JPH03501330A - カケクチンと反応するモノクロナール抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 カケク゛チンと反応するモノクロナール抗体発明の分野 本発明は、免疫学的手法を用いて診断および治寮（特に、細菌感染症の診断・治 療）に有用な新規物質を生産スルこと、より詳細には、ヒト・カケクチンと特異 的に反応しうる改良されｌ；モノクローナル抗体を生産および使用することに関 する。

発明の背景 寄生生物、１ｇＪｒｍまたはウィルス感染のような侵入的刺激の導入、あるいは 腫瘍細胞は、感受性宿主に有意な代謝的変化を引き起こす。重症である場合、こ れらの変化は最後には正常なホメオスタシス機構を局所的ｔこまたは全身的に破 壊して、消耗性疾患（悪液質）へ進行する宿主エネルギー貯蔵の枯渇、組織損傷 、多重器官系不全、ショックおよび死へと導く。

最近まで、臨床医学者はその体系的ノ（ターンが主として侵入物質それ自体の作 用ｌこよるものであると信じてシ％た。しかしながら、現在では、侵入的刺＃Ｉ こよって宿主が各種のサイトカインを生産し、これらのサイトカインの作用が合 わさって大部分の望ましくなし）生物学的反応を誘発することが知られている。

これらの宿主ｌこより誘導される炎症媒介物質は、多種多様の炎症疾患を二対す る治ダ法を開発するための新たな渡合を提供する。

最も効力のあるサイトカインの１つは、適切な刺激の後に主にマクロファージに よって放出されるカケクチン（ｅａｅｂｅｃｔｉｎ）である。カケクチン（腫瘍 壊死因子またはＴＮＦとも呼ばれる）は１５７個のアミノ酸から成るタンパク質 であり、通常生体内ではダイマーまたは他のマルチマーとして存在している。ヒ トＴＮＦモノマーの計算分子量は約１７０００ダルトンである。

カケクチンは数種類の脂肪細胞特異的タンパク質（例えば、リポタンパク質リパ ーゼ）の生合成を抑制するように作用する。また、それは多数の他のタンパク質 （クラスＩ主要組織適合抗原、顆粒球−マクｏ７アージーコロ二−形成刺激因子 、およびインターロイキン１を含む）の生合成または放出を誘導するように作用 する（一般的に、Ｂｕ＋ｔｌｓｒ　ａｎｄ　Ｃ！ｒｓｍｉ、　Ｎｅｖ　ＥＢ、　 Ｊ、　ｏｆ　Ｍｅｄ、、　３１６：３７９−３８５　（１９Ｎ）を参照されたい 。この技術内容は参照によりここに引用するものとする）。

カケクチンの各種疾患に対する広範な影響が認識されＩ；ために、その作用を制 御しようとする試みがなされた。

例えば、実験により、カケクチンと特異的に反応する抗体は、カケクチンと関係 のあることが知られている免疫調節反応を制御するために治療上有用であること が分かつｔ；（米国特許第４６０３１０６号および同第４６８４６２３号を参照 されたい。これらの技術内容は参照によりここに引用するものとする）、特に、 ヒト・カケクチンの種々のエピトープと高親和結合しうる中和抗体は、過剰カケ クチンレベルの有毒な作用を中和する能力をもっていると思われる。

従って、１ｎｖｉｖｏにおいてカケクチンの毒性作用を中和しうる改良された抗 体の必要性が存在している。本発明はこれらの必要性を満たすものである。

発明の要約 においてヒト・カケクチンのエピトープに結合しうる増強された中和能力をもつ モノクローナル抗体を生産することができる。さらに、予防または治療量のモノ クローナル抗体もしくはその結合断片少なくとも１種と、好ましくは生理学的に 許容しうる担体と、を含む組成物を投与することから放る、筒車症や敗血症にか かりやすいヒトまたは内毒素保有細菌にすでに感染しているヒトの治療方法が提 供され、前記モノクローナル抗体およびその結合断片はヒト・カケクチンと反応 する能力を有し、かつＬ９２９細胞溶解検定において約４００ｎｇ未満、一般に は約５０〜２０Ｑｎｇまたはそれ以上で中和活性を示すことができる。前記組成 物はさらに１種以上の次の成分を含むことができる：すなわち、細菌内毒素また は外毒素と反応しうるヌリのモノクローナル抗体：内毒素を保有する特定菌株の 血清を抗原決定基と反応しうるモノクローナル抗体：ヒト血漿からの７−グロブ リン画分：細菌内毒素と反応する免疫グロブリンを高レベルで含むヒト血漿から の７−グロブリン画分；および１種またはそれ以上の抗菌剤。さらに、診断用キ ットの製造を含むモノクローナル抗体の臨床使用が提供される。

特定の実２１！態様の説明 本発明によれば、希望する親和力の中和モノクローナル抗体を生産しうる新規細 胞、並びにこの種の抗体を含む組成物が提供され、前記組成物はヒト・カケクチ ンに存在するエピトープを選択的に認識することができる。

前記細胞は、それら由来のまたは前駆細胞由来の生殖系列ＤＮＡがヒト・カケク チンの希望エピトープと結合する部位をもつ抗体をコードするように組み換えら れた、同定可能な染色体を含んでいる。これらのモノクローナル抗体は、診断や 治療のほかにも、いろいろな面で利用することができる。

