JPH03501383A

JPH03501383A - オリゴヌクレオチド官能化試薬及び方法

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Publication number: JPH03501383A
Application number: JP63508099A
Authority: JP
Inventors: レベンソン，コレイ; チャン，チュ‐アン; オーケス，フレッド　ティー．
Original assignee: カイロン　コーポレイション
Priority date: 1987-10-02
Filing date: 1988-09-19
Publication date: 1991-03-28
Anticipated expiration: 2013-02-16
Also published as: US4914210A; IE61046B1; IE882971L; WO1989002931A1; IL87879A0; DE3886543T2; DE3886543D1; JP2714090B2; CA1310600C; IL87879A; EP0380559A1; EP0380559B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】オリゴヌクレオチド官能化試薬及び方法孜歪圀互本発明は一般にオリゴヌクレオチド官能化試薬に関し、そしてさらに詳しくは合成オリゴヌクレオチドにスルヒドリル基、アミノ基及びヒドロキシル基を導入するための新規な試薬に関する。

非−アイソトープ性標識合成りＮＡ断片は分子生物学において、・・・例えば、ＤＮＡの配列決定の分野、Ｄ　Ｎ　Ａプローブに基く診断等の分野において広範な用途を有することが見出されている。本明細書に開示される試薬は、任意の位置、典型的には５′−末端においてオリゴヌクレオチドに１又は複数のユニークな修飾可能なスルヒドリル、アミノ又はヒドロキシル基を導入することにより特定の基によりオリゴヌクレオチドの標識化を促進する。

幾つかの参考文献が、合成オリゴヌクレオチドの５′−末端にスルヒドリル又はアミノ基を導入する方法を開示している。例えば、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ、　Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１３（１２）　：　４４８５−４５０２（１９８５）及びＮｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１５（７）　：　３１３１−３１３９（１９８７）は、２−メルカプトエタノール、３−メルカプトプロパン−１−オール及び６−メルカブトヘキサンー１−オールのＳ−）リチルーＯ−メトキシーモルホリノホスフィン誘導体、すなわち、（式中、Ｘは２，３又は６である）で表わされる試薬を用いて合成りＮＡにスルヒドリル成分を導入する方法を記載している。

Ｃｏｕ　ｌ　ｌ　ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　２７（３４）　：　３９９１−３９９４（１９８６）は、次の式：で表わされるＮ−保護脂肪族アミノホスホアミダイトを官能化試薬として用いてオリゴヌクレオナトの５′−末端に脂肪族−級アミノ基を導入する反応を記載しておりＨ５ｐｒｏａｔら、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１５（１５）　：　６１８１−６１９６（１９８７）は同様な方法を記載している。Ｓｍｉ　ｔｈ　ら、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１３（７）　：　２３９９−２４１１（１９８５）もまた、オリゴヌクレオチドと５′−アミノ−５′−デオキシチミジンの保護されたホスホラミダイト誘導体との直接反応による、５′−脂肪族アミノ基を含有するオリゴヌクレオチドの合成方法を記載している。５′−末端に一級アミノ基を導入するだめの他の官能化試薬はアプライド・バイオシステムス社（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、）により商標「八ｍ１ｎｏｌｉｎｋＪのもとで販売されておりそして次の式：で示されるものである。この試薬は使用前に活性化剤ジメチルアミノピリジンで処理することを必要とし、そしてさらに鋭敏な悪臭のある試薬であるチオフェノールによる脱保護を必要とする。

これらの及び他の従来技術の方法は下記の欠点の１つ又は複数を有する。

（１）オリゴヌクレオチドの５′−末端をスルヒドリル、アミノ又はヒドロキシ基に連結する短いスペーサー鎖が誘導体化された構造の不安定性をもらたす・・・、すなわち、オリゴヌクレオチドへの固体支持体又は嵩ばった標識種の接近が構造的障害を惹起し、そしてそれ故にプローブに暴く用途における誘導体化されたオリゴヌクレオチドの使用を妨害する；（２）オリゴヌクレオチドの５′−末端をスルヒドリル、アミノ又はヒドロキシ基に連結する疎水性スペーサー鎖が、ＤＮＡプローブに基礎を置く方法において一般に使用される水性溶剤での溶解性の問題をもたらす；（３）常用されている官能化試薬はしばしば、−ｉに使用されるＤＮＡ合成法と適合せず、その主たる理由は、官能化試薬が試薬及びそれと −緒に典型的に使用される溶剤と適合しないためである；（４）常用されている官能化試薬は高収率で合成することがしばしば困難であり、複雑な多段階反応である；（５）　Ａｍ１ｎｏｌｉｎｋの場合に前記したように、ある種の既知試薬は使用直前に複数の活性化剤により処理する必要がある；（６）常用されている官能化試薬は、末端スルヒドリル、アミノ又はヒドロキシ成分とオリゴヌクレオチド鎖との距離を増加するための複数のスペーサー鎖の「接ぎ合わせ」を許容しないのみならず、一般にそれらはオリゴヌクレオチド鎖にそっての複数官能化を許容しない；（７）常用されている官能化試薬は一般に５′−ヒドロキシル末端以外の位置での官能化を許容しない；及び（８）常用されている官能化試薬と時として、激しい条件下での脱保護を必要とし、この脱保護反応はしばしば容易に検出できない。

従って、上記の点を考慮したオリゴヌクレオチド官能化剤の必要性が当業界において存在する。

主里至Ｍ玉従って、本発明の第一の目的は従来技術の上記の欠点を克服するオリゴヌクレオチド官能化試薬を提供することである。

特に、本発明の１つの目的はカップリングの後に安定な水溶性の誘導体化されたオリゴヌクレオチドを提供するオリゴヌクレオチド官能化試薬を提供することである。

本発明の他の目的は、オリゴヌクレオチド鎖の５′−末端での多官能化を許容する・・・、すなわち、連結された複数のスペーサー鎖の逐次付加を可能にするオリゴヌクレオチド官能化試薬を提供することである。

本発明の他の目的は、標準的なりＮＡ合成試薬及びプロトコールと組合わせて使用することができるオリゴヌクレオチド官能化試薬を提供することである。

本発明の他の目的は、簡単な方法で高収率で合成することができるオリゴヌクレオチド官能化試薬を提供することである。

本発明の他の目的は、使用に先立って標準的活性化剤のみによる処理を必要とし、そしてカップリング反応が分光分析的手段により容易にモニターすることができるような態様でオリゴヌクレオチド鎖にカップリングすることができるオリゴヌクレオチド官能化試薬を提供することである。

本発明の他の目的は、オリゴヌクレオチド鎖に、典型的には５′−末端において１又は複数のスルヒドリル、アミノ又はヒドロキシ成分を導入するために前記のオリゴヌクレオチド官能化試薬を用いてオリゴヌクレオチド鎖を官能化する方法を提供することである。

本発明の他の目的は、スルヒドリル、アミノ又はヒドロキシル基を介してオリゴヌクレオチド鎖に結合する検出可能な種によりオリゴヌクレオチド鎖を誘導体化する方法を提供することである。

本発明の１つの最終目的は前記のオリゴヌクレオチド官能化試薬を合成する方法を提供することである。

本発明の他の目的、利点及び新規な特徴は部分的には以後の記載において示され、そして部分的には以後の試験に基いて、又は本発明の実施により当業者に知られるであろう。本発明の目的及び利点は添付された請求の範囲中に特に指摘される手段及び組合せにより実現されそして達成されるであろう。

