JPH0314437B2 - - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、発酵法によるＬ−トリプトフアン
（以下、トリプトフアンと記す）の製造法に関す
る。 従来トリプトフアンの製造法としては、トリプ
トフアンの前駆物質であるアントラニル酸、イン
ドールあるいは３−インドールピルビン酸よりト
リプトフアンを製造する方法が知られている。 これらの前駆物質を使用する方法に対し、前駆
物質を使用しないで、糖類等を炭素源とし、ブレ
ビバクテリウム属に属し５−メチルトリプトフア
ンなどのトリプトフアンアナログに耐性を有する
変異株又は５−メチルトリプトフアンなどのトリ
プトフアンアナログに耐性を有し、かつフエニル
アラニン又は、およびチロシン要求性を示す変異
株（以下、トリプトフアン生産能を有する微生物
と略す。）を使用して直接発酵法によりトリプト
フアンを生産する方法（特公昭48−18828）が開
発されている。 本発明者らは、さらに効率よくトリプトフアン
を発酵生産する方法を開発することを目的として
研究を重ねた結果、ブレビバクテリウム属及びコ
リネバクテリウム属などのコリネフオルムバクテ
リアに属し、Ｎ，Ｎ−ビス−（ホスホノメチル）
グリシンまたはＮ−（ホスホノメチル）グリシン
に耐性を有しトリプトフアン生産能を有する微生
物が、従来のトリプトフアン生産能を有する微生
物より更に多量のトリプトフアンを生成、蓄積す
ることを見い出した。本発明はこの知見に基づい
て完成されたものである。即ち本発明は、ブレビ
バクテリウム属及びコリネバクテリウム属などの
コリネフオルムバクテリアに属し、Ｎ−（ホスホ
ノメチル）グリシンまたはＮ，Ｎ−ビス−（ホス
ホノメチル）グリシンに耐性を有し、かつＬ−ト
リプトフアン生産能を有する微生物を液体培地中
で好気的に培養し、培地中にＬ−トリプトフアン
を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴と
する発酵法によるＬ−トリプトフアンの製造法に
関する。 コリネホルム・バクテリアは好気性、グラム陽
性桿菌であり、非抗酸性でバーヂース・マニア
ル・オブ・デターミネイテイブバクテリオロジー
第８版599頁（1974）に記載されている。 本発明の方法で使用される変異株はブレビバク
テリウム属及びコリネバクテリウム属などのコリ
ネフオルムバクテリアに属し、Ｎ，Ｎ−ビス−
（ホスホノメチル）グリシンまたはＮ−（ホスホノ
メチル）グリシンに耐性を有し、かつ、Ｌ−トリ
プトフアンを生産する能力を有する微生物であ
り、例えば次のような変異株が使用される。 ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ12043FERM−P7126（５−MTr、５−FTr、
BPMGr） ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ12044FERM−P7127（５−MTr、５−FTr、
PMGr） コリネバクテリウム・グルタミクム
AJ12052FERM−P7128（IMr、BPMGr） ５−MTr：５−メチルトリプトフアン耐性 ５−FTr：５−フルオロトリプトフアン耐性 BPMGr：Ｎ，Ｎ−ビス−（ホスホノメチル）グ
リシン耐性 PMGr：Ｎ−（ホスホノメチル）グリシン耐性 IMr：インドールマイシン耐性 これらの本発明の変異株は、ブレビバクテリウ
ム属及びコリネバクテリウム属などのコリネフオ
ルムバクテリアに属するトリプトフアン生産能を
有する微生物を親株として、これに通常の変異誘
導操作、例えば紫外線、Ｘ線照射あるいはＮ−メ
チル−N1−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
（NGと略す）、亜硝酸等の化学薬剤処理を施し、
変異処理した菌体を親株が生育できないような量
のＮ，Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンまたはＮ
−（ホスホノメチル）グリシンを含有する寒天平
板培地で培養し、平板培地上に生育するコロニー
を分離することによつて得られる。 上記ブレビバクテリウム属及びコリネバクテリ
ウム属などのコリネフオルムバクテリアに属する
トリプトフアン生産能を有する微生物は公知のも
のを使用すればよいが、具体例としては次のよう
な変異株が使用される。 ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ12042FERM−P7125（５−MTr、５−FTr） コリネバクテリウム・グルタミクム
