NO306563B1

NO306563B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av et nytt t-PA-derivat, dettes DNA-sekvens og ekspresjonsplasmid

Info

Publication number: NO306563B1
Application number: NO904211A
Authority: NO
Inventors: Anne Stern; Ulrich Kohnert; Rainer Rudolph; Stephan Fischer; Ulrich Martin
Original assignee: Roche Diagnostics Gmbh
Priority date: 1989-02-07
Filing date: 1990-09-27
Publication date: 1999-11-22
Also published as: PT93082B; HK153396A; NZ232337A; DK0382174T3; LU90025I2; FI100244B; JPH03500724A; IL93280A; US5223256A; NL970008I2; EP0382174B1; ES2031804T3; ZA90861B; RU2107094C1; CA2025900A1; NO2000002I1; UA27111A1; DE3903581A1; CZ281836B6; PT93082A

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for fremstilling av et nytt t-PA-derivat, en DNA-sekvens som koder for det nye t-PA-derivatet samt ekspresjonsplasmider som inneholder en DNA-sekvens kodende for t-PA-derivatet.

Koagulert blod inneholder som hovedkomponenter protein-matrikspolymeren fibrin. Fibrin blir løst opp gjénnom et fibrinolytisk system under fysiologiske betingelser i en reaksjonskaskade som ligner blodkoagulering. Den sentrale reaksjonen er her aktivering av plasminogen til plasmin, som f.eks. blir tilveiebragt gjennom vevsplasminogenaktivator t-PA (vevstypeplasminogen-aktivator). Plasmin oppløser fibrin som er hovedkomponenten av proteinmatriksen til koagulert blod. Den enzymatiske aktiviteten til naturlig eller gen-teknologisk isolert t-PA fra eukaryoter, er i fravær av fibrin eller fibrinogen-spaltingsprodukter meget lav, men kan derimot ved nærvær av disse proteinene økes betydelig, dvs. med mere enn faktor 10.

t-PA blir i blodet spaltet av tilstedeværende proteaser til en A- og en B-kjede. Delkjedene blir forbundet over en cysteinbro. Stimulerbarheten av aktiviteten til t-PA er en avgjørende fordel i forhold til andre kjente plasminogen-aktivatorer, som for eksempel urokinase eller streptokinase [jfr. f.eks. M. Hoylaerts et al., J. Biol. Chem. 257 (1982), 2912-2919; W. Nieuwenhuizen et al., Biochem. Biophys, Acta, 755 (1983), 531-533].

Virkningsmekanismen til t-PA in vivo er for eksempel beskrevet i Korniger og Coilen, Tromb. Håmostasis 46 (1981), 561-565. De fokuserte aktiviteter på fibrinoverflaten til enzymet, gjør det til et egnet middel for bekjempelse av patologiske venetilstoppelser (f.eks. ved hjerteinfarkt), som for det meste kan bli bekreftet gjennom kliniske forsøk [Coilen et al., Circulation 70 (1984), 1012; Circulation 73

(1986), 511].

Ulempen til t-PA må derimot ansees å være den raske reaksjonen av plasmakonsentrasjonen (Clearance). Dette fører til at det er nødvendig med en relativ stor mengde t-PA for å oppnå en effektiv lysering av tromber in vivo. De høye behandlingsdosene har videre bivirkninger som f.eks. blød-ninger .

I EP 0 196 920 er et naturlig nedbrytningsprodukt av t-PA beskrevet, som bare inneholder Kringel II- og protease-domenene og dennes N-terminus som begynner med Alanin 160 (tellemåten til Pennica et al., i Nature 301 (1983) 214-221 angitte aminosyresekvens).

Clearance-hastigheten til dette t-PA-nedbrytningsproduktet er derimot ikke vesentlig forskjellig fra naturlig t-PA. Først gjennom en kjemisk modifikasjon av det katalytiske området gjennom anbringelse av en blokkerende gruppe, kan man her oppnå en forbedring.

Gjenstand for oppfinnelsen er dermed en fremgangsmåte for fremstilling av et vevs-plasminogenaktivator-(t-PA)-derivat, som ikke er glykosylert og som består av følgende aminosyresekvens : som kan være forlenget ved aminoenden med M, kjennetegnet ved at man innfører i egnede vertsceller et ekspresjonsplasmid, som inneholder DNA-sekvens:

eller en i rammen av degenerasjon til den genetiske koden derav forskjellige DNA-sekvenser, som koder for t-PA-derivatet, og isolerer ekspresjonsproduktet fra kulturmediet eller etter oppslemming av vertscellene.

Det ble overraskende fastslått at delesjon av de ellers, i det native t-PA tilstedeværende området, ikke har noen inn-flytelse på den trombolytiske virksomheten til proteinet og at den fibrinavhengige stimulerbarheten til muteinene er sammenlignbare med nativt t-PA. Det ble til og med fastslått at t-PA-derivatet fremstilt ifølge oppfinnelsen mangler fibrinbindings-egenskapen, men som til tross for dette overraskende oppviser en in vivo trombolyse-effektivitet som i forhold til nativt t-PA er forbedret. Like overraskende er den kjennsgjerning at ved tilsetning av en trombolytisk tilstrekkelig virksom dose av derivatet, ble den systemiske fibrinolysen nesten upåvirket. Det har dermed blitt vist at t-PA-derivatet oppviser typiske egenskaper når det gjelder fibrinspesifisitet under fysiologiske betingelser som nativt t-PA. Dette resultatet ble oppnådd fra farmakologiske forsøk av t-PA-derivatet fremstilt ifølge oppfinnelsen (se eksempel 6 og 7). Proteinet viser dessuten en meget høy spesifikk aktivitet. Ved anvendelse av den beskrevne renatureringen ble aktiviteter på 500 til 800 kU/mg bestemt.