本発明の１つの観点において、構造が実質的に線状であり、一端にオリゴヌクレオチド鎖上のヒドロキシル基と反応するホスホラミダイト成分を有し、他端にスルヒドリル基、アミノ基又はヒドロキシル基を有し、これら２端が比較的長い親水性鎖により連結されているオリゴヌクレオチド官能化試薬が提供される。好ましい態様において、前記親水性鎖は少なくとも８個の炭素原子をその中に存するポリエーテルスペーサーである。好ましい特定の構造は後に記載されよう。

本発明の他の観点において、これらの試薬が、脱保護の後に、少なくとも１個のスルヒドリル、アミノ又はヒドロキシル基を導入するためにオリゴヌクレオチドを官能化するのに使用される。このカップリング反応は、ホスホラミダイトをオリゴヌクレオチドの末端端ヒドロキシル基にカップリングするための標準的技法を用いて行われる。官能化の後、オリゴヌクレオチドは、導入されたスルヒドリン、アミノ又はヒドロキシ成分において検出可能な種により誘導体化され得る。

官能化試薬への種々の新規な合成ルートが後に記載されよう。これらのルートのそれぞれは非常に簡単であり、関与する合成段階の数を最少にし、そして高収率での生成物の回収を可能にする。

主ユ■失隻ｑ履櫃１、定義「官能化Ｊ　（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｉｎｇ）は、本明細書において使用する場合、保護されているか又は保護されていないスルヒドリル成分（−３Ｈ）又はアミノ成分（−ＮＨ−α、ここでαは水素又は低級アルキルである）をオリゴヌクレオチド鎖に導入することを意味する。官能化により導入されるスルヒドリル、アミノ又はヒドロキシ基は典型・的には本明細書に記載するようにスペーサー鎖によりオリゴヌクレオチドから離れて配置される。従って、［オリゴヌクレオチド官能化試薬ｊはスルヒドリル、アミノ又はヒドロキシル基をオリゴヌクレオチド鎖に導入して「官能化されたオリゴヌクレオチド鎖」を生成する試薬である。

「誘導体化」は、本明細書において使用する場合、官能化されたオリゴヌクレオチドが、付加されたスルヒドリル、アミノ又はヒドロキシル成分において、検出可能な種、すなわちプローブに基礎を置く用途における標識として役立つ種と反応することを意味する。従って「誘導体化された」オリゴヌクレオチドは、「誘導体化」種により検出可能なものであ［オリゴヌクレオチド」は本明細書において使用する場合、ヌクレオチド、典型的にはデオキシリボヌクレオチドモノマーユニットの一本鎖又は二本鎖、典型的には１本鎖である。

本発明の試薬及び方法は単一ヌクレオチドモノマー又は全長ＤＮＡｔＪｆと組み合わせて使用することができるが、本発明における「オリゴヌクレオチドは典型的には、約２〜約４００モノマーユニツト、そしてさらに典型的には、はとんどのプローブに基礎を置く用途のために、約２〜約１００モノマーユニツトの一本鎖である。

［プローブに基礎を置く」用途における誘導体化されたオリゴヌクレオチドの使用は、検体中のオリゴヌクレオチドセグメント又は配列を検出又は定量するための標識された鎖の使用を意味することが意図される。

「保護される」スルヒドリル又はアミノ基は、生ずる保護された基が、保護基が存在する１又は複数の合成段階の間のあらゆる種類の化学反応に対して感受性でないように、保護成分と反応する基である。

官能化され又は誘導体化されたオリゴヌクレオチド鎖の「安定」とは、立体的障害の実質的な不存在、及びほとんどのプローブに基礎を置く用途での化学的安定性を意味する。

「低級アルキル」又は「低級アルコキシ」は、約１〜６個、より典型的には約１〜３個の炭素原子を有するアルキル置換基及びアルコキシ置換基をそれぞれ意味する。

芳香族置換基が示される場合、各個々の芳香族環が１又は複数の炭素原子において機能又は反応性に実質的に影響を与えない成分によに置換されていてもよいと理解すべきである。

２、　な′　ｆ巧の　゛告前記のごとく、新規化合物は、一端にホスホラミダイト成分を有し、該成分が親水性のスペーサーを介して、保護されているか又は保護されていないスルヒドリル、アミノ又はヒドロキシ成分を有する他端に連結されている、実質的に線状の官能化試薬である。これらの官能化試薬は一般に次の構造式：Ｒは保護されているか又は保護されていないアミノ、スルヒドリル又はヒドロキシ成分であり；Ｒ”は水素、−ｃｕｔｏｎ　、又は次の式：（式中、ＸＩ　、Ｘｚ、Ｘ：１．Ｘ ’、Ｘ’　及びＸ’　は同一でも又は異っていてもよく、そして水素、低級アルキル及び低級アルコキシから成る群から選択される）で表わされる置換基であり；Ｒ１及びＲ２は独立に水素及び低級アルキル基から成る群から選択され；Ｒ３はβ−シアノエチル又はメチルであり；Ｑ成分は次の式：％式％から成る群から選択され、そして同一でも異っていてもよ（；ｎ’、ｎ”及びｎ ″′は２〜ｌｏの範囲（２及び１０を含む）、さらに典型的には２〜６の範囲（２及び６を含む）の整数であり；そしてｎは３０より大でもよく、しかし典形的には２〜３ｏの範囲（２及び３０を含む）、そしてさらに典型的には２〜１ｏの範囲（２及び１０を含む）の整数である〕により表わされる。

構造式（６）：（式中、Ｒ，Ｒ”、Ｒ’、Ｒ”、Ｒ３及びｎは前記の通りである）は特に好ましい態様の一例である。親水性スペーサー鎖は、上に示す場合においては、例えばポリエチレングリコールから形成されるポリエーテル連結である。〔一般構造式（４）に含まれる他の態様において、スペーサー鎖はポリエチレングリコール等、又はテキサコ・ケミカル社（Ｔｅｘａｃｏ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、）により販売されているＪｅｆｆａｎｉｎｅのごときポリ（オキシアルアルキレンアミン）から形成することもできる。

官能化試薬を任意の位置でオリゴヌクレオチド鎖にカップリングすることが望まれる場合、一般に、ヌクレオシドホスホラミダイトを該鎖にカップリングすることができ、Ｒ成分は保護されたスルヒドリル、アミノ又はヒドロキシル成分である。保護基は、スルヒドリル、アミノ又はヒドロキシル成分が、スルホラミダイトカップリング段階のあいだに、すなわち試薬のホスホラミダイト基がオリゴヌクレオチド鎖上のヒドロキシル成分と反応する間に、無傷であるように選択される。この反応のための条件は、例えばＢｅａｕｃａｇｅ及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　２２　：　１８５９−１８６２（１９８１）に記載されているいわゆる「ホスホラミダイト」ルートを介してＤＮＡを合成する常法において使用されるものである。