このようにして得られたモノクローナル抗体は、従来の抗体と比較して、薗血症 、敗血症、悪液質、高レベルのカケクチンと関連した他の疾患などの重い病気の 治療もしくは予防に特に有用である。従って、これらの抗体は一般的に、Ｌ９２ ９細胞溶解検定において、４００ｎｇ未満、好ましくは約３００ｎｇ以下、最も 好ましくは約５０〜２００ｎｇで中卯活性をもつであろう。この比較的高レベル の活性のために、有意に低い投与量レベルでの治療が可能である。

モノクローナル抗体の生産は、ヒト・カケクチンの希望エピトープに特異的な抗 体をコードする核酸配列を発現しうる細胞系列を不滅化することによって達成さ れる。

不滅化細胞系列は腫瘍形成を経て、またはトランスフェクシヨンや突然変異など によって、形質転換された哺乳動物細胞系列でありうる。このような細胞には骨 髄腫系列、リンパ腫系列、または１Ｉｌｖｉｔｒｏで免疫グロブリンもしくはそ の結合断片の発現・分泌を支持しうる他の細胞系列が含まれる。免疫グロブリン またはその断片は、リンパ球（特に、牌細胞）の形質転換により、ウィルスによ り、またはハイブリッド細胞系列をつくるためのリンパ球と腫瘍細胞（例、骨髄 腫細胞）との融合により得られた、好適なマウスまたはヒト源以外の哺乳動物の 天然に存在する免疫グロブリンでありうる。一般に、牌細胞はカケクチン関連抗 原またはそのエピトープ部位を含む断片に対して免疫した動物から得られるであ ろう。免疫法プロトコールはよく知られており、効果を保持したＡｅ＊ｄｔｍｉ ｃ　Ｐｒｔｓｓ、　Ｎ、Ｙ、　（１９１８１を参照されたい。この技術内容は参 照によりここに引用するものとする）。

ハイブリッド細胞系列は慣用技術を用いてクローニングおよびスクリーニングを 行い、そして適当な親和力で希望のヒト・カケクチン抗原決定基に結合しうる細 胞上溝中の抗体を検出する。適当なハイブリッド細胞系列はその後大規模培養で 増殖させるか、あるいは抗体腹水の生産のために適当な宿主の腹腔内に注入され る。

ヒト・カケクチンタンパク質に特異的な本発明抗体を利用することによって、い くつかの場合には、希望の抗ヒト・カケクチンモノクローナル抗体（いわゆる“ 阻止抗体＃）の別の例を同定する手段として本発明モノクローナル抗体を用いる 競合検定において、後続の実験の上溝をスクリーニングすることができる。従っ て、ハイブリッド細胞系列は、特定のカケクチン抗原決定基に特異的な適切な親 和力の抗体の利用可能性に基づいて、いろいろな源から容易につくることができ る。

また、対象のエピトープ部位に特異的な抗体を生産するハイブリッド細胞系列が 利用可能である場合、これらのハイブリッド細胞系列は他の腫瘍Ｂ細胞（抗体を コードするゲノムＤＮＡの受容細胞として役立つ）と融合させることができる。

これらの抗体は細胞表面で機能するが、例えばレセプターとしては機能しない。

誓書類（特に、ネズミ）の腫ｌＩＢ細胞が最も一般的に利用されるが、ウサギ、 ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、トリのような他の動物種も用いられる。

モノクローナル抗体はＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥのような免疫グロブリン のいずれのクラスまたはサブクラスであってもよく、また、それぞれの動物種に おいて知られているＩｇＧのいずれのサブクラスであってもよい。一般に、モノ クローナル抗体は完全なままで、またはＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ　（ａｂ’）２のよう な結合断片として用いられるが、通常は完全なままで用いられる。

本発明の細胞系列にはモノクローナル抗体の直接生産以外の他の用途がある。細 胞系列を他の細胞（例えば、適当には薬物でマークしたヒト骨髄腫、マウス骨髄 腫またはヒトリンパ芽球様細胞）と融合させて、ハイブリドーマまたはトリオー マをつくり、これによりモノクローナル抗体をコードする遺伝子を転移させるこ とができる。

また、本発明の細胞系列を免疫グロブリンをコードする染色体源として用いて、 染色体の分離後、融合以外の技術を使って細胞に転移させることができる。さら に、モノクローナル抗体をコードする遺伝子は、分離後、いろいろな宿主による 特定の免疫グロブリンの生産のために組換えＤＮＡ技術に従って使用される。特 に、メツセンジャーＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製することにより、免 疫グロブリンをコードしかつイントロンを含まない単一のｃＤＮＡクローンを単 離し、これを適当な原核まｔミは真核発現ベクターに挿入し、統いて最終的な大 量生産のために宿主に形質転換することができる。（一般的には、米国特許第４ １７２１２４．４３５０６ｇ３：４３６３７９９；４３８１２９２；４４２３１ ４７号これらの文献の技術内容はすべて参照によりここに引用するものとする。

） より詳細には、ハイブリッドＤＮＡ技術に従って、本発明の免疫グロブリンまた はその断片は細菌または酵母により生産される。（Ｂｏｓｓ、　！ｔ　ｓｌ、、 　Ｎ＋＋ｅ１．ムｃｉｄ、ｌ！ｓ、。