Oppfinnelsen omfatter også DNA-sekvens kjennetegnet ved at den koder for det tidligere omtalte t-PA-derivatet og inneholder følgende sekvens:

DNA-sekvensen tjener for ekspresjon av t-PA-derivatet når den er tilstede på et ekspresjonsplasmid. Ekspresjonsplasmidet ifølge oppfinnelsen er kjennetegnet ved at det inneholder den ovenfor viste DNA-sekvens, eller en i rammen av degenerasjon av den genetiske koden derifra forskjellige DNA-sekvens, som koder for et protein som tidligere omtalt.

Ekspresjonsplasmidet inneholder fortrinnsvis ved siden av sekvensen som koder for t-PA-derivatet, ytterligere enda en regulerbar promoterstruktur (f.eks. tac), en effektiv terminator (f.eks. f d), en seleksjonsmarkør (f.eks. P-laktamasegen) og et replikasjonsorigo.

Ifølge en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen, er ekspersjonsplasmidet plasmid pA27.3. Fremstilling av dette plasmidet er beskrevet i eksempel 1, og inneholder en DNA-sekvens som koder for t-PA-derivatet ifølge oppfinnelsen.

Valg av plasmid hvor den kodende DNA-sekvensen av t-PA-derivatet fremstilt ifølge oppfinnelsen kan bli skutt inn i, er avhengig av vertscellen som senere blir anvendt til ekspresjon av derivatet. Egnede plasmider samt minimalkravene som blir krevd av et slikt plasmid (f.eks. replikasjonsopp-rinnelse, restriksjonsspaltningsseter) er kjent for fagfolk. Innenfor rammen av oppfinnelsen kan derimot, i steden for et plasmid, også anvendes et kosmid, den replikative, dobbelt-trådete formen av fag (X, M13), og andre for fagfolk kjente vektorer. Metoden for rettet mutagenese (sete-rettet mutagenese) er beskrevet av Morinaga et al., Biotechnology 21,

(1984) 634, og blir utført vesentlig som beskrevet deri.

Det er foretrukket at det anvendes prokaryote celler som vertsceller for fremstilling av t-PA-derivatene. Her er det videre spesielt foretrukket at man først separerer de heri dannede såkalte "inclusion bodies" (uoppløselige protein-aggregater) fra løselige cellepartikler, oppløser t-PA-inneholdende inclusion bodies gjennom behandling med guanidinhydroklorid under reduserte betingelser, derivatiserer tilslutt med GSSG og til slutt denaturer t-PA-derivatet gjennom tilsetning av L-arginin og GSH. Nøye forskrifter for aktivering av t-PA fra "inclusion bodies" er beskrevet i EP-A 0219 874 og EP-A 0 241 022. Ytterligere andre fremgangsmåter for isolering av det aktive proteinet fra "inclusion bodies" kan også anvendes ifølge oppfinnelsen.

For rensing av K2P arbeider man fortrinnsvis i nærvær av L-arginin, spesielt i en konsentrasjon på 10 til 1000 mmol/1.

Separeringen av fremmed protein gjennom affinitetskromatografi, kan gjennomføres over en ETI (Eritrina Trypsin Inhibitor) absorpsjonskolonne. Her er ETI fiksert på et bærermateriale (adsorber), som for eksempel Sepharose. Rensing over en ETI-adsorberingskolonne har den fordelen at ETI-adsorber-kolonne-materialet kan bli anbragt direkte fra den konsentrerte denatureringstilsetningen, sogar i nærvær av høyere argininkonsentrasjoner som 0,8 mol/l arginin. En aggregasjon av K2P, som kan oppstå ved lave argininkonsentrasjoner under 10 mmol/1, blir dermed unngått. Rensing av K2P foregår spesielt over en ETI-adsorbsjonskolonne i nærvær av 0,6 til 0,8 mol/l arginin. Den K2P-inneholdende oppløsningen har her en pH på over 7, spesielt foretrukket på 7,5 til 8,6.

Eluering fra ETI-kolonnen kan foregå gjennom pH-reduksjon samt i nærvær, men også i fravær, av arginin under betingelser som muliggjør en god oppløselighet av K2P. pH-verdien ved elueringen ligger fortrinnsvis i det sure området, spesielt foretrukket i området 3 til 5,5.

K2P fremstilt på denne måten, innehar en spesifikk t-PA-aktivitet på 550.000 ± 200.000 IU/mg ved en renhet på over 95%, fortrinnsvis på over 99%.