官能化試薬がスルヒドリル官能化試薬である場合の特に好ましい保護基の例は、次のＲ二で表わされる。

官能化試薬がアミン官能化試薬である場合の特に好ましい保護基の例は、次のＲ：で表わされる。

上に例示した保護基は単なる例に過ぎず、上記の「保護」の基準に合致する限り任意のスルヒドリル保護基及びアミノ保護基を用いることができると理解すべきである。

ヒドロキシ官能化試薬の場合、多数のヒドロキシ保護基が利用可能であり、そして当業者によ（知られている。しかしながら、Ｒｏはほとんどの態様においてＤＭＴのごとき酸感受性保護基により保護されたヒドロキシ成分〔構造式（５）を参照のこと〕であり、Ｒが保８Ｗされたヒドロキシ成分である場合、保護基はＲ ”におけるそれから官能的に区別できること、すなわち酸怒受性のもの以外のものであることが好ましい。従って、「Ｒ」のための典型的なヒドロキシ保護基は塩基感受性成分、例えばフルオレニルメチルクロロホルメート（ＦＭＯＣ）のごときエステルである。

ホスホラミダイト基：により定義される官能化試薬の他端は、はとんどの場合に成長しつつある又は完成したオリゴヌクレオチド鎖の末端５′−ヒドロキシル基である遊離ヒドロキシル成分にカップリングするように選択される。前記のように、Ｒ１及びＲ２は水素又は低級アルキルであり、そして同一でも異っていてもよく、特に好ましい態様においてはＲ１及びＲ”の両者がイソプロピルである。Ｒ３はメチル又はβ− シアンエチルであり、特に好ましい態様においてはＲ３はβ−シアノエチルである。

カップリング手段としてのホスホラミダイトの使用はＤＮＡ合成の分野においてよく知られており、さらに詳細な記載のためにはＢｅａｕｃａｇｅ及びＣａｒｕ　ｔｈｅｒｓ　（１９８１）　（前掲）に言及しなければならないであろう。

スペーサー鎖：は親水性鎖であり、ここでｎ・ｎ′　・ｎ”及びｎ″′は前記０値を有する整数である。

式（６）で表わされる好ましい態様において、スペーサー鎖は、ポリエーテル成分：であり、ここでｎは典型的には２〜３０、さらに典型的には２〜２０であり、しかしながらある場合、すなわち誘導体化成分とオリゴヌクレオチド鎖との間の増加した距離が望まれる場合には３０より大であることができる。

ｎの最適値は、スペーサー鎖の長さにそって約８個以上の合計炭素原子を有するスペーサー鎖を提供する。スペーサー鎖の長さは本発明の試薬の有効性に非常に関連しており、スルヒドリル、アミノ又はヒドロキシ基とオリゴヌクレオチド鎖との間の距離が大きくなれば、（１）ＤＮＡへの試験のカップリングを促進し、（２）ハイブリダイゼーション妨害しそして官能化又は誘導体化されたオリゴヌクレオチド鎖を不安定化するであろう立体障害を回避し、そして（３）誘導体化されたスルヒドリル又はアミン成分の運動の自由度を増強するように「溶液ｊタイプの環境を刺激する。スペーサー鎖が親水性であるという事実はまた水性媒体中での官能化又は誘導体化されたオリゴヌクレオチド鎖の溶解性を増強する。

Ｒ“は水素、−ＣＨ２０１（、又は（５）により示される芳香族置換基である。

Ｒ１が（５）である場合、これは、クロモゲン陽イオン：が放出後にモニターできるように選択される。すなわち、ＤＮＡへの官能化試薬のカップリングの後、脱保護が溶液中に陽イオン（５ａ）をもたらすであろう、特に好ましい置換基の例はジメトキシトリチル（ＤＭＴ）　、すなわちＲ１が− ＣＨｚ−０−ＤＭＴである。

好ましい態様においては、構造式（６）により示されるように、Ｒ′″がホスホラミダイト基に隣接した炭素原子に結合しているが、式（４）に示されるように、Ｒ”がスペーサー鎖にそっての１又は複数の他の炭素原子に結合していてもよい。

３、　第１ゴヌクレオチパ′　−た　の、　なｉ工゛戸の一般に、新規な官能化試薬とヒドロキシ基含有化合物との間のカップリング反応は次のス゛キーム：により表わされる。スキームＩにおいてＸは典型的にはオリゴヌクレオチド鎖である。反応条件は、前に記載されるように、そして特にＢｅａｕｃａｇｅ及びＣａｒｕ　ｔｈｅｒｓ　（１９８１）　（前掲）により記載されているような、ＤＮＡ合成へのホスホラミダイトルートにおいて使用されるものと同じである。

化合物（１４）は次の様にして脱保護される。Ｒ”が式（５）で表わされる場合、非保護ヒドロキシへの転換は酸で処理することにより行われる。「Ｒ」における保護されたアミノ又はヒドロキシ置換基は一般に塩基で処理することにより脱保護される。例えば、ＮＨ，ＯＨによる処理はオリゴヌクレオチド鎖を脱保護するのみならず、Ｒがアミノ又はヒドロキシである場合には該Ｒ１換基も同様に脱保護する。Ｒが保護されたスルヒドリル成分である場合、脱保護は例えば硝酸塩によって行うことができる。

オリゴヌクレオチドの多官能化は複数のＲ′″部位〔Ｒ”は式（５）で表わされる〕を使用することにより可能である。

酸膜保護の後、脱保護されたヒドロキシル部位での反応によりさらに官能化することができる。すなわち、官能化されたオリゴヌクレオチド（１５）　：の場合、例えばＲ“の脱保護、及び標準的ホスホラミダイトカップリング法を用いての該脱保護により生じたー〇〇成分におけるさらなる官能化が次の式（１６）　：で表わされる化合物をもたらす。

オリゴヌクレオチド鎖にそっての複数のヒドロキシル基における多数官能化もまた同じ化学的方法を用いて可能である。

４、ｉ反に１見企威本発明者らは新規試薬への種々のルートを開発した。簡単のため、官能化試薬の合成を一般構造式（４）によってではなく例示構造式（６）により検討しよう、しかしながら、記載される合成方法は一般に、（４）により表わされる化合物に実質的に同様に通用されることが理解されるべきである。

合成されるべき官能化試薬がアミン官能化試薬である第一の態様において、スキーム■は次の通りである。

ス土二左工ＨＯ−ＣＨ！−（Ｈ，（０−（Ｈ，−（Ｈ２）、０−ＣＨ！−ＣＨ，−ｏＨ”段階（１）は、当業界においてよく知られているＭｉ　ｔｓｕｎｏｂｕ反応を示す。要約すれば、この反応は化合物（１７）、　（１８）。

（１９）及び（２０）の混合物を用い、極性有機溶剤中で少なくとも数時間、好ましくは一夜行われる（実施例１を参照のこと）。

化合物（２１）が単離され、そして次のようにしてホスホラミダイト（ここで、Ｘはハロゲン、好ましくは塩素である）にカップリングされる０モル過剰のホスホラミダイトが化合物（２１）に、適当な溶剤、やはり好ましくは極性有機溶剤中で、不活性雰囲気下で添加される。化合物（２２）は、例えばカラムクロマトグラフィーにより単離される。

