応器では、８８−９８．７％の
範囲で９３．７％の平均回収率が達成された。これらは
、殺菌、濾過及び限外濾過により約２５％のＡＨＦの損
失が証明されている慣用の湿式熱ウィルス不活性化工程
に比べて非常に高い収率である。更に、穏やかなあ理工
径は、タンパク質に対する不利な作用の可能性を最小に
する。

積み重ねカラムを、０．１５ＭＮａＣ１，０，００］　
Ｍ　Ｃａ　Ｃ１ｚを含むｐＨ７，１６の緩衝液と２２℃
で平衡化した。緩衝液の範囲は、０．２Ｍ以下のＮａＣ
１，０，００３Ｍ以下のＣａＣｌ２、ｐＨ６，８−７，
８及び温度１６−２６°Ｃである。合計３．９ＫｇのＣ
ｕＰＨ処理Ａ処理全ＨＦムにポンプで送った後、カラム
を平衡化するのに使用したのと同じ緩衝液を溶離緩衝液
として使用した。溶離緩衝液を９．０１２／時間の流速
でカラムにポンプで送った。

流速範囲は６−１２Ｑ／時間であった。別の緩衝液、例
えば、０．０５Ｍトリズマ塩基（Ｔｒｉｚｍａ　ｂａｓ
ｅ）、Ｏ，ｌ５ＭＮａＣｌ、Ｏ、ＯＯＩ　ＭＣａＣＩ□
、ｐＨ７，４又は０．０２ＭＬ−ヒスチジン、０．１５
ＭＮａＣＩ、　　Ｏ−００１ＭＣａＣ１２、ｐＨ７，２
を使用することができる。溶離緩衝液は最終容器中に存
在しているので、それは無毒性であるべきであり、イオ
ン濃度はフオンビルプラント因子（ｖａｎ　Ｗｉｌｌｓ
ｂｒａｎｄ　ｆａｃｔｏｒ）からＡＨＦを解離させる程
高くするべきではない。

予備濾過したＣｕＰＨ処理したＡＨＦ３．９Ｋｇを、上
記の溶離緩衝液と平衡化した６４Ｑのバイオラドのバイ
オゲルＡ５Ｍ（１００−２００メツシユ）を使用して、
６．１％のゲル容積を用いて、ゲル濾過した。十分な分
離及び収率のＩ；めに好ましいゲル容積の範囲は５−８
．０％であった。より多くのゲル容積はＡＨＦプールの
より低い力価をもたらし、より少ないゲル容積は、収率
をより低くするであろう。ＡＨＦプールの収集の開始ま
でのカラムにＡＨＦを加える時間は２．３５時間であっ
た。ＡＨＦプールの収集は、Ａ！、。が溶離しているこ
と紫外線モニターが示した時に開始した。空隙容積（■
０）は２０．０３Ｋｇであった。

直接のＡ２Ｂ。分光光度計の読みが２．０のＡ　２６６
が得られたことを示すまでＡＨＦプールを収集した。１
４．８Ｋｇの重量のＡＨＦプールを集めた。

ＡＨＦプールが溶離されると、桃色のＣｕＰＨ反応体は
依然としてカラムの道程の半分未満であることにより証
明されるように、ゲル濾過は銅フェナントロリン反応体
を除去するのに有効な手段である。更に、フィブリノー
ゲン及びフィブロネクチンなどのような大きい粒子も又
ゲルー過により分離される。

ＣｕＰＨ反応体が除去されたことを確認するため及びフ
ェナントロリン（ＰＨ）の残留レベルを評価するために
、放射性標識した目Ｃを使用して一連の実験を行った。

目Ｃ−Ｐ　Ｈを調製しそして種々のプロセス工程中、前
記化合物の除去をモニターするのに使用された。これら
の結果は、ゲル濾過がＡＨＦ及び他のタンパク質から遊
離ＰＨの除去に有効な方法であることを示した。更に、
研究の結果、タンパク質とＰＨの会合が、ギ酸アンモニ
ウム、ヒスチジン及びマンニトールの存在下に反応を行
った場合にほば４−５倍減少したことが示された。これ
らの化合物は、このプロセスに加えられて、タンパク質
と小残留量のＰＨとの会合の存在を最小にした。