Et t-PA-derivat blir dermed ifølge oppfinnelsen fremstilt som oppviser en tydelig forlenget plasma-halveringstid på grunn av redusert Clearance-hastighet. Derivatet mister derimot ikke noen av sine egenskaper som legemiddel for arteriell trombolyse og venøs koagulasjon. Derimot kan for trombolytisk terapi med K2P den nødvendige dosen bli redusert til minst en fjerdedel i forhold til nativt t-PA. Ved like virksomme doser av K2P og nativt t-PA, blir koagulasjonssys-temet mindre påvirket av K2P enn av nativt t-PA, og blød-ningstiden blir ikke signifikant forlenget i forhold til nativt t-PA, slik at blødningskomplikasjoner ved terapi med K2P muligens blir mindre.

t-PA-derivatet fremstilt ifølge oppfinnelsen, er dermed spesielt egnet for anvendelse i et legemiddel. Ved anvendelse av t-PA-derivatet i legemiddel, er det for oppnåelse av lik virksomhet bare nødvendig med tydelig redusert administrer-ingsdose ved anvendelse av nativt, i CHO-produsert t-PA.

Følgende eksempler forklarer oppfinnelsen i forbindelse med f igurene. Fig. 1 viser skjematisk fremstilling av plasmid pA27,3; Fig. 2 viser sammenligning av fibrinbinding til t-PA-derivatet ifølge oppfinnelsen (kurve 1) med CHO-celler som uttrykker nativt t-PA (tokjedet t-PA fra CHO-celler, spaltet ved fysiologisk spaltningssete Arg 275-Ile276, kurve 2) og enkjedet t-PA fra CHO-celler (kurve 3).

Fig. 3 og

fig. 4 viser diagram for pharmakokinetikk av t-PA-aktiviteten til t-PA-derivatet ifølge oppfinnelsen, sammenlignet med et kommersielt oppnåelig t-PA-preparat (Actilyse<R>); (kurve 1: K2P, dose 200.000 U (kg = 0,25 mg/kg; I.V. Inf. i løpet av 30 min.; antall undersøkte dyr (kaniner): 4;

kurve 2: Actilyse<R>, dose 200.000 U/kg; I.V. Inf. i løpet av 30 min., antall undersøkte dyr (kaniner): 6).

Fig. 5 Viser dosevirkningskurven (for kaniner) av trombolyse av t-PA-derivatet ifølge oppfinnelsen, sammenlignet med (vist er middelverdien + SEM, 1 kU = 1000 IU; kurve 1: K2P; kurve 2:

Actilyse<R>).

Fig. 6 viser tidsmessig forløp av simplatblødningstid (BT) før og etter i.v. Bolusinfeksjon av Placebo eller stigende doser Actilyse<R>i narkosebehandlede hunder. Fig. 7 viser tidsmessig forløp av simplat-blødningstid (BT) før og etter i.v. Bolusinfeksjon av Placebo eller økende doser K2P i narkosebehandlede hunder.

EKSEMPEL 1

Konstruksjon av plasmid pA27. 3

Utgangsplasmid pREM7685-, beskrevet i EP-A 0 242 836, inneholder følgende komponenter: tac-promoter, lac-operator-region med et ATG-startkodon, kodende region for t-PA-derivatet FK2P, transkripsjonsterminator fra pKK223-3, et P-laktamasegen, et kanamycinresistensgen og origo til plasmid pACYC177, et plasmid som foreligger i cellen i lavt kopi-antall. Sekvensen til t-PA-derivatet FK2P settes sammen fra nukleotidene 190-336 (F-domene), 715-1809 (K2-domene, prote-ase, redusert andel 3'UT) og et ATG-startkodon. Nukleotid-posisjonene blir angitt som sekvensen beskrevet av Pennica et al., Nature 301 (1983) 214-221.

For delesjon av F-domenen fra FK2P-konstruksjonen i plasmid pREM7685 ble metoden til Morinaga et al., Biotechnology 21

(1984), 634, vesentlig anvendt. For heterodupleksdannelse ble to fragmenter isolert fra pREM7685. Fragment A: pREM7685 ble spaltet med restriksjonsenzym EcoRI. Spaltningsproduktene ble separert gelelektroforetisk og det største EcoRI-fragmentet ble eluert fra gelen. Fragment B: PLasmid pREM7685 ble linearisert med restriksjonsenzym Xhol. Det lineariserte plasmidet ble likeledes oppnådd etter preparativ gelelektro- forese. For imitagenesen "ble følgende oligomikleotid fremstilt syntetisk:

For heterodupleksdannelse ble fragment A, fragment B (hver 450 fmol) og oligonukleotidet (75 pMol) dannet i nærvær av 50 mmol/1 NaCl, 10 mmol/1 Tris-HCl, pH 7,5 og 10 mmol/1 MgS04inkubert først i tre minutter ved 100°C og deretter øyeblik-kelig overført på is. Renaturering av DNA foregår i 30 minutter ved 60°C. For repareringssyntese ble følgende tilføyet heterodupleksen: Deoksynukleotidtrifosfat (0,25 mmol/1) ATP (1 mmol/1), NaCl (100 mmol/1), Tris-HCl, pH 7,5 (6,5 mmol/1), MgCl2(8 mmol/1) e-merkaptoetanol (1 mmol/1), Klenow-fragmentet til DNA-poly-merase fra E. coli (0,125 U/pl tilsats) og T4-ligase (0,1 U/pl tilsats). Repareringssyntesen foregår i 4 timer ved 16°C. Til slutt ble denne tilsatsen i E. coli-celler (RM82, DSM 3689) transformert med et lac Il-plasmid og transformant-ene selektert ved tilsetning av 25 pg/ml kanamycin til nær-ingsmediet.