アミン官能化試薬を合成するための他の方法であって、スルヒドリル官能化試薬を得るためにも使用できるものは次のスキーム■により表わされる。

スキーム■において、段階１ａ−１ｃ及びｌａ’−１ｂ’は中間体（２５）への代替できるルートを示す。段階１ａ−１０において、保護されたジオール（２５）は、ポリエチレングリコールとアリルブロマイドとの反応（この反応は室温において、少なくとも約数時間、好ましくは一夜行われる）による（２３）の生成；常用の既知の条件下での（２３）と四酸化オスミウムとの反応によるジオール（２４）の生成；及び２゜２−ジメトキシプロパンとの反応による該ジオールの保護、により生成される０段階１ａｌ　１　ｂ　Ｉはトシル化グリコールとツルケタール陰イオンとの反応を介して（２５）をもたらす０段階２はスキーム■に示したＭｉｔｓｕｎｏｂｕ反応を示し、ここでＲは前に定義した通りであり、他方段階３の酸処理はジオールを脱保護する０段階４−１はクロモゲン成分（１４）〔ここでＲ′″は（５）により表わされる（そしてＲ′″が水素である場合には略すことができる〕を導入し、そして段階４−２はホスホラミデー）　（１２）を導入する０両段階４−１及び４−２におけるｒＸｕはハロゲン脱離基、好ましくは塩素である。

スルヒドリル官能試薬の製造のために特異的な第三の合成法はスキーム■により示される。

スキーム■ ＨＯ−ＯＨ宜−ＣＨ！（Ｏ−ＣＨ，−ＣＨ占Ｑ−ＣＨ，−ＣＨｔ−ＯＨスキーム ■において、段階１番１低温、好ましくは０°Ｃ以下において行われ、そしてトリフェニルホスフィン、ジイソプロピルアゾジカルボキシレート及びｓ−トリチルメルカプタンを一夜反応せしめる。ホスホラミデートが段階（２）において添加され、そして（２９）が高収率で得られる。ここで、構造式（４）のＩ’　ＲＪは−５−Ｃφ、（常にφ−フェニル）として示されるが、実際に任意の保護されたスルヒドリル成分であることができる。

５、−ベル　れた　による悸。

新規な試薬を用いて製造される官能化されたオリゴヌクレオチド鎖はプローブを基礎とする用途において主として有用である。すなわち、オリゴヌクレオチドにスルヒドリル、ア部位において、標識された種による誘導体化を可能にすることである。はとんど共通のタイプの標識された種は、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）　、発色物質（ｃｈｒｏｏ＋ｏｐｈｏｒｅ）　、放射性同位元素及び酵素である。

例えば、官能化されたオリゴヌクレオチド鎖と西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ　）との共有結合接合体である誘導体化されたオリゴヌクレオチドを製造することができ、この接合体は次の構造式（２８）　：（式中、Ｒ＊　、　Ｑ　、　ｎ　、　ｎ　Ｉ　、　ｎ　′を及びｎ″′は構造式（４）について前に定義した通りであり、そしてＸはオリゴヌクレオチド鎖である）により表わされる。

オリゴヌクレオチド鎖の長さは典型的には２〜１００モノマーユニツトの範囲である。接合体が対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（＾ＳＯ）として使用される場合、鎖中のモノマーユニットの数は好ましくは約１３〜２１である。

１つの具体例において、この様な接合体は次の構造式（２９）　：（式中、Ｒ” 、Ｘ及びｎは前記の通りである）により表わされる０式（２９）の接合体はオリゴマーＸへのスルヒドリル官能化試薬（４）のカップリングにより生ずる。

式（２８）により示される共有結合接合体（２８）はスキーム■により例示される方法により製造される。

スキーム■（続き）（２日）ｍａｌ　−５ａｃ−ＨＮＳＡ％すなわち４−ヒドロキシ−３−二トロベンゼンスルホン酸ナトリウム塩（ＨＮＳＡ）のＮ−マレイミド−６−アミノカプロイル（Ｉｌｌａｌ−ｓａｃ）誘導体、及び対応するｍａｌ　−５ａｃ−ＨＮＳＡ　ＨＲＰ複合体（３０）は実施例６及び７に後記する。

チオール化オリゴヌクレオチド（３１）は前記のようにして製造される。典型的には、トリチルチオオリゴヌクレオチドをスキーム■の反応において使用する直前に試薬（１９）に誘導体化する。

ｍａｌ　ｓａｃ　ＦＩＲＰ複合体（３０）を単純な混合により、好ましくは室温以下でチオール化オリゴヌクレオチド（３１）にカップリングさせる。反応混合物を室温において、例えば約０℃において、少なくとも一夜、そして好ましくは少なくとも数日間保持し、この時点で共有結合ＨＲＰ接合体（２８）を単離し、そして好ましくはクロマトグラフィーにより精製する。

プローブに基礎を置く用途において使用する前に、接合体を、約５．５〜約７．５、好ましくは約６．０のｐＨに維持されたリン酸緩衝液（場合によっては酸を添加する）に、約−１０°Ｃ〜約３０°Ｃ（但し溶液が凍結しないようにする）、最適には約４°Ｃの温度にて保持する。

ハイブリダイゼーションにおいて使用するため、接合体溶液は通常、ハイブリダイゼーション緩衝液により稀釈され（最終濃度は用途に依存する）、そして標準的ハイブリダイゼーション技法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　。

ニューヨーク、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋　１９８２）に従って使用される。一般的方法は当業界においてよく知られており、そして典型的には、（１）注目の分析対象のヌクレオチド配列に対して実質的に相補的な、すなわちハイブリダイゼーションを可能にするために十分なだけ相補的な共存結合接合体を用意し；　（２）溶液中で注目の分析対象を共有結合接合体と接触せしめ；そして（３）生成する核酸複合体の存在を、ＨＲＰ活性を測定することにより検出する、ことを含む。

一般に、共有結合複合体は固体支持体に結合した分析対象にハイブリダイズし、そして次にその上で検出される。

本発明をその好ましい特定の態様と関連させて記載したが、前記の記載及び実施例は例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものではないと理解される。

他の観点、利点、及び本発明の範囲での変更は当業者に明らかであろう。

実施■玉（ａ）テトラエチレングリコールとフタリミドとの反応〔スキーム■、段階（１）を参照のこと〕テトラエチレングリコール（３８，８５ｇ　、　２００ｍｍｏｌｅ）及びトリフェニルホスフィン（５２，４６ｇ　、　”２００ｍｍｏｌｅ）を２００ｍＫ！の乾燥ＴＨＦに？理解し、そしてフタリミド（２９，４３ｇ　、　２００ｍｍｏｌｅ）を加えた。ｌｏｏｍｊ！の乾燥ＴＨＦ中ジエチルアゾジカルボキシレー　ト（ＤＥＡＤ）の溶液を、凍却及び撹拌しながら反応混合物に滴加した。反応混合物を室温にて一夜撹拌した。次に、溶剤を減圧下で除去し、そして残渣を２５Ｍの水と２５０ｄのジエチルエーテルとの間で分配した。水性層を２００７のジエチルエーテルにより５回洗浄し、そして真空乾燥した。残渣を、トルエンの共沸蒸留（３Ｘ１００ｍｌ）により乾燥した。次に、得られた２５．８９　ｇ　５ｉＯｚカラム上で溶離剤として酢酸エチルを用いて精製した。生成物画分を集め、そしてシロップ状（１１，７５ｇ　；　３６．３ｍｍｏｌｅ　；　１８．２％）に濃縮し、これを−夜結晶化させた。

