JPH03503892A - 免疫反応を増強する方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 免疫反応を増強する方法及び組成物 技術分野 この発明は、１種又は１種以上の生物適合性重合体又は共重合体、望ましくは生 物分解性重合体又は共重合体の賦形剤にカプセル封じされた生物活性剤を経口投 与し、それらマイクロカプセルの適当な大きさおよび物理化学的性質のためにマ イクロカプセルおよび含有された生物活性剤を動物の胃腸道の小胞リンパ管集合 体（バイアー斑として知られる）に到達させると共に胃腸道を通過したために生 物活性剤の作用効力を失うことなく小胞リンパ管集合体に効果的に吸収されるマ イクロカプセルを供給する方法および製剤に関する。

背景技術 敏感な生物活性剤の分解を防ぐためにマイクロカプセル封じを用いることは周知 のこととなった。典型的に、生物活性剤は多数の保護壁材料、一般に重合体材料 の中にカプセル封じされる。カプセル封じされる生物活性剤は重合体材料の単一 壁でコーティングしたシ（マイクロカプセル）、或いは重合体マトリックス内に 均一に分散させることができる（微小球）。以後、用語「マイクロカプセル」は 、マイクロカプセルと微小球の両方を意味する。マイクロカプセル内の生物活性 剤の量は必要に応じて変えることができ、少量からマイクロカプセル組成の９５ チ又はそれ以上の範囲にすることができる。マイクロカプセルの直径も必要に応 じて１μｍ以下から３寵又はそれ以上の大きさに変えることができる。

前記バイアー斑（Ｐｅｙｅｒ’ｉ　ｐａｔｃｈｅｓ）　　は小腸、大腸および盲 腸の壁に位置するリンパ小節の集合体であって、感染性剤や他の体に対する異質 の物質の粘着および浸透に対する体の重要な防遠部分である。抗原は体の抗体− 産生および（または）細胞−仲介免疫系を誘導する物質であって、異質のタンパ ク質や組織のような物を含む。抗原と免疫系との相互作用によって誘導される免 疫反応は抗体を配置する体の能力又は後続の抗原への再露出に対する細胞仲介免 疫反応に関して陽性又は陰性になる。細胞仲介免疫反応は異質細胞又は組織を殺 すこと、「細胞−仲介細胞毒性」および遅延型超高感度反応のような反応を含む 。抗体と抗原が結合すると、それらは複合体を生皮する。この複合体は体からの 抗原の一掃を助け、感染性剤のような生きた抗原および異質の組織又は癌を殺す のを促進し、トキシン又は酵素の活性を中和する。体の粘、膜表面の場合に、こ れらの部位を洗う分泌液に存在する主クラスの抗体は分泌免疫グロブリンＡ（ｓ Ｉ＃Ａ）である。分泌ＩＰＡ抗体は。

体の粘膜組織へおよび該組織を通る感染性剤および他の抗原の粘着および浸透を 防止する。

多数の抗原が粘膜組織を通して体の中に入るが。

抗原やワクチンの筋肉内又は皮下注射のような一般に用いられている方法は粘膜 の分泌液に５ＩＪＦＡ抗体の出現を滅多に誘発しない。分泌液０ＩｔＡ抗体は。

粘膜に関連したリンパ系組織の直接免疫化によって最も効果的に誘導される。

胃腸道のバイアー斑は、胃腸道および上部呼吸管の板固有領域に居住することが できると共に成熟したＩｊ’Ａ合成用血漿細胞に分化するＩＰＡ前駆体Ｂ細胞を 有する。抗体分子を実際に分泌するのはこれらの血漿細胞である。抗原で経口免 疫化されたマウスにおけるＩｔ人反応の発生を測定するバーマンおよびパチンに よる研究は、抗原−特異的ＩｔＡ血漿細胞の連続的出現が最初腸間膜のリンパ小 節に、次に膵臓に、そして最後に胃腸道の固有板に発生することを示したＱ３ａ ｚｉｎ、Ｈ，、Ｌｅｖｉ、　Ｇ、、　ａｎｄ　Ｄｏｒｉａ、Ｇ、。

“Ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ　ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩＰＡ　ａｎｔ ｉｂｏｄｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ　ｔｏ　ａｎ　ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｓ ｐｏｎｓｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎ　ｅｘｔｒａｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｌｙｍ ｐｈｏｉｄ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｏｆ　ｇｅｒｍｆｒｅｅ　ｍ１ｃａ　ｅｘｐｏｓ ｅｄ　ｔｏ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｖｉａ　ｔｈｅ　ｏｒａ＋ｒｏｕｔｅ、’、Ｊ、 　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　１０５：１０４９：　　１９７０：ａｎｄ　　０ｒａ ｂｂｅ。

Ｐ、Ａ、、　　Ｎａ５ｈ＋　　Ｄ、Ｒ，、Ｂａｚｉｎ、Ｈ，、Ｅｙｓｓｅｎ、　 　ａ　　ａｎｄＨｅｒｅｍａｎｓ＋　　Ｊ、Ｆ、、”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　　 ｏｆ　　ｔｈｅ　　ＩＰＡ　　ｔｙｐｅ　　１ｎｉｎｔｅｓｔｉｎｅｌ　　Ｐｌ ａｓｍａ　　ｃｅｌｌＳ　ｏｆ　　ｇｅｒｍ−ｆｒｅｅ　　ｍ１ｃａ　　ａｆｔ ｅｒｏｒａｌ　　ｏｒ　Ｐａｒｅｎｔｅ’ｒａｌ　　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ 　ｗｉｔｈ　　ｆｅｒｒｉｔｉｎ、”Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　　１３０ニア２３ ：　　１９６９））　　。

その後の研究は、抗原の経口投与が腸および腸から離れた粘膜の分泌液にも１例 えば気管支洗浄液、初乳、乳、唾液および涙にｓＩｊ’Ａ抗体の産生を導くこと を示している１ｌｅｓｔｅＣｋｙ、　Ｊ、　、　ＭｃＧｈｅｅ、　Ｊ、　Ｒ，、 Ａｒ−＋ｏ、１ｄ。

ＦＬ　ＬＩ　Ｍｉｃｈａｌｅｋ、　Ｓ、Ｍ、、　Ｐｒ１ｎｃｅ＋　Ｓ、Ｊ、　ａ ｎｄ　Ｂａｂｂ。

Ｊ、Ｌ、、　”５ｅｌｅｃｔｉｖｅ　１ｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　ｉｍｍ ｕｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｅｘｔｅｒｎａｌ　５ｅｃｒｅｔ ｉｏｎｓ　ｂｙ　ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ　ｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｎｔｉｇｅ ｎ、”、　Ｊ、　０１ｉｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　６１ニア３１：１９７８：Ｍｏ ｎｔｇｏｍｅｒｙ、　Ｐ、　Ｑ、　、　Ｒｏｓｎｅｒ、　Ｂ、　Ｌ　ａｎｄ　Ｃ ｏｈｅｎ。

Ｊ、、　”Ｔｈｅ　５ｅｃｒｅｔａｒｙ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ 、　Ａｎｔｉ−ＤＮＰａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　１ｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｄｉｎｉ ｔｒｏｐｈｅｎｙｌａｔｅｄ　Ｔｙｐｅエエエｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、”＋ 　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　３：１４３：１９７４：　ａｎｄ　Ｈａ ｎｓｏｎ、　Ｌ、Ａ、、　Ａｈｉｓｔｅｄｔ、　Ｓ、、　０ａｒｌｓｓｏｎ。

Ｂ、、　Ｋａｉｊｓｅｒ、　Ｂ、、　Ｌａｒｓｓｏｎ、　Ｐ、、Ｍａｔｔｓｂｙ Ｂａｌｔｚｅｒ。

Ａ、、　８ｏｈｌ　Ａｋｅｒｌｕｎｄ、ん、　Ｓｖａｎｂｏｒｇ　Ｅｄｅｎ、　 Ｏ，ａｎｄＤｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ、　Ａ、Ｍ、、　”５ｅｃｒｅｔａｒｙ　Ｉ ＰＡ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏ　　ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌ　　ｖｉ ｒｕｌｅｎｃｅ　　ａｎｔｉｇｅｎｓ：ｔｈｅｉｒＭｅｄ、Ｂｉｏｌ、　１００ ７：１６５：　１９７８）　）　。従って、バイアー斑は前駆体の工ｔＡ細胞の 富化源であって、それらＩＰＡ細胞は抗原感作に続いて環状移動通路に従って移 動して初抗原暴露の領域と離れた粘膜表面の両方においてＩＰＡの発現を引き起 すことは明らかである。この環状パターンは感作Ｂ細胞を粘膜部位へ連続的に輸 送して腸で遭遇した環境の抗原および潜在的な病原体に対して反応をする粘膜免 疫系を提供する。

本発明の特に重要なのは経口投与が保護抗体を誘発する能力である。動物による 抗原の摂取は気管支および鼻の洗液に抗原−特異的ｓＩ＃Ａ抗体をもたらすこと が知られている。例えば、インフルエンザ・ワクチンの経口投与は鼻の分泌液に おける分泌抗−インフルエンザ抗体の誘発に有効であることが研究されている。

多くの研究の粘膜の免疫系を誘発する経口投与の可能性を示しているが、稀な例 外はあるが有効な免疫化を達成するのに大用量を必要とすることがこの方法を非 実用的にしている。成分の経口投与を含むいずれの方法又は製剤もそれが胃腸道 を通過する間に成分が分解しないようにして成分のバイアー斑への供給を狙う設 計になっていることは明らかである。

そうでないと、その成分は不適当な量又は有効でない条件下でバイアー斑に到達 することになる。

従って、免疫系を効果的に刺激すると共に、胃腸道を経てバイアー斑へ到達する 間の抗原の分解問題を解決する経口免疫化法が必要である。さらに詳しくは、抗 原をバイアー斑に標的させてその抗原を一旦体の中に放出させる方法が必要であ る。また、抗原の分解問題を解消して、粘膜−関連リンパ系組織への供給を狙う ところの体の他の粘膜組織を介して免疫化する方法が必要である。さらに、粘膜 に付加した生物活性剤の分解を防ぎ、それらの粘膜−関連リンパ系組織を介して 体の中に入るのを改善および（または）標的して１体に入った生物活性剤を一旦 放出させる必要がある。

