JPH0347840B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0347840B2 JPH0347840B2 JP58188041A JP18804183A JPH0347840B2 JP H0347840 B2 JPH0347840 B2 JP H0347840B2 JP 58188041 A JP58188041 A JP 58188041A JP 18804183 A JP18804183 A JP 18804183A JP H0347840 B2 JPH0347840 B2 JP H0347840B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- phenylalanine
- resistant
- tyrosine
- producing
- tryptophan
- Prior art date
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- Expired - Lifetime
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
- C12P13/222—Phenylalanine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は発酵法によるＬ−フエニルアラニン
（以下、単にフエニルアラニンという。）の製造法
に関する。 従来、発酵法によるフエニルアラニンの製造法
としては、ブレビバクテリウム属、又はミクロコ
ツカス属細菌のチロシン要求菌を使用する方法
（特公昭37−6345）、生育にチロシンを要求しかつ
５−メチルトリプトフアンに耐性を有する変異株
を使用する方法（特公昭51−21079）、フエニルア
ラニンアナログに耐性を有する変異株を使用する
方法（特公昭51−28712）、更にはデコイニン感受
性変異株を使用する方法（特公昭56−64793）等
が知られている。 一方、バチルス属についてはＬ−チロシン要求
性変異株を使用する方法（特公昭37−6345）、あ
るいはトリプトフアン要求性、ｐ−フルオロフエ
ニルアラニン耐性及びβ−２−チエニルアラニン
耐性の変異株を使用する方法（特開昭48−67488）
等が知られているが、そのフエニルアラニン蓄積
量は0.2〜0.4ｇ／dl程度であり、上記ブレビバク
テリウム属又はコリネバクテリウム属のフエニル
アラニン生産菌に比べて著るしく劣つている。こ
の為、フエニルアラニンの工業的生産性を目的と
した菌株の育種は殆んど検討がなされず、実際に
フエニルアラニン生産性の高いものは知られてい
ない。 本発明者等は、バチルス属の微生物によるフエ
ニルアラニンの工業生産を目的としたフエニルア
ラニン生産菌の育種を行つた。その結果、バチル
ス属の微生物に、トリプトフアンとチロシンの複
要求性且つ、桂皮酸に耐性を付与したところ多量
のフエニルアラニンを生成、蓄積する菌株が存在
することを見い出した。 本発明はこの知見に基づいて完成されたもので
ある。 本発明において用いられる微生物は、具体的に
は次のような変異株が挙げられる。 バチルス・ズブチルス AJ12096 FERM−Ｐ 7287、FERM BP−608（Trp-、
Tyr-、cinr） バチルス・ズブチリス AJ12097 FERM−Ｐ 7288、FERM BP−609（Trp-、
Tyr-、mFPr、cinr） Trp-：トリプトフアン要求 Tyr-：チロシン要求 mFPr：メタフロロフエニルアラニン耐性 cinr：桂皮酸耐性 本発明の変異株はバチルス属の野生株又は公知
のフエニルアラニン生産菌を親株として、これに
通常の変異誘導操作、例えば紫外線、Ｘ線照射あ
るいはＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソ
グアニジン（NGと略す）、亜硝酸等の化学変異
剤処理を施し、変異誘導株として育種することが
可能である。本発明の変異株の性質を、フエニル
アラニン生産菌の公知の性質、例えばメタフロロ
フエニルアラニン（mFP）耐性等を組み合わせ
ることにより、さらに顕著なフエニルアラニン生
産性の向上が達成できる。 実験例 １ バチルス・ズブチリスAJ11708より誘導したト
リプトフアン、チロシン複要求性のフエニルアラ
ニン生産菌AJ12094FERM−P7285をイーストブ
イヨン寒天斜面培地で培養し、生育した菌体を集
めて１／50Mリン酸緩衝液（PH7.0）に懸濁し
（109個／mlの菌体を含む）、これにNGを加え
（NG濃度は200μｇ／ml）、室温で30分間保持し
た。 NG処理菌体を同リン酸緩衝液で充分洗浄した
後、mFP1000μｇ／mlを含む第１表に示す最小寒
天平板培地に塗布し、31.5℃で７日間培養した。
（以下、単にフエニルアラニンという。）の製造法