（ａ）において得られた生成物の構造は、’）ｌ−ＮＭＲにより、であると石育認された。

（ｂ）アリル誘導体の合成〔スキーム■、段階（１ｂ）を参照のこと〕１００ｄの乾燥ＴＨＦ中段階（ａ）で得られたアルコール（４，６７ｇ　、　１４．４ｍｍｏｌｅ）のン容液にＮａ）Ｉ（５２０ｍｇ、　２１．６７ｍｍｏｌｅ）を加えた。この混合物を１時間撹拌し、そして次にアリルブロマイド（１，９ｍｉ！、　２．６１　ｇ　、　２１．６７ｎｏｎｏｌｅ）を加えた。この懸濁液を一夜撹拌し、この時点で濾過し、そして溶剤を減圧下で除去した。残渣をＳｉ０ｇカラム上で溶離剤として酢酸エチルとヘキサンとの混合物（７０：　３０）を用いて精製した。目的の生成物を含有する画分をプールし、そして２．８４　ｇ　（７，８２ｍｍｏｌｅ。

５４．３％）のシロップ状に濃縮した。元素分析は次の通りであった。

計算値：　Ｃ６２，８０；　Ｈ６，９３；Ｎ　３．８５測定値：　Ｃ６２，４９；Ｈ６，９９；Ｎ　３．８２゜得られた生成物の提案される構造は、（ｃ）対応するジオールの合成〔スキーム■、段階（１ｂ）を参照のこと〕１８０ｄのＤＭＦ／水（８：１）中段階（ｂ）で得られたアリルエーテル（２，８４ｇ　、　７．８２ｍｍｏｌ　）及びＮ−メチルモルホリンＮ−オキサイド（１，８３ｇ、　１５．６３ｍｍｏｌｅ）の溶液に四酸化オスミウム（ｔ−ブタノール中２５■／−の溶液８．１３戚；８００μｍｏｌｅ）を加えた。生ずるコハク色の溶液を室温にて撹拌した。４８時間後、水（１０ｍｆ）中ナトリウムハイドロサルファイド（２，１３ｇ）の溶液を反応混合物に加えた。形成される黒色沈澱及び懸濁液を１時間撹拌した。この混合物を濾過し、そして減圧下で濃縮した。残渣をＳｉ０ｇカラム上で溶離剤として塩化メチレンとメタノールとの混合物を用いて精製した。元素分析は次の通りであった。

生成物の提案される構造は、（ｄ）ＤＭＴによる標識前記（Ｃ）において得られたジオール（１ｇ　、　２．２５ｍｍｏｌｅ）を無水ピリジン（２ｘ１５ｄ）と共蒸発せしめた０次に、乾燥残渣を２５ｍの無水ピリジンに溶解した。この溶液にＤＭＴ−Ｃｆｆｉ（０，９２ｇ、　２．７５ｍｍｏｌｅ）を加えた。反応を室温にて行い、そして生成物の出現までＴ　Ｌ　Ｃ（ＣＨｓＣｆ　：　ＭｅＯＨ約９７：３）によりモニターした。

１時間後、１０ｍ１のメタノールを添加し、そして反応混合物をさらに１０分間撹拌した。次に、１０ｍ１の氷水により反応を停止せしめ、そして酢酸エチル（２Ｘ７５ｄ）で抽出した。

有機層を５％ＮａＨＣＯｓ　（５０ｍｌ）で１回、及び飽和ＮａＣｌ溶液で２回洗浄し、そしてＮａ２５Ｏ，で乾燥した。生成物を減圧下で油状残渣になるまで蒸発させた。

残渣を上記の溶剤系を用いてクロマトグラフ処理した。最終生成物をさらに精製することな（段階ｃｅ＞において使用した。収率：理論量の８６．３％（実際量１．５１　ｇ　／理論量１．７５ｇ）。

この段階で得られた提案される構造は、（ｅ）ホスホラミダイトの製造段階（ｄ）において得られた生成物（１，０ｇ　＋　１．４ａｕａｏｌｅ）を１０ｍ１の酸不含有クロロホルムに溶解し、そして乾燥アルゴンによりレフレッシュされた２５０ＩＩｒｌ丸底フラスコに入れた。

この溶液に、０．７２　ｇ　（５，６＋＋ｕａｏｌｅ）の（（ＣＨ３）ｇ　Ｃｌ）　ｚ　Ｎ−Ｅｔを加えた。次に、ホスホラミダイト：０．６６　ｇ　（２，８ｍｍｏｌｅ）を注射器を用いて２分間にわたって加えた。反応を室温にてそしてアルゴンのもとで行った。１時間後、混合物を５０ｍ１の酢酸エチルと共に２５０ｍｊ！の分液漏斗に移し、そして飽和ＮａＣｌ溶液により４回抽出した。有機層をＮａ、ＳＯ。

で乾燥し、そして真空下で油状残渣まで蒸発せしめた。この残渣を酢酸エチル中１％Ｅｔ３Ｎによりクロマトグラフ処理した。収率：理論量の４８．４％（実際量０．６１　ｇ　／理論１１．２６ｇ）。

１施班久実施例１に記載したのと実質的に同じ方法に従ったが、しかしこの場合テトラエチレングリコール出発物質を最初にフタリミドと反応させなかった。

（ａ）ペンタエチレングリコールのアリル誘Ｒ体の合成１００ｍｆｆ１の乾燥’ ｒ　ＨＦ中ペンタエチレングリコール（５，６５ｇ　。

２０ａ＋ｍｏｌｅ）の溶液にＬ−ブタノールのカリウム塩（２，２４ｇ、　２０ｍｍｏｌｅ）を添加した。この混合物を３０分間撹拌し、そして１８−クラウン −６（５３■、　０．２＋＋＋ａ＋ｏｌｅ）を添加した。混合物をさらに３０分間撹拌し、そして次にアリルブロマイド（２，４２ｇ、　１．７３ｍ１．２Ｑｍｍｏｌｅ）を加えた。臭化カリウムと考えられる白色沈澱が認められ、そして撹拌を一夜続けた。反応混合物をワットマンＧＦＢフィルターを通して濾過し、８ｇの５ｉ０２に吸着せしめ、そして溶剤として塩化メチレンとアセトンとの混合物（１；１）を用いて５ｉＯ１カラム上で分画した。プールされた画分が４．２８　ｇ　（１３，２８ｍｎ＋ｏｌｅ、　６６．４％）の生成物をもたらした。

元素分析は次の通りであった。

計算値：　Ｃ５５，８Ｂ、　Ｈ９，８３測定値：　Ｃ５５，５６；　Ｈ９，７６゜生成物の提案される構造は、８゜２ハしイー（Δヘッｏ／（〃−リスへンであった。

（ｂ）対応するジオールの合成アセトンと水との混合物（８：　１）２７０ｄ中段階（ａ）において調製したアリルエーテル（４，２８ｇ　、　１３．２８ｍｍｏｌｅ）の溶液にＮ−メチルモルホリン（３，１１ｇ　、　４．６　ｒｎｆｌ、　２６．５５ｍｍｏｌｅ、　２当量）及びこれに続いて四酸化オスミウム（Ｌ−ブタノール中２５■／ｄ　；　３３Ｂ■；　１３．５ｍｉ！；　１．３３ｍｍｏｌｅ（０，１当量）を加えた。

