JPH0349895B2 - - Google Patents
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- JPH0349895B2 JPH0349895B2 JP628788A JP628788A JPH0349895B2 JP H0349895 B2 JPH0349895 B2 JP H0349895B2 JP 628788 A JP628788 A JP 628788A JP 628788 A JP628788 A JP 628788A JP H0349895 B2 JPH0349895 B2 JP H0349895B2
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Description
本発明は肝炎ワクチンに関する。
Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）はヒトの血清肝炎
を起すウイルスとして知られ、輸血を要する患者
や臨床検査、血漿製剤に従事する者にしばしば感
染し、誠にやつかいな問題を引き起す。今日
HBVはコア抗原（HBcAg）と表面抗原
（HBsAg）及びｅ抗原とから成り立ちコアの中に
DNAポリメラーゼを持つ直径約40nmの大型粒子
であることが知られており〔（WHO Technical
Report SeriesNo.570、Viral hepatitis）1975〕、
またアンチ−HBs（Anti−HBs）が、のHBVの
感染を予防しうることも既に明らかにされてい
る。 従来HBsAgは、これを含む血漿または血漿画
分を密度勾配超遠心分離法によつて、密度1.20−
1.23の画分を得る方法〔（J.L.Gerin，P.V.
HollandおよびR.H.Purcell）：（Journal of
Virology）第７巻、第569−576ページ（1971年）
及び（N.Sukeno，R.Shirachi，R.Shirachi，J.
YamaguchiおよびN.Ishida）：同誌、第９巻、第
182−183ページ（1972年）〕によつて比較的純枠
に得られていた。 更に新しくはアフイニテイ−クロマトグラフイ
ー法が提案されている（白石広行、石田名香雄、
助野典義、日本ウイルス学会抄録昭和48年11月
４、５、６日発表、東京において）。この方法の
概要は次のとおりである。 精製HBsAgを動物、例えば山羊に免疫して得
た山羊抗HBs血清にHBsAgを含まないヒトの血
清を加えて混在するヒト血清成分に対する抗体を
吸収沈殿させ、上清を硫酸アンモニウム沈殿分画
法によつてγ−グロブリン抗HBs（antiHBs）を
得る。臭化シアンで活性化したセフアロース−
4B（Sepharose−4B）とこのantiHBsとをカツプ
リングさせ、この生成物のカラムを準備する。
HBsAgを含むヒト血漿、またはこれから常法に
よつて分画されたα−及びβ−グロブリン画分を
0.01Mリン酸緩衝液に懸濁し、遠心分離し、得ら
れる上清について上記のカラムを用いてクロマト
グラフイーを行う。カラムに結合したHBsAgを
0.4M−グリシン−HCl（PH2.5）緩衝液で溶出し、
溶出援を0.01Mリン酸緩衝液に対して透析し、
HBsAg溶液を得る。この溶液を、前記のカラム
と同様に、ただし、山羊抗HBs血清を用いる代
りに、動物、例えば馬に免疫して得た馬抗ヒト血
漿血清を用いる以外は同様に調製したカラムを用
いてクロマトグラフイーにかけ、微量に混在する
血漿成分をカラムにとどめ精製HBsAg溶液を通
過部分として集める。 HBsAgを構成するサブユニツトについては、
HBsAgを切断することによつて見いだされるペ
プチドを検索し、サブユニツトは種々の分子量の
ポリペプチドを含むことが多くの報告者によつて
報告されている。すなわち、ゲリン（前出）は
HBsAgは、分子量26000、32000及び40000のポリ
ペプチドからなることを報告している。その外、
それが、25000及び32000の分子量のポリペプチド
〔（G.N.Vyas，E.W.Williams，GGB Klausおよ
びH.E.Bond）：（The Journal of Immunology）
第108巻、第1114−1118ページ（1972年）〕、
39000、32000、27000及び22000のポリペプチド並
びに微量の16000及び10000のもの〔（G.R.
Dressmann，F.B.Hollinger，J.R.Suriano，R.S.
Fujioka，J.P.BrunschwigおよびJ.L.Melnik）：
Journal of Virology、第10巻、第469−476ペー
ジ（1972年）〕及び分子量100000のポリペプチド
を主成分とし、65000、36000及び20000のもの
〔C.R.HoWardおよびA.J.Tuckerman）：
（Hepatitis Memoranda）、Ｈ−567、1973年10
月、U.S.A.〕のサブユニツトから構成されるこ
とが報告されている。またN.Sukeno，S.