発明の開示 本発明は、粘膜への塗布、特に経口および気管内投与によって動物の体に生物活 性剤を標的および放出する方法および製剤に関する。その生物活性剤は。

生物適合性重合体又は共重合体、望ましくは生物活性剤が変化なく有効量でバイ アー斑又は他の粘膜に関係したリンパ系組織に達して入るように分解することな く又は最少の分解で胃腸道を通過できる又は粘膜表面に存在することができる生 物分解性重合体又は共重合体にマイクロカプセル封じされる。用語「生物適合性 」は、体に有毒でなく、発癌性でなく、体の組織をもた牡さない重合体材料と定 義される。

マイクロカプセルの重合体賦形剤は、肉体的プロセスによって体で容易に処理で きる生成物に分解して体に蓄積しない意味において生物分解性であることが望ま しい。それらのマイクロカプセルはバイアー斑によって効果的かつ選択的に吸収 できるサイズおよび物理化学的組織も有する。従って、バイアー斑又は他の粘着 に関係した組織に到達して吸収されるという問題は解決される。

本発明の目的は、抗原をバイアー斑に到達してバイアー斑によって吸収され、そ れによって動物の胃腸道を通過する結果としてその作用効果を失うことなく、粘 膜の免疫組織を刺激するところの抗原を動物に経口投与する方法を提供すること である。

また１本発明の目的は、抗原をバイアー斑に到達してパイプ−斑によって吸収さ れ、それによって動物の胃腸道を通過する結果としてその作用効果を失うことな く、全身の免疫組織を刺激するところの抗原を動物に経口投与する方法を提供す ることである。

さらに本発明の目的は、抗原が粘膜−関連リンパ系組織に到達して該リンパ組織 によって吸収され。

それによって粘膜表面上での分解の結果としてその作用効果を失うことなく抗原 を動物に投与する方法を提供することである。

さらに本発明の目的は、抗原が粘膜−関連リンパ系組織に到達して該リンパ系組 織によって吸収され。

それによって粘膜表面上での分解結果としてその作用効果を失うことなく抗原を 動物に投与する方法を提供することである。

さらに本発明の目的は、生物活性剤がバイアー斑に到達してバイアー斑によって 吸収され、それによって生物活性剤の局部的又は全身的濃度を高めるところの生 物活性剤を動物に経口投与する方法を提供することである。

さらに本発明の目的は、生物活性剤が粘膜−関連リンパ系組織に到達して該リン パ系組織によって吸収され、それによって生物活性剤の局部的又は全身的濃度を 高めるところの生物活性剤を動物に投与する方法を提供することである。

さらに本発明の目的は、コアの生物活性成分と。

生物適合性でかつ望ましくは生物分解性であって、前述の粘膜−投与方法に利用 できるカプセル封じ用重合体又は共重合体の賦形剤からなる製剤を提供すること である。

本発明の他の目的は、免疫強化剤の必要がない優れ九ワクチン放出系を提供する ことである。

さらに本発明の目的は、マイクロカプセル封じの抗原の単一投与による抗原の拍 動的放出を通して免疫を誘導する優れたワクチン放出系を提供することである。

さらに本発明の目的は、免疫強化剤の必要をなくすると共にマイクロカプセル封 じの抗原の単一投与による抗原の拍動的放出を通して免疫を誘導する優れたワク チン放出系を提供することである。

さらに本発明の目的は、前記の目的を達成できる組成物を提供することである。

図面の簡単な説明 第１図は終点滴定法によって測定されたマウスにおける血漿工？Ａ反応を示す。

発明を実施するための最良の形態 本発明の実施態様を実施する方法を以下に説明する。これらの説明は、抗原（ト リニトロフェニル・スカシガイ・ヘモシャニンおよびブドウ状球菌エンテロトキ シンＢ）と５０　：　５０ポリ（ＤＬ−ラクチドーコーグリコリド）にカプセル 封じされた薬剤（エントレチナート）のマウスへの粘膜−関連リンパ系組織標的 およびプログラムド放出を説明する。

しかしながら、ポリ（ＤＬ−ラクリドーコーグリコリド）−の外に他の重合体も 使用できうることに留意する必要がある。かかる重合体は、限定ではないが、例 えばポリ（グリコリド）、ポリ（ＤＬ−ラクチドーコーグリコリド）、コポリシ ュウ酸塩、ポリカプロラクトン。

ポリ（ラクチドーコーカプロラクトン）、ポリ（エステルアミド）、ポリオルト エステルおよびポリ（８−ヒドロキシ酪酸）および多価無水物である。

また、他の生物活性成分も使用することができる。

限定ではないが１例えば、ノ（イアル、細菌、原虫。

真菌の病気、例えばインフルエンザ、呼吸シンチウム、パラインフルヘンザ・ウ ィルス、ヘモフィルス・インフルエンザ、百日ぜき、淋菌、連鎖球菌性肺炎菌お よび熱帯性マラリア原虫、又は病原性微生物に起因する他の病気に対して予防接 種の抗原又は駆虫薬病原体のような生物による病気に対する予防接種の抗原又は アレルギーに対する予防接種の抗原を含む。さらに使用できる別の生物活性剤１ 例えば免疫調節剤、栄養素、薬剤、ペプチド、リンフ才力インおよびサイトカイ ンが含まれる。

■、マイクロカプセル封じ クマリン（水不溶性螢光染料）を非分解性であるポリスチレンでマイクロカプセ ルに包み、そのマイクロカプセルがバイアー斑に浸透するの全追従するために使 用できる螢光マイクロカプセル調製した。

これらマイクロカプセルの調製に用いた手順は次の通りである： 先ず、塩化メチレン（イーストマン・コダック社の試薬品位）　２９．５　？に ポリスチレン（ダウケミカル社の製品、タイプ６８５　Ｄ　）　４．９　ｓ　＃ を溶解することによって重合体溶液を調製する。次に、クマリン（ｐｏｌｙｓｃ ｉｅｕｃｅｓ社の製品）約０．０５　ｊ’をその重合体溶液に添加して、混合物 を磁気かくはんバーでかくはんすることによって溶解させる。

別の容器で、脱イオン水３６０ｔにポリ（ビニルアルコール（ＰＶＡ）（商品名 Ｖｉｎｏｌ　２０５０．　ＡｉｒＰｒｏｄｕｃｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓ　　社の製品〕　４０ｔを溶解させることによって、プロセシング媒質である １０重量％のＰＶＡ水溶液を調製する。ＰＶＡ溶液の調製後、塩化メチレン６ｔ を添加することによってその溶液を飽和させる。次に、そのＰＶＡ溶液をかくは んシャフトおよび６．３５ｃｒｎ（１５ｉｎ）のテフロン羽根車を備えたＩｔの 樹脂ケラトル（Ａｃｅ　Ｇｌａｓｓ社製）に添加してフィッシャーの定速度モー タによシ約３８　Ｏｒｐｍでかくはんした。

次にポリスチレンとクマリンの混合体をＰＶＡプロセシング媒質を含有する樹脂 ケラトルに添加する。

これは、混合体を樹脂ケラトルに向ける長いステムの７ｍ穴漏斗を通して混合体 を注入することによって行なう。安定な水中油型エマルションが得うれる。

次にそれを大気圧下で約３０分間かくはんして適当な大きさの微細油滴を得る。

次に樹脂ケラトルを密閉して、マノメータおよびブリード弁に接続された水アス ピレータによって樹脂ケラトル内の圧力を徐々に５２０ｔｘＨｔ’４で下げる。

樹脂ケラトルの内容物を減圧下で約２４時間かくはんして塩化メチレンの全てを 蒸発させる。全ての塩化メチレンを蒸発させた後、硬化したマイクロカプセルを 遠心分離法によって収集して、室温に保持された真空室内で７２時間乾燥する。

ＴＮＰ−ＫＬＨ（水溶性抗原）を生物適合性、生物分解性ポリエステルであるポ リ（ＤＬ−ラクチドーコーグリコリド）によってカプセル封じを行つ念。

マイクロカプセルの調製に使用した方法は次の通りである： 最初に、重合体溶液は塩化メチレン４．Ｏｆに５０＝５０のポリ（ＤＬ−ラクチ ドーコーグリコリド）０．５２を溶解させることによって調製された。次に、Ｔ ＮＰ−ＫＬ）（の水溶液３００μＬ（４６ダＴＮＰ−Ｌ　Ｋ　Ｈ／　ｍ　Ｌ　： 透析後）をポリ（ＤＬ−ラクチド−コルグリコリド）溶液に添加し、その混合体 をＶｏｒｔｅｘ−Ｇｅｎｉｅ　２（商品名、米国ニューヨーク州ボヘミアに在る ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社の製品）で渦流を発生させるこ とによって均一に分散させた。

別の容器において、脱イオン水５５．２Ｊｌ’１ＣＰＶＡ４．８ｔを溶解させる ことによって８重量％のＰＶＡ水溶液を調製した。ＰＶＡの溶解後、そのＰＶＡ 溶液をかくはん機と３．８（７）（１，５宜ｎ）のテフロン製タービン羽根車を 備えた１００１ｄの樹脂ケラトル（米国ニュージャーシイ州ビネランドにあるＫ ｏｎｔｅｓＧｌａｓｓ社の製品）に添加した。その重合体溶液は次に長ステム、 ７關穴の漏斗を通して注入することによりＰＶＡプロセシング媒質に添加した。

この添加中にＰＶＡ溶液は約６５Ｏｒｐｍでかくはんした。

得られた水中油形エマルションを樹脂ケラトル中で約１０分間かくはんした後、 樹脂ケラトルの内容物は４ｔのビーカーに入った３、５ｔの脱イオン水に移して 、　５ｃｒｒ１（２ｉｎ）のステンレス鋼羽根車で約８０゜ｒｐｍでかくはんさ れた。得られたマイクロカプセルは脱イオン水中で約３０分間かくはんし、遠心 分離により収集し、脱イオン水で２回洗浄して全ての残留ＰＶＡを除去し、次に 凍結乾燥によって収集した。