この反応混合物を一夜撹拌した０次の朝、１５ｄの水中ナトリウムハイドロサルファイド（３，６２ｇ　）の溶液を加えた。

４５分間の撹拌の後、懸濁液をワットマンＧＦＢフィルターを通して濾過した。

溶剤を蒸発せしめ、残渣をメタノール中に入れ、そして懸濁液を濾過した。濾液をコハク色のシロップ状に濃縮し、このシロップを次にＳｉＯ□上で溶離剤として塩化メチレン、メタノール及び酢酸の混合物（８０：２０：５）を用いて精製した。生成物を含有する両分を濃縮して３．３　ｇ　（９，２６ａ＋＋＋＋ｏｌｅ　、収率６９．７％）の生成物を得た。

この生成物の提案される構造は、（ｃ）段階（ｂ）において調製したトリオール（３，３ｇ。

９．２６＋ａｍ＋ｏｌｅ）を６０ｊｄ！のアセトンに入れ、そして硫酸第二銅（４５ｇ　、　２８．２０ｍｍｏｌｅ）を加えた。生ずる青味がかった懸濁液に６０−〇ＨｔＳＯ，を添加し、この時点で溶液が黄色に変った。フラスコに栓をし、そして−週末にわたって撹拌した０次に、懸濁液をワットマンＧＦＢフィルターを通して濾過し、そして濾液を２．５８のＣａ　（ＯＨ）　ｚ中で１時間処理した。懸濁液を再び濾過し、そして濾液を濃縮しそしてＳｉ０ｇカラム上で精製した。

カラムにクロロホルム／メタール（９７：　３　”）を通し、そして次に再びクロロホルム／メタノール（８：１）を用いた。カラム画分をプールし、３．０３ｇ　（７，６４＋ｕａｏｌｅ、　８２．５％）の生成物生成物の提案される構造は、１旅１の合成を次の様にして行った。

（ａ）へキサエチレングリコール（１０，０ｇ、　３５．４０ｗａｍｏｌｅ）を無水ピリジン（３Ｘ２５ａＮ）と共に共蒸発せしめ、そして次に１００ｍ１！のそれに溶解した。この溶液にＤＭＴ−ＣＩ！　（１３，１７ｇ　。

３８．９４ｍｍ＋ｏｌｅ）を加えた。反応を室温にて行い、そして生成物が出現するまでＴ　Ｌ　Ｃ（ＣＨＣｌ　ｓ　：　ＭｅＯＨ約８：１）によりモニターした。２時間後、２５ｄのメタノールを添加し、そして反応混合物をさらに１５分間撹拌した０次に、この反応を５０ｊｄの氷水により停止せしめ、そして酢酸エチル（３Ｘ１５０ｍ１りにより抽出した。有機層を５％ＮａＨＣＯｚ　（２Ｘ　１００ｍ　）及び飽和ＮａＣ１，（２Ｘ　ｌｏｏｍｌ）により洗浄し、Ｎａ２５Ｏ，により乾燥し、そして次に油状残渣（黄味がかった色）にまで蒸発せしめた。

この油状残渣をシリカゲルカラム（４００ｇ　）上でクロマトグラフ処理した。

カラムをまずＣｌＩＣ（１３／　ＭｅＯＨ（約９７：３）により、次にＣＨＣｌ　３　／　ＭｅＯＨ（約９０　：　１０）により溶出した。両分を一緒にし、そして蒸発乾燥して油状残渣を得た。得られた物質は次の構造：を有するものと予想され、そしてさらに精製することなく、対応するホスホラミダイトの合成において使用した。

（ｂ　）　２．０　ｇ　（３，４０ｍｍｏｌｅ）の（ａ）において得た化合物、１、６　ｇ　（６，８０ｍｍｏｌｅ）のホスホラミダイト：及び１．７６　ｇ　（１３，６０ｍｍｏｌｅ）の（（Ｃｌｈ）ｚ　Ｃｌ）　Ｎ　Ｅｌを用いて実施例１（ｅ）の方法を反復した。生成物の元素分析は、Ｃ４□１１６１Ｎ２０１゜ＰｘＨｚＯについて予想した通りであった。

計算値：　Ｃ６３，４９；　Ｈ７，９３；　Ｎ　３．５２測定値：　Ｃ６３，３６、ＩＩ７．９５　；　Ｎ　４．１１゜収率：理論量の８５．４％（２，２８ｇ　／２．６７　ｇ　）。

某ＪＬ［汁Ｌ（ａ）化合物：〔化合物（２６）　、スキーム■、ステップ（１）を参照のこと］の合成を次の様にして行った。７５ｍ！の乾燥ＴＨＦＨＦジトリフェニルホスフィン、８７　ｇ　、　３０ｍｏｎｏｌｅ）のＯ″Ｃの溶液に撹拌しながらアゾジカルボキシレート（ＮＣＯＯＣＨ（Ｃｔ（：＋））ｚ　（６，０７ｇ　、　３０ｍｍｏｌｅ）を加えた。１時間後、１０　ｍｆｌの乾燥ＴＨＦＨＦ中子トラエチレングリコール、８３　ｇ　、　３０ｍｍｏｌｅ）の溶液を加えた。溶解したすべての物質が淡黄色溶液を与えた。１時間の後、２０ｄの乾燥ＴＨＦ中メルカプタンφ、Ｃ− ＳＨの溶液を、冷去及び撹拌しながら滴加した。反応混合物を一夜撹拌し、そして溶剤を減圧下に除去した。残渣をＳｉＯ□カラムに適用し、そし°ζ塩化メチレン及びこれに続き塩化メチレンとＣ）１．ｃＮとの混合物（２：１）を用いて分画した。物質をＳｉｎ、上で溶離剤としてＣＨ，ＣＮを用いて再クロマトグラフィー処理し、そして生成物をφＰ＝０から、小（約１５ｄ）画分を取ることにより取り出した。

両分をプールし、５．２２　ｇ　（１１，５３ｍｍｏｌｅ、　３８．４％全体収率、理論量の７７％）を得た。元素分析の結果は次の通りであった。

計算値：　Ｃ７１，６５；　Ｈ７，１２；　Ｓ　７．０８測定値：　Ｃ７１，３２；　Ｈ７，２１；　Ｓ　７．１５゜（ｂ）次に、対応するホスホラミダイト：の合成を、実施例１　（ｅ）に記載した方法に従って、段階（ａ）の反応生成物（４，２２ｇ　、　９．３０ｍｍｏｌｅ）、ホスホラミダイト　：（４，４０ｇ、　１８．６（ｌＩｍｍｏｌｅ）　、及び（（ＣＨ３）２ＣＨ）　ｚＮ−Ｅｔ　（４，８１ｇ　。

３７．２０＋ｒｍｏ１ｅ）を用いて行った。収率：理論量の７５．３％（４，５７ｇ　／６．０７　ｇ　）。

実ＪＪ江乳（ａ）化合物：の合成を次の様にして行った。１５ｄの乾燥ＴＨＦＨＦジトリフェニルホスフィン、８７　ｇ　、　３０ｍｍｏｌｅ）の０°Ｃの溶液に、撹拌しながらジイソプロピルアゾジカルボキシレート（ＮＣＯＯＣＨ（ＣＨ３））２（６，０７ｇ　、　３０ｍｍｏｌｅ）を加えた。１時間後、１０ｄの乾燥ＴＨＦＨＦ中子トラエチレングリコール、８３　ｇ　、　３０ｍｍｏｌｅ）の溶液を加えた。溶解したすべての物質が淡黄色溶液を与えた。１時間後、２０ｄの乾燥Ｔ　ｌ−Ｉ　Ｆ中メルカプタンφ、Ｃ−５１１の溶液を、冷却及び撹拌しながら滴加した。反応混合物を一夜撹拌し、そして溶剤を減圧下で除去した。残渣をＳｉＯ□カラムに適用し、そして塩化メチレン及びそれに続き塩化メチレンとＣＨ３ＣＮとの混合物（２７１）を用いて分画した。物質を５ｉＯｔ上で溶離剤としてＣＨ３ＣＮを用いて再クロマトグラフ処理し、そして生成物をφ３Ｐ＝０から、小（約１５ｍｊり画分を取ることにより取り出した。画分をプールし、５．２２ｇ　（１１，５３ｍｍｏｌｅ　；全体収率３８．４％；理論量の７７％）を得た。元素分析は次の通りであった。