AikawaおよびN.Ishida：同誌、Ｈ−292、1972
年４月、U.S.A.〕は、HBsAgを尿素の存在にお
いてドデシル硫酸ナトリウムによつて切断するド
デシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動簡易分子量分析法〔Colowick−
Kaplan：Method in Enzymology第26巻、第３
ページ（1972年）〕によつてそれが分子量25000、
28000及び33000のポリペプチドのサブユニツトか
らなることを報告している。 このようなHBsAgのサブユニツトの探索は、
そのサブユニツトと抗原性との関係を明らかに
し、より抗原性の特異部位を取り出すことを目的
としており、ひいては効率的なワクチン、試薬の
原料としての利用、HBsAgの抗原基の研究への
利用を図ろうとするものである。 本発明の共同研究者らも先に、このHBsAgの
抗原性を持つサブユニツトの回収法として、
HBsAgを脱リピド化（delipidation）することの
できるある種の界面活性剤の存在下で加熱処理す
ることによつて、HBsAgとしての抗原性を保持
した分子量約55000の単一のポリペプタイドのみ
のサブユニツトからなる大きさが約18−20nmの
均一な球形粒子（HBAg55）に変換することがで
きることを開示している（特開昭50−160420号）。 本発明者らは、またHBsAgの抗原性を持つ粒
子の回収法として新たな方法を発明し、その方法
によつて新規性状を有する、すなわち等電点PH
5.5−6.5、分子量２−４百万、比重1.80〜1.24、
直径180〜220Åの球形粒子の高い抗原性を保持し
た均一な変性HBsAg粒子を提供することにも成
功している（特開昭53−104724号）。 本発明者らは、これらの成功に引き続き、実際
にワクチンとして用いうるペプタイドを得るため
の研究を続けてきた。 ワクチンとしては精製して得たHBsAg粒子を
そのまま用いることもできるが、その場合感染性
を有したHBウイルスを完全に除去することはほ
とんど不可能で、したがつてホルマリンや加熱処
理によつて混入が予測されるHBウイルスを不活
性化させる方法が検討されている。しかし、不活
性化したかどうかを証明する方法として、現在
HBウイルスに感染する動物として知られている
のはチンパンジーのみであることからチンパンジ
ーを用いたテストが必要である。しかし現状では
世界中のチンパンジーの数も限られ、経済的にも
高価なテストで、将来継続して不都合なくテスト
が行える保証もない。またHBsAg粒子のままで
は、ヒト血清タンパクの完全な除去も極めて困難
で、これらタンパクが不活性化処理を通じて変性
すれば副作用の原因にもなるおそれがある。 これに対し、精製HBsAgより分子量の小さい
サブユニツトと分離してペプタイドを得、これを
ワクチンとすることができれば、粒子の大きい
HBウイルスの混入してくるおそれもなく、
HBsAg粒子においてはなんらかの親和性でこれ
より分離が困難であつた血清タンパク成分も分離
除去が容易である。 HBワクチンとして用いられるペプタイドは、
HBsAgの抗原性を有していることが必須である。
既に説明したように、HBsAg粒子はこれに対す
る化学処理のわずかな相違によつて各種分子量の
サブユニツトに分離されらるが、ワクチンとして
用いる場合にはその安全性と有効性が変動しては
ならず、またワクチン性剤としての安定性が確保
されなけばならないから、一定のポリペプタイド
であることが最も望ましい。 本発明は、このような事柄を背景としてなされ
たものであり、HBsAgの抗原性を有した、分子
量24000〜28000からなる糖ペプタイドを得る方法
を発明し、安全、かつ有効で安定なるHBワクチ
ンを提供することに成功した。 本発明はヒト血漿より精製して得られる
HBsAgを用い、界面活性剤及び還元剤を存在さ
せて加熱することによつて、HBsAgをサブユニ
ツトの糖ペプタイドに切断し、これが再重合する
ことのないように、界面活性剤及び還元剤を存在
させてゲル濾過法によつて分画し、分子量24000
〜28000の糖ペプタイドから成る画分を分別し、
用いた界面活性剤を除去するための吸着補助剤と
糖ペプタイドの溶解性を雑持させるための溶解補
助剤とを用いながら透析して、生理的に受入れら
れる中性付近の溶液として回収した糖ペプタイド
からなるHBワクチン及びその製造方法である。 本発明において用いられるHBsAgとして公知
の方法によつて血漿または血清から純粋に得たも
のを用いることができる。また血漿または血清の
代りにα−及びβ−グロブリンを含む血漿画分、
例えばコーンのアルコール分画法におけるＮ−１
画分もまた原料として好ましい。 本発明に用いられる界面活性剤はドデシル硫酸
ナトリウムなどのアルキル硫酸エステル塩、ある
いはアルキルリン酸エステル塩などから選ばれる
アニオン界面活性剤である。界面活性剤の添加量
は0.1〜10％、好ましくは0.5〜2.0％である。アニ
オン界面活性剤の添加量は多くても差し支えない
濃度が高いと固体化しやすく、したがつて、温度
を高く保つ必要があるので好ましくないことにな
る。 本発明に用いられる還元剤は、２−メルトカプ
トエタノール、ジチオスレイトール、グルタチオ
ンなどから選ばれるチオール型還元剤である。還
元剤の添加量は0.1〜10％、好ましくは0.5〜2.0％
である。 加熱は中性付近の緩衝液中、100〜40℃で２〜
60分間、好ましくは100〜90℃で、１〜５分間あ
るいは70〜50℃で20〜40分間行う。 この処理で生成した糖ペプタイドは、界面活性