に関する。 従来、発酵法によるフエニルアラニンの製造法
としては、ブレビバクテリウム属、又はミクロコ
ツカス属細菌のチロシン要求菌を使用する方法
（特公昭37−6345）、生育にチロシンを要求しかつ
５−メチルトリプトフアンに耐性を有する変異株
を使用する方法（特公昭51−21079）、フエニルア
ラニンアナログに耐性を有する変異株を使用する
方法（特公昭51−28712）、更にはデコイニン感受
性変異株を使用する方法（特公昭56−64793）等
が知られている。 一方、バチルス属についてはＬ−チロシン要求
性変異株を使用する方法（特公昭37−6345）、あ
るいはトリプトフアン要求性、ｐ−フルオロフエ
ニルアラニン耐性及びβ−２−チエニルアラニン
耐性の変異株を使用する方法（特開昭48−67488）
等が知られているが、そのフエニルアラニン蓄積
量は0.2〜0.4ｇ／dl程度であり、上記ブレビバク
テリウム属又はコリネバクテリウム属のフエニル
アラニン生産菌に比べて著るしく劣つている。こ
の為、フエニルアラニンの工業的生産性を目的と
した菌株の育種は殆んど検討がなされず、実際に
フエニルアラニン生産性の高いものは知られてい
ない。 本発明者等は、バチルス属の微生物によるフエ
ニルアラニンの工業生産を目的としたフエニルア
ラニン生産菌の育種を行つた。その結果、バチル
ス属の微生物に、トリプトフアンとチロシンの複
要求性且つ、桂皮酸に耐性を付与したところ多量
のフエニルアラニンを生成、蓄積する菌株が存在
することを見い出した。 本発明はこの知見に基づいて完成されたもので
ある。 本発明において用いられる微生物は、具体的に
は次のような変異株が挙げられる。 バチルス・ズブチルス AJ12096 FERM−Ｐ 7287、FERM BP−608（Trp-、
Tyr-、cinr） バチルス・ズブチリス AJ12097 FERM−Ｐ 7288、FERM BP−609（Trp-、
Tyr-、mFPr、cinr） Trp-：トリプトフアン要求 Tyr-：チロシン要求 mFPr：メタフロロフエニルアラニン耐性 cinr：桂皮酸耐性 本発明の変異株はバチルス属の野生株又は公知
のフエニルアラニン生産菌を親株として、これに
通常の変異誘導操作、例えば紫外線、Ｘ線照射あ
るいはＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソ
グアニジン（NGと略す）、亜硝酸等の化学変異
剤処理を施し、変異誘導株として育種することが
可能である。本発明の変異株の性質を、フエニル
アラニン生産菌の公知の性質、例えばメタフロロ
フエニルアラニン（mFP）耐性等を組み合わせ
ることにより、さらに顕著なフエニルアラニン生
産性の向上が達成できる。 実験例 １ バチルス・ズブチリスAJ11708より誘導したト
リプトフアン、チロシン複要求性のフエニルアラ
ニン生産菌AJ12094FERM−P7285をイーストブ
イヨン寒天斜面培地で培養し、生育した菌体を集
めて１／50Mリン酸緩衝液（PH7.0）に懸濁し
（109個／mlの菌体を含む）、これにNGを加え
（NG濃度は200μｇ／ml）、室温で30分間保持し
た。 NG処理菌体を同リン酸緩衝液で充分洗浄した
後、mFP1000μｇ／mlを含む第１表に示す最小寒
天平板培地に塗布し、31.5℃で７日間培養した。
【表】
【表】
寒天平板上に生育したコロニーのうち、大きな
ものをmFP耐性株として採取した。このように
して得られた耐性株の内には親株よりフエニルア
ラニン生産能の優れたものが多く見出された。こ
のうち、生産能の最も高い菌株AJ12095を選ん
だ。同様の変異操作によりAJ12094に桂皮酸耐性
を付与してAJ12096を、AJ12095に桂皮酸耐性を
付与してAJ12097を誘導した。 実験例 ２ 第２表に示す濃度のmFP又はcinを含む最小培
地（第１表）を試験管に4.0ml宛分注し加熱殺菌
した。この培地に上記変異誘導株を一定量接種し
31.5℃、24時間振盪培養した。各培養液を水で26
倍に稀釈し、その562nｍに於ける吸光度を測定
して生育度を求めた。その結果を第２表に示す。
尚、第２表には薬剤無添加時の生育度を100とす
る相対生育値を示した。
ものをmFP耐性株として採取した。このように
して得られた耐性株の内には親株よりフエニルア
ラニン生産能の優れたものが多く見出された。こ
のうち、生産能の最も高い菌株AJ12095を選ん
だ。同様の変異操作によりAJ12094に桂皮酸耐性
を付与してAJ12096を、AJ12095に桂皮酸耐性を
付与してAJ12097を誘導した。 実験例 ２ 第２表に示す濃度のmFP又はcinを含む最小培
地（第１表）を試験管に4.0ml宛分注し加熱殺菌
した。この培地に上記変異誘導株を一定量接種し
31.5℃、24時間振盪培養した。各培養液を水で26
倍に稀釈し、その562nｍに於ける吸光度を測定
して生育度を求めた。その結果を第２表に示す。