計算値：　Ｃ７１，６５：　Ｈ７，１２；　Ｓ　７．０８測定値：　Ｃ７１，３２；　Ｈ７，２１；　Ｓ　１１５゜（ｂ）ホスホラミダイト：段階（ａ）で得られた生成物（４，２２ｇ　、　９．３０ｍｍｏｌｅ）を１０戚の酸不含有クロロホルムに溶解し、そしてアルゴンによりレフレッシュされた２５０ｍ１丸底フラスコに入れた。この溶液に０．７２　ｇ　（５，６ｍｍｏｌｅ）の（（ＣＨ３）　ｚＣＨ）　２ＮＥｔを加えた。次に、ホスホラミダイト：（０，６６ｇ　、　２．８ｍｍｏｌｅ）を注射器を用いて２分間にわたり加えた。室温にてアルゴンのもとて反応を行った。１時間後、混合物を５０ｄの酢酸エチルと共に２５０Ｊｄの分液漏斗に移し、そして飽和ＮａＣｌ溶液により４回抽出した。有機層をＮａｚＳＯｎで乾燥し、そして真空下で油状残渣にまで蒸発せしめた。この残渣を酢酸エチル中１％ＥｔＪによりクロマトグラフ処理した。

ｉ　ｎ＋ａｌ−ｓａｃ−ＨＮＳＡエスールの１１゛告１モル当量（２，２４ｇ　）の４−ヒドロキシ−３−二トロベンゼンスルホン酸ナトリウム塩（ＩＩ　Ｎ　Ｓ　Ａ　）を１モル当量（２，０６ｇ　）のジシクロヘキシルカルボジイミドのＮ−マレイミド−６−アミノカプロン酸と２５ａｆｆｉのジメチルホルムアミド中で室温にて混合した．ジシクロヘキシル尿素の白色沈澱が生成した．この沈澱を濾去し、そして母液に３００ｄのジエチルエーテルを加えた。約１０分間〜４時間後、母液からゴム状の固体が沈澱した。この固体は５８％の活性ＨＮＳＡエステル及び４２％の遊１＠ＨＮＳＡを含有していることが見出された。

少量の沈澱を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、そして４０６ｎｎ＋での吸光を測定することにより分析を行った．この読みが未反応の遊離ＨＮＳＡの量を与え、これが粗ＨＮＳＡエステル中の挾雑物質である。非常に少量の濃強塩基（５　Ｎ　ＮａＯＩＩ）の添加がこのエステルを加水分解した．第二の続みを取った。

第二の読みから第一の読みを差引いた差がもとの物質中のエステルの量を与えた．生成目的のため、前記固体をＤＭＦに溶解し、ＬＨ２０セファデックスカラム上に置き、そしてＤＭＦで溶出することによりエステルを挟雑遊離ＨＮＳＡから分離した。

精製の進行を、溶出溶剤としてクロロホルム、アセトン及び酢酸（６：３：１＝ｖ：ｖ：ｖ）を用いる薄層クロマトグラフィーによりモニターした．生成物は、アミンと反応するその活性によりｍａｌ　−ｓａｃ　ＨＮＳＡとしてポジティブに同定された。

生成した粗エステルの量は理論量の約３０％であると算定され、生成された物質は９９％のエステルから成っていた。

こうして得られたエステルは水に十分に溶解することが見出され、そして親核物質が添加されなければ数時間にわたり水中で安定であることが見出された．精製されたエステルは乾燥状態で貯蔵されれば長期間安定であることが見出された。

Ｍ　ｍａｌ−ｓａｃＨＮｓＡエスールと　′　サビパーオキシ゛−ゼ（）！ＲＰ　との　八　の″ ｍａｌ　−ｓａｃ　ＨＮＳＡエステルとＨＲＳとのアミドを次の様にして製造した。

合計４０ｍｇ　（　１．　０　μｏ＋ｏｌｅ）のＨＲＰ　（シグマ・ケミカル社）を０．　５　Ｊｌｌｌ！の０．　１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、全アミン濃度を３．　７　ＸＩＯ−’Ｍとした．次に、実施例６Ａのデーターから計算して５１ｎｇ　（　１．　Ｉ　Ｘ　１０−’ｍｏｌｅ）の実施例５Ａのｍａｌ　−ｓａｃ　ＨＮＳＡエステルを０．　５　ｄのＨＲＰ溶液に溶解した．この混合物を室温にて撹拌し、そしてＨＲＰ画分（２．８ｍ）をファルマシアＧー２５カラム上に集め溶剤として０．　１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を使用した。

ｎ　ＨＲＰ−オｉゴヌクレオチド　八　の１′告バイオサーチ８６３０　ＤＮＡシンセサイザーで合成した次の１９−ｍａｒ　：　ｄ（ＴＧＴＴＴＧＣＣＴＧＴＴＣＴＣＡＧＡＣ）を用いてチオール−官能化オリゴマーを調製した。

実施例１（ｂ）で得られたスルヒドリル官能化試薬をオリゴマーの溶液と混合し、そして標準的ホスホラミダイトカップリング条件〔例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）　、前掲〕下でそれにカップリングさせた。

トリチルチオ・オリゴマーを、分取用ＰＲＰーカラム、及び次の溶剤系〔ここで、溶剤「Ａ」はＣＨｓＣＮであり、そしてｒ１３Ｊは０．　１　Ｍ　ＴＥＡＡ（ｐＨ　７．　２　）中５％ＣＨ３ＣＮである）：（１）Ａ：１０％→４０％、１５分間；（２）Ａ：４０％→１００％、１５分間；及び（３）Ａ：１００％、５分間、を用いて精製した．トリチルチオ・オリゴマーは約２０分後に溶出した。

こうして得られた精製トリチルチオ・オリゴマーを、硝酸銀及びジチオスレイトール（０．　１　Ｍ　ＴＥＡＡ（ｐＨ６．　５　）中それぞれ０．　１　Ｍ及び０．１５Ｍ）を用いて脱トリチル化した。次に、ジトリチル化オリゴマーをＧ　 −　２５　（ＮＡＰ−１０）カラムに通し、真空濃縮して約１００ｉ１１とし、そして次の接合反応においてすぐに使用した。