マイクロカプセル製品は直径が約１〜１０μｍの球状粒子からなった。他のマイ クロカプセル、例えばブドウ状球菌エンテロトキシンＢマイクロカプセルも同様 の方法で作ることができる。

抗原を負荷したマイクロカプセルのＴＮＰ−ＫＬＨ含量、すなわちマイクロカプ セルのコア・ローディングは１２ゴの沈殿管中の抗体−負荷マイクロカプセル１ ０Ｍ９を検量することによって決定した。その沈殿管に塩化メチレン３．Ｏ−を 添加し、かくはんして（ＤＬ−テクチドーコーグリコリド）を溶解した。

次に、その沈殿管に脱イオン水３．０コを添加して１分間激しくかくはんした。

その沈殿管の内容物を遠心分離機にかけて有機層と水層を分離した。その水層を １０−のメスフラスコに移し、抽出ヲ〈シ返し。

メスフラスコにおける水層を一緒にする。そのフラスコのマークまで脱イオン水 を充てんする。フラスコ内のＴＮＰ−ＫＬＨＯ量およびマイクロカプセル中のＴ ＮＰ−ＫＬＨの量はタンパク質の検定法を用いて定量する。それらのマイクロカ プセルは０．２重量％のＴＮＰ−ＫＬＨを含有した。ブドウ状球菌エンテロトキ シンＢカプセルのブドウ状球菌エンテロトキシン含量も同様の方法によって定量 することができる。

■、経口投与後の染料−負荷マイクロカプセルのバイアー床中への浸透 分泌ＩＰＡ反応の誘導（誘発）部位として機能する性能をもった組織の桁外れに 大きな集団がバイアー斑である。これらリンパ網様組成の個々の小節は小腸およ び盲腸の全長に沿っである。高い局部濃度を達成するためにこの組織の中に処女 抗原をＭ接種的供給することが、汎発生粘膜Ｉｊ’Ａ反応を誘発する最も有効な 手段であると最近考えられている。生物分解性マイクロカプセルはこの標的予防 接種を達成する理想的な運搬体である。

実施例１　：　ポリスチレンのマイクロカプセル腸−関連すンパ網様組成中への マイクロカプセルの摂取およびこの浸透の大きさの制限は、螢光染料クマリンを 負荷したポリスチレンのマイクロカプセルをマウスに経口投与することによって 研究した。

麻酔を行わない絶食したＢＡＬＢ１０マウスに１種々の大きさの螢光マイクロカ プセル（直径５μｍ以下又は８〜５０μｍ）の水道水中のｘｏｏｖ／ｍ／懸濁液 ０、５　ｍ／が給飼針を使用して胃の中に投与された。投与後種々の時間におい て（０，５，１および２時間）、マウムを犠牲にして小腸を検査した。個々のバ イアー斑を含有する腸の１ｃｒｎ部分を分離し、管腔内容物を洗い落し、外転し て素早く冷凍した。冷凍部分を調製して、螢光顕微鏡下で検査して腸管腔からバ イアー斑に吸収され九マイクロカプセルの数、場所および大きさを観察した。

絨毛間に捕捉されたマイクロカプセルのいくらかは洗落し中に除去されなかった が、バイアー斑を除く全ての点において組織内への侵入は観察されなかった。経 口投与の０．５時間後に、マイクロカプセルが小腸の近くのバイアー斑に観察さ れたが、その遠い場所には見られなかった。時間の経過と共にマイクロカプセル はぜん動移動によって移送され、２時間までに胃腸道全体に及び腸骨のバイアー 斑に見られた。エンドサイトーシスド・マイクロカプセルはバイアー斑ドームの 頂点から離れて周辺部に優先的に配置され、せん動中のドームと隣接絨毛間の物 理的捕獲がそれらの摂取を助けたと思われる。５μｍ以下と８〜５０μｍの調製 品の摂取の効率を比較して見ると、直径１０μｍ以上のマイクロカプセルはバイ アー斑に吸収されなかったが、直径１〜１０μｍのマイクロカプセルは迅速かつ 選択的に摂取された。

これは、生物分解性壁材料から槽数され九マイクロカプセルは粘膜表面における 免疫の誘導のため抗原のリンパ網様組織への標的配達の有効な手段として作用す ることを示唆し念。

コーグリコリド）マイクロカプセル １、　生物適合性、生物分解性マイクロカプセルのノ（イアー斑への摂取。

水道水中の懸濁液として螢光染料のクマリン−６を含有する生物分解性マイクロ カプセルをマウスのグループに胃管を介して投与し念。これらの研究に選んだマ イクロカプセルの壁材料は、６週間の期間に渡って顕著なバイオエロージョン抵 抗能力のために８５：１５ポリ（ＤＬ−ラクチドーコーグリコリド）からなった 。投与後１〜３５日の種々の時間において、それぞれのマウスから３つの代表的 なバイアー斑、主腸間膜リンパ節および膵臓を除去し、処理そして連続する凍部 分を調製した。

適当な励起およびバリヤー・フィルターを使用して螢光顕微鏡で観察したとき、 クマリンは深緑色の螢光を示し、それは直径１μｍ以下のマイクロカプセルの視 覚検出を可能にした。各組織又は器官内のマイクロカプセルの全数を定量するた めに全ての部分を観察し次。吸収された各マイクロカプセルの大きさは校正され た接眼マイクロメーターを使用して　。

決定したそしてその組織又は器官内の場所を記録した。

経口投与後２４時間および３５日まで試験し念全ての時点でバイアー斑において 吸収され九各種サイズのマイクロカプセルを観察した。その結果を第１表に示す 。バイアー斑以外の点において腸の組織内に浸透した全てのサイズのマイクロカ プセルはいずれかの時点でも観察されなかった。パイプ−床内のマイクロカプセ ルの総数は４日まで増加し１次に３１まで減少し最大数の約１５チまで減少した 。

これは、遊離マイクロカプセルが、１．２および４日後の時点で腸絨毛のに観察 できたことと一致する。マイクロカプセル懸濁液の経口投与の約１０時間後にク マリン−負荷マイクロカプセルが通過した便に観察できたことは興味ある。この クリアラ、ンスは紫外線光源の助けによって追跡されたそして２４時間までは摂 取されたマイクロカプセルの大多数が通過した。従って２日および４日後に観察 され念マイアー床中へのマイクロカプセル連続摂取は腸絨毛間の粘液内に捕獲さ れるようになった投与量の少部に帰因するに違いない。さらに、捕獲されたマイ クロカプセルの摂取効率は、腸管腔内の粘液層上に存在するマイクロカプセルの 値よシも数倍に違いない。

これらの観察は、これらのデータがヒトに外挿されるときに重要でアシ、マウス と比較して恐しく大きなバイアー斑組織およびヒトの小腸を通る材料の非常に長 い週間時間は、ヒトのバイアー床中に摂取されるマイクロカプセルの効率は極め て高いであろうことを示唆する。

第１表に示し念ように試権した全ての時点において種々の大きさのマイクロカプ セルがバイアー炎内に観察された。１．２および４日の時点で、２μｍ以下（４ ５−４７％）、２〜５μｍ　（３１−３５％　）および５μｍ以上（１８−２３ ％）のマイクロカプセルは比較的一定のままであった。７日およびそれ以後の時 点で大きさの分布が変わったのは明日であって、小（２μｍ以下）および中位（ ２−５μｍ）のマイクロカプセルの優勢が止まり大きな（５μｍ以上）マイクロ カプセルが数値的に最大の種類になることが観察された。このシフトは、７日お よびそれ以後に観察されたバイアー斑における全マイクロカセプセル数の減少と 同時に生じた。これらの結果は小および中サイズのマイクロカプセルのパイプ− 斑からの優先的移動、一方大きい（５μｍ以上）マクロカプセルの優先的保持と 一致する。

バイアー斑の構造内にマイクロカプセルが配置されることに関するデータはバイ アー斑の外に小および中サイズのマイクロカプセルが優先的に移動することに一 致する。マイクロカプセルがバイアー炎内に観察されたとき、それがバイアー斑 に入る所のドーム上皮に比較的に近い（２００μｍ以内）か、又はリンパ組織内 の深いところ（最も近い確認できるドーム上皮から２００μｍ以上）であること が注目された。　バイアー炎内の深い所に見られたマイクロカプセルは殆んど小 および中位直径のものであった。投与の１日後において、９２％のマイクロカプ セルはドーム上皮の近くにあった。深い所に位置したマイクロカプセルの割合は ４日まで全体の２４％と増加し、それ以降時間の経過と共に減少し１４日以後は 約２％どなった。従って、小および中サイズのマイクロカプセルはバイアー斑を 通って外へ移動するが、大きなマイクロカプセルは長時間の間ドームの領域内に とどまったままである。

λ　腸間膜リンパ節および膵臓へのマイクロカプセルの移動 第２表に示すように、小数のマイクロカプセルが投与１日後に腸間膜リンパ節に 観察された。そしてその数は７日までに徐々に増加した。７日後、その数は減少 したが、３５日にも検出できた。サイズ分布は、直径５μｍ以上のマイクロカプ セルはこの組織に入らなかった。そして初期の時点で中サイズ（２−５μｍ）の マイクロカプセルに対して小サイズ（２μｍ以下）のマイクロカプセルの割合が 高いのは小径のマイクロカプセルが高い効率でこの組織に移動することを示して いることは明白である。さらに、初期の時点に８いて、マイクロカプセルの大さ らに後の時点で、その分布がシフトしてリンパ節構造内の深い所になり、１４日 後までにマイクロカプセルの９０％が皮質および髄質の領域内に位置した。マイ クロカプセルが最初に皮膜下洞に又はその近くに検出されることは、マイクロカ プセルがリンパ管を介してこの組織に入ることと一致する。この組織の深い所に 位置するマイクロカプセルの割合の漸増は４日目に明白に認められ、そして１４ 日以後はその総数が漸減することは、マイクロカプセルがこの組織を進行して輸 出リンパ系ドレナージを介して溢出することを示唆する。