されたい。両文献の技術内容は参照によりここに引用するものとする。）例えば 、本発明の細胞系列により生産されるモノクローナル抗体の軽鎖および重鎮をコ ードする遺伝子から転写されたメツセンジャ−ＲＮＡは、当該クローン以外のＢ 　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃリンパ球由来のｃＤＮＡを使って分画ｃＤＮＡハイブリダ イゼーシ３ンにより単離しうる。ハイブリダイズしないｍ　ＲＮ　Ａは目的の免 疫グロブリン鎖をコードするメツセージに富んでいるだろう。

必要な場合は、目的のｍ　ＲＮ　Ａレベルをさらに上げるために、この方法を繰 り返し行うことができる。その後、分画されたｍ　ＲＮ　Ａ組成物を逆転写して 、目的の配列について濃縮されたｃＤＮＡ混合物を得る。ＲＮＡは適当なＲＮＡ アーゼで加水分解し、５ｓＤＮＡはＤＮＡポリメラーゼ！およびランダムプライ マー（例えば、ランダムに断片化しＩ：ウシ胸腺ＤＮＡ）を用いて二本鎖とする 。

得られｒｉｄｓＤＮＡはその後適当なベクター（例えば、ラムダベクターのよう なウィルスベクター、またはｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１ｇ４などのプラスミド ベクター）に挿入してクローン化する。軽鎖および重鎮の不変部の既知配列に基 づいたプローブを用いて、目的の軽鎖および重鎮をコードする遺伝子を含むｃＤ ＮＡクローンをノＸイブリダイゼーシシンにより同定する。その後、遺伝子はプ ラスミドから切り出し、開始コドンの上流にある余分のＤＮＡまたは不変部ＤＮ Ａを遺伝子操作により除き、そして宿主の形質転換および遺伝子の最終発現のた めに適当なベクターに導入する。

有利には、完全な免疫グロブリンを生産させるために、さらに、所望により、リ ーダー配列を含まない免疫グロブリンを分泌させるために、鎖のプロセッシング （例えば、重鎮と軽鎖の結合）を行う哺乳動物宿主（例、マウス細胞）が用いら れる。これとは別に、単細胞微生物を用いて２本の鎖を生産させることもでき、 この場合は、重鎮をコードする配列の５′末端に開始コドンが存在するので、プ ロセッシングシグナルおよび分泌リーダーをコードするＤＮＡ配列を除去するた めの遺伝子操作がさらに必要になる。この方法では、免疫グロブリンは哺乳動物 細胞以外の細胞において構成およびグリコジル化されるように生産され、プロセ ッシングされる。所望により、それぞれの鎖は少なくとも可変部を保持するよう に切断することができ、この可変部はその後カケクチンエピトーグに特異的な他 の免疫グロブリンまたは断片をつくるＩこめに遺伝子操作される。（例えば、欧 州特許公開筒ｏ２：ｑｃｚｏｏ号および同第０１２５０２３号を参照されたい。

これらの技術内容は参照によりここに引用す）　るものとする。） 本発明のモノクローナル抗体は、ヒト・カケクチンのエピトープに対するそれら の高い親和性ゆえに、特に有用である。まｌ；、モノクローナル抗体の一部はｉ ｎ　ｖｉｖ。

において防御的であり、医薬品（例えば、細菌感染症用の抗体組成物）へのそれ らの配合が可能である。

本発明のモノクローナル抗体はさらに％　ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいているいろＩ ：利用される。例えば、七ツクローナル抗体は天然のまたは組換えヒト・カケク チンを精製するために、あるいは不均質なタンパク質混合物に含まれるヒト・カ ケクチンを選択的に取り出す！こめに利用できる。

診断目的のために、モノクローナル抗体は標識されてもされなくてもよい。一般 に、診断検定はモノクローナル抗体とタンパク質から形成されＩ；複合体の検出 を伴う。

抗体が標識されていない場合、それは凝集検定で利用される。さらに、非標識抗 体はモノクローナル抗体と反応する他の標識抗体（第二抗体；例えば、免疫グロ ブリンに特異的な抗体）との組合せで用いることもできる。これとは別に、モノ クローナル抗体は直接標識されてもよい。多種多様の標識が使用でき、例えば、 放射性核種、蛍光物質、酵素、酵素基質、酵素コファクター、酵素阻害剤、リガ ンド（特に、ハプテン）などがある。いろいろなタイプのイムノアッセイが利用 でき、例えば、米国特許第３８１７８２７；３８５０７５２；３９０１６５４　 ．３９３５０７４　；　３９８４５３３　．３９９６３４５：４０１４０７４： ４０９８８７６号に記載されるものが含まれる（これらの特許の技術内容は参照 によりここに引用するものとする）。

一般に、本発明のモノクローナル抗体は酵素イムノアッセイで利用され、その場 合当該抗体または異なる種からの第二抗体が酵素に結合される。ヒト・カケクチ ンを含む試料（例えば、ヒト血液またはその溶解液）を当該抗体と混合すると、 抗体と目的のエピトープを示す分子との間で結合が起こる。このような複合体を 未結合試薬類から分離し、第二抗体（酵素で標識したもの）を加える。