剤及び還元剤の存在しない条件では再結合するの
で、アニオン界面活性剤及びチオール基を有した
還元剤の存在している条件においてゲル濾過し、
各種の生成されたペプタイド及び糖ペプタイドを
分子量の大きさによつて分画する。 ゲル濾過は界面活性剤として、例えばドデシル
硫酸ナトリウムを0.05〜２％、好ましくは0.1〜
0.5％、及び還元剤として、例えば２−メルカプ
トエタノール0.05〜２％、好ましくは0.1〜0.5％
存在する中性付近の緩衝液を用いて、15〜45℃、
好ましくは35〜40℃にて行う。 ゲル濾過剤はセルロース、アガロース、交差結
合デキストランなどの高分子多糖体顆粒あるいは
交差結合ポリアクリルアミドであり、商品として
はセフアクリルＳ、セフアデツクス、セフアロー
ス、バイオーゲル（Bio−Gel）Ｐ、バイオーゲ
ルＡなどが例示されるが、分子ふるい作用を有す
る担体であればこれらに限定されない。 ゲル濾過の結果、分子量が約68000、約27000及
び約22000その他から成る幾つかの画分が得られ
るが、これらのうち分子量約24000〜28000から成
る画分を分取する。 このようにして得られた画分は適当な濃度にな
るよう濃縮し、画分に含まれていたアニオン界面
活性剤及びチオール基を有した還元剤を除去し
て、生理的に受け入れられる溶液とするのである
が、界面活性剤及び還元剤は共に完全に除去され
てしまうと糖ペプタイドの溶解性が低下し、その
溶液を長期間保管したいような場合、沈殿を析出
するおそれがあるので、プルロニツク
（Pluronic）F68、ツウイーン（Tween）80など
の非イオン界面活性剤から選ばれた溶解補助剤を
溶液中に保たせるようにするのがよい。 濃縮した後の溶液は、中性付近の緩衝液に対し
て透析することによつて、加熱反応に用いた界面
活性剤と還元剤を除去するが、この際完全な除去
はなかなか困難である。 そこで透析外液にプルロニツクF68、ツウイン
ーン80などの非イオン性界面活性剤から選ばれた
溶解補助剤を0.01〜0.1％含有し、アニオン界面
活性剤及び還元剤を吸着除去するための吸着剤と
してバイオ−ラツド（Bio−Rad）AG−２（商品
名）などの塩基性陰イオン交換吸着剤を加えたも
のを用いる。 このようにして得られた溶液は、中性付近の生
理的に等張で、一定量の糖ペプタイド濃度となる
ように調製し、除菌濾過した後、容器に分注して
HBワクチンの製造を完了する。 HBワクチンの有効性は、これのHBsAg抗原
力価と共にこれをウサギ、モルモツトなどの実験
動物に注射してHBsAgに対する抗体の産生をみ
ることによつて求めることができる。 本発明の糖ペプタイドの理化学的特徴は、実施
例１で得られたものを用いて求めた。 (1) 分子量 本発明の糖ペプタイドを、ドデシル硫酸ナト
リウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に
よつて分子量を測定したところ、約27000であ
つた。またセフアデツクスＧ−100によるゲル
濾過分析では分子量24000〜28000であつた。従
つて分子量を24000〜28000とすることが、最も
信頼度の高い範囲と思われる。 (2) 溶解性 本発明の糖ペプタイドの水に対する溶解性
は、中性付近で約５％以下であり、それ以上で
はタンパク乳濁色を呈するようになる。この溶
解性は塩化ナトリウム溶液、リン酸緩衝液、ト
リス−HCl緩衝液においても大差はないが、
0.01〜0.1％程度のプルロニツクF68あるいはツ
ウイーン80などの非イオン界面活性剤から選ば
れた溶解補助剤の存在で溶解性は高まる。 (3) 紫外線吸収 本発明のペプタイドの水溶液の280nmにおけ
る吸光度から求めた分子吸光係数Ｅ１％ １cm280nm
は35であつた。 (4) 温度安定性 本発明の糖ペプタイドの0.05％のプルロニツ
クF68を含有するPH7.2のリリン酸塩緩衝液を60
℃±0.5℃で１時間加熱しても、そのHBsAgの
抗原性は失われなかつた。 (5) 呈色反応 本発明のペプタイドの水溶液について、ロー
リー・フオリン法で試験した結果、ペプタイド
特有の青色を呈した。また６規定塩酸溶液中、
110℃で22時間加水分解した後ニンヒドリン反
応で試験した結果、α−アミノ酸による紫青色
を呈した。糖類試験のためのα−ナフトール硫
酸反応〔モリツシユ（Molish）反応〕では紫
色を呈しフエノール硫酸反応でかつ色を呈して
共に陽性であつた。 (6) 構成アミノ酸 本発明の糖ペプタイドを常法によつて加水分
解して、アミノ酸自動分析装置を用いて、アミ
ノ酸組成を求めた。結果は第１表のとおりであ
る。
を起すウイルスとして知られ、輸血を要する患者
や臨床検査、血漿製剤に従事する者にしばしば感
染し、誠にやつかいな問題を引き起す。今日
HBVはコア抗原（HBcAg）と表面抗原
（HBsAg）及びｅ抗原とから成り立ちコアの中に
DNAポリメラーゼを持つ直径約40nmの大型粒子
であることが知られており〔（WHO Technical
Report SeriesNo.570、Viral hepatitis）1975〕、
またアンチ−HBs（Anti−HBs）が、のHBVの
感染を予防しうることも既に明らかにされてい
る。 従来HBsAgは、これを含む血漿または血漿画
分を密度勾配超遠心分離法によつて、密度1.20−
1.23の画分を得る方法〔（J.L.Gerin，P.V.
HollandおよびR.H.Purcell）：（Journal of
Virology）第７巻、第569−576ページ（1971年）
及び（N.Sukeno，R.Shirachi，R.Shirachi，J.