膵臓と同様の検査は投与４日後までマイクロカプセルを検出できなかったことを 示した。マイクロカプセルのピーク数はこの器官においては４日目で観察されな かった。腸間膜リンパ節の場合におけるように、直径５μｍ以上のマイクロカプ セルは観察されなかった。全ての時点において、マイクロカプセルはこの器官の 深く皮質内には見られなかった。マイクロカプセルのピーク数は、腸間膜リンパ 節に存在する大部分のマイクロカプセルが深い所に位置しに注目する必要がある 。これらのデータは、バイアー斑から腸間膜リンパ節へそしてそこから胸管を介 して血流へとリンパ・ドレナージの既知ノ（ターンと一致する。従って、膵臓に 存在するマイクロカプセルはバイアー斑そして腸間膜リンパ節を通って血液循環 によって膵臓に入ると思われる。

さらに別の実験において、吸収した８５：１５ＤＬ−ＰＬＧマイクロカプセルを 含有したバイアー斑、腸間膜リンパ節および膵臓からの組織切片を組織化学およ び免疫組織化学によって検査した。これらの研究は、バイアー炎内に吸収された マイクロカプセルが細胞内炭水化物（多分グリコーゲン）および主組織適合性錯 体（Ｍ）ＩＣ）クラス■の抗原用の過ヨウ素シック試薬（ＰＡＳ）によって染色 されたマクロファージ状細胞内に存在したことを明示した。

さらに、腸間膜リンパ節および膵臓に見うれたマイクロカプセルはこれらＰＡＳ およびＭＨＯクラス■正細胞内に運ばれていることが一般に知られた。従って、 マイクロカプセルを含有する抗原はバイアー斑の抗原に存在する補助細胞（ＡＰ Ｃ）によって吸収された。そしてこれらのＡＰＣは抗原−マイクロカプセルを他 のリンパ系組織へ散在させた。

これらのデータは、マイクロカプセルに封じたワクチンを経口投与することによ って誘導された免疫反応の性質を粒子の大きさで制御できることを示す。

直径が５μｍ以下のマイクロカプセルはＡＰＣ内のバイアー斑から溢出して、全 身の免疫反応の誘発部位であるリンパ系組織に抗原を放出する。一方、直径が５ 〜１０μｍのマイクロカプセルはバイアー斑。

またＡＰＯ内に長時間質まって、抗原をこのｓＩ＃Ａ誘発部位内に放出する。

イクロカプセルの摂取の比較 実際の制御された放出受渡し系に有用であシ、かつマイクロカプセルを粘膜に関 連したリンパ系組織内への標的吸収をさせる物理化学的性質を有するマイクロカ プセルの重合体賦形剤を確認するために実験を行った。後者の事柄に関して、疎 水性粒子は細網内系の細胞によってさらに容易に捕食されることが示されている 。従って、疎水性に関しである範囲を示すところの１０種類の重合体からなる１ 〜１０μｍのマイクロカプセルのバイアー床内への吸収を研究した。これらの研 究に選んだ壁材料は水の摂取、生物分解性および疎水性の異なる重合体からなっ た。

これらの重合体はポリスチレン、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（ＤＣ−ラクチド ）、ｓｏ：ｓｏポリ（ＤＬ−ラクチドーコーラクチド）％８５：１５ポリ（ＤＬ −ラクテドーコーグリコリド）、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、ポリ（メチル・メタ クリラート）。

エチルセルロース、セルロース・アセテート・水素フタレートおよび三酢酸セル ロースを含んだ、１０種の賦形剤の中の７つから調製されたマイクロカプセルは 、第３表に示したように、２０Ｍｇのカプセルを含有する懸濁液の経口投与の４ ８時間後に吸収されてバイアー斑のドーム領域に目立って存在した。

バイアー斑以外の組織内に浸透したマイクロカプセルは見られなかった。１つの 例外として、エチルセルロースの吸収効率は賦形剤の相対的疎水性と関連性があ ることがわかった。投与されたマウスの３つの代表的なバイアー斑に、最も疎水 性グループの化合物〔ポリスチレン、ポリ（メチル・メタクリラート）およびポ リ（ヒドロキシブチラード）〕のマイクロカプセル１５００個までが観察された が、比較的低い疎水性のポリエステル〔ポＩＪ　（Ｌ−ラクチド）。

ポリ（ＤＬ−ラクチド）、８５：１５ポリ（ＤＬ−ラクチドーコーグリコリド、 ５０：５０（ＤＬ−ラクチドーコーグリコリド）〕では２００〜１０００個のマ イクロカプセルが観察された。種類として。

セルロースを主成分とする物質は吸収されなかった。

マイクロカプセルの物理化学的特性はバイアー斑によって腸管腔からそれらの吸 収効率を通してマイクロカプセルの標的を調節することそしてこれは表面現象で あることがわかった。従って、マイクロカプセルの表面特性１重合体の化学改良 の形態、又は塗膜の形態における変更を用いて、マイクロカプセルが生物活性剤 を粘膜−関連リンパ系組織およびＡＰＯへの供給を目標にするところの効率を調 節することができる。塗膜の例としては、限定ではないが、化学物質１重合体、 抗体、生物接着剤、タンパク質、ペプチド、炭水化物、レクチン、等がある。

これらは自然および人工的なものである。

材料および方法 ８〜１２週）を使用した。

トリニトロフェニル−練成動物装置ヘモシアニン。

練皮動物の並置（Ｍｅｇａｔｈｕｒａ　０ｒｅｎｕｌａｔｅ）からのヘモシアニ ン（ＫＬＨ）をＯａ　Ｉｂ　ｉｏｃｈｅｍ社（米国カリフォルニア州すンジエゴ ）から購入した。それを。

Ｒｉ　ｔ　ｔｅｎｂｕｒｇ　　およびＡｍｋ　ｒ　ａ　ｕ　ｔの方法（Ｒｉｔｔ ｅｎｂｕｒｇ。

Ｍ＋Ｂ、　ａｎｄ　Ａｍｋｒａｕｔ、　Ａ、Ａ、、”Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉ ｔｙ　ｏｆｔｒｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ　：　Ｐｒｏ ｄｕｅｔｉｏｎ　ｏｆｐｒｉｍａｒｙ　ａｎｄ　５ｅｃｏｎｄａｒｙ　ａｎｔｉ −ｈａｐｔｅｎ　ｐｒｅｃｉｐｉｔｉｕｓ”Ｊ、　Ｉｍｍｕｏｌ、　９７：４２ １．１９６６）　　の方法に従って２．４゜６−トリニトロベンゼンスルホン酸 を使用してトリニトロフェニル・ハブテンと共役すせた（ＴＮＰ−ＫＬＨ）。

置換比は、波長３５０ｎｍにおいてモル吸光係数１５、４００を使用しこの波長 におけるＫＬＨの寄与に対する３０％の補正を適用して分光光度計で測定してＴ ＮＰｓｓｓ−ＫＬＨであつ九。

ウオレンら（Ｗａｒｒｅｎ、　Ｊ＋Ｒ，、５ｐｅｒｏ、　Ｌ、　ａｎｄＭｅｔｚ ｇｅｒ＋　Ｊ、Ｆ、　”Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｆｏｒｍａｌｉｎ− ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ　５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ　ｅｎｔｅｒｏｔｏｘ ｉｎ　Ｂ″。

Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ、１．１１１　、８８５．　（１９７３）　：）によって記 載された方法に従って、ブドウ状球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）のホルマリ ン添加ワクチンを調製した。

要約すると、１ｔのエンテロトキシン’ｅ　０．　Ｉ　Ｍのリン酸ナトリウム緩 衝液（ｐ　Ｈ７，５）に溶解させた（２ｗ／ｍＬ）。そのエンテロトキシン溶液 にホルムアルデヒドを添加してホルムアルデヒド：エンテロトキシンのモル比４ ３００：１を得九。その溶液を３７℃に制御された環境下でゆつ〈シ振とうする 恒温器−振とう器に入れて、ｐＨを毎日７．５　＋　０．１に維持、監視した。

３０日後、圧力濾過セルを使用してそのトキソイドは濃縮そして洗浄されホウ酸 塩緩衝化塩類溶液（ＢＢＳ）に入れ、濾過滅菌した。

エンテロトキシンのエンテロトキソイドへの転化は。

トキソイド化（無毒化）した材料１ダを筋肉内注射した３〜３．５即のウサギの 体重減がないことによつ免疫処置 マイクロカプセル封じおよび非マイクロカプセル封じの抗原を一過滅菌水道水８ 部と重炭酸す）　ＩＪウム（７，５％溶液）２部からなる溶液に適当な濃度で懸 濁させた。受容体のマウスは挿管針で行なった胃挿管を介して懸濁液０．５　ｍ 　Ｌの投与前に一晩絶食さａｎｄ　ＭｃＧｈｅｅ、　Ｊ、Ｒ，、”ＬＰＳ　ｒｅ ｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ：　５ｕｐｐ ｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｓｐｏｕｓｅｔｏ　ｏｒｃｌｌｙａ ｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ　Ｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａｎｔｉｇｅｎ″。

眼窩後装の穿刺の後に、校正毛管ピペットに血液を収集した。血餅形成後、血漿 を収集し、遠心分離して赤血球および血小板を除去し、熱で不活性化し。

検定まで一７０℃で貯蔵した。

２　腸分泌物 マウスに洗浄溶液（２５ｍＭ　ＮａＣＡ、　４０　ｍＭ　ＮａｔＳＯ４。

１０　ｍＭ　ＫＯＬ　、　２０　ｍＰＪ　ＮａＨＣＯｍ　　および４８．５ｍＭ ポリ（エチレングリコール）、浸透濃度５３０モスＭ）を１５分間隔で４回の投 与量（０，５ｍＬ）を投与した［：　Ｅｌｓｏｎ。