その後、細胞に特異的に結合された抗体−酵素複合体の存在を調べる。当分野で 知られたその他の技法も利用できる。

まｔ；、溶液中のヒト・カケクチンを検出するために、または組換え体画分中の ヒト・カケクチンエピトープの存在を検出するために、当該抗体を含むキットが 供給される。こうして、本発明のモノクローナル抗体組成物は、通常凍結乾燥さ れた形で、モノクローナル抗体単独または内毒素、外毒素もしくはグラム陰性菌 に特異的な抗体との組合せで提供される。抗体（標識されていてもされていなく てもよい）は緩衝液（例、トリス、リン酸塩、炭酸塩）、安定剤、殺生物剤、不 活性タンパク質（例。

ウシ血清アルブミン）などと共にキット内に収められる。

一般に、これらの物質は活性抗体の量に基づいて約５重量％以下で存在し、通常 抗体濃度に基づいて約０．００１重量％以上の合計量で存在するだろう。往々に して、活性成分を希釈する！こめに不活性増量剤または賦形剤を加えることが望 ましい。その場合、賦形剤は全組成物の約１〜９９重量％の量で存在するだろう 。モノクローナル抗体と結合しうる第二抗体を用いる場合、それは通常２りのバ イアルに入れられる。第二抗体は一般に標識に結合され、先に述べた抗体組成物 と同様な方法で配合される。

まＩ；、本発明のモノクローナル抗体は、治療または予防量の本発明モノクロー ナル抗体少なくとも１種（しかし、一般的には２種以上から成る混合物）を製剤 学的に有効な担体と共に含有する薬剤組成物の成分として配合される。製剤学的 担体はモノクローナル抗体を患者に投与するのに適した相溶性の無毒性物質であ るべきである。

担体としては滅菌水、アルコール、脂肪、蝋、不活性固体などが用いられる。製 剤学的に許容しうるアジュバント（緩衝剤、分散剤）も薬剤組成物に配合するこ とができる。この種の組成物はヒト・力ヶクチンに対してのみ特異的なモノクロ ーナル抗体を含みうる。また、薬剤組成物は細菌と直接反応するモノクローナル 抗体（“カクテル”に利用できるもの）を含むこともできる。例えば、ヒト・カ ケクチンエピトープに対するモノクローナル抗体および敗血症を引き起こす種々 の菌株群（例えば、異なる血清型）に対するモノクローナル抗体を含むカクテル は、病気の原因となる大多数の臨床単離物に対して活性のある万能薬となるであ ろう。

種々のモノクローナル抗体成分のモル比は、一般に１０倍より大きく相異するこ とはなく、より一般的には５倍より大きくは異ならず、通常他の抗体成分のそれ ぞれに対しそ約１　：１−２のモル比で用いられるだろう。本発明のモノクロー ナル抗体は、併用する場合、一般に等モル比で用いられるだろう。

本発明のモノクローナル抗体は、現在使用されている血液血漿製剤、例えばヒト 細菌敗血症の予防または治療に用いられている市販のガンマグロブリンおよび免 疫グロブリン製剤と併用することもできる。好ましくは、免疫グロブリン製剤の 場合、血漿は内毒素保有細菌と反応する免疫グロブリンの高レベルを示す提供者 から得られるであろう。（一般的に、概説“静脈内免疫グロブリンおよび処置宿 主（Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ　Ｉｍｎｕｎ＊　ＧｌｏｂＩｌｌｉｎ　ａｎｄｔｂ ｔ　Ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｔｄ　Ｅａｓｔ）”、　Ａｍ５ｒ、Ｊ、Ｍｓｄ、、　Ｌ ６Ｑｓ）、　Ｍｘｒｃｂ３０、　＋９１４．　ｐ、］−２３１を参照されたい。

この文献は参照によりここに引用するものとする。） また、モノクローナル抗体は抗生物質または抗菌剤と。

共ｊ；投与される別個の組成物として使用することもできる。一般に、抗菌剤は アミノグリコシド（例、ゲンタマイシン、トブラマイシンなど）と共にペニシリ ンを含むが、当分野で知られた多くの他の抗菌剤（例、セファロスポリン）も利 用できる。

本発明のモノクローナル抗体およびその薬剤組成物は経口または非経口投与に適 している。好ましくは、薬剤組成物は非経口的ｊ二、すなわち皮下、筋肉内、動 脈内または静脈内に投与される。従って、本発明は、許容しうる担体（好ましく は、水性担体）中のモノクローナル抗体またはそのカクテルの溶液から成る非経 口投与用の薬剤組成物を提供する。例えば、水、緩衝水、０．４％食塩水、０， ３％グリシンのような水性担体が使用できる。

これらの溶液剤は無菌であり、一般に粒状物質を含まない。これらの組成物は慣 用の滅菌法により滅菌される。

本組成物は生理学的条件に近づけるために、ｐＨ１節剤、緩衝剤、毒性調節剤の ような製剤学的に許容しうる補助物質（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウ ム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなど）を含むことができる 。これらの組成物中の抗体の濃度は広い範囲で変化し、すなわち約０．５重量％ 以下から、一般には約１重量％以上から１５または２０重量％程度までの範囲で あり、主として液体の容量、粘度などに基づいて、好ましくは選ばれた特定の投 与方式により決定されるであろう。