Ved hjelp av kolonihybridiseringsteknikken under anvendelse av ovennevnte mutagenese-oligonukleotider som prober, kunne kloner inneholdende plasmid pA27,3 som kodet for t-PA-derivatet K2P ifølge oppfinnelsen, bli valgt ut. Dette plasmidet skiller seg fra utgangsplasmid pREM7685 bl.a. gjennom mangel på et Pst-I- hhv. et Sspl-spaltningssete. Begge disse spalt-ningssetene er innbefattet i hvert område av utgangsplasmide-ne som koder for F-domenen. Konstruksjon av plasmid pA27.3 er fremstilt skjematisk i fig. 1.

EKSEMPEL 2

Preparering av aktivt t- PA- derivat K2P fra E. coli Cellelysering og preparering av inclusion bodies (IB's)

1,6 kg cellefuktemasse (E. coli, DSM 3689, transformert med plasmid pA27.3) ble suspendert i 10 1 0,1 mol/l Tris-HCl. 20 mmol/1 EDTA, pH 6,5. 4°C. Til dette ble 2,5 g lysozym tilsatt og inkubert i 30 minutter ved 4°C; til slutt ble en fullstendig celleåpning ved hjelp av høytrykksdispersjon gjennom-ført. I åpningsoppløsning ble 5 1 0,1 mol/l Tris-HCl, 20 mmol/1 EDTA, b% Triton X100 og 1,5 mol/l NaCl; pH 6,5 tilblandet og ytterligere inkubert i 30 minutter ved 4°C. Deretter fulgte separering av uløselige bestanddeler (IB's) ved sentrifugering med en Padberg-sentrifuge.

Pelleten ble suspendert i 10 1 0,1 mol/l Tris-HCl, 20 mmol/1 EDTA, pH 6,5, inkubert i 30 minutter ved 4°C og IB-preparatet ble isolert ved sentrifugering.

Solubilisering av IB' s.

100 g IB<*>s (Fuktvekt) ble suspendert i 450 ml 0,1 mol/l Tris-HCl, 6 mol/l guanidin HC1, 0,2 mol/l DTE (1,4 ditioerytrit), 1 mmol/1 EDTA, pH 8,6 og rørt i 2,5 timer ved 20°C.

Etter innstilling av pH-verdien til pH 3 med HC1 ( 25%) ble en dialyse mot 10 mmol/1 HC1 (3 x 50 1, 24 timer, 4°C) gj ennomført.

Derivatisering

Guanidin-HCl (fast) ble tilveiebragt, slik at etter sluttfor-tynning av ovennevnte dialysat med 10 mmol/1 HC1 konsentrasjon til guanidin-HCl utgjorde 6 mol/l.

Blandingen ble for-inkubert ved 25° C i 1,5 timer, tilslutt ble oksidert glutation (GSSG) innstilt på 0,1 mol/l og Tris-HCl til 0,05 mol/l og pH-verdien titrert med 5 mol/l NaOH til pH 9,3. Blandingen ble rørt i 3,5 timer ved 25°C.

Etter innstilling av pH-verdien til pH 3 med HC1 (25%) ble en dialyse gjennomført mot 10 mmol/1 HC1 (3 x 100 1, 48 timer, 4°C). Etter dialyse ble det sentrifugert og den klare super-natanten ble videre bearbeidet.

Renaturering

Et 10 1 reaksjonskar ble fylt med 0,1 mol/l Tris-HCl, 0,8 mol/l L-arginin, 2 mmol/1 GSH [Genthation, (redusert form)], 1 mmol/1 EDTA, pH 8,5. Renatureringen ble bevirket ved tre ganger tilsetning av 100 ml derivat (blandet disulfid) ved 20°C i løpet av 24 timer.

Etter renaturering oppnår man et materiale med en spesifikk aktivitet på 1500 til 10.000 IU/mg (bestemmelse jfr. eksempel 4b). Enheten IU er en enhet på aktivitet ifølge definisjonen til WHO, National Institute for Biological Standards and Control.

Konsentrering av renatureringsblandingene

Renatureringsblandingen kan etter behov bli konsentrert over en hemodialysator.

EKSEMPEL 3

Rensing av K2P fra E. coli

1. Rensing av K2P fra E. coli over affinitetskromatografi på ETI-Sepharose etter forhåndsutført konsentrering.

a) Eluering med sitronsyre

Renatureringsblandingen ble konsentrert over en

memodialysator (Asahi AM 300) 1:23, og avsluttet med 0,5 mol/l NaCl. En ETI (Erythrina-Trypsin-Inhibitor)-Sepharose-kolonne (V = 50 ml) ekvilibrert med 0,1 mol/l Tris-HCl, pH 7,5, 0,8 mol/l arginin, 0,5 mol/l NaCl ble belastet med 550 ml konsentrat fra reoksydasjonsblandingene (10 søylevolum/1, 10 SV/t) og vasket så lenge med ekvilibreringsbufferen til absorpsjon av eluatene ved 280 nm oppnådde nullverdien til

buffrene. Eluering av bundet materiale foregår med 20 mmol/1 sitronsyre, pH 3,2.

b) Eluering med 0, 3 mol/ l Arg, pH 4. 5. Renatureringsblandingen ble konsentrert som beskrevet i eksempel 3.1.a). En med 0,1 mol/l Tris-HCl, pH 7,5, 0,8 mol/l arginin, 0,5 mol/l NaCl ekvilibrert ETI-Sepharose-kolonne (25 ml) ble belastet med 800 ml konsentrat (12 SV/t) og vasket med ekvilibreringsbufferen til ekstinksjonen til. eluatene ved 280 nm nådde ekstinksjonen til bufferen. Det bundede materialet ble eluert med 0,3 mol/l arginin, pH 4,5. 2. Rensing av K2P fra E. coli over affinitetskromatografi på ETI-Sepharose uten på forhånd konsentrering.