ｃ、ｏ、ｌ　Ｅａｌｄｉｎｇ　、　Ｗ、　　ａｎｄ　Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ、　Ｊ 、、　　”Ａｌａｖａｇｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ａｌｌｏｗｉｎｇ　ｒｅｐｅａ ｔｅｄ　ｍｅａｓｕｒｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｉ＃Ａａｎｔｉｂｏｄｙ　　ｏｎ　ｍｏ ｕｓｅ　　１ｎｔｅｓｔｉｎａｌ　　５ｅｃｒｅｔｉｏｎｓ″、　　　Ｊ。

の投与の１５分後に、マウスに麻酔をかけ、さらに１５分後にマウスに０．１ダ のどロカルピンを腹腔内注射によって投与した。次の１０〜２０分に渡って。

腸内容物の排出を刺激した。これを、５０ｍＭのＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　ｉＣ０，１１ ｖ／　ｍＬ　の大豆トリプシン抑制剤（Ｓｉｇｍａ社製品、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉ ｓ、　ＭＯ）の溶液３ゴを含有するぺ）　ＩＪ皿に収集し、激しくかくはんし、 遠心分離によって懸濁物質を除去した。上澄み液金丸底のポリカーボネート遠心 分離チューブに移した、そしテ２　ｍＭ　（７）フッ化フェニルメチルスルホニ ル（ＰＭＳＦ。

Ｓ　ｉ　ｇｍａ社製品）３０μｔを高速遠心分離（２７ｏｏｘｐ、２０分、４℃ ）による清澄前に添加した。清澄後、それぞれ２０μＬのＰＭＳＦと１％のアジ 化ナトリウムを添加し、その溶液をＦＯ８中１０％にして残留するプロテアーゼ に別の基質を提供した。

３、唾液 腸内容物の排出と同時に大量の唾液が分泌されるので、その０．２５　ｄを毛管 作用によってパスツール・ピペットに収集し念。清澄前にトリプシン抑制剤。

ＰＭＳＦ、　　アジ化ナトリウムおよびＦｅ２をそれぞれ２０μを添加した。

４、　気管支−肺胞洗浄流体 肺を１．０−のＰＢＳで洗浄することによって気管支−肺胞洗浄流体を得た。動 物給飼針を気管支内に挿入し、縫合材料で縛ることによってそこに固定した。Ｐ ＢＳを５回挿入および回収して洗浄液を得た、それにトリプシン抑制剤、　ＰＭ ＳＦ　、アジ化ナトリウム、およびＦｅ８をそれぞれ２０μＬ遠心分離による清 澄前に添加した。

マウスのＩ＃Ｍ、ＩＰＧおよびＩ＃ＡＫ特異ノ固相吸収および親和カー精製ポリ クローナルのヤギエ＃Ｇ抗体を間約に入手した（　５ｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ、　Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、　ＡＬ） 　ｏそれらの放射線免疫検定法における特異性は適当に精製されたモノクロ−カ ル抗体および骨髄型タンパク質を結合するそれらの能力によって試験した。

精製された抗体は、クロラミンＴ法（Ｈｕｎｔｅｒ＋Ｗ、Ｍ、　Ｒａｄｉｏｉｍ ｍｕｎｏａｓｓａｙ、　Ｉｎ　：　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｒｒ ＋ｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｙ、　Ｍ、　Ｗｅｉｒ　（ｅｄｉｔｅｒ）　、　 Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、　０ｘｆｏ ｒｄ、　ｐ、１４．１　、　　（１９７８））　　ｆ用いて担２Ｂ 体を含まないＮａ　　１　（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の標識をつけた。

イムロン・リモパウエル（Ｉｍｍｕ　１　ｏ　ｎ　Ｒｅｍｏ　ｖ　ａｗｅ　１　 ＋　）検定用ストリップにＴＮＰ共役ウシ血清アルブミン又はブドウ状球菌エン テロトキシンＢを１μｔ　／　ｍＬＢＢＳで４℃において１晩コーテイングした 。対照のストリップはコーティングしなかつ九が、ストリップは全てＢＢＳ中１ ４ＥＳＡ（これは全ての試料および放射性核種の　ニー標識化試薬に対する希釈 剤として使用された）で室温においてブロックされた。生物流体の試料は適当に 希釈して洗浄された３重の多数の凹部（ｗｅｌｌｓ）に添加し、室温で６時間製 置した。洗浄後、　　Ｉ−標識化アイソトープ−特異的抗−免疫プロブリンの１ ００．　ＯＯＯｃｐｍを各凹部に添加して４℃において１晩温置し念。洗浄によ る未結合　ニー抗体の除去後、それらの凹部をガンマ５５００分光計（ベックマ ン・インスッルメンツ社製）において計数した。ＴＰＮ特異抗体の検定の場合に 、校正は、１μｔ／凹部のアイソトープ−特異抗体でコーティングされた凹部に 既知量の免疫グロブリンを含有する標準血清（Ｍｉｌｅｓ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉ ｃ社製品）の連続的２倍希釈を用いて行った。校正曲線および未知数の挿入はコ ンピュータ（“Ｌｏｇｉｔ−１部ｇ”又は“Ｆｏｕｒ　Ｐａｒａｍｅｔｅｒ　Ｌ ｏｇｉｓｔｉｃ″ＢＡＳＩＯＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｅｎｔｅｒ　（Ｖａｎｄｅ ｒｂｉｔ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ＋　Ｎａ５ｈｖｉｌｌｅ。

ＴＮ　）　を利用）によって得た。ブドウ状球菌エンテロトキシンＢの場合には 、結果は逆の血清希釈として提供される。

人、注射により投与されたワクチン−マイクロカプセル作用 により与えられる補助作用。

我々研究室の研究は、多数の実験系においてマイクロカプセル封じが取シ入れた 抗原又はワクチンに対して大いき高い免疫反応をもたらすことを示した。

−例は可溶性又はマイクロカプセル化エンテロトキシドで免疫化し、ブドウ状球 菌エンテロトキシンＢ（ブドウ状球菌の食品中毒の原因剤）に対する循環抗体反 応の水準およびアイソトープ分布を直接比較することによって提供される。マウ スのグループに５０：５０ポリ（ＤＬ−ラクチドーコーグリコリド）マイクロカ プセルに取り入れた。又は可溶性の形でのトキシド・ワクチンを種々の用量で腹 膜内注射によって投与した。免疫化の１０日および２０日後に、血漿試料を得て 、アイソトープ−特異免疫放射分析検定法における終点滴定によって抗トキシン 活性を分析した（第４表）。可溶性トキシドの最適用量（２５μｔ）はトキシン に対して特徴的に低い免疫反応（Ｉｊ’Ｍアイソトープにおいてのみ検出された ）を引き出した。一対、マイクロカプセル内に取り入れ九トリキシド２５ｆの投 与はＩＢＭ反応のみならずＩＪ’Ｇ反応（それは免疫化の２０日後に血漿希釈度 １／２，５６０　　で検出できた）を誘導した。さらに。

可溶性トキシドの５０μｔの用量で見られるように、さらに高い用量のトキシド も反応の強さを下げるこトナくマイクロカプセル封じの形で投与できた。実際に 、マイクロカプセルで得られた被測定放出は４〜５倍の用量の投与を高ゾーン麻 ひをもたらすことなく可能にし、実質的に高免疫性をもたらした。この補助活性 は２次（第５表）および３次（第６表）の免疫化に伴ってさらに高められた。

２次免疫化に伴って２０日後のＴ２Ｏ抗−トキシン反応は、マイクロカプセル封 じのトキシド５０μｔを受けたマウスの方が可溶性トキシドの最適用量を受けた マウスよりも５１２倍高かった。さらに、最適用量における可溶性トキシドでの ３次免疫化が。

マイクロカプセル封じのエンテロトキシド１００μｔでの単一免疫化に伴う抗体 反応に等しいトキシンに対する抗体反応を高めるために必要であった。ノ・ブテ ン添加の練成動物装置ヘモシアニンおよびインフルエンザ・ウィルス・ワクチン のような一般の研究室的タンパク質抗原に同等の強さの補助活性が立証された。

実施例２：マイクロカプセル封じ一皮下投与により与えられる補助作用。

本供給系は筋肉内又は皮下（ＳＣ）注射の後に活性であることがわかった。これ は、第７表に示すようにマウスのグループにＩＰおよびＩＣ注射に伴う免疫反応 の時間経過および水準を直接比較することによって研究した。

マウスの背中に沿って４ケ所にＳＣ注射によって投与されたマイクロカプセル中 の１００μｔのエンテロトキシドは、ＩＰ注射に伴って観察された反応に等しい ピークのＩＰＧ抗−トキシン反応を刺激した。抗−トキシン発現の速度論に若干 の遅れが観察された。しかしながら、優れた抗体水準が得られ。

腹膜以外の部位での注射の有用性を示した。２次免疫化に伴ひ、第８表に示した ようにＳＣルートの遅延反応は明白であったけれども、ＩＰおよびＳＣのルート はピーク・タイターに関して等しかった。

２マイクロカプセル封じにより与えられる補助作用補助作用が重合体に固有の補 助作用で １〜１０μｍのＤＬ−ＰＬＯ微小球がカプセルに封じられた抗原に対して増強さ れた体液性免疫反応を仲介する機構を考えるとき、可能性として３つの機構を考 えなければならない。第１は、非カプセル封じ抗原の丸薬投与量に比べて長期の 緩性放出が免疫増強の役割を果す。第２に、我々の実験は、この大きさの範囲の 微小球は抗原の処理および提供する細胞によって容易に捕食される。従って、Ｔ 細胞−依存抗原に対する免疫反応の開始に関与する細胞へ直接比較的大用量の非 分解抗原を標的供給することも考慮しなければならない。第３は、マイクロカプ セルは細菌のリボ多糖又はムラミル・ジペプチドのような補助剤と同じ様に免疫 系の細胞を活性化させるそれらの能力を通して固有の免疫増強活性を有している ことである。この後者の機構による免疫増強は、補助剤が抗原と同時に投与され るときに表現されるという特徴を有する。