YamaguchiおよびN.Ishida）：同誌、第９巻、第
182−183ページ（1972年）〕によつて比較的純枠
に得られていた。 更に新しくはアフイニテイ−クロマトグラフイ
ー法が提案されている（白石広行、石田名香雄、
助野典義、日本ウイルス学会抄録昭和48年11月
４、５、６日発表、東京において）。この方法の
概要は次のとおりである。 精製HBsAgを動物、例えば山羊に免疫して得
た山羊抗HBs血清にHBsAgを含まないヒトの血
清を加えて混在するヒト血清成分に対する抗体を
吸収沈殿させ、上清を硫酸アンモニウム沈殿分画
法によつてγ−グロブリン抗HBs（antiHBs）を
得る。臭化シアンで活性化したセフアロース−
4B（Sepharose−4B）とこのantiHBsとをカツプ
リングさせ、この生成物のカラムを準備する。
HBsAgを含むヒト血漿、またはこれから常法に
よつて分画されたα−及びβ−グロブリン画分を
0.01Mリン酸緩衝液に懸濁し、遠心分離し、得ら
れる上清について上記のカラムを用いてクロマト
グラフイーを行う。カラムに結合したHBsAgを
0.4M−グリシン−HCl（PH2.5）緩衝液で溶出し、
溶出援を0.01Mリン酸緩衝液に対して透析し、
HBsAg溶液を得る。この溶液を、前記のカラム
と同様に、ただし、山羊抗HBs血清を用いる代
りに、動物、例えば馬に免疫して得た馬抗ヒト血
漿血清を用いる以外は同様に調製したカラムを用
いてクロマトグラフイーにかけ、微量に混在する
血漿成分をカラムにとどめ精製HBsAg溶液を通
過部分として集める。 HBsAgを構成するサブユニツトについては、
HBsAgを切断することによつて見いだされるペ
プチドを検索し、サブユニツトは種々の分子量の
ポリペプチドを含むことが多くの報告者によつて
報告されている。すなわち、ゲリン（前出）は
HBsAgは、分子量26000、32000及び40000のポリ
ペプチドからなることを報告している。その外、
それが、25000及び32000の分子量のポリペプチド
〔（G.N.Vyas，E.W.Williams，GGB Klausおよ
びH.E.Bond）：（The Journal of Immunology）
第108巻、第1114−1118ページ（1972年）〕、
39000、32000、27000及び22000のポリペプチド並
びに微量の16000及び10000のもの〔（G.R.
Dressmann，F.B.Hollinger，J.R.Suriano，R.S.
Fujioka，J.P.BrunschwigおよびJ.L.Melnik）：
Journal of Virology、第10巻、第469−476ペー
ジ（1972年）〕及び分子量100000のポリペプチド
を主成分とし、65000、36000及び20000のもの
〔C.R.HoWardおよびA.J.Tuckerman）：
（Hepatitis Memoranda）、Ｈ−567、1973年10
月、U.S.A.〕のサブユニツトから構成されるこ
とが報告されている。またN.Sukeno，S.
AikawaおよびN.Ishida：同誌、Ｈ−292、1972
年４月、U.S.A.〕は、HBsAgを尿素の存在にお
いてドデシル硫酸ナトリウムによつて切断するド
デシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動簡易分子量分析法〔Colowick−
Kaplan：Method in Enzymology第26巻、第３
ページ（1972年）〕によつてそれが分子量25000、
28000及び33000のポリペプチドのサブユニツトか
らなることを報告している。 このようなHBsAgのサブユニツトの探索は、
そのサブユニツトと抗原性との関係を明らかに
し、より抗原性の特異部位を取り出すことを目的
としており、ひいては効率的なワクチン、試薬の
原料としての利用、HBsAgの抗原基の研究への
利用を図ろうとするものである。 本発明の共同研究者らも先に、このHBsAgの
抗原性を持つサブユニツトの回収法として、
HBsAgを脱リピド化（delipidation）することの
できるある種の界面活性剤の存在下で加熱処理す
ることによつて、HBsAgとしての抗原性を保持
した分子量約55000の単一のポリペプタイドのみ
のサブユニツトからなる大きさが約18−20nmの
均一な球形粒子（HBAg55）に変換することがで
きることを開示している（特開昭50−160420号）。 本発明者らは、またHBsAgの抗原性を持つ粒
子の回収法として新たな方法を発明し、その方法
によつて新規性状を有する、すなわち等電点PH
5.5−6.5、分子量２−４百万、比重1.80〜1.24、
直径180〜220Åの球形粒子の高い抗原性を保持し
た均一な変性HBsAg粒子を提供することにも成
功している（特開昭53−104724号）。 本発明者らは、これらの成功に引き続き、実際
にワクチンとして用いうるペプタイドを得るため
の研究を続けてきた。 ワクチンとしては精製して得たHBsAg粒子を
そのまま用いることもできるが、その場合感染性
を有したHBウイルスを完全に除去することはほ
とんど不可能で、したがつてホルマリンや加熱処
理によつて混入が予測されるHBウイルスを不活
性化させる方法が検討されている。しかし、不活
性化したかどうかを証明する方法として、現在
HBウイルスに感染する動物として知られている
のはチンパンジーのみであることからチンパンジ