尚、第２表には薬剤無添加時の生育度を100とす
る相対生育値を示した。
【表】
本発明で使用する培地は炭素源、窒素源、無機
塩類、Ｌ−チロシンＬ−トリプトフアンその他必
要に応じてアミノ酸、ビタミン、核酸等の有機微
量栄養素を含有する通常の栄養培地が使用され
る。炭素源としては使用する変異株の利用可能な
ものであれば良く、例えばグルコース、フラクト
ース、シユークロース、マルトース、澱粉分解物
糖蜜等の糖類が使用され、その他、エタノール、
プロパノール等のアルコール類、酢酸、クエン酸
等の有機酸類等が使用される。 窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム
塩、硝酸塩、尿素、アンモニア、肉エキス等無機
あるいは有機の窒素源が使用される。有機微量栄
養素としてはアミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核
酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザ
ミノ酸、酵母エキス、蛋白分解物等が使用され
る。 Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトフアン等のアミノ
酸を要求する変異株を使用するときは、要求する
栄養素等を補添することが必要である。 培養は好気的条件で行うことが望ましく、培養
期間中培地のPHを５ないし９、温度を20℃ないし
40℃に制御しつつ１日ないし４日間振盪培養又は
通気攪拌培養することによりフエニルアラニンが
著量培養液中に蓄積される。培養液からフエニル
アラニンを採取する方法は公知の方法に従つて行
えば良く、培養液から菌体を分離除去した後、濃
縮晶析する方法あるいはイオン交換樹脂を用いる
方法等により採取される。 以下、実施例にて説明する。 実施例 １ 下記第３表に示すフエニルアラニン生産用培地
を調製し、500ml容振盪フラスコに20ml宛分注し、
120℃で10分間加熱滅菌した。これに別途加熱殺
菌した炭酸カルシウム粉末10ｇを補添した。
塩類、Ｌ−チロシンＬ−トリプトフアンその他必
要に応じてアミノ酸、ビタミン、核酸等の有機微
量栄養素を含有する通常の栄養培地が使用され
る。炭素源としては使用する変異株の利用可能な
ものであれば良く、例えばグルコース、フラクト
ース、シユークロース、マルトース、澱粉分解物
糖蜜等の糖類が使用され、その他、エタノール、
プロパノール等のアルコール類、酢酸、クエン酸
等の有機酸類等が使用される。 窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム
塩、硝酸塩、尿素、アンモニア、肉エキス等無機
あるいは有機の窒素源が使用される。有機微量栄
養素としてはアミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核
酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザ
ミノ酸、酵母エキス、蛋白分解物等が使用され
る。 Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトフアン等のアミノ
酸を要求する変異株を使用するときは、要求する
栄養素等を補添することが必要である。 培養は好気的条件で行うことが望ましく、培養
期間中培地のPHを５ないし９、温度を20℃ないし
40℃に制御しつつ１日ないし４日間振盪培養又は
通気攪拌培養することによりフエニルアラニンが
著量培養液中に蓄積される。培養液からフエニル
アラニンを採取する方法は公知の方法に従つて行
えば良く、培養液から菌体を分離除去した後、濃
縮晶析する方法あるいはイオン交換樹脂を用いる
方法等により採取される。 以下、実施例にて説明する。 実施例 １ 下記第３表に示すフエニルアラニン生産用培地
を調製し、500ml容振盪フラスコに20ml宛分注し、
120℃で10分間加熱滅菌した。これに別途加熱殺
菌した炭酸カルシウム粉末10ｇを補添した。
【表】
この培地に第４表に示すフエニルアラニン生産
菌を１白金耳接種し、30℃で72時間振盪培養し
た。培養液中のフエニルアラニン生成量を測定
し、その結果を第４表に示した。
菌を１白金耳接種し、30℃で72時間振盪培養し
た。培養液中のフエニルアラニン生成量を測定
し、その結果を第４表に示した。
Claims (1)
- １ バチルス属に属しトリプトフアンとチロシン
の複要求性を示し、且つ、桂皮酸に耐性を有する
Ｌ−フエニルアラニン生産菌を液体培地中で培養
してＬ−フエニルアラニンを生成蓄積せしめ、こ
れを採取することを特徴とする発酵法によるＬ−
フエニルアラニンの製造方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58188041A JPS6078590A (ja) | 1983-10-07 | 1983-10-07 | 発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法 |