従って、筋肉注射用の代表的な薬剤［成約は１ｍｌの滅菌緩衝水および５００ｍ ｇのモノクローナル抗体を含むように調製される。静脈内輸液用の代表的組成物 は２５０ｍ１の滅菌リンゲル液および１５０ｍｇのモノクローナル抗体を含むよ うに調製されるだろう。非経口投与用の薬剤組成物を調製するための寅際的方法 は当分野で知られており、例えば、ＲｅＩａｉｎ（ｔｏｎ’ｓ　Ｐｂ＊ｒａａｃ ＣｕｔｉｃｉｌＳｃｉ＊ｎｅｓ、　＋５　Ｅｄ、、　Ｈａｃｋ　Ｐｎｂｌｆｓｈ ｉＢ　Ｃｏｒｒ＋ｐａｎｙ、　Ｅａｓｒｏｎ。

Ｐｅｎｍ５ｙＩｖａｔ＋ｉｓ　（１９１０）により詳細に記載されテイル。

本発明のモノクローナル抗体は保存のために凍結乾燥することができ、適当な担 体により用時調製される。この技術は通常の免疫グロブリンに有効であることが 分かり、当分野で知られた凍結乾燥法および用時調製法が使用できる。当業者は 、凍結乾燥および用時調製が抗体活性の低下へ導くこと（例えば、通常の免疫グ ロブリン製剤の場合、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体よりも活性の低下が著しい傾向に ある）、およびこれを補償するｔ；めに使用量を調整しなければならないことを 理解するであろう。

モノクローナル抗体またはそのカクテルを含む組成物は、いろいろな細菌感染症 の予防および／または治療のために投与しうる。治療用途において、本組成物は 、１種以上の細菌にすでＩこ感染した患者に、その感染症およびその合併症を治 療もしくは少なくとも部分的に抑制するのに十分な量で投与される。これを達成 するに足る量は“治療上有効な量”として定められる。このＩ；めに有効な量は 感染症の重症度および患者自身の免疫系の一般状態に左右されるが、通常約１〜 ２００ｍｇ抗体／ｋｇ体重の範囲であり、好ましくは５〜２５ｍｇ／ｋｇの投与 量が用いられる。本発明の物質は一般に重い症状、すなわち命に危険があるかま たはありうる状態、特に筒車症および内毒素血症、に対して用いられることに留 意すべきである。

予防用途において、モノクローナル抗体またはそのカクテルを含む組成物は、ま だ感染していない患者に、感染症に対する患者の抵抗性を高めるために投与され る。

このような量は“予防上有効な量”として定められる。

この場合の正確な量もやはり患者の健康状態や一般的な免疫レベルにより左右さ れるが、通常０．１〜２５　ｍ　ｇ／　ｋ　ｇ　ｓ特に０．５−２．５ｍｇ／ｋ ｇの範囲であるだろ本組成物の１回または数回投与を行うことができ、投与量お よび投与方式は治療にあたっている医師により選ばれる。いずれの場合において も、薬剤組成物は患者を効果的に治療または予防するに足る量の本発明抗体を与 えるべきである。

え艷 カケクチンの生産および精製 ｌｌＡ換えヒトリカケクチン（Ｐｅ＋＋ｌ１ｉｅｓ、　ｓＬ　ｓｌ、、　Ｎｔｔ ｕｒｅ。

容は参照によりここに引用するものとする）は、開始メチオニンおよび成熟カケ クチンの配列をコードする合成遺伝子から、酵母により細胞内タンパク質として 発現された。その際合成遺伝子のコドンは、標準技術に従って、高度に発現され る酵母遺伝子のコドンを反映するように選ばれた。この合成配列はハイブリッド ・アルコール脱水素酵素／グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ ２／ＧＡＰＤＨ）プロモーターの下流に配置した。カケクチン合成はサツカロミ セス−セレビシェ（Ｓａｃｃｂ烏ｒｏｍｙｅｔｓ　ｃＣｒｓｖｉｓｉａｅ）の形 質転換培養物を用いてグルコース欠乏により訴導した。全酵母タンパク質の約５ 〜１０％がカケクチンであった。

カケクチンは粗製酵母抽出物から（ａ）硫安分画、（ｂ）Ｑ−セファロース高速 カラムクロマトグラフィー、（ｃ）Ｓ−セファロース高速カラムクロマトグラフ ィー、および（ｄ）セファクリルＳ−２００（ＨＲ）カラムクロマトグラフィー により精製した。

この方法は、アクチノマイシンＤ処理し９２９細胞を用いて検定したとき、カケ クチン活性の約８０％の回収を与えた（Ｒ１１ｆｔ　ａｎｄ　Ｇｉｆｆｏｒｄ、 　（１９８１）　Ｔ＋＋ｍｏｒ　ＮｅｃｒｏｓｉｓＦｘｃｔｏｒ、　Ｌｙｍｐｂ ｏｋｉｎｅｓ、　２：２３Ｓ−２７２）。精製力ヶクチンの比活性は２−４Ｘ１ ０ａ単位／ｍｇであり、純度はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べて ９８％以上であっＩ；。

カケクチンに対するモノクローナル抗体の生産Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスは ５〜２５μｇフロイント完全アジュバントで腹腔内に免疫し、その後３週問おき に７０インド不完全アジユバント中の同一用量で２回追加免疫した。最後に、水 溶液中の同一用量で腹腔内に追加免疫し、３〜４日後に細胞融合を実施した。