微小球が免疫系を非特異的に活性化させるこれら粒子の能力を介して仲介される 補助性を有するか否かを試験するために、マイクロカプセル封じのエンテロトキ シドＺｏｏμｔに対する抗体反応を抗原を含有しないブラシーボ微小球を混合し たエンテロトキシド等用量の投与に伴う抗体反応と比較した。種々の形態の抗原 が１０　ＢＡＬＢ１０マウスのグループにＩＰ注射によって投与された。そして 血漿ＩＢＭおよび工ｔＧエンテロトキシンー特異抗体反応が第９表に示したよう に終点適定ＲＩ　Ａ　ｓによって決定された。

可溶性エンテロトキシドの最適用量（２５μ？）の丸薬注入に対する血漿抗体反 応は特徴的に弱くて１０日でＳＯＯのピークＩＢＭタイターそして２０日で８０ ０のビークＩｔＧタイタ〜からたつ之。マイクロカプセル封じのエンテロトキシ ドの等用量投与はＩＰＭおよびＩｔＧアイソトープにおいて強い反応（それは免 疫化３０日後でも増加した）を誘発した。カプセル封じの抗原投与に使用した重 量、大きさおよび組成が同じのブラシーボ微小球の投与量と可溶性エンテロトキ シドの共同投与は血漿抗−トキシン反応（それは可溶性抗原単独によって誘発さ れる反応よシ著しく高かった）を誘発しなかった。

この結果は、ブラシーポ微小球の１日前、又は１．２又は５日後に可溶性抗原の 投与によって変らなかった。従って、これらの結果は、抗原が１〜１０μｍ以内 のＤＬ−ＰＬＰ微小球で投与されるときに示される免疫増強作用は免疫系を固有 に活性化させる微小球の能力の関数でないことを示す。むしろ、そのデータは、 蓄積作用、抗原を提供する補助細胞の標的供給、又はこれらの２つの機構の組合 せと一致する。

実施例２：１−１０μｍのマイクロカプセルからの抗原放出速度の抑制は抗体反 応の水準を高め、ピーク反応の時間を遅らす。

エンテロトキシドを含有し種々の抗原放出速度を有する４つのマイクロカプセル 調製品のＩＰ注射に伴う血漿抗−トキシン反応誘発能力を比較した。この研究に 使用し九マイクロカプセルによる抗原の放出速度は２つの機構、すなわち壁マト リックスの穴を介した拡散と壁マトリックスの加水分解（パイオニローション） の関数である。バッテナ６０５−０２６−１およびす５１４−１４０−１は穴を 介した異なる初放出速度を有し、加水分解を介したそれらの分解の関数である第 ２段階の放出に従った。一方、バッチ６９７−１４３−２およびす９２８−０６ ０−００は堅い均一なマトリックスの壁材料（それは穴からの放出が少ない）で 製造された。そしててれらの放出は本質的に壁材料が加水分解される速度の関数 である。しかしながら、これら後者の２つのロットはマイクロカプセルを槽底す るラクチド：グリコリドの比が異なシ、加水分解に対する抵抗の高い８５：１５ ＤＬ−ＰＬＧの方が工ンテロトキシドの放出速度が遅かった。

バッチ◆６０５−０２６−１によって誘発されるりＩＰＧタイター６．４００に 達した（第１０表）。

バツチナ５１４−１４０−１　（４８時間で３０チ放出）もＩｔＯ抗体を刺激し 、２０日でピークに達したが、２０日および３０日でょシ高濃度で存在した。

バッチナ６９７−１４３−２での免疫化（４８時間で１０％放出）は３０日およ び４５日でピークの工ｔＧ抗体水準をもたした。それは初期放出でいずれのロッ トで誘発されたものより実質的に高かった（１０２，４００）。レクチド：グリ コリドの比８５：１５を使用した抗原放出速度のさらに遅延は。

バッチ◆９２８−０６０−００（４８時間で０％放出）が４５日および６０日ま でピーク抗体水準を遅らしたが、免疫増強作用のそれ以上の増加は監察されなか った。

これらの結果は高抗体反応を刺激する抗原の遅延および持続放出と一致する。し かしながら、これら種々の微小球によって誘発される反応パターンのある側面は 、蓄積作用が免疫増強の唯一の機構でないことを示す。初期放出が速い程、ピー クの抗体タイターは低くなる。これらの結果は、穴からの拡散による最初の４８ 時間以内に放出され比抗原が可溶性抗原の投与よシ効来がないというモデルと一 致する。

マクロファージによる微小球の食作用の時間を許す放出開始における著しい遅延 は抗原の効果的なプロセシングおよび存在を可能にする。そして得られる反応の 高さは存在する細胞内へ供給される抗原の量に支配される。しかしながら−全で の抗原が存在する細胞の中に供給される点を越えた抗原放出の遅延−り水準を遅 らすだけである。

２、単一注射に続くプログラムドブ−スティングのためマイクロカプセルからの ワクチンの拍動放出 ヒトが多数のワクチンのいずれかを注射によって受は入れるとき、良好な免疫反 応を禁止するには２〜３回又はそれ以上のワクチン投与が必要である。

典型的に、最初の注射は一次反応を与える九め、２回目の注射は２次反応を与え るため、そして３回の注射は３次反応を与えるために行われる。強い免疫反応を 刺激するには抗原と免疫系細胞との反復相互作用が必要であるので、多重注射が 必要である。従って、ワクチンの最初の注射を受けた後、患者は保護を必要とす る第２．第３および後続の注射を受ける九めに数回医師の所に行かなければなら ない。しばしは、患者は次の注射を受ける・念めに医師の所に行くことができな い。

患者に注射されるワクチン製剤は補助剤と共に抗原からなる。例えば、抗原はミ ョウバンと結合することができる。最初の注射中に抗原と補助剤との組合せが、 補助剤が免疫反応の刺激を助ける点において重要である。第２および第３回の注 射中に、抗原の投与は抗原に対する体の免疫反応を改善する。しかしながら、第 ２および第３回の投与又は後続の投与は補助剤を必ずしも必要としない。

アルザ（Ａｌｇａ）社は免疫反応を刺激するために抗原および免疫増強剤（補助 剤）を連続的に放出する方法を開示した（米国特許第４．４５５．１４２号）。

この発明はアルザの特許と少なくとも２つの重要な方法において相違する。第１ は、免疫反応を高めるのに免疫増強剤を必要としないこと、第２は、抗原が供給 系から連続的に放出されないことである。

本発明はワクチン（抗原）をマイクロカプセル（または微小球）に入れて抗原を ボＩＪ　（Ｄ　Ｌ−ラクチドーコーグリコリド）のような生物分解性重合体でカ プセル封じをする方法に関する。さらに詳しくは９種々のワクチンのマイクロカ プセルを製造し。

次にワクチン・カプセル混合物の単一注射が一次免疫反応を改良し１次にさらに 後の時点で抗原を拍動的に供給して２次、３次および後続の反応を与えるように 一緒に混合される。

マイクロカプセルの混合物は大小のマイクロカプセルからなる。１０μｍ以下、 望ましくは５μｍ以下、又はさらに望ましくは１〜５μｍの小さいマイクロカプ セルは、効率的に認識されてマクロファージに吸収されるので補助剤を必要とす ることなく１次反応を強める。次にマクロファージの内側のマイクロカプセルは 、後で処理されてマクロファージの表面に現われて１次反応を与える抗原を放出 する。

５μｍ以上、望ましくは１０μｍ以上であるが１例えば注射によって投与できな い程大きくない、望ましくは２５０μｍ以下の大きなマイクロカプセルは。

それらが種々の速度で分解する際に拍動的に抗原を放出するように異なる重合体 で作られる。

本発明を使用した１次反応用の抗原マイクロカプセルの組成は２次、３次および 後続の反応用使用される抗原マイクロカプセルの組成と基本的に同一である。す なわち、抗原は同じクラスの生物分解性重合体でカプセル封じをされる。抗原マ イクロカプセルの大きさおよび拍動放出特性が抗原に対する免疫反応を最高にす る。

望ましい生物分解性重合体は、その単量体比、例えばポリ（ＤＬ−ラクチドーコ ーグリコリド）の比を変えるだけでその生物分解速度を変えることができるもの である。従って２次反応用に使用される抗原マイクロカプセルは後続の反応用に 使用される抗原マイクロカプセルよシ速く生物分解して、抗原の拍動的放出をさ せる。

要約すると、基本的に同一組成のマイクロカプセルの大きさを調節することによ って抗原に対する免疫反応を最高にすることができる。また、１次反応を最高に させるには、抗原マイクロカプセルの混合物に小さいマイクロカプセル（１０μ ｍ以下、望ましくは５μｍ以下、最適には１〜５μｍ）を有することが重要であ る。小さいマイクロカプセルのような免疫増強用共給系の使用は、キルド・ワク チン。

サブユニット・ワクチン、ペプチドのような低分子量ワクチン、等のような低抗 原産生化合物に対する免疫反応を禁止しようとするときにはさらに重要になる。

実施例１：遊離及びマイクロカプセル封じワクチンの共同投与。

日本脳炎ウィルス・ワクチン（Ｊ　Ｅ　）　（Ｂｉｋｅｎ）を研究した。使用し たウィルスは大阪大学の微生物病研究財団の製品である。その製造業者は、１〜 ２週間の間隔で投与されるワクチンの２回投与量、初免疫化シリーズの１ケ月後 に投与されるワクチンの第３回目の投与量からなる３投与貴免疫化シリーズを推 薦している。我々は、ＪＥの標準３投与量シＩＪ−ズで免疫化され次マウスの抗 ウイルス性免疫反応と、カプセル封じをしないワクチン１部とカプセル封じをし たワクチン２部からなるＪＥワクチンの単一投与で免疫化したマウスの抗ウイル ス性反応とを比較した。ＪＥマイクロカプセルは１０μｍ以上であった。これら ２つの方法によってＪＥワクチンでマウスを免疫化した結果はＥＬＩＳＡ検定法 によって検出されたＪＥワクチンに対する血清抗体タイターを測定することによ って比較したＢＬＩＳＡ検定法はＪＥワクチン成分の特異性をもった血清抗体の 存在を測定するが、血清に存在する抗体を中和するウィルスあ水準を測定しない 。従って、抗体活性を中和するウィルスは、ウィルス細胞変性効果（ＯＰＢ）抑 制分析法およびウィルス・プラーク減少分析法によって測定された。それらの検 定結果をここに示す。