AJ11492FERM−P5294（IMr） 親株としてはこの他コリネフオルムバクテリア
に属する微生物、特にグルタミン酸生産性細菌と
して知られている微生物を用いることができる。
このような親株にＮ，Ｎ−ビス−（ホスホノメチ
ル）グリシン耐性および、またはＮ−（ホスホノ
メチル）グリシン耐性およびトリプトフアン生産
性を付与することによつて目的とするトリプトフ
アン生産菌を誘導することができる。 この場合、Ｎ，Ｎ−ビス−（ホスホノメチル）
グリシン耐性および、又はＮ−（ホスホノメチル）
グリシン耐性をあらかじめ付与した後に従来から
トリプトフアン生産性を付与する性質として知ら
れている５−メチルトリプトフアンなどのトリプ
トフアンアナログに対する耐性又は５−メチルト
リプトフアンなどのトリプトフアンアナログに対
する耐性、およびフエニルアラニン又は、及びチ
ロシン要求性を付与することもできるし、逆にあ
らかじめ従来から知られているトリプトフアン生
産能を付与する性質を付与した後にＮ，Ｎ−ビス
−（ホスホノメチル）グリシン耐性および、又は
Ｎ−（ホスホノメチル）グリシン耐性を付与して
も良い。こような親株の例としては、ブレビバク
テリウム・デバリカタムATCC14020、ブレビバ
クテリウム・ラクトフエルメンタムATCC13869、
ブレビバクテリウム・ロゼウムATCC14066、ブ
レビバクテリウム・フラバムATCC14067、コリ
ネバクテリウム・アセトアシドフライム
ATCC13870、コリネバクテリウム・アセトグル
タミクムATCC15806、コリネバクテリウム・グ
ルタミクムATCC13032等がある。 次に本発明で使用する変異株の変異誘導法およ
び薬剤に対する耐性度を以下の実験例にて示す。 実験例 １ ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
ATCC13869より誘導した５−メチルトリプトフ
アン耐性、５−フルオロトリプトフアン耐性のト
リプトフアン生産菌AJ12042FERM−P7125をイ
ーストブイヨン寒天斜面培地で培養し、生育した
菌体を集めて1/50Ｍリン酸緩衝液（PH7.0）に懸
濁し（108〜109個／mlの菌体を含む）、これにNG
を加え（NG濃度は200μｇ／ml）、室温で30分間
保持した。このようにしてNG処理した菌体を同
リン酸緩衝液で充分洗浄した後、Ｎ，Ｎ−ビス−
（ホスホノメチル）グリシンを含む第１表に示す
最小寒天平板培地に塗布し、31.5℃で４〜10日間
培養した。
（以下、トリプトフアンと記す）の製造法に関す
る。 従来トリプトフアンの製造法としては、トリプ
トフアンの前駆物質であるアントラニル酸、イン
ドールあるいは３−インドールピルビン酸よりト
リプトフアンを製造する方法が知られている。 これらの前駆物質を使用する方法に対し、前駆
物質を使用しないで、糖類等を炭素源とし、ブレ
ビバクテリウム属に属し５−メチルトリプトフア
ンなどのトリプトフアンアナログに耐性を有する
変異株又は５−メチルトリプトフアンなどのトリ
プトフアンアナログに耐性を有し、かつフエニル
アラニン又は、およびチロシン要求性を示す変異
株（以下、トリプトフアン生産能を有する微生物
と略す。）を使用して直接発酵法によりトリプト
フアンを生産する方法（特公昭48−18828）が開
発されている。 本発明者らは、さらに効率よくトリプトフアン
を発酵生産する方法を開発することを目的として
研究を重ねた結果、ブレビバクテリウム属及びコ
リネバクテリウム属などのコリネフオルムバクテ
リアに属し、Ｎ，Ｎ−ビス−（ホスホノメチル）
グリシンまたはＮ−（ホスホノメチル）グリシン
に耐性を有しトリプトフアン生産能を有する微生
物が、従来のトリプトフアン生産能を有する微生
物より更に多量のトリプトフアンを生成、蓄積す
ることを見い出した。本発明はこの知見に基づい
て完成されたものである。即ち本発明は、ブレビ
バクテリウム属及びコリネバクテリウム属などの
コリネフオルムバクテリアに属し、Ｎ−（ホスホ
ノメチル）グリシンまたはＮ，Ｎ−ビス−（ホス
ホノメチル）グリシンに耐性を有し、かつＬ−ト
リプトフアン生産能を有する微生物を液体培地中
で好気的に培養し、培地中にＬ−トリプトフアン
を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴と
する発酵法によるＬ−トリプトフアンの製造法に
関する。 コリネホルム・バクテリアは好気性、グラム陽
性桿菌であり、非抗酸性でバーヂース・マニア
ル・オブ・デターミネイテイブバクテリオロジー
第８版599頁（1974）に記載されている。 本発明の方法で使用される変異株はブレビバク