En med 0,1 mol/l Tris-HCl, pH 7,5, 0,8 mol/l arginin, 0,5 mol/l NaCl ekvilibrert ETI-Sepharose-kolonne (V = 10 ml) ble belastet med 12 1 reoksidasjonsblanding og vasket med ekvilibreringsbufferen helt til ekstinksjonen av eluatene ved 280 nm nådde ekstinksjonen til bufferen. Eluering av bundet materiale foregår med 0,8 mol/l arginin, pH 5.

EKSEMPEL 4

Karakterisering av renset K2P fra E. coli

a) Proteinkjemisk karakterisering - SDS-Page og revers fase HPLC

Homogeniteten til materialet renset over affinitetskromatografi på ETI-Sepharose, ble vist gjennom SDS-PAGE og gjennom revers fase HPLC (RP-HPLC). Fra den relative vandringen oppnås for K2P fra prokaryoter en molekylvekt på 38.500 + 2.000 Da. Den densitometriske vurderingen viste at preparatet hadde en renhet på

> 95%.

RP-HPLC beror på den forskjellige vekselvirkningen til proteinene med hydrofobe matrikser. Denne egenskapen ble anvendt som analytisk metode for kvantifi-sering av renhetsgraden.

Analysen av den rensede K2P fra E. coli foregikk over en nukleosil 300-separasjonskolonne (Knauer) ved hjelp av en trifluoreddiksyre/acetonitrilgradient (buffer A: 1,2 ml trifluoreddiksyre i 1000 ml H20; buffer B: 300 ml H20, 700 mlacetoni tr i 1, 1 ml trifluoreddiksyre; 0 til 100%). Integrasjon av den kromatografiske analyse tilveiebragte en renhet på

> 95%.

- N- terminal aminosvresekvens.

Den N-terminale aminosyresekvensen ble bestemt med en ABI 470 sekvenator med standardprogram og on line PTH-deteksjon. Den oppnådde sekvensen S1-Y2-Q3-G4-N5-S6-D7-C8-Y stemmer med den ventede sekvensen avledet fra DNA-sekvensen.

b) Aktivitetsbestemmelse

In vitro-aktiviteten til K2P fra E. coli, ble bestemt

ifølge forsøksforskriftet i "Zeitschrift fiir die gesamte innere Medizin" (ZGIMAL) 42 (17) 478-486

(1987). Den spesifikke aktiviteten utgjorde 550.000

IU/Mg ± 200.000 IU/mg. Stimulerbarheten til K2P fra E. coli gjennom BrCN-fragmenter av fibrinogen (aktivitet i nærvær av fibrinogenfragmenter beregnet gjennom aktivitet uten fibrinfragmenter) var i dette testsystemet > 25.

c) In vitro- binding på fibrin

In vitro-binding på K2P fra E. coli på fibrin ble

bestemt ifølge metoden beskrevet av von Higgins og Venar (Higgins, D.L. og Vehar, G.A. (1987), Biochem. 26,, 7786-7791).

Avbildning 2 viser at K2P fra E. coli i forhold til t-PA fra CHO eller t-PA fra E. coli, ikke oppviser nevneverdig fibrinbinding.

EKSEMPEL 5

For øking av ekspresjonsutbyttet ble sekvensen kodende for K2P-genet klonet inn i et plasmid med høyere kopitall. Til dette ble plasmid pePA 126.1 benyttet som er beskrevet i patentsøknad DE 38 38 378.0. Dette plasmidet blir vesentlig satt sammen av Vektor pKK223-3 og den kodende sekvensen for t-PA, som beskrevet i EP-A 0 242 835.

I dette plasmidet ble først sekvensen til en fd-terminator integrert. Plasmid pePA 126.1 ble linearisert med restriksjonsenzym Hind III. Plasmidet spaltet på denne måten ble separert gelelektroforetisk og preparativt isolert. Plasmid pLBUl (Beck et al. (1978), Nucl.Acids Res., 5, 4495-4503; Gentz et al. (1981) PNAS 78(8):4963) ble spaltet med Hind III og et 360 bp stort Hin III-fragment, som inneholder fd-terminator, ble preparativt fremstilt gjennom gelelektro-forese og geleluering. Det lineariserte plasmidet pePA 126.1 og 360 bp Hin III-fragmentet fra pLBUl ble ligert. Ligerings-blandingen ble kotransformert med plasmid pUBS 500 i E. coli, DSM 2102 som beskrevet i søknad DE 38 38 378.0. Fra klonene ble de utvalgt som inneholder ønsket plasmid pePA 126 fd som skiller seg fra utgangsplasmid pePA 126.1, idet det inneholder et ytterligere Hind III-spaltningssete.