免疫しｔ；マウスからの牌細胞（約１０”細胞）は、Ｋｏｂｌ＊ｒ　ｌｎｄ　Ｍ ｉｌｓＨ４ｎ　（Ｎａｌｒｅ　２５６：４９５　（Ｉｓ〕９））に従ってポリエ チレングリコールにより約２Ｘ１０’個の骨髄腫細胞（Ｒ３−Ｘ６３−Ａｇ８． ６５３）　（Ｋｅａｒｎｓｙ　ｅｔａｌ、、　Ｊ、Ｉｉｍｎｎｏｌ、　（１９７ ９）　１２ユニ１５４Ｂ−１５５０）と融合させた。これらの細胞をマイクロタ イタープレートにまき、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ） 培地によりハイブリッドを選別しＩ；。

カケクチンで免疫したマウス５匹からの牌細胞を用いて５回の融合を実施した。

固相酵素結合免疫吸着検定法を用いることにより、カケクチンに対するモノクロ ーナル抗体を生産する６０個の陽性クローンが得られた。

陽性ウェルからのハイブリッドは、それぞれが真のクローンであることを確かめ るために、限界希釈法により３回クローン化した。カケクチンに対して陽性のハ イブリドーマ１４個がクローン化され、性状決定がなされた。

カケクチン／ＴＮＦバイオアッセイ：Ｌ−９２９細胞の細胞毒性 ＴＮＦ活性はＲｕｆｆ　ｉｎｄ　Ｇｉｆｆｏｒｄ、　Ｌｙｍｐｈｏｋｉ＋ｕｓ　 ２：２３５゜（１９Ｎ）に記載の通りにアクチノマイシンＤｆｉ３１Ｌ９２９細 胞を用いる細胞溶解検定により測定した。

Ｌ９２９細胞（ＣＣＬＩ、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシミン、ロ ックビル、ＭＤ）は、１０ｍＭヘペスおよび１０％ウシ胎児血清（またはＤＭＥ ＋１０％ＦＢＳ）を補給したＲＰＭＩ　１６４０に維持した。

集密的培養物（３−４Ｘ１０’細胞／　７５　ｃ　ｍフラスコ）は５ｍＭＥＤＴ Ａおよび１０ｍＭへペスを含む生理食塩水（ｐＨ７，４）中での短時間のトリプ シン処理（０゜０５％トリプシンで洗う）により解離させ、アクチノマイシンＤ （ｌμｇ／ｍ　１　）を含む新鮮な培地に再び浮遊させた。その後、細胞を９６ ウエルのマイクロタイター培養皿にまいた（５−７Ｘ１０’細胞／ウエル）。

培養の２時間後、段階的希釈を行つＩ；試料をウェルに加え（１０−２０％以下 の血清）、プレートを一晩（５％ＣＯ，，３７°Ｃ）インキュベートした。試料 は４通りずつ検定した。翌日、顕微鏡で観察しｔ；後、培地をデカントシ、ウェ ルに０．２％クリスタルバイオレット、１０％ホルマリンおよび０．Ｏｌリン酸 塩の溶液（ｐＨ７−７，５）を５分間溝たし、水で十分に洗い、乾かした。

溶解の程度はマイクロタイタープレート読取り機で分光学的に（５５０−５７０ ％Ｍ）定量化した。検定結果はＵ　／　ｍ　１として表し、１単位（Ｕ）は５０ ％の細胞を溶解させるカケクチンの量と規定した。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏ中和検定 組換えヒト・カケクチン（０，０２Ｍ！−リスＭＣＩ、ｐＨ８，０，０，１５Ｍ 　ＮａＣ＋、１ｍｇ／ｍｌ　Ｂ５Ａ１ｍ１あたり２０％ｇ）は等容量の希釈抗体 と混合し、３７℃で６０分間インキュベートシシュ；この混合物をアクチノマイ シンＤ　Ｏｇ／ｍ　１　）を含む新鮮培地で１：１０に希釈した。４通りの段階 的希釈（２倍）試料０゜１ｍｌをマイクロタイタープレートウェルに加えた。残 存する細胞溶解活性はＬ９２９−細胞の細胞毒性活性により測定した。

モノクローナル抗体の性状決定 カケクチンに対して陽性のハイブリドーマ１４個を同定し、サブクローニングし た。これらのハイブリドーマによって生産された抗体は、ＥＬＩＳＡでカケクチ ン結合に関してモノクローナル抗体１８−１〜１（Ｔｒｍｃｅｙ。

ｔ１＊１．、　Ｎａ１ｒｔ　３３０：６６２−６６４　（１９Ｎ）　、参照によ りここに引用するものとする）と競合するそれらの能力について調べた。表１に 示すように、モノクローナル抗体は３つのクラス：すなわち１８−１−１と競合 しないもの：競合するもの；および中間競合を示すものに分類される。

１８−１−１と競合しないモノクローナル抗体がカケクチンに特異的であること を証明するためＩ；、カケクチン捕捉検定を行った。カケクチンを捕捉するモノ クローナル抗体を同相に結合させ、そしてモノクローナル抗体１８−１−１を標 識抗体として使用した。この検定では、すべてのモノクローナル抗体がカケクチ ンに対して特異的であった。