ーを用いたテストが必要である。しかし現状では
世界中のチンパンジーの数も限られ、経済的にも
高価なテストで、将来継続して不都合なくテスト
が行える保証もない。またHBsAg粒子のままで
は、ヒト血清タンパクの完全な除去も極めて困難
で、これらタンパクが不活性化処理を通じて変性
すれば副作用の原因にもなるおそれがある。 これに対し、精製HBsAgより分子量の小さい
サブユニツトと分離してペプタイドを得、これを
ワクチンとすることができれば、粒子の大きい
HBウイルスの混入してくるおそれもなく、
HBsAg粒子においてはなんらかの親和性でこれ
より分離が困難であつた血清タンパク成分も分離
除去が容易である。 HBワクチンとして用いられるペプタイドは、
HBsAgの抗原性を有していることが必須である。
既に説明したように、HBsAg粒子はこれに対す
る化学処理のわずかな相違によつて各種分子量の
サブユニツトに分離されらるが、ワクチンとして
用いる場合にはその安全性と有効性が変動しては
ならず、またワクチン性剤としての安定性が確保
されなけばならないから、一定のポリペプタイド
であることが最も望ましい。 本発明は、このような事柄を背景としてなされ
たものであり、HBsAgの抗原性を有した、分子
量24000〜28000からなる糖ペプタイドを得る方法
を発明し、安全、かつ有効で安定なるHBワクチ
ンを提供することに成功した。 本発明はヒト血漿より精製して得られる
HBsAgを用い、界面活性剤及び還元剤を存在さ
せて加熱することによつて、HBsAgをサブユニ
ツトの糖ペプタイドに切断し、これが再重合する
ことのないように、界面活性剤及び還元剤を存在
させてゲル濾過法によつて分画し、分子量24000
〜28000の糖ペプタイドから成る画分を分別し、
用いた界面活性剤を除去するための吸着補助剤と
糖ペプタイドの溶解性を雑持させるための溶解補
助剤とを用いながら透析して、生理的に受入れら
れる中性付近の溶液として回収した糖ペプタイド
からなるHBワクチン及びその製造方法である。 本発明において用いられるHBsAgとして公知
の方法によつて血漿または血清から純粋に得たも
のを用いることができる。また血漿または血清の
代りにα−及びβ−グロブリンを含む血漿画分、
例えばコーンのアルコール分画法におけるＮ−１
画分もまた原料として好ましい。 本発明に用いられる界面活性剤はドデシル硫酸
ナトリウムなどのアルキル硫酸エステル塩、ある
いはアルキルリン酸エステル塩などから選ばれる
アニオン界面活性剤である。界面活性剤の添加量
は0.1〜10％、好ましくは0.5〜2.0％である。アニ
オン界面活性剤の添加量は多くても差し支えない
濃度が高いと固体化しやすく、したがつて、温度
を高く保つ必要があるので好ましくないことにな
る。 本発明に用いられる還元剤は、２−メルトカプ
トエタノール、ジチオスレイトール、グルタチオ
ンなどから選ばれるチオール型還元剤である。還
元剤の添加量は0.1〜10％、好ましくは0.5〜2.0％
である。 加熱は中性付近の緩衝液中、100〜40℃で２〜
60分間、好ましくは100〜90℃で、１〜５分間あ
るいは70〜50℃で20〜40分間行う。 この処理で生成した糖ペプタイドは、界面活性
剤及び還元剤の存在しない条件では再結合するの
で、アニオン界面活性剤及びチオール基を有した
還元剤の存在している条件においてゲル濾過し、
各種の生成されたペプタイド及び糖ペプタイドを
分子量の大きさによつて分画する。 ゲル濾過は界面活性剤として、例えばドデシル
硫酸ナトリウムを0.05〜２％、好ましくは0.1〜
0.5％、及び還元剤として、例えば２−メルカプ
トエタノール0.05〜２％、好ましくは0.1〜0.5％
存在する中性付近の緩衝液を用いて、15〜45℃、
好ましくは35〜40℃にて行う。 ゲル濾過剤はセルロース、アガロース、交差結
合デキストランなどの高分子多糖体顆粒あるいは
交差結合ポリアクリルアミドであり、商品として
はセフアクリルＳ、セフアデツクス、セフアロー
ス、バイオーゲル（Bio−Gel）Ｐ、バイオーゲ
ルＡなどが例示されるが、分子ふるい作用を有す
る担体であればこれらに限定されない。 ゲル濾過の結果、分子量が約68000、約27000及
び約22000その他から成る幾つかの画分が得られ
るが、これらのうち分子量約24000〜28000から成
る画分を分取する。 このようにして得られた画分は適当な濃度にな
るよう濃縮し、画分に含まれていたアニオン界面
活性剤及びチオール基を有した還元剤を除去し
て、生理的に受け入れられる溶液とするのである
が、界面活性剤及び還元剤は共に完全に除去され
てしまうと糖ペプタイドの溶解性が低下し、その
溶液を長期間保管したいような場合、沈殿を析出
するおそれがあるので、プルロニツク
（Pluronic）F68、ツウイーン（Tween）80など
の非イオン界面活性剤から選ばれた溶解補助剤を
溶液中に保たせるようにするのがよい。 濃縮した後の溶液は、中性付近の緩衝液に対し
て透析することによつて、加熱反応に用いた界面
活性剤と還元剤を除去するが、この際完全な除去
はなかなか困難である。 そこで透析外液にプルロニツクF68、ツウイン
ーン80などの非イオン性界面活性剤から選ばれた
溶解補助剤を0.01〜0.1％含有し、アニオン界面
活性剤及び還元剤を吸着除去するための吸着剤と
してバイオ−ラツド（Bio−Rad）AG−２（商品
名）などの塩基性陰イオン交換吸着剤を加えたも