実施例７において調製したｍａｌ　−ｓａｃ　ＨＲＰ複合体（７００ｍ）をチオオリゴマーに分配して最終容量８００Ｉとした。個々の反応容器を室温にて約１時間、そして次に約４℃にて約２日間保持し、そしてこの時点で４種類の接合体を取り出し、そしてＤＥＡＥ　Ｎｕｃｌｅｏｇｅｎカラム上で次の溶剤勾配（「Ｂ」は２０ｓ＋ＭＮａｔＰＯａ　（ｐＨ６　）　；　’ＣＪは２０ｍＭ　ＮａｔＰＯ４＋　Ｉ　Ｍ　ＮａＣＩ２　（ｐＨ６　）を意味する）：　（１）Ｂ：Ｏ→ １００％、３０分間；（２）Ｃ：１００％、１０分間；及び（３）Ｃ：１００％ →０％、５分間、を用いて精製した。残りの未接合ＨＲＰ及びオリゴマーはそれぞれ約２分間後及び約１５〜４０分間後（オリゴマーのサイズに依存する）に溶出し、他方接合体は同様に約１５〜４０分間後（やはりオリゴマーのサイズに依存する）に溶出した．生成物の同一性は、オリゴマー（２６０ｎｍ　）及びＨＲＰのヘム基（４０２ｎｍ）のピーク吸光をモニターして紫外線分光法により確認した。

手続補正書く方式）平成３年　１月　１０日

Claims

【特許請求の範囲】

１．次の構造： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒは保護されているか又は保護されていないアミノ、スルヒドリル又はヒドロキシル成分であり；Ｒ＊は水素、−ＣＨ２ＯＨ、又は次の式：▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４，Ｘ５及びＸ６は同一でも異っていてもよく、そして水素、低級アルキル及び低級アルコキシから成る群から選択される）により表わされる置換基であり；Ｒ１及びＲ２は独立に水素及び低級アルキルから成る群から選択され；Ｒ３はβ−シアノエチル又はメチルであり；Ｑ成分は次の基： −Ｏ−，−ＮＨ−，−Ｓ−，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼及び▲数式、化学式、表等があります▼から成る群から選択され、そして同一でも異っていてもよく；ｎ′，ｎ′′及びｎ′′′は２と１０（２及び１０を含む）の範囲の整数であり；そしてｎは２と３０（２及び３０を含む）の範囲の整数である〕を有するオリゴヌクレオチド官能化試薬。
２．Ｒが−ＯＨ，−ＳＨ、又は−ＮＨ−αであり、ここでαが水素又は低級アルキルである、請求項１に記載の試薬。
３．Ｒが保護されたアミノ成分である請求項１に記載の試薬。
４．Ｒが次の基： ▲数式、化学式、表等があります▼及び▲数式、化学式、表等があります▼から成る群から選択されたものである請求項３に記載の試薬。
５．Ｒが保護されたスルヒドリル成分である請求項１に記載の試薬。
６．Ｒが次の基： ▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、化学式、表等があります▼及び▲数式、化学式、表等があります▼から成る群から選択されたものである請求項５に記載の試薬。
７．Ｒ＊が−Ｏ−ＤＭＴである請求項１に記載の試薬。
８．Ｒ１及びＲ２が低級アルキルである請求項１に記載の試薬。
９．Ｒ１及びＲ２がイソプロピルである請求項８に記載の試薬。
１０．Ｒ３がβ−シアノエチルである請求項１に記載の試薬。
１１．次の構造： ▲数式、化学式、表等があります▼
１２．アミン成分を導するためにオリゴヌクレオチド鎖のヒドロキシル基を官能化する方法であって、請求項３の官能化試薬をカップリング条件下で遊離ヒドロキシル基を有するオリゴヌクレオチド鎖と反応せしめ、該オリゴヌクレオチド鎖が保護されたアミン成分を有するようにする段階を含んで成る方法。
１３．複数のヒドロキシル基を官能化する請求項１２に記載の方法。
１４．末端５′−ヒドロキシル基を官能化する請求項１２に記載の方法。
１５．スルヒドリル成分を導入するためにオリゴヌクレオチド鎖のヒドロキシル基を官能化する方法であって、請求項５に記載の官能化試薬を遊離ヒドロキシル基を有するオリゴヌクレオチド鎖と反応せしめ、該オリゴヌクレオチド鎖が保護されたスルヒドリル成分を有するようにする段階を含んで成る方法。
１６．複数のヒドロキシル基を官能化する請求項１５に記載の方法。
１７．末端５′−ヒドロキシル基を官能化する請求項１５に記載の方法。
１８．次の構造式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒは保護されているか又は保護されていないアミノ、スルヒドリル又はヒドロキシル成分であり；Ｒ■は水素、−ＣＨ２ＯＨ、又は次の式：▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４，Ｘ５及びＸ６は同一でも異っていてもよく、そして水素、低級アルキル、及び低級アルコキシから成る群から選択される）により表わされる置換基であり；Ｒ１及びＲ２は独立に水素及び低級アルキルから成る群から選択され；Ｒ３はメチル又はβ−シアノエチルであり；そしてｎは２と１０（２及び１０を含む）の範囲の整数である〕により表わされるオリゴヌクレオチド官能化剤の合成方法であって、式ＨＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨのジオールを式Ｒ−Ｈの化合物とカップリングさせることにより式Ｒ−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨのアルコールを生成せしめ；そしてこうして得られたアルコールを、次の構造式：▲数式、化学式、表等があります ▼ （式中、Ｘはハロゲン脱離基である）で表わされるホスホラミダイトと、ホスホラミダイトカップリング条件下で反応せしめる；段階を含んで成る方法。
１９．次の式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒは保護されているか又は保護されていないアミノ、スルヒドリル又はヒドロキシル成分であり；Ｒ＊は水素、−ＣＨ２ＯＨ、又は次の式：▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４，Ｘ５及びＸ６は同一であっても異っていてもよく、そして水素、低級アルキル及び低級アルコキシから成る群から選択される）により表わされる置換基であり；Ｒ１及びＲ２は独立に水素及び低級アルキルから成る群から選択され；Ｒ３はメチル又はβ−シアノエチルであり；そしてｎは２と１０（２及び１０を含む）の範囲の整数である〕により表わされるオリゴヌクレオチド官能化試薬の合成方法であって、トシル化ポリエチレングリコールをソルケタール陰イオンにカップリングさせて次の構造： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有するケタールを生成せしめ；こうして得られたケタールをトリフェニルホスフィンの存在下で式Ｒ−Ｈの化合物と反応せしめることにより該ケタールの末端ヒドロキシル基を−Ｒで置き換え；該Ｒ−置換ケタールを脱保護して、次の構造式：▲数式、化学式、表等があります▼ により表わされるジオールを生成せしめ；該Ｒ＊−置換ジオールを次の構造： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有するホスホラミダイトに、ホスホラミダイトカップリング条件下でカップリングせしめる；段階を含んで成る方法。
２０．次の構造式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ１及びＲ２は独立に水素及び低級アルキルから成る群から選択され；そしてＲ３はメチル又はβ−シアノエチルである）で表わされるオリゴヌクレオチド官能化試薬の合成方法であって、次の構造式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされるジオールを、トリフェニルホスフィン及び▲数式、化学式、表等があります▼ の存在下でφ３Ｃ−ＳＨにカップリングさせて、置換されたアルコール： ▲数式、化学式、表等があります▼ を生成せしめ；そしてこうして得られた置換されたアルコールを次の構造式：▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｘはハロゲン脱離基である）で表わされるホスホラミダイトと、ホスホラミダイトカップリング条件下で反応せしめる；ことを含んで成る方法。