（１）免疫化をしない未処理の対照マウス：　（２１ｏ日にＪＥワクチン３．０ 　Ｉ！　（非カプセル封じ＞を受けたマウス：　（３）　０．１４および４２日 にＪＥワクチン３．０■（非カプセル封じ）を受は念マウス（標準スケジュール ）：および０日にＪＥワクチン３Ｍｇ（非カプセル封じ）とＪＥワクチン３．０ 　＃　（カプセル封じ）３．０ηを受けたマウスからなる４つの実験グループを 研究し念。未処理の対照品は免疫化された動物を比較することができるウィルス 中性化バックグラウンド・タイターを提供する。０日にＪＥワクチンの単一投与 量３．０りを受ける動物は、カプセル封じのワクチンと共に非カプセル封じのワ クチンを受ける動物を比較することができる中性化バックグラウンド・タイター を提供する。この比較はカプセル封じワクチンの投与が非カプセル封じワクチン の３．　Ｏｑ単一投与量の免疫化の可能性を増大させる証拠を与える。

非カプセル封じワクチンの３投与量を受ける動物は、カプセル封じワクチンのグ ループが非カプセル封じおよびカプセル封じワクチンからなる単一注射の標準３ 投与量免疫化スケジユールに匹適する抗ウィルス活性を生成する能力を立証する ために比較できる対照品を提供する。

各実験グループにおける１０匹の動物から２１日、４９日および７７日に収集し た血清試料は、ＪＥウィルスの標準刺激（１００ＴＣＩＤ５゜）によって誘導さ れる細胞変性効果を抑制する能力を試験した。

ＯＰＥ抑制検定の結果（ウィルスのＣＰＥの５０％を抑制できる最高の血清希釈 として表現される）は第１１表に示す。表示のように、未処理の対照動物（グル ープ１）は試験したいずれの時点においても著しい血清ウィルス中和活性をもた なかった。０日にＪＲワクチンの単一３．０■用量を受けた１０匹の動物（グル ープ２）の中の１匹は検出できるタイルス中和抗体を発生しなかった。残シの９ 匹のマウスの得られた最高タイターは４９日における２５４であった。この実験 グループの幾何平均抗ウィルス・タイターは４９日のピークであった。ワクチン の３投与量の標準スケジュールを受けた１０匹の動物（グループ３）の中の７匹 は４９日から７７日で抗体活性を減少した。このグループの幾何平均タイターは ４０日から７７日で５０％以上減少した。カプセル封じＪＥワクチンを受けた１ ０匹の動物は全て血清抗ウィルス活性を発生した。このグループの幾何平均タイ ターは２１日から７７で増加した。このグループにおける４９日に生じ念平均タ イターはワクチン３用量グループ（プラーク３）で生じる値よりも著しく低かっ たＧ　ｐ　＝　Ｏ，ＯＯ６）が、そのタイターは、ワクチン３用量グループと対 照的に４９日から７７日まで増大し続けた。７７日の試料におけるこれら２つの グループの平均タイターに著しい差はなかった。これはカプセル封じのワクチン ・グループが７７日において同じような血清抗ウィルス・タイターを得たことを 示す。ワクチン３用量グループ（グループ３）と異なシ、カプセル封じのワクチ ンを受ける動物（グループ４）は検査した時点全てに渡って血清ウィルス中和活 性の増加を示し続けた。

標準のワクチン処理グループと対照的に、カプセル封じのＪＥワクチンを受けた マウスは４９日から７７日で平均血清中和タイターが２倍に増加した。

マイクロカプセル封じワクチンを受けたマウスの２１日の平均抗ウィルス・タイ ターは、０日にＪＥワクチンの単一用量を受けたマウスの２１日の平均タイター と余り相違しなかった（ｐ＝０．１２）：Ｌかし４９日と７７日目における平均 タイターは２つのグループで著しく異なった（それぞれｐ　＝　０．０３とｐ＝ 　ｏ、　０３　）。これらのデータは、標準ワクチン投与によって得られるもの に類似の血清ウィルス中和タイターはカプセル封じのＪＥワクチンの単一用量を 投与することによって得られうることを示す。この研究に使用した賦形剤製剤で 得られた抗ウィルス・タイターは標準ワクチンで得られ念もののように迅速に増 加しなかったけれども、血清中和抗体活性は標準のワクチン３用量スケジユール で得られた値に匹適するタイターに達した。

これらの発見をさらに確証するために、各血清試料の等体積を混合することによ って生成されたプール試料を各実験グループ用に調製した。これらの試料は抗ウ ィルス活性を決定するために独立の研究室に提供された。それらの試料はＪＥウ ィルスの標準刺激に対してプラーク減少検定法によって試験した。

第１２表に示したこれらの検定結果は前記の発見を立証している。カプセル封じ のワクチンを受けた動物は標準ワクチン・グループのように迅速にピーク・タイ ターに達しなかったけれども、カプセル封じのワクチンは同様のウィルス中和用 抗体活性を誘導した。さらに、カプセル封じのワクチンは標準ワクチンの場合よ シも長期間に渡って高い抗ウィルス・タイターを維持した。これらの結果はさら に、マイクロカプセル封じワクチンの単一投与が標準ワクチンの３用量スケジユ ールで得られる結果と同様の結果を与えうるという結論を支持する。

実施例２：１０μｍ以下と１０μｍ以上のワクチン・マイクロカプセルの同時投 与。

共重合体マイクロカプセル供給システムの利点は取入れ次材料が放出される時間 および／または速度を制御できることである。ワクチンの場合には、単一投与に 伴う抗体反応を最高にさせるように抗原の放出を予定することができる。ワクチ ンに対する抗体反応の改良が期待される可能な放出パターンの１つは拍動放出（ 従来のブースター免疫化に相当）である。

拍動化放出プロフィールを用いる可能性は、１〜１０μｍ　（５０：　５０　Ｄ 　Ｌ　−Ｐ　Ｌ　Ｇ　；　１．５１重量％ェンテロトキシド）、２０〜１２５μ ｍ　（５０：　５０Ｄ　Ｌ　−Ｐ　Ｌ　Ｇ　：　０．６４重量％ェンテロトキシ ド）又は１〜１０μｍと２０〜１２５μｍのマイクロカプセルの混合物（それら には各サイズの範囲内に等部のエンテロトキシドが含有されている）でマウスの グループにエンテロトキシド１００μｔを皮下投与することによって研究された 。マウスのグループは１０日毎に採血して、血漿工ｔＧ反応を固相吸着エンドト キシンを使用するアイソトープ−特異免疫放射分析における終点滴定法によって 決定した（第１図）。１〜１０μｍエンテロトキシド・マイクロカプセルの投与 に伴う血漿ＩｔＧ反応は、１０日に検出し、３０日および４０日に最高タイター １０２，４００に上昇し、６０日で２５，６００に減少した。これに対して、２ ０〜１２５μｍマイクロカプセルで投与されたトキシドに対する反応は３０日ま で遅れ、その後５０日および６０日で５１．２００のタイターに増加した。１〜 １０μｍおよび２０〜１２≦μｍのマイクロカプセルで等部のトキシドの同時投 与は単独で投与された１〜１０μｍマイクロカプセルによって刺激された最初の ３０日での工？Ｇ反応と本質的に同じであったＩｊ’Ｇ反応を与えた。しかしな がら、１〜１０と２０〜１２５μｍのマイクロカプセを同時に受けたマウスで測 定された４０日で始まる反応は６０日の８１９．２００のタイターまで一定に増 加した。その水準は１度に投与された２つの太きさの範囲によって誘発された反 応の付加量よシ著しく大であった。

１−１０および２０−１２５μｍのエンテロトキシド含有マイクロカプセルの共 同投与によって得られた抗体反応は抗原の２相（拍動）放出と一致する。

第１の相は、組織球による１〜１０μｍ粒子の迅速な摂取および分解からもたら される、そしてそれはこれらの補助細胞内への高濃度抗原の効率的な負荷のため に増強された１次免疫反応をもたらす。抗原放出の第２の相は２０〜１２５μｍ マイクロカプセル（それらは食細胞による摂取には大き過ぎる）の生物分解のた めである。この第２の抗原パルスはプライムド・ホスト内に放出されて既往免疫 反応を刺激する。従って、５０：５０のＤＬ−ＰＬＧ共重合体を使用して、単一 注射ワクチン供給方式を構成することができ、それによって抗体反応を増強しく １〜１０μｍマイクロカプセル）、時間調節と共に長持続の２次ブースター免疫 化（２０〜１２５μｍマイクロカプセル）をすることができる。さらに、共重合 体の比率を変えることによって、それ以上の注射の必要がなく３次又はさらに４ 次の増強をさせるために、さらに遅く放出する製剤を調製することができる。

従って、本発明の注射可能なマイクロカプセルによる予防接種には多数の方法が ある。これらの中には５マクロフアージによって飲み込まれて免疫増強剤の必要 がない望ましくは１〜５μｍの小マイクロカプセル、並びに２次及び３次反応を 増強する抗原の拍動放出をさせ単一投与で免疫化を提供する直径１０μｍ以上を 有するマイクロカプセルの形でマイクロカプセル封じの抗原と組合せた一次反応 用の遊離抗原の混合物の多重注射を含む。また、−次反応用の小マイクロカプセ ルと２次およびそれ以後の反応用の大きいマイクロカプセルの組合せも可動であ シ、それによって免疫増強剤と多重注射の両方の必要がない。

実施例１　：　ＴＮＰに対する粘膜抗体反応および同時循環を誘導するＴＮＰ− ＫＬＨを含有する経口投与マイクロカプセル。

ハプテン添加タンパク質抗原トリニトロフェニル−輔皮動物並置ヘモニアニン（ ＴＨＰ−ＫＬＨ）’ｅ金含有るマイクロカプセルを賦形剤として５０　：　５０ ＤＬ−ＰＬＧｔ−使用して調製し友。これらのマイクロカプセルは大、きさによ って分けて、直径１〜５μｍの範囲内のものを選んで評価した。これらのマイク ロカプセルは０．２重量％の抗原を含有した。摂取され次ときに有効な抗原供給 システムとして作用する能力は、重炭酸塩−緩衝化滅菌水道水に１０９７Ｒ１懸 濁液（１０μｔの抗原）　ｏ、　ｓ　ｍｌを４日間連続して胃での製置を介して 投与することによって試験した。