のを用いる。 このようにして得られた溶液は、中性付近の生
理的に等張で、一定量の糖ペプタイド濃度となる
ように調製し、除菌濾過した後、容器に分注して
HBワクチンの製造を完了する。 HBワクチンの有効性は、これのHBsAg抗原
力価と共にこれをウサギ、モルモツトなどの実験
動物に注射してHBsAgに対する抗体の産生をみ
ることによつて求めることができる。 本発明の糖ペプタイドの理化学的特徴は、実施
例１で得られたものを用いて求めた。 (1) 分子量 本発明の糖ペプタイドを、ドデシル硫酸ナト
リウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に
よつて分子量を測定したところ、約27000であ
つた。またセフアデツクスＧ−100によるゲル
濾過分析では分子量24000〜28000であつた。従
つて分子量を24000〜28000とすることが、最も
信頼度の高い範囲と思われる。 (2) 溶解性 本発明の糖ペプタイドの水に対する溶解性
は、中性付近で約５％以下であり、それ以上で
はタンパク乳濁色を呈するようになる。この溶
解性は塩化ナトリウム溶液、リン酸緩衝液、ト
リス−HCl緩衝液においても大差はないが、
0.01〜0.1％程度のプルロニツクF68あるいはツ
ウイーン80などの非イオン界面活性剤から選ば
れた溶解補助剤の存在で溶解性は高まる。 (3) 紫外線吸収 本発明のペプタイドの水溶液の280nmにおけ
る吸光度から求めた分子吸光係数Ｅ１％ １cm280nm
は35であつた。 (4) 温度安定性 本発明の糖ペプタイドの0.05％のプルロニツ
クF68を含有するPH7.2のリリン酸塩緩衝液を60
℃±0.5℃で１時間加熱しても、そのHBsAgの
抗原性は失われなかつた。 (5) 呈色反応 本発明のペプタイドの水溶液について、ロー
リー・フオリン法で試験した結果、ペプタイド
特有の青色を呈した。また６規定塩酸溶液中、
110℃で22時間加水分解した後ニンヒドリン反
応で試験した結果、α−アミノ酸による紫青色
を呈した。糖類試験のためのα−ナフトール硫
酸反応〔モリツシユ（Molish）反応〕では紫
色を呈しフエノール硫酸反応でかつ色を呈して
共に陽性であつた。 (6) 構成アミノ酸 本発明の糖ペプタイドを常法によつて加水分
解して、アミノ酸自動分析装置を用いて、アミ
ノ酸組成を求めた。結果は第１表のとおりであ
る。
【表】
精製HBsAgのアミノ酸組成に対する分析結果
も第１表に含めて示してあるが、この結果と本発
明の糖ペプタイドの結果と比べるとき大きな差異
は認められない。このことからこの糖ペプタイド
はHBsAgの主たる部分を構成していることが推
察される。 (7) 糖質部分の構成糖 シアル酸はチオバルビツール酸法〔デイ．ア
ミノフ（D.Aminoff）法〕により、他の糖は、
試料をメタノライシス後トリメチルシリル化
し、ガスクロマト・マスフラグメントグラフイ
ーによつて、本発明の糖ペプタイドに含まれる
糖の組成に関する分析を行つた。結果は第２表
に示したとおりである。
も第１表に含めて示してあるが、この結果と本発
明の糖ペプタイドの結果と比べるとき大きな差異
は認められない。このことからこの糖ペプタイド
はHBsAgの主たる部分を構成していることが推
察される。 (7) 糖質部分の構成糖 シアル酸はチオバルビツール酸法〔デイ．ア
ミノフ（D.Aminoff）法〕により、他の糖は、
試料をメタノライシス後トリメチルシリル化
し、ガスクロマト・マスフラグメントグラフイ
ーによつて、本発明の糖ペプタイドに含まれる
糖の組成に関する分析を行つた。結果は第２表
に示したとおりである。
【表】
【表】
(8) タンパク質と糖質の構成比率
本発明の糖ペプタイドのセミミクロケルダー
ル法によるタンパク質定量結果は87〜90％であ
つた。残る13〜10％の糖質は前記(9)記載の12.5
〜10％とよく一致する。 (9) 色及び形 本発明の糖ペプタイドは、乾燥させたときほ
ぼ白色の不定形粉末となつた。 本発明を更に具体的に説明するために以下実施
例を掲げるが、実施例の記載は本発明をなんら限
定するものではない。 例 １ HBsAg陽性と判定されたヒト・プール血漿１
を、抗HBs抗体グロブリン（ヤギ）結合セフ
アロース4B（anti−HBs globulin coupled
Sepharose 4B）で作成したカラムを通過させ、
HBsAgをカラムに吸着させる。吸着カラムは
0.15M塩化ナトリウム溶液を流して洗浄後、
0.4Mグリシン−HCl緩衝液でHBsAgを溶出させ
る。 溶出液は0.15M塩化ナトリウム溶液で透析した
後、抗ヒト血漿抗体グロブリン（ヤギ）結合セフ
アロース4Bで作成したカラムを通過させ、ヒト
血漿成分をカラムに吸着させる。吸着せずに通過
した溶液は濃縮した後、塩化セシウムによりリニ
ア・グレデイエント超遠心分離を行い、密度1.19
〜1.23の画分を集め、濃縮して２mlとした。 このものは抗ヒト血漿抗体グロブリン（ヤギ）
に対して免疫電気泳動を行つた結果、ヒト血清成
分の存在を認めず、電子顕微鏡観察で直径22nm
の均一なHBsAgの小型球形粒子から成り立つて
おり、水型粒子の存在は認めず、RPHA法によ
る測定で抗原価は１：１，280000であつた。回収
率は52％であつた。この精製HBsAgをHB糖ペ
プタイドワクチン製造の材料とした。 精製HBsAgの溶液に、ドデシル硫酸ナトリウ
ム及び２−メルカプルエタノールをそれぞれ