Fra plasmid pePA 126 fd ble to fragmenter isolert: et 3,4 kb stort BamHI/PvuI-fragment og et omtrent 1,3 kb stort Pvul/Xmal-fragment. Begge nevnte fragmenter ble ligert med et omtrent 1,3 kb stort BamHI/Xmal-fragment fra plasmid pA27.3 og plasmid pUBS 500 ble transformert i E. coli. Det resul-terende plasmidet oppnår navnet pA27 fd og kan dermed bli skjeldnet fra paPA 126 fd, som ved en restriksjonstilsetning med EcoRI foreligger som det nest minste EcoRI-fragmentet fra pePA 126 fd på omtrent 610 bp lengde i pA27 fd forkortet med omtrent 515 bp.

EKSEMPEL 6

Farmakologiske funn av uttrykt t- PÅ- derivat K2P i prokaryote organismer.

1. Farmakokinetikk til K2P i kaniner

K2P ble sammenlignet i hvite New Zealand-kaniner med Actilyse<R>når det gjelder farmakokinetiske egenskaper. Begge fibrinolytiske medikamenter ble i en dose på 200.000 IU/kg KG trukket i 30 minutter. Plasma-prober ble isolert til definerte tidspunkter før, i løpet av og etter infusjon. t-PA-aktiviteten ble modifisert med en spektrofotometrisk test ifølge J.H.Verheijen et al., (Thromb. Haemostas. 48, 266, 1982), og målt ifølge H. Lill (Z. ges. Inn. Med. 42, 478, 1987).

For beregning av farmakokinetiske parametre ble det benyttet et regneprogram med ikke-lineær regresjon, modifisert ifølge H. Y. Huang (Aero-Astronautics-Report 64, Rice University, 1-30, 1969). Parameteren ble individuelt beregnet ved hjelp av en bieksponentiell farmakokinetisk modell.

K2P utviser en fem ganger lengere halveringstid (tl/2a = 10,3 min., reduksjon av konsentrasjon i plasma) enn Actilyse<R>(t-PA-preparat fra firma Thomae) (tabell 1, avbildning 5 og 6). Etter endt infusjon (etter 30 min.) ble det for K2P-Pro målt en plasmakonsentrasjon av t-PA-aktiviteten (C^nf) på 1986 IU/ml, som dermed var seks ganger høyere enn for Actilyse<R>. Fordelingsvolumet til sentrale kompar-timenter (Vc) utgjorde for K2P 46,8 ml/kg sammenlignet med 73,7 ml/kg for Actilyse<R>. Totalplasma-clearance (Cl-tot) ble i forhold til Actilyse<R>(Cl-tot = 22,2 ml/min/kg) for K2P-Pro redusert 1/7 (Cltot= 3,2 ml/min/kg). For anvendelse av et fibrinolytikum for bolusinjeksjon er "område under kurven" (AUC) spesielt interessant, på grunn av at det muliggjør sammenligning av den over tid i plasma herskende konsentrasjonen. K2P utviser en åtte ganger høyere AUC (1064 IU/ml-t) enn Actilyse<R>(133,3 IU/ml•t).

Totalt viser K2P samamenlignet med Actilyse<R>, det for tiden eneste kommersielt tilgjengelige rekombinante t-PA-proteinet, ved like doser en fem- til åtte ganger forbedret farmakokinetisk profil.

2) Farmakodynamikk til K2P i kaniner

For vurdering av trombolytisk effektivitet ble den av D. Coilen et al., etablerte kaninmodellen til jugularvenetrombosen anvendt (J. Cl in, Invest. 71, 368, 1983). K2P og Actilyse<R>ble undersøkt i 3 doser. Fibrinolytika ble infusert i 4 timer og tilslutt ble trombolysehastigheten tilveiebragt (tabell 2, avbildning 5).

Den ved hjelp av en lineær regresjonsrett oppnådd dose for en trombolysehastighet på 50% (ED50) lå for K2P på 124.000 IU/kg KG og for Actilyse på 520.000 IU/kg KG. K2P utviste dermed en fire ganger høyere trombolytisk virkning enn Actilyse.

K2P oppnådde doseavhengighet av en plasmakonsentrasjon av t-PA-aktivitet som var sammenlignbar med Actilyse<R>i en fire ganger dose. Den i det trombolytiske virkning med 800 kU Actilyse<R>/kg KG sammenlignbare dosen på 200 kU K2P/kg KG, fører til lave resultater når det gjelder koagulasjonsparametrene til fibrinogen, plasminogen og a2-antiplasmin, men som ikke skiller seg fra resultatet, en dose på 800 kU Actilyse<R>/kg KG.

K2P er et t-PA-mutein som tilveiebringer i jugular-venetrombosemodellen i kaniner ved fire timers infusjon av fibrinolytika ved endosereduksjon på 1/4 av Actilyse<R->dosen samme trombolytiske virkning som Actilyse^. K2P skiller seg ikke fra Actilyse^ ved den reduserte dosen når det gjelder virkning på koagula-sjonssystemet og i plasmakonsentrasjonen til t-PA-aktivitet.

EKSEMPEL 7

Farmokologiske egenskaper til K2P fra E. coli med koronararterietrombose i en hundemodell.