テリウム属及びコリネバクテリウム属などのコリ
ネフオルムバクテリアに属し、Ｎ，Ｎ−ビス−
（ホスホノメチル）グリシンまたはＮ−（ホスホノ
メチル）グリシンに耐性を有し、かつ、Ｌ−トリ
プトフアンを生産する能力を有する微生物であ
り、例えば次のような変異株が使用される。 ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ12043FERM−P7126（５−MTr、５−FTr、
BPMGr） ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ12044FERM−P7127（５−MTr、５−FTr、
PMGr） コリネバクテリウム・グルタミクム
AJ12052FERM−P7128（IMr、BPMGr） ５−MTr：５−メチルトリプトフアン耐性 ５−FTr：５−フルオロトリプトフアン耐性 BPMGr：Ｎ，Ｎ−ビス−（ホスホノメチル）グ
リシン耐性 PMGr：Ｎ−（ホスホノメチル）グリシン耐性 IMr：インドールマイシン耐性 これらの本発明の変異株は、ブレビバクテリウ
ム属及びコリネバクテリウム属などのコリネフオ
ルムバクテリアに属するトリプトフアン生産能を
有する微生物を親株として、これに通常の変異誘
導操作、例えば紫外線、Ｘ線照射あるいはＮ−メ
チル−N1−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
（NGと略す）、亜硝酸等の化学薬剤処理を施し、
変異処理した菌体を親株が生育できないような量
のＮ，Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンまたはＮ
−（ホスホノメチル）グリシンを含有する寒天平
板培地で培養し、平板培地上に生育するコロニー
を分離することによつて得られる。 上記ブレビバクテリウム属及びコリネバクテリ
ウム属などのコリネフオルムバクテリアに属する
トリプトフアン生産能を有する微生物は公知のも
のを使用すればよいが、具体例としては次のよう
な変異株が使用される。 ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ12042FERM−P7125（５−MTr、５−FTr） コリネバクテリウム・グルタミクム
AJ11492FERM−P5294（IMr） 親株としてはこの他コリネフオルムバクテリア
に属する微生物、特にグルタミン酸生産性細菌と
して知られている微生物を用いることができる。
このような親株にＮ，Ｎ−ビス−（ホスホノメチ
ル）グリシン耐性および、またはＮ−（ホスホノ
メチル）グリシン耐性およびトリプトフアン生産
性を付与することによつて目的とするトリプトフ
アン生産菌を誘導することができる。 この場合、Ｎ，Ｎ−ビス−（ホスホノメチル）
グリシン耐性および、又はＮ−（ホスホノメチル）
グリシン耐性をあらかじめ付与した後に従来から
トリプトフアン生産性を付与する性質として知ら
れている５−メチルトリプトフアンなどのトリプ
トフアンアナログに対する耐性又は５−メチルト
リプトフアンなどのトリプトフアンアナログに対
する耐性、およびフエニルアラニン又は、及びチ
ロシン要求性を付与することもできるし、逆にあ
らかじめ従来から知られているトリプトフアン生
産能を付与する性質を付与した後にＮ，Ｎ−ビス
−（ホスホノメチル）グリシン耐性および、又は
Ｎ−（ホスホノメチル）グリシン耐性を付与して
も良い。こような親株の例としては、ブレビバク
テリウム・デバリカタムATCC14020、ブレビバ
クテリウム・ラクトフエルメンタムATCC13869、
ブレビバクテリウム・ロゼウムATCC14066、ブ
レビバクテリウム・フラバムATCC14067、コリ
ネバクテリウム・アセトアシドフライム
ATCC13870、コリネバクテリウム・アセトグル
タミクムATCC15806、コリネバクテリウム・グ
ルタミクムATCC13032等がある。 次に本発明で使用する変異株の変異誘導法およ
び薬剤に対する耐性度を以下の実験例にて示す。 実験例 １ ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
ATCC13869より誘導した５−メチルトリプトフ
アン耐性、５−フルオロトリプトフアン耐性のト
リプトフアン生産菌AJ12042FERM−P7125をイ
ーストブイヨン寒天斜面培地で培養し、生育した
菌体を集めて1/50Ｍリン酸緩衝液（PH7.0）に懸
濁し（108〜109個／mlの菌体を含む）、これにNG
を加え（NG濃度は200μｇ／ml）、室温で30分間
保持した。このようにしてNG処理した菌体を同