| DE8484306803T DE3477938D1 (en) | 1983-10-07 | 1984-10-05 | Method of producing l-phenylalanine by fermentation, and bacteria therefor |
| EP84306803A EP0138526B1 (en) | 1983-10-07 | 1984-10-05 | Method of producing l-phenylalanine by fermentation, and bacteria therefor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58188041A JPS6078590A (ja) | 1983-10-07 | 1983-10-07 | 発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6078590A JPS6078590A (ja) | 1985-05-04 |
| JPH0347840B2 true JPH0347840B2 (ja) | 1991-07-22 |
Family
ID=16216637
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58188041A Granted JPS6078590A (ja) | 1983-10-07 | 1983-10-07 | 発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0138526B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6078590A (ja) |
| DE (1) | DE3477938D1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU643752B2 (en) * | 1990-01-31 | 1993-11-25 | Upjohn Company, The | Strain RAL-4, useful for production of small proteins and peptides |
| DE19644566A1 (de) | 1996-10-26 | 1998-04-30 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Mikrobielle Herstellung von Substanzen aus dem aromatischen Stoffwechsel / I |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3660235A (en) * | 1969-08-22 | 1972-05-02 | Ajinomoto Kk | Method for producing phenylalanine by fermentation |
| JPS4867488A (ja) * | 1971-12-20 | 1973-09-14 | ||
| US3909353A (en) * | 1973-03-12 | 1975-09-30 | Ajinomoto Kk | Method of producing L-phenylalanine by fermentation |
| JPS58134994A (ja) * | 1982-02-05 | 1983-08-11 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法 |
-
1983
- 1983-10-07 JP JP58188041A patent/JPS6078590A/ja active Granted
-
1984
- 1984-10-05 DE DE8484306803T patent/DE3477938D1/de not_active Expired
- 1984-10-05 EP EP84306803A patent/EP0138526B1/en not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6078590A (ja) | 1985-05-04 |
| EP0138526A2 (en) | 1985-04-24 |
| EP0138526A3 (en) | 1987-03-04 |
| DE3477938D1 (en) | 1989-06-01 |
| EP0138526B1 (en) | 1989-04-26 |
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