For å undersøke den trombolytiske virkningen av K2P fra E. coli på arterielle tromber, ble eksempelvis en dyreeksperi-mentell modell for akutt myokardinfarkt valgt. Som dyreart ble hunden valgt. Metoden for dannelse av en koronararterie-trombe tilveiebringer en modifikasjon av teknikken til Romson et al. (Thromb. Res. 17, 841, 1980). Den åpnede brystkassen blir i narkotiserte og åndende hunder intimaoverflaten til Ramus circumflexus i A. coronaria sinistra (= left circumflex coronary artery = LCX) elektrisk belastet (150 jjA) og en trombe ble dermed oppnådd. Distalt for trombosen ble det på forhånd anpasset en skrue for gjennom den eksperimentelle prognosen å eliminere de reaktive hyperemiene. Proksimalt for koronartrombosen ble LCX instrumentert med et elektromag-netisk målstrømningshode for å kunne måle reperfusjonen.

I en doseringsstudie ble BM 06.022 med eukaryotisk t-PA

(Alteplase, Actilyse<R>, Dr. Karl Thorne GmbH, Biberach, FRG)

injisert hver gang i fire forskjellige doser og med Placebo i 6 dyr/dose som initial engangsintravenøs bolus over 1 min i de hepariniserte hundene. Før og til definerte tidspunkter etter injeksjonen, ble plasmaproben isolert for å bestemme plasmakonsentrasjonen til t-PA-aktiviteten og fibrinogen, plasminogen og cxg-antiplasmin samt trombozytttallet i fullblod. Fibrinogen ble målt spektrofotometrisk gjennom koagulometri ifølge Clauss (Acta haemat. 17, 237, 1957), plasminogen og o^-antiplasmin som beskrevet i von Coilen et al. (J. Clin. Invest. 71, 368, 1983). Videre ble "Simplat-blødningstiden" bestemt i bakbenet til hunden ved hjelp av en klemme (Simplat<R>I, Organon Teknika, Eppelheim, FRG) i løpet av en venøs opphopning på 40 mm Hg (J. Surg. Res. 27, 244, 1979). Den statiske sammenligning av måleverdien etter injeksjon med kontrollverdien før injeksjon foregår med Wilcoxon-testen for pardifferanser.

For å kunne beskrive det trombolytiske forløpet, ble antall pro Dosis.gruppe reperfunderte dyr (= reperfusjonshastighet) samt tid til reperfusjon (= reperfusjonstid) angitt. Videre ble fuktvekten av tilstedeværende resttrombus målt 2 timer etter injeksjon, og antall dyr med ny lukning etter reperfusjon ( = reokklusjonshastighet) ble tilveiebragt. Ved hjelp av en halvlogaritmisk regresjonsanalyse av dosevirkningen (reperfusjonshastighet)-relasjon, ble det for hver forbindelse beregnet den effektive dosen for en 50%-reperfusjonshastighet (= ED5Q). Den statistiske sammenligningen av resttrombusvekter foregår med Wilcoxon-Mann-Whitney-testen for ikke bundede stikkprøver.

Plasmakonsentrasjonen til t-PA-aktiviteten ble målt med en spektrofotometrisk test ifølge Verhejen et al. (Thromb. Haemost. 48, 266., 1982), modifisert ifølge Lill (Z. gesamte Inn. Med. 42, 478, 1987). For beregning av farmakokinetiske parametere, ble et regneprogram av ikke-lineær regresjon, modifisert ifølge H. Y. Huang (Aero-Astronautics Report 64, Rice University, USA, 1-30, 1968) benyttet. Parameteren ble individuelt beregnet etter fratrekk av kroppseget basalspeil av t-PA-aktiviteten fra etterpåfølgende måleverdier ved hjelp av en bieksponentiell farmakokinetisk modell.

Følgende resultater ble oppnådd:

1. Farmakodynamikk i hund

K2P fører etter intravenøs injeksjon til en doseavhengig reperfusjonshastighet. Den maksimale effekten (reperfusjonshastighet på 100%) ble oppnådd etter injeksjon av 200 kU/kg KG. Dosen med 100% reperfusjonsforløp for Actilyse<R>utgjorde 1600 kU/kg KG. En sammenligning av ED5ø-verdien tilveiebragte for K2P (ED50= 83 kU/kg KG) en 11,5-ganger lavere verdi enn for Actilyse<R>(ED50= 961 kU/kg KG). Administrering av Placebo fører ikke til reperfusjon. Resttrombevekten til Placebo-dyr utgjorde 9,6 ± 1,6 mg (middelverdi ± SEM); både K2P og Actilyse<R>førte med stigende dose til en statistisk signifikant reduksjon av resttrombevektene sammenlignet med Placebo-kontrollen. Reperfusjonen foregår i begge fibrinolytika i gjennomsnitt av alle de reperfunderte dyrene etter 25,9 ± 3,5 min K2P hhv. etter 24,2 ± 6,2 min (Actilyse<R>). De fleste av dyrene behandlet med K2P eller Actilyse<R>reokklu-derte etter reperfusjon (tabell 3).

2. Farmakokinetikk i hund

Etter intravenøs injeksjon av 200 kU/kg K2P eller Actilyse<R>viser det seg i narkotisert hund at den hurtige fasen av reduksjon i plasmakonsentrasjonen, uttrykt som t^/2a»f°r K2P med 7,2 ± 1,1 min. er lengere med faktor 4,5 enn for Actilyse<R>med 1,6 ± 0,2 min (tab.4). Den umiddelbare etter avsluttet injeksjon funnede plasmakonsentrasjonen til K2P var omtrent dobbelt så høy som for Actilyse<R>. Fjerning av K2P av plasma (plasmaclearance = Cl-t-0-t-)foregår ni ganger langsommere enn for Actilyse<R>. Tilsvarende var flaten under plasmakon-sentrasjonstidskurven for K2P omtrent 9,5 ganger større enn for Actilyse<R>.