リン酸緩衝液で充分洗浄した後、Ｎ，Ｎ−ビス−
（ホスホノメチル）グリシンを含む第１表に示す
最小寒天平板培地に塗布し、31.5℃で４〜10日間
培養した。
【表】
【表】
寒天平板上に生育したコロニーのうち大きなも
のをＮ，Ｎ−ビス−（ホスホノメチル）グリシン
耐性株として採取した。このようにして得られた
耐性株の内には親株よりトリプトフアン生産能の
優れたもが多く見い出された。この内生産能の最
も高い菌株AJ12043を選んだ。同様の変異操作に
よりAJ12042を親株としてＮ−（ホスホノメチル）
グリシン耐性株AJ12044を誘導した。 また全く同様の方法でコリネバクテリウム・グ
ルタミウムAJ11492を親株としてＮ，Ｎ−ビス−
（ホスホノメチル）グリシン耐性株AJ12052を誘
導した。 次にこのようにして得た変異株のＮ，Ｎ−ビス
−（ホスホノメチル）グリシン耐性度、およびＮ
−（ホスホノメチル）グリシン耐性度の結果を第
２表に示す。
のをＮ，Ｎ−ビス−（ホスホノメチル）グリシン
耐性株として採取した。このようにして得られた
耐性株の内には親株よりトリプトフアン生産能の
優れたもが多く見い出された。この内生産能の最
も高い菌株AJ12043を選んだ。同様の変異操作に
よりAJ12042を親株としてＮ−（ホスホノメチル）
グリシン耐性株AJ12044を誘導した。 また全く同様の方法でコリネバクテリウム・グ
ルタミウムAJ11492を親株としてＮ，Ｎ−ビス−
（ホスホノメチル）グリシン耐性株AJ12052を誘
導した。 次にこのようにして得た変異株のＮ，Ｎ−ビス
−（ホスホノメチル）グリシン耐性度、およびＮ
−（ホスホノメチル）グリシン耐性度の結果を第
２表に示す。
【表】
実験方法は、各変異株の菌体を第１表の最小培
地で良く洗浄した後、小型試験管に入れた第２表
に示す所定量の薬剤を含む最小培地（４ml）に一
定量接種し、31.5℃で24時間振盪培養を行い、培
養液の560nｍに於る吸光度を測定して生育度を
求めた。第２表にはその相対生育値を示した。 本発明で使用する培地は炭素源、窒素源、無機
塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン、
核酸等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培
地が使用される。炭素源としては使用する変異株
利用可能なものであれば良く、例えばグリコー
ス、フラクトース、シユークロース、マルトー
ス、澱粉分解物糖密等の糖類が使用され、その
他、エタノール、プロパノール等のアルコール
類、酢酸、クエン酸等の有機酸類、更に菌株によ
つてノルマルパラフイン等も単独あるいは他の炭
素源と併用して使用される。 窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム
塩、硝酸塩、尿素、アンモニア、肉エキス等無機
あるいは有機の窒素源が使用される。有機微量栄
養素としてはアミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核
酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザ
ミン酸、酵母エキス、蛋白分解物等が使用され、
生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を
使用する場合には要求される栄養素を補添するこ
とが必要である。 培養は好気的条件で行うことが望ましく、培養
期間中培地のPHを５ないし９、温度を20℃ないし
40℃に制御しつつ１日ないし４日間振盪培養又は
通気攪拌培養することによりトリプトフアンが蓄
量培養液中に蓄積される。培養液からトリプトフ
アンを採取する法方は公知の方法に従つて行えば
良く、培養液から菌体を分離除去した後、濃縮晶
析する方法あるいはイオン交換樹脂を用いる方法
等により採取される。 以下、実施例にて説明する。 実施例 １ 下記第３表に示すトリプトフアン生産用培地を
調製し、500ml容振盪フラスコに20ml宛分注し、
120℃で10分間加熱滅菌した。これに別途加熱殺
菌した炭酸カルシウム粉末1.0ｇを補添した。
地で良く洗浄した後、小型試験管に入れた第２表
に示す所定量の薬剤を含む最小培地（４ml）に一
定量接種し、31.5℃で24時間振盪培養を行い、培
養液の560nｍに於る吸光度を測定して生育度を
求めた。第２表にはその相対生育値を示した。 本発明で使用する培地は炭素源、窒素源、無機
塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン、