回収されたＡＨＦプールは、６．８５のｐＨ。

１．２１Ｉ７）Ａ２．。、１４．８Ｋｇの重量、５６．
６ｕ／ｍＱの力価を有していｔ：。これは、５６．６／
１゜２１＝４６．８単位／Ａ２．。単位の特異的活性及
び４６．８／ｌ　３（ＡＨＦ濃厚物について）＝３．６
倍の精製を与える。カラムを通しての収率は、７５゜５
％であっＩ；。以前の実験から平均収率は７９゜５％で
あり、範囲は７０．１−８９．９％であった。

ＡＨＦプールの高い力価（５６，６ｕ／　ｍｆｆ）によ
り、限外濾過は行わなかった。実際、ＡＨＦプールは、
次の処理のために約３５ｕ／ｍ１２以下にカラム緩衝液
により希釈されなければならなかった。しかしながら、
より高い最終容器濃度を望む場合には、Ａ　ＨＦプール
は１００　３００ｕ／ｍ＋２に容易に限外ｐ遇すること
ができる。

この特定の実験のＡＨＦプールは凍結されなかったけれ
ども、ゲル濾過カラムからの従来のＡＨＦプールは、−
緒に集めそして凍結乾燥されるまで、保存工程として、
−７０°Ｃで凍結及び貯蔵された。

計算された最終容器力価が約２５ｕ／ｍ（２となるよう
に、普通の血清アルブミンを加えた。２５％アルブミン
４９２ｍ１２を加えて、最終容器での再構成を助けた。

この量のアルブミンは、ＡＨＦＩ液１ｍ＆当たり５ｍｇ
のアルブミンに相当し、アルブミンの範囲はＡＨＦ１ｍ
ｌ当たりアルブミン１１０ｍｇ５更に好ましくは３−５
＋ｎｇである。アルブミンの他に、最終容器は、０．２
Ｍグリシン及び０．００１　ＭＣａＣｌ、又は０．１５
ＭＮａＣ１及び０．００１　ＭＣａＣｌ、などのような
安定剤を含むことができる。

〜ヒト血清アルブミン（Ｈ３Ａ）を、１０インチのデュ
オフィン（［）ｕｏｆ　１ｎｅ）、１２インチｃｗｓｓ
及び無菌濾過器として１０インチのミリポアＴＰ（Ｍｉ
ｌｉｐｏｒｅ　ＴＰ）を使用して無菌濾過した。無菌−
過器を新たなカラム緩衝液で洗浄して、目標の全体重量
２４．６　Ｋｇとした。無菌濾過を通してのＡＨＦ回収
率は９１．５％であった。平均は８５％であり、範囲は
７８−９２．８％であった。無菌濾過ＡＨＦのＡＨｏは
５．１５であった。

無菌ＡＨＦ−ＩＳＡ溶液を無菌のバルク容器中で混合し
、各びんに２０ｍＱずつ５０ｃｃのびんに充填し、製造
凍結乾燥機に入れ、凍結乾燥した。

凍結乾燥での収率は８９．８％であった。平均は８９．
４％であり、範囲は７８−１１１％であった。

最終容器を品質制御のための広範な分析に付し、非常に
低いレベルのＩｇＧ、ＩｇＭ、１ｇＡ１フィブリノーゲ
ン及びフィブロネクチンを持っｔ；、安定で、発熱物質
を含まない、安全な調製物を証明した。

最終容器の濃度は６１０ＡＨＦ単位／２０ｍ１２であり
、特異的活性は５．７ＡＨＦ単位／ｍｇタンパク質であ
り、非常に低いレベルの銅及び７エナントロリンが検出
された。

実施例２ 低い特異的活性の同じロフトからの試料を種々のゲル濾
過（ＧＦ）カラムでゲル濾過し、他の汚染物の残りから
ＡＨＦを分離する効率を比較した。

種々のゲル濾過樹脂を２．６Ｘ２５ｃｍのカラムに注ぎ
、濃厚物１０ｍ１２を加えそしてゲル濾過した。

結果を表１に示す。

プールｌは、前記の如く２．０への上昇からＡｔｍ。を
追跡することにより集めｆ：、　Ａ　ＨＦプールを表す
。プール２は特定のゲル濾過カラムから溶離されたＡ２
．。の残りのすべてを表す。全回収率はプール１とプー
ル２の収率の和を表す。