3. Fibrinspesifisitet i hund

To timer etter injeksjon av K2P oppstod en doseavhengig liten reduksjon av restkonsentrasjonen av fibrinogen på 81 ± 10% ved høyeste dose (200 kU/kg KG). Derimot var fibrinogenkonsentrasjonen etter administrering av den høyeste dose Actilyse<R>(1600 kU/kg KG) nesten fullstendig redusert med 3 ± 0% (tab. 5). Gjennomfører man en halvlogaritmisk regresjonsanalyse av dose-bivirkningen (fibrinogenreduksjons)-forhold gjennom og formidler den for ED50trombolytiske virkningen tilhørende fibrinogenrestkonsentrasjonen, så oppnås for ekvipotente doser for K2P et restinnhold av fibrinogen på 92,5% i forhold til for Actilyse<R>38,6%. Også for plasminogen og ag-antiplasmin foregår en doseavhengig reduksjon av restinnholdet 2 timer etter injeksjon, som for Actilyse<R>er utpreget som ved K2P. Platekonsentrasjonen er for begge forbindelsene nærmest upåvirket.

4. Innvirkning på blødningstiden i hund

Intravenøs injeksjon av K2P tilveiebragte ingen statistisk signifikant forlenging av blødningstiden sammenlignet med kontrollverdien for injeksjon i alle de 4 undersøkte dosene. Derimot førte Actilyse<R>i doser på 1130 og 1600 kU/kg KG til statistisk signifikant forlenging av blødningstiden (fig. 6 og 7).

5. Totalvurdering

Av den beskrevne hundemodellen av koronararterietrombosen viste K2P seg som et trombolytikum, som etter intravenøs Bolusinjeksjon oppnådde en 100% reperfusjonshastighet uten sterk innvirkning på fibrinogenkonsentrasjonen og uten signifikant forlenging av blødningstiden. Sammenlignet med Actilyse<R>som teknikkens stand viser K2P seg i trombolytisk potens etter intravenøs Bolusinjeksjon tydelig overlegen (faktor 11,5). Undersøkelse av farmakokinetiske profiler til K2P viste videre at Clearance av K2P, som uttrykk for langsommere fjerning fra plasma var ni ganger langsommere sammenlignet med Actilyse^.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et vevs-plasminogen-aktivator-(t-PA)-derivat, som ikke er glykosylert og som består av følgende aminosyresekvens:

som kan være forlenget ved aminoenden med M,karakterisert vedat man innfører i egnede vertsceller et ekspresjonsplasmid, som inneholder DNA sekvensen eller en i rammen av degenerasjon til den genetiske koden derav forskjellige DNA-sekvenser, som koder for t-PA-derivatet, og isolerer ekspresjonsproduktet fra kulturmediet eller etter oppslemming av vertscellene.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at man anvender plasmid pA27.3, skjematisk fremstilt i figur 1.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at man anvender plasmid pA27fd.

4 . Fremgangsmåte ifølge krav 1, 2 eller 3,karakterisert vedat man anvender som vertsceller prokaryote celler, spesielt E. coli.

5 . Fremgangsmåte ifølge krav 4,karakterisertved at man for forhøying av utbyttet av aktivt protein separerer dannede "inclusion bodies", oppløser disse gjennom behandling med guanidinhydroklord, derivatiserer deretter med oksidert glutation og renaturerer til slutt t-PA derivatet gjennom tilsetning av L-arginin og GSH.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5,karakterisertved at man etter renaturering konsentrerer t-PA-derivatet i renatureringsblandingen og gjennomfører deretter en kromatografisk rensing ved hjelp av affinitetskromato-graf i.

7 . Fremgangsmåte ifølge krav 6,karakterisertved at man arbeider i nærvær av 10 til 1000 mmol/1 L-arginin.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7,karakterisertved at man gjennomfører den kromatografiske rensingen med konsentratet av renatureringsblandingene som inneholder 10 til 1000 mmol/1, fortrinnsvis 600 til 800 mmol/1 L-arginin, over en ETI-adsorbsjonskolonne.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisertved at det til kromatografisk rensing tilsatte konsentrat innstilles på en pH verdi på 7,5 til 8,6.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 8 eller 9,karakterisert vedat man gjennomfører elueringen ved en pH-verdi fra 3 til 5,5.

11. DNA-sekvens,karakterisert vedat den koder for et t-PA-derivat ifølge krav 1 og inneholder følgende sekvens:

12 . Ekspresjonsplasmid,karakterisert vedat det inneholder DNA-sekvensen ifølge krav 11, eller en i rammen av degenerasjon av den genetiske koden derifra forskjellige DNA-sekvens, som koder for et protein ifølge krav 1.

13. Ekspresjonsplasmid ifølge krav 12,karakterisertved at det er plasmid pA27.3, skjematisk fremstilt i figur 1.

14 . Ekspresjonsplasmid ifølge krav 12,karakterisertved at det er plasmid pA27 fd.