核酸等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培
地が使用される。炭素源としては使用する変異株
利用可能なものであれば良く、例えばグリコー
ス、フラクトース、シユークロース、マルトー
ス、澱粉分解物糖密等の糖類が使用され、その
他、エタノール、プロパノール等のアルコール
類、酢酸、クエン酸等の有機酸類、更に菌株によ
つてノルマルパラフイン等も単独あるいは他の炭
素源と併用して使用される。 窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム
塩、硝酸塩、尿素、アンモニア、肉エキス等無機
あるいは有機の窒素源が使用される。有機微量栄
養素としてはアミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核
酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザ
ミン酸、酵母エキス、蛋白分解物等が使用され、
生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を
使用する場合には要求される栄養素を補添するこ
とが必要である。 培養は好気的条件で行うことが望ましく、培養
期間中培地のPHを５ないし９、温度を20℃ないし
40℃に制御しつつ１日ないし４日間振盪培養又は
通気攪拌培養することによりトリプトフアンが蓄
量培養液中に蓄積される。培養液からトリプトフ
アンを採取する法方は公知の方法に従つて行えば
良く、培養液から菌体を分離除去した後、濃縮晶
析する方法あるいはイオン交換樹脂を用いる方法
等により採取される。 以下、実施例にて説明する。 実施例 １ 下記第３表に示すトリプトフアン生産用培地を
調製し、500ml容振盪フラスコに20ml宛分注し、
120℃で10分間加熱滅菌した。これに別途加熱殺
菌した炭酸カルシウム粉末1.0ｇを補添した。
【表】
【表】
この培地に第４表に示すトリプトフアン生産菌
を１白金耳接種し、30℃で72時間振盪培養した。
培養液中のトリプトフアン生成量を測定し、その
結果を第４表に示した。
を１白金耳接種し、30℃で72時間振盪培養した。
培養液中のトリプトフアン生成量を測定し、その
結果を第４表に示した。
Claims (1)
- １ ブレビバクテリウム属及びコリネバクテリウ
ム属に属し、Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンま
たはＮ，Ｎ−ビス−（ホスホノメチル）グリシン
に耐性を有し、かつＬ−トリプトフアン生産能を
有する微生物を液体培地中で好気的に培養し、培
地中にＬ−トリプトフアンを生成蓄積せしめ、こ
れを採取することを特徴とする発酵法によるＬ−
トリプトフアンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12197383A JPS6012997A (ja) | 1983-07-05 | 1983-07-05 | 発酵法によるｌ−トリプトフアンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12197383A JPS6012997A (ja) | 1983-07-05 | 1983-07-05 | 発酵法によるｌ−トリプトフアンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6012997A JPS6012997A (ja) | 1985-01-23 |
| JPH0314437B2 true JPH0314437B2 (ja) | 1991-02-26 |
Family
ID=14824440
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12197383A Granted JPS6012997A (ja) | 1983-07-05 | 1983-07-05 | 発酵法によるｌ−トリプトフアンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6012997A (ja) |
-
1983
- 1983-07-05 JP JP12197383A patent/JPS6012997A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6012997A (ja) | 1985-01-23 |
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