表から、ファーマシアＣ１−４Ｂ、バイオゲルＡ−１５
Ｍ及びＬＫＢウルトロゲルＡ４も又バイオラド社のバイ
オゲルＡ５Ｍで得られた結果と同様な結果を与えること
がわかる。別の実験では、１００−２００メツシユのバ
イオゲルＡ５Ｍ樹脂は他の２つのメツシュに比べて最適
であった。メツシュは、Ｕ、Ｓ標準ウェットメツシュ呼
称（水和）である。

これらのゲルは、ＡＨＦ／７オンビルプラント複合体（
Ａｔ（Ｆ／ｖａｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ　ｃｏｍｐｌ
ｅｘ）がフィブリノーゲン、フィブロネクチン等のよう
な他の不純物から分離されることを可能とする分別範囲
を持つように選ばれる。

表１に示されたゲルのいくらかは５０％より少ないＡＨ
Ｆの収率をもたらしたが、これは多分不十分な分別範囲
のためであろう。すべては上述のウィルス不活性化工程
からの化学的反応体を除去する作用をする。この理由は
、このような反応体は３００ｄより少ないＭＷを有する
からである。

ファーマシアゲルはすべて架橋したビーズ状のアガロー
スである。バイオゲル樹脂はすべてアガロースをベース
とするゲルである。ＬＫＢウルトロゲルＡ４Ｒは４％ア
ガロースビーズを有する。

フラクトゲルは、ビニルポリマーから製造された親水性
半硬質球状ゲルである。ＣＰＧシリーズは制御された多
孔性ガラスピーズを指す。

へへへ−ζ′″、ススス〜（コロ６３ｈｈ実施例３ 上述のバイオゲルＡ５Ｍカラム実験からのＡＨＦプール
の試料１５０ｍ４をカラム緩衝液で希釈して７００ｍ＋
２とした。希釈したＡＨＦプールに、米国特許第４，５
４３，２１０号に記較の０．９ＭＬ−グリシン、０．８
ＭＬ−リシン、０．００２Ｍ　Ｃａ　Ｃｌ　２及び１．
２ｇ／ｍｇスクロースを加えた。

混合して溶解した後、溶液を６０°Ｃの水浴に１０゜５
時間入れ、ｌ／２時間加温した（湿式熱殺菌）。

６０°Ｃでインキュベーションした後、この殺菌した溶
液をカラム緩衝液でｌ：ｌに希釈し、ＡＰ２５フラット
ストック−過器（ｆｌａｔ　５ｔｏｃｋ　ｆｉｌｔｅｒ
）により予備濾過した。流出液は室温でＷＦ　Ｉ　８１
２続いて２−３容量のカラム緩衝液に対してＤＦ／ＵＦ
であった。次いでＤＦ殺菌ＡＨＦを無菌濾過しそして凍
結乾燥した。殺菌ＤＦ／ＵＦ工程の収率は７５％であっ
た。最終容器の特異的活性は、Ａ、。単位当たり４３．
１単位であることが見出だされた。Ｈ５Ａはこの特定の
実験では加えなかっｔこ　。

この実施例は、本ゲル濾過カラムからのＡＨＦプールを
追加の又は別のウィルス不活性化工程として処理するこ
とができることを示す。

実施例４ 増加していくレベルのスクロースをバイオゲルＡ５Ｍカ
ラム実験からのＡＨＦプールの試料に加えた。タンパク
質濃度の効果を決定するために、希釈していないＡ）Ｉ
Ｆプール及びｌ：】に希釈したＡＨＦプールを使用した
。他の賦形剤には、０゜３ＭＬ−グリシン、０．５ＭＬ
−リシン（１）又は０．９ＭＬ−グリシン又は０．５Ｍ
、０．８ＭＬ−リシン（２）が包含される。０−２ｇ／
ｒｒｌのスクロース乃至１．２ｇ／ｍ１２のスクロース
（水平軸）を加え、試料を水浴中で６０℃で１０時間加
熱した。

プレ及びポスト因子■（Ｐｒｅ　ａｎｄ　Ｐｏ５ｔ　’
Ｆａｃｔｏｒ■）アッセイを試料について行った。第１
図において、ＡＨＦＨＦ収率タスクロースベルは、ＡＨ
Ｆ回収率がスクロース０．６−１．２　ｇ／ｍＱでほぼ
同じであるので、スクロースのレベルを１．２ｇ／ｍＱ
から０．６ｇ／ｍＱに減少させることができることを示
す。