まｔ；、カケクチンのＭＡｂ中和された細胞毒性活性の程度を調べるために、ハ イブリドーマ細胞からの調整培地を用いｌ；実験を行った。１４のモノクローナ ル抗体はすべて性状決定のｔ：めにマウス腹水中で生産した。カケクチンの毒性 に対してＬ９２９ｍ胞を防御する精製モノクローナル抗体の効力が測定されｔ； 。ＭＡｂｌ−２−４Ｂｌの中和活性はその精製物質により確かめた。ＭＡｂ２− ２−３Ｅ３　（５０％ｇ／ｍｌ）と等容量のヒト組換えカケクチン（２０ｎ　ｇ 　／　ｍ　１　）との３７°Ｃ１６０分間のインキユベーションは、Ｌ９２９細 胞毒性検定で調べたとき、カケクチンの細胞溶解活性の５０％が中和されたこと を示した。表１に示すように、ＭＡｂｌ８−１−１と同じエピトープを認識する ＭＡｂ２−２−３Ｅ３は、細胞防御に要する量が１８−１−１の量の１／８であ った。また、表１に示すように、１Ｂ−１−１と同じ特異性をもつ抗体の大部分 はＬ９２９細胞雪性検定においてカケクチンを中和（１００％）した。１８−１ −１と異なるエピトープ特異性をもつ１−２−４８１のような他の抗体も有意な 中和活性を有していた。

色Ｌ ヒト・カケクチンと反応する モノクローナル抗体のプロフィール １１−］−１１ｇＧ　÷　＋　４００ １−４−４１４１ＩＣ＋＋ ＋−２−４Ｂ２　１ｇＭ ｌ−２−４Ｂｌ’Ｉｇｃ＋１００ １−１−ＩＦ３　１．Ｇ　± ２−２−２ＦＳｌＫＧ＋±〉８００ １−１−ＪＣＢＩｇＧ＋士 ｌ−２−３Ｅ３ｃ　ＩｇＧ　＋　＋　５０１−２−２ＦＲｌｔＣ＋　＋ １−］−２１３１ｇＧ＋＋２００ １−４−２ＡＩ　ＩｇＧ±十 ２−３−ＩＡ８　ＩｇＧ　±　＋ １ｉ−４Ｃ６１ｇＧ± ａ）ｉ安沈澱により腹水から部分精製し２：ＭＡｂの５ＤＳ−ＰＡＧＥにより決 定した。

ｂ）次のようにして固相競合ＥＬ　Ｉ　ＳＡにより測定した。

２４時間ハイブリドーマ培養物からの調整培地（５０μｌ）およびＨＲＰ標識１ Ｂ−１−１（２５μｍ１ＰＢＳ＋１０％ヤギ血清　１ｍｌあたり０．２ｔｔｇ） を各ウェルに加えた。

Ｃ）細胞系列１−２−４８１および２−２−３Ｅ３はそれぞれ寄託番号ＨＢ９７ ３７およびＨＢ９７３６としてＡＴＣＣに寄託された。

ヒヒ敗血症の有害作用の阻止における抗ＴＮＦモノクローナル抗体断片による処 置後の効力 ヒヒに大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ＋）の２時間Ｌ　Ｄ　ｌｏ。輸液を投与しＩ；。動物 は１０時間監視し、その後死亡するまで、または最高７日間観察し！；。アミノ グリコシド抗生物質、ゲンタマイシン、を大腸菌の２時間輸液後指定された回数 で投与した。抗ＴＮＦモノクローナル抗体２−２−３Ｅ３　Ｆ（ａｂ’）ｚ断片 （ｔｏｍｇ／ｋｇ）のポーラス注入は、Ｔ＋３０分（細菌輸液期間の４分の１１ すなわち″処置後″）に４匹のヒと！二対して行った。別の１匹のヒヒには同量 の大Ｂ菌十ゲンタマイシンを与え、無関係のＦ（ａｂ’）、断片のアイソタイプ 対照を用いて治療した。

２／２５／Ｈ＋抗体　１　６．８Ｍ　３．７ｘｌＯＩＯ１ｙ時間３／Ｉ／８８　 ＋抗体　２　目、３Ｍ　４．６ＸｌＯ”　２４時間３／１７／Ｈ＋抗体　３　７ ．３１１　６．２２ＩＯ”　７４８　間４１５／８ｇ　＋抗体　４　６．６ＦＭ 　４．４ＸＩＯ”　７１ａ　間４／Ｓ／８８　対照（担体）　５　６．４ＦＭ　 ６．５ｘｌＯ”　０時間（２）死後観察 ヒヒ＃１．２．５に対して実施した死後試験の要約（生存動物を用いた以前の研 究が組織学的な悪影響を示さなかったので、生存ヒヒ＃３．４に対しては死後試 験を行わなかった）。動物＃１，２．５に対する全体的な死後観察は互いに非常 に似通っており、次の通りである：盪−二外見は正常であるが、動物＃ｌ、２に おいて小腸に腸重積が観察された。

（３）１０時間監視したときの生理学的およびその他の（ａ）ヒヒ＃３．４の生 存利益と関連し、非生存ヒヒ（＃１．２．５）と異なるパラメーターは：↑平均 全身動脈圧（ＭＳＡＰ）、↑ｐＨ１↓乳酸塩、↓ＢＵＮ、↓クレアチニン、↓５ ＧＰＴ、↓フルチゾル、↑グルコース、↓ＦＤＰ、および↑フィブリノーゲンで あった。