1w／ｖ％濃度となるように加え、100℃で２分間
加熱処理した後、別にあらかじめ0.1％ドデシル
硫酸ナトリウム、0.1％２−メルカプトエタノー
ルを含有する1/100Ｍリン酸塩緩衝液、PH7.2で平
衡化したセフアクリルＳ−200のカラムを用いて
37℃にてゲル濾過した。そのときの画分像は第１
図に示すとおりである。 第１図のF3画分を集め、再ゲル濾過を行つて
混在しているF4画分成分（F3画分は主としてF2
及びF4画分成分から成り立つている）を完全に
分離した後、0.5％のバイオーラツドAG−２と
0.02％のプルロニツクF68を含有したリン酸緩衝
液で透析する。透析の終つた液は0.02％プルロニ
ツクF68含有0.15M塩化ナトリウム溶液を加えて
希釈して糖ペプタイドが60μｇ／mlとなるように
調製し、除菌濾過後１mlずつ容器に小分けした
HBワクチン製剤510本を得た。 このようにして得たHBワクチンを３匹のウサ
ギに注射した。注射は１回0.5mlを背部皮下及び
皮内に行い、２週間間隔で３回注射した後２週間
後に採血し、その血漿についてPHA法でHBs抗
体価を測定したところ、それぞれ１：256、１：
8000、１：8000のHB抗体産生を認めた。 例 ２ 例１の精製HBsAgを用い、実施例１で用いた
２−メルカプトエタノールの代りにジチオスレイ
トールを用いて60℃、30分間加熱処理した後、別
にあらかじめ0.1％ドデシル硫酸ナトリウム、0.1
％ジチオスレイトール及び0.15M塩化ナトリウム
を含有する1/100Ｍリン酸塩緩衝液、PH7.2で平衡
化したセフアデツクスG200のカラムを用いて37
℃にてゲル濾過した。実施例１と同様にしてF3
画分を集め、再ゲル濾過を行つて混在している
F4画分成分を完全に分離してから実施例１と同
様に操作してHBワクチン製剤120本を得た。 このものの２匹のウサギに対するHBs抗体産
生は、それぞれ１：1.024及び4.096であつた。 例 ３ 実施例１において、F3画分を集め、再ゲル濾
過して混在しているF4画分成分を完全に分離し
たものにつき0.02％のツウイーン80を含有した
0.15M塩化ナトリウム溶液で透析した後同じ液で
希釈して糖ペプタイドが50μｇ／mlとなるように
調製した。この液に0.1％の水酸化アルミニウム
を加え、除菌濾過後１mlずつ容器に小分けした
HBワクチン製剤590本を得た。 このようにして得たHBワクチンを３匹のモル
モツトに注射した。注射は実施例１と同様にして
行つた。結果はそれぞれのモルモツトに１：512、
１：32000、１：32000のHBs抗体産生を認めた。
ル法によるタンパク質定量結果は87〜90％であ
つた。残る13〜10％の糖質は前記(9)記載の12.5
〜10％とよく一致する。 (9) 色及び形 本発明の糖ペプタイドは、乾燥させたときほ
ぼ白色の不定形粉末となつた。 本発明を更に具体的に説明するために以下実施
例を掲げるが、実施例の記載は本発明をなんら限
定するものではない。 例 １ HBsAg陽性と判定されたヒト・プール血漿１
を、抗HBs抗体グロブリン（ヤギ）結合セフ
アロース4B（anti−HBs globulin coupled
Sepharose 4B）で作成したカラムを通過させ、
HBsAgをカラムに吸着させる。吸着カラムは
0.15M塩化ナトリウム溶液を流して洗浄後、
0.4Mグリシン−HCl緩衝液でHBsAgを溶出させ
る。 溶出液は0.15M塩化ナトリウム溶液で透析した
後、抗ヒト血漿抗体グロブリン（ヤギ）結合セフ
アロース4Bで作成したカラムを通過させ、ヒト
血漿成分をカラムに吸着させる。吸着せずに通過
した溶液は濃縮した後、塩化セシウムによりリニ
ア・グレデイエント超遠心分離を行い、密度1.19
〜1.23の画分を集め、濃縮して２mlとした。 このものは抗ヒト血漿抗体グロブリン（ヤギ）
に対して免疫電気泳動を行つた結果、ヒト血清成
分の存在を認めず、電子顕微鏡観察で直径22nm
の均一なHBsAgの小型球形粒子から成り立つて
おり、水型粒子の存在は認めず、RPHA法によ
る測定で抗原価は１：１，280000であつた。回収
率は52％であつた。この精製HBsAgをHB糖ペ
プタイドワクチン製造の材料とした。 精製HBsAgの溶液に、ドデシル硫酸ナトリウ
ム及び２−メルカプルエタノールをそれぞれ
1w／ｖ％濃度となるように加え、100℃で２分間
加熱処理した後、別にあらかじめ0.1％ドデシル
硫酸ナトリウム、0.1％２−メルカプトエタノー
ルを含有する1/100Ｍリン酸塩緩衝液、PH7.2で平
衡化したセフアクリルＳ−200のカラムを用いて
37℃にてゲル濾過した。そのときの画分像は第１
図に示すとおりである。 第１図のF3画分を集め、再ゲル濾過を行つて
混在しているF4画分成分（F3画分は主としてF2
及びF4画分成分から成り立つている）を完全に
分離した後、0.5％のバイオーラツドAG−２と
0.02％のプルロニツクF68を含有したリン酸緩衝
液で透析する。透析の終つた液は0.02％プルロニ
ツクF68含有0.15M塩化ナトリウム溶液を加えて
希釈して糖ペプタイドが60μｇ／mlとなるように
調製し、除菌濾過後１mlずつ容器に小分けした
HBワクチン製剤510本を得た。 このようにして得たHBワクチンを３匹のウサ
ギに注射した。注射は１回0.5mlを背部皮下及び
皮内に行い、２週間間隔で３回注射した後２週間
後に採血し、その血漿についてPHA法でHBs抗