添付図面を参照すると、凡例”ＯＬＤ　　ＳＴ”は、ス
クロース添加前に賦形剤（１）を含んでいる希釈されて
いないＡＨＦプールを表す。凡例“０ＬＤＤＬＬ”は、
スクロース添加前に賦形剤（１）中のカラム緩衝液で希
釈された１：１ＡＨＦプールを表す。“ＮＥＷ　　ＤＬ
Ｌ”は、スクロース添加前に賦形剤（２）中のｌ：ｌに
希釈されたＡＨＦプールを表す。ＮＥＷ　　ＳＴ”は、
賦形剤（２）中の希釈されていないＡＨＦプールを表す
。

０．６ｇ／ｍｆｆ以下のスクロースレベルは、賦形剤（
１）又は（２）のいずれでも、３０％以下の活性損失を
示した。賦形剤（２）は、０．６ｇスクロース／ｍＱで
賦形剤（１）に対する２０％近くの収率改善を示した。

この実施例は、ゲルｉ（＃；Ｉ！ｈＡＨＦは、減少した
スクロースレベル、即ち、１．２又は１．１−０．６ｍ
ｇ／ｍ（ｌで湿式熱処理することができることを示す。

スクロースレベルを減少させることは、処理（ＤＦ／Ｕ
Ｆ）を減少させるであろう。それはウィルス不活性化を
高めることができる。その理由は、スクロースはウィル
ス粒子及びＡＨＦも［１するからである。より低いスク
ロースレベルは、ＡＨＦ活性の損失なしにウィルス粒子
に対する少ない保護を与えるであろう。未希釈／希釈Ａ
ＨＦ試料について同一の結果が両緩衝液系で見られる。

実施例５ 製造カラム実験からのＡＨＦプールを、アミコン中空繊
維カートリッジ（１０平方フイート）を使用して限外濾
過（ＵＦ）した。ＡＨＦプール（１６゜２Ｋｇ）を１時
間限外濾過して４．８　Ｋｇの重量とした。下記の表は
、限外−過工程に対する適切なデータを要約する。

表　　■ ゲルー過ＡＨＦの限外ｐ過 ＡＨＦプールは、純度を失わないで非常に僅かな収率損
失で（約５％）非常に容易に限外濾過された。ＡＨＦ力
価は、１８０単位／ｍＱより高く濃縮された。別の実験
では、ＡＨＦプール（１）をＡＨＦ３００ＨＦ３００単
り高くなるように容易に限外濾過することが可能であっ
た。この高い力価では、非常に低容積の再構成最終容器
で血友病者が大量のＡＨＦを迅速に受は取ることを可能
となる。最終容器の力価は、限外濾過の程度に依存する
であろう。予想される範囲の最終容器の力価は５０−３
００単位ＡＨＦ／ｍＱである。

実施例６ 実施例５からの限外濾過ＡＨＦプール（１）をカラム緩
衝液で希釈し、正常な血清アルブミンを、計算最終容器
力価が約１００ｕ／ｍ４となるように加えた。無菌濾過
（実施例１の如く）及び凍結乾燥の後、最終容器ＡＨＦ
濃厚物をアッセイし、これらの結果の一部を表■に示す
。

表−１ ＴＮＢＰ／ツイーンＡＨＦに体する最終容器試験の結果
試験　　　　　　　　　　結果 ＡＨＦ　　力価　　　　　　　　１０４ｕ／ｍ１２７オ
ンビルブランツ因子　　　９５ｕ／ｍｆｌ特異的活性　
　　　　　　　１６．８単位／■タンパク質ＴＮＢＰ　
　　　　　　　　　　　二０．８　ｐｐｍツイーン８０
　　　　　　　　≦ｏ　ｐｐ□ウサギ発熱物質　　　　
　　パス 無菌性　　　　　　　　　　パス 安全性　　　　　　　　　　パス フィブロネクチン　　　　　０．３９　Ｔｎ９／ｍ１２
フィブリノーゲン　　　　　〉０．６■／−ｒ　ｇＧ　
　　　　　　　　　　　＞ｏ、ｏｉｓ■／−表で見られ
るように、通常の２５　ｕ／　ｍ　Ｑの４倍のＡＨＦ濃
厚物を製造することができそしてこのＡＨＦ濃厚物は最
終容器の性質に影響を与えない。