Ｃｂ）生存（＃３．４）および非生存（＃１．２．５）ヒビ間に差がないパラメ ーターは：心拍数および呼吸数、ＷＢＳ、血小板、ｐｃｏ、、ｐ０２、ＣＰＫ、 ヘマトクリット、コロニー（大腸菌）血中濃度、および体温であった。

完全な抗体を用いて実験を繰り返したが、有意な差は認められなかった。従って 、結合断片および完全抗体はともに本発明において利用できる。

前述のことから、本発明の細胞系列は低い中和量でヒト・カケクチンと反応する モノクローナル抗体およびその断片を得るための手段を提供する。これにより、 多くの内毒素保有細菌が原因の感染症に有効であり、しかも安全に投与しうる予 防および治療用組成物の開発がより経済的にできるようになつｔ；。さらに、本 発明抗体はいろいろな診断法や他の治療法においても利用されるであろう。

本発明は、理解しやすくするために、例示や実施例を用いて詳しく開示されてい るが、いくつかの変更・修飾が添付の請求の範囲内で可能であることが明らかだ ろう。

国際調査報告

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｌ９２９細胞による細胞溶解検定において４００ｎｇ未満で中和活性を示す 、ヒト・カケクチンと特異的に反応するモノクローナル抗体またはその結合断片 を含む組成物。
2. ２．前記モノクローナル抗体またはその結合断片はモノクローナル抗体１８−１ −１のカケクチン結合を阻止することができる、請求項１記載の組成物。
3. ３．前記モノクローナル抗体またはその結合断片はインビボにおいて内毒素血症 に対し防御作用を有する、請求項１記載の組成物。
4. ４．前記モノクローナル抗体は、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９７３６またはＨＢ９７ ３７の細胞系列により生産されるモノクローナル抗体の結合を阻止することがで きる、請求項１記載の組成物。
5. ５．ヒト・カケクチンの異なるエピトープと反応することができる２種以上のモ ノクローナル抗体またはそれらの結合断片を含む組成物。
6. ６．前記モノクローナル抗体の少なくとも１種はインビボにおいて防御作用を有 する、請求項５記載の組成物。
7. ７．抗生物質またはヒト血漿から７−グロブリン画分をさらに含む、請求項１ま たは５記載の組成物。
8. ８．前記モノクローナル抗体の１種はＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９７３６またはＨＢ ９７３７の細胞系列により生産される、請求項５記載の組成物。
9. ９．請求項１または５記載の組成物、および生理学的に許容しうる担体を含む薬 剤組成物。
10. １０．ヒト・カケクチンのエピトープと反応しかつインビボにおいて防御作用を 有するモノクローナル抗体、抗菌剤、ヒト血漿からの７−グロブリン画分、およ び生理学的に許容しうる担体を含む、感染症を治療または予防するのに有用な薬 剤組成物。
11. １１．ヒト血漿からの７−グロブリン画分は、内毒素保有細菌と反応する免疫グ ロブリンの高レベルを示すヒトから得られる、請求項１０記載の薬剤組成物。
12. １２．菌血症および／または敗血症にかかりやすいヒトに、予防または治療量の 請求項１、５、または１０記載の組成物を投与することから成る、菌血症および ／または敗血症にかかりやすいヒトの治療方法。
13. １３．ヒト・カケクチンと特異的に反応することができＬ９２９細胞による細胞 溶解検定において約５０〜４０Ｏｎｇで中和活性を示すモノクローナル抗体を生 産する細胞系列。
14. １４．前記モノクローナル抗体は内毒素保有細菌に対しインビボで防御作用を有 する、請求項１３記載の細胞系列。
15. １５．ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９７３６またはＨＢ９７３７の請求項１３記載の細 胞系列。
16. １６．ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９７３７の細胞系列。
17. １７．内毒素保有細菌感染症に特異的であり、それを治療または予防することが できるモノクローナル抗体を生産する方法であって； 請求項１５または１６記載の細胞系列の少なくとも１種を培養し、前記抗体を回 収することから成る方法。
18. １８．菌血症および／または敗血症にかかりやすいヒトを治療する方法であって ； 前記ヒトに、予防または治療量の、請求項１５または１６記載の細胞系列により 生産されたモノクローナル抗体を投与することから成る方法。
19. １９．請求項１７記載の方法により生産されたモノクローナル抗体に結合しうる エピトープと反応するモノクローナル抗体またはその断片。
20. ２０．１−２−４Ｂｌまたは２−２−３Ｅ３と指定されたモノクローナル抗体の いずれかと実質的に同じ結合親和性および特異性を有するモノクローナル抗体組 成物。
21. ２１．検出可能な信号を発することができる標識に結合されている、請求項２０ 記載のモノクローナル抗体。
22. ２２．前記標識は蛍光物質または酵素である、請求項２１記載のモノクローナル 抗体。
23. ２３．ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９７３６またはＨＢ９７３７の細胞系列により生産 されるモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体組成物；および前記抗体に 共有結合された、またはそれぞれの前記モノクローナル抗体と反応する第二抗体 に共有結合された検出可能な信号を発する標識；を含む、宿主における内毒素保 有細菌感染症の存在を検出するためのキット。