体価を測定したところ、それぞれ１：256、１：
8000、１：8000のHB抗体産生を認めた。 例 ２ 例１の精製HBsAgを用い、実施例１で用いた
２−メルカプトエタノールの代りにジチオスレイ
トールを用いて60℃、30分間加熱処理した後、別
にあらかじめ0.1％ドデシル硫酸ナトリウム、0.1
％ジチオスレイトール及び0.15M塩化ナトリウム
を含有する1/100Ｍリン酸塩緩衝液、PH7.2で平衡
化したセフアデツクスG200のカラムを用いて37
℃にてゲル濾過した。実施例１と同様にしてF3
画分を集め、再ゲル濾過を行つて混在している
F4画分成分を完全に分離してから実施例１と同
様に操作してHBワクチン製剤120本を得た。 このものの２匹のウサギに対するHBs抗体産
生は、それぞれ１：1.024及び4.096であつた。 例 ３ 実施例１において、F3画分を集め、再ゲル濾
過して混在しているF4画分成分を完全に分離し
たものにつき0.02％のツウイーン80を含有した
0.15M塩化ナトリウム溶液で透析した後同じ液で
希釈して糖ペプタイドが50μｇ／mlとなるように
調製した。この液に0.1％の水酸化アルミニウム
を加え、除菌濾過後１mlずつ容器に小分けした
HBワクチン製剤590本を得た。 このようにして得たHBワクチンを３匹のモル
モツトに注射した。注射は実施例１と同様にして
行つた。結果はそれぞれのモルモツトに１：512、
１：32000、１：32000のHBs抗体産生を認めた。
第１図は、実施例１においてゲル濾過して得た
画分の画分像グラフである。 図中、F1、F2、F3、F4及びF5それぞれの画分
を示す。
画分の画分像グラフである。 図中、F1、F2、F3、F4及びF5それぞれの画分
を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 次の理化学的性質を有するHBsAg由来の糖
ペプタイド： (a) 分子量：SDS−ポリアクリルアミドによる電
気泳動分析で24000〜28000， (b) 溶解性：水に対する溶解性は、中性付近にお
いて約15％であり、それ以上ではタンパク乳濁
色を呈する， (c) 紫外線吸収：280nmにおける分子吸光係数
（Ｅ１％ １cm）は35である， (d)温度安定性：水溶液を60℃±0.5℃で１時間加
熱してもその抗原性は失われない， (e) 呈色反応：ローリー・フオリン反応によりペ
プタイドの、また加水分解後ニンヒドリン反応
により、アミノ酸の呈色反応を示し、またα−
ナフトール硫酸反応（モリシユ反応）及びフエ
ノール硫酸反応で、それぞれ紫色とかつ色の糖
類の呈色反応を示す， (f) 構成アミノ酸：アスパラギン酸、スレオニ
ン、セリン、グルタミン酸、プロリン、グリシ
ン、アラニン、システイン、バリン、メチオニ
ン、イソロイシン、ロイシン、チロジン、フエ
ニルアラニン、リジン、ヒスチジン、アルギニ
ン， (g) 糖質部分の構成糖： マンノース（2.4〜3.5％）、ガラクトース
（1.2〜3.2％）、グルコース（2.8〜4.4％）、Ｎ−
アセチルグルコサミン（2.2〜2.7％）、シアル
酸（0.2％）で、フコースとＮ−アセチルガラ
クトサミンは含有しない， (h) タンパク質と糖質の構成比率： 重量比で糖質10〜13％，および (i) 色及び形；ほぼ白色、不定形である，Ｂ型肝
炎ワクチン。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP628788A JPH01279841A (ja) | 1988-01-14 | 1988-01-14 | 肝炎ワクチン |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP628788A JPH01279841A (ja) | 1988-01-14 | 1988-01-14 | 肝炎ワクチン |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4405979A Division JPS55136234A (en) | 1979-04-11 | 1979-04-11 | Hb glycopeptide vaccine |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01279841A JPH01279841A (ja) | 1989-11-10 |
| JPH0349895B2 true JPH0349895B2 (ja) | 1991-07-31 |
Family
ID=11634174
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP628788A Granted JPH01279841A (ja) | 1988-01-14 | 1988-01-14 | 肝炎ワクチン |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01279841A (ja) |
-
1988
- 1988-01-14 JP JP628788A patent/JPH01279841A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01279841A (ja) | 1989-11-10 |
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