このＡＨＦプールの無菌濾過には何等の問題もない。ウ
サギ発熱物質試験は、ウサギＩＫｇ当たり■００単位の
ＡＨＦを注射することにより行った。

３匹のウサギの全体の温度効用は０．３°Ｃにすぎなか
った。ＡＨＦＨＦオフオンビルプラント因子算比ｌ：１
は、最終容器における１、０の殆ど理想的な血漿比を暗
示する。この最終容器ＡＨＦ濃厚物においては検出不可
能なＴＮＢＰ及びツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０が見出だ
された。

吠−；Ｘ　１　容隠ツぶコ以へ℃ヤ；５へ莞へｈ　　念
沢　　“へ騰　　Ｎへごご表■は、種々のロフトからの
追加のアッセイの結果を示す。ＡＨＦ対ｖＷＦの比は比
■ＲｃｏＦ／■：Ｃとして示される。

かくして一連の沈でん、溶解、ゲル濾過及びウィルス不
活性化工程を含むＡＨＦの製造方法を説明してきた。特
定の好ましい態様について言及したけれども、本発明は
このような特定の態様に限定されるものではなくて、特
許請求の範囲に記載の法的範囲により限定されるものと
みなすべきである。

本発明の主なる特徴及び態様は以下のとおりである。

１、低温性でん物から抗血友病因子（ＡＨＦ）の濃厚物
を製造する方法であって、 （ａ）　　前記低温性でん物を溶解し、（ｂ）　　ポリ
エチレングリコール（Ｐ　Ｅ　Ｇ）による沈でんによっ
て非ＡＨＦタンパク質を除去し、（ｃ）前記ＡＨＦをウ
ィルス不活性化のために熱処理し、次いで、 （ｄ）　　サイズ排除樹脂を含むゲルー過カラムに前記
ＡＨＦを通して、前記化学薬品を除去し、そして前記Ａ
ＨＦを、プールした濃厚物１ｍ＋２当たりの因子■活性
が少なくとも３５単位となるように濃縮する、 工程を含むことを特徴とする方法。

２、前記樹脂が３００乃至１５．ｏｏｏ、０００ダルト
ンの分別範囲を有する滋養機１に記載の方法。

３、前記ゲル濾過の前にグリシンとＮａＣ１の混合物で
ＡＨＦを沈でんさせる工程を更に含む、上記ｌに記載の
方法。

４、ＰＥＧを２−５％の量で加える、上記ｌに記載の方
法。

５、前記濃厚物を限外濾過して、濃厚物１ｍ（２当たり
少なくとも１００単位の因子■活性を得る工程を更に含
む、上記ｌに記載の方法。

６、（ａ）　　低温性でん物を調製し、（ｂ）　　沈で
んにより非ＡＨＦタンパク質を除去して可溶化したＡＨ
Ｆプールを形成し、（ｃ）　　前記プールをゲル濾過カ
ラムに通し、（ｄ）　　前記カラムから得られたＡＨＦ
をスクロースの存在下に溶液中で加熱する、 工程を含んで成る、抗血友病因子（ＡＨＦ）濃厚物を製
造する方法。

７、限外濾過により前記プールを濃縮する工程を更に含
む上記６に記載の方法。

８、スクロースの存在下の前記加熱を１．２−０　、６
　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｑのスクロースにおいて行う、上記
７に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の調製物において種々の量のスクロー
スの存在下にＦ、■活性に対する熱の効果を示すグラフ
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、低温沈でん物から抗血友病因子（ＡＨＦ）の濃厚物
   を製造する方法であって、 （ａ）前記低温沈でん物を溶解し、 （ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）による沈でん
   によって非ＡＨＦタンパク質を除去し、 （ｃ）前記ＡＨＦをウィルス不活性化のために熱処理し
   、次いで、 （ｄ）サイズ排除樹脂を含むゲルろ過カラムに前記ＡＨ
   Ｆを通して、前記化学薬品を除去し、そして前記ＡＨＦ
   を、プールした濃厚物１ｍｌ当たりの因子VIII活性が少
   なくとも３５単位となるように濃縮する、 工程を含むことを特徴とする方法。 ２、（ａ）低温沈でん物を調製し、 （ｂ）沈でんにより非ＡＨＦタンパク質を除去して可溶
   化したＡＨＦプールを形成し、 （ｃ）前記プールをゲル濾過カラムに通し、 （ｄ）前記カラムから得られたＡＨＦをスクロースの存
   在下に溶液中で加熱する、 工程を含んで成る、抗血友病因子（ＡＨＦ）濃厚物を製
   造する方法。