比較のためにさらに別のマウスのグループに平行して非カプセル封じのＴＮＰ− ＫＬＨの２０μｆ７／ｍｌ溶液０．５−で経口免疫化した。対照マウスは希釈剤 のみで経口投与された。

最終免疫の１４日および２８日後に各グループで絶食した５匹のマウスから血清 、唾液および腸分泌物を得た。これらの試料はイソタイプ−特異放射線免疫検定 法で試験してＩＢＭ％工ｔＧおよび１２人イソタイプのＴＮＰ−特異および全抗 体の水準を測定した（第１３表）。唾液および腸分泌液の試料は殆んどもつばら Ｉｔｋクラスであった抗体を含んだ。

これらの結果は、前の研究と一致し、これらの分泌液を収集するために用いた方 法が血清で汚染されないという証拠を提供する。免疫化プロトコールのいずれも 試験した流体に存在する免疫グロブリンの全水準に著しい変化をもたらさなかっ た。Ｉ＃Ｍ：Ｍよび工ｔＧイソタイプの自然に発生する抗−ＴＮＰ抗体の低いが 検出可能な水準は血清に検出された、そして同様にＩＰＡイソタイプの水準も偽 免疫化対照マウスの血清および腸分泌液に検出された。しかしながら、マイクロ カプセル封じのＰＮＰ　−ＫＬＨの３０μｔを等用量３日間に渡って続けて投与 したものは１分泌液に著しい抗原−特異的Ｉｔ人抗体の出現、および免疫化後１ ４日まで血清に全てのイソタイプの出現をもたらした（第１３表の最後の欄参照 ）。

これらの抗体の水準は２８日でさらに増した。これに対し、非カプセル封じ抗原 の等量の経口投与は試験した流体の全てにおいてインタイブの特異的抗体の誘導 に無効であつ九。

これらの結果は２，３の点で注目に価する。第１に、血清と粘膜分泌液に著しい 抗原−特異ＩｔＡ抗体が誘導される。その反応は一般に使用されている全身免疫 化法に従うと極めて低い又は存在しない。

従って、この免疫化法は粘膜に著しく増大された免疫をもたらすことが期待され る。第２に、マイクロカプセル封じの抗原調製品が経口投与のときに有効な免疫 原であったが、同一量のカプセル封じをしない抗原は有効な免疫原でなかった。

従って、マイクロカプセル封じは、バイアー斑の標的およびバイアー斑による高 吸収のために効果が激的に増した。第３に、免疫反応の誘導相は長持続であると 思われる。

補助剤の不在下でタンパク質抗原による全身性免疫化は７〜１４日に抗体水準が ピークになることを特徴とするが、経口投与の抗原含有マイクロカプセル誘導反 応は１４日よりも２８日において高かった。

これは、壁材料のバイオエロージョンおよび抗原の放出が長期間に渡って生じ、 従って長い持続反応を誘導することを示す。

ン抗体を誘導する５ＥＢ）キシドを含有する経口投与マイクロカプセル。

（ａ）強い補助剤の活性がマイクロカプセル封じによって与えられること、およ び（ｂ）直径５μｍ以下のマイクロカプセルがバイアー斑を通して入った後に腸 間膜のリンパ節および膵臓に播き散られることを示す上記の結果は、適当な大き さの生物分解性マイクロカプセルに取シ入れたワクチンでの経口免疫化による全 身性免疫反応を誘導することが可能なことを示唆した。この可能性は、可溶性の 形又は５０：５０ＤＬ−ＰＬＧ賦形剤のマイクロカプセル内のブドウ状球菌エン テロトキシンＢ１００μｔでマウスのグループを免疫化した実験で確認した。こ れらのマウスは、３０日まで分けた３つの場合について胃管を介して可溶性又は マイクロカプセル封じのトキシドを投与された。そして各免疫化の後１０日およ び２０に血漿試料が得られた。第１４表のデータは１次。

２次および３次の経口投与後２０日の時点のＩｔＭおよび工ｔＧ抗−トキシン反 応の血漿プラズマ終点タイターを示す。

マイクロカプセルに取シ入れたワクチンを受けたマウスは各免疫化でのトキシン に対し特異の血漿抗体が定常上昇したが、可溶性エンテロトキシンは効果がなか った。この実験は同一ロットのマイクロカプセルを使用して行ない、前記第４〜 ６表に示した実験と平行して検定された。従って、これらのデータハ、マイクロ カプセル封じのブドウ状球菌エンテロトキシドＢでの経口免疫化が血清抗−トキ シン反応の誘導に最適用量での可溶性エンテロトキシンの非口経投与よシも有効 であることを直接示している。

分泌液のＩｔＡ反応を同じグループのマウスで研究し九。このロットのエンテロ トキシド含有マイクロカプセルの特徴の１μｍ以上〜約１０μｍの範囲の不均一 な大きさであることが、マイクロカプセルの１部分がバイアー斑に固定されてい る間にトキシドを放出させるであろうという理由でおった。従って、３次の経口 免疫化の１０日および２０日後に。

唾液および腸洗浄液の試料を得て工ｔＡイソタイプのトキシン−特異抗体を検定 した（第１５表）。可溶性トキシドが経口投与され次ときに反応を引き出せない のと対照的に、マイクロカプセルに取シ入れたトキシド・ワクチンの等量摂取は 唾液および腸分泌液の両方にかなシのｓＩ＃Ａ抗−トキシン反応をもたらした。

各マウスからの腸分泌液は収集中に合計３−に希釈されることを指摘しなければ ならない。

収集した材料に賦課する厳密な希釈係数を決定することは困難であるけれども、 ｓＩ＃Ａの濃度が腸を洗浄する粘液において最低１０倍高いと仮定するのが安全 である。そしてこれはここでの測定には考慮されなかった。

これらのデータは、経口投与され念とき腸および離れた粘膜の部位の両方にｓＩ ｊ’Ａ抗−トキシン反応を誘発することにおけるマイクロカプセル封じのエンテ ロトキシドの効能を明確に示している。さらに、直径１μｍ〜１０．ｕｍの範囲 のマイクロカプセル混合物の使用を通して、強い循環性抗体反応と共在するこの 粘膜の反応を誘発することができる。これは１種々のワクチンがマイクロカプセ ル封じ技術の使用を通してさらに効果的が便利に投与できることを示唆する。

Ｃ９気管内に投与されるワクチンのマイクロカブを誘発する５ＥＢ）キシド含有 の気管内投与マイクロカプセル。

胃腸道のバイアー斑に類似し之小胞リンパ管集合体は、他の解部学的場所１例え ば呼吸気管に見られる粘膜−関連リンパ系組織に存在する。それらの機能はバイ アー斑の機能に類似して、肺の管腔からの物質を吸収すると共に、ｓＩ＃Ａの高 比率を特徴とする抗体反応の誘発部位である。気管支−関連リンパ系組織を介し た免疫化の可能性を研究した。マイクロカプセル封じ又は非マイクロカプセル封 じの形でＳＢＢ　）キシド５０μｔを含有するＰＢＳ５０μｔをマウスのグルー プに直接その気管内に投与した。

免疫化の１０．２０．３０および４０日後に、血漿、唾液、腸洗浄液および気管 支−肺胞洗浄液の試料を収集した。

抗−トキシン特異抗体に対する血漿試料の検定は。

遊離５ＥＢ）キシドの投与は全てのイソタイプにおいて検出可能な抗体反応を誘 発しなかった（第１６表）。一方、マイクロカプセル封じのＳＥＢワクチン等用 量の気管内注入は全てのイソタイプのトキシン特異抗体を誘発し九。この反応は ３０日で層高水準に達して、４０日まで維持され、Ｉ＃Ｍ、Ｉ＃ＧＲよび工ｆＡ タイターはそれぞれ４００．５１，３００および４００であった。

血漿において観察された反応と同様に、気管支−肺胞洗浄液におけるトキシン− 特異抗体は、マイクロカプセル封じのトキシドによって誘発されたが、非カプセ ル封じのワクチンによって誘発されなかった（第１７表）。気管支分泌液におけ る抗−トキシン抗体の出現の速度は血漿反応と比較して若干遅れ、２０日での反 応は工ｔＧイソタイプに検出されたのみであって、最終的に得られた平坦な水準 に比較して低かつ念。しかしながら、ＩｔＧおよび工？Ａ抗−トキシン抗体の最 高タイター（それぞれ１．２８０と３２０）は３０日までに得られて４０日まで 維持された。この免疫化法を使用して、気管支−肺胞洗浄液にはＩＢＭクラスの 抗体は検出されなかった。

これらのデータはマイクロカプセル封じが呼吸管内への投与に伴って抗原ＳＥＢ トキシドに対して免疫反応を生じさせたが、非カプセル化抗原が効果がなかった ことを示す。この反応は循環および呼吸管を洗浄する分泌液の両方に観察された 。この免疫化法はＩＰＡクラス抗体の出現の誘導に有効であったことに注目され る。この抗体は上部呼吸管の血液循環から下部の肺に入るＩ、Ｉｉ’Ｇクラスの 抗体によって保護されない部分における局所合皮の産物と思われる。従って、エ アゾールの吸収によるマイクロカプセル封じ抗原での気管内免疫化は上部呼吸管 を保護する抗体を誘発する有効な手段である。

Ｄ、混合免疫化ルートにより投与のワクチン・マイクロカプセル ヒトおよび動物の両方において、抗原の粘膜提供と組合せた全身的免疫化が粘膜 の免疫反応促進における他の全ての組合せよシも有効であることが示されている （　Ｐｉｅｒｃｅ、　Ｎ、　Ｆ、　ａｎｄ　Ｇｏｗａｎｓ、　Ｊ、　Ｌ、　＋“ Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　ｋｉｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　１ｎｔｅｓｔｉｎａｌ　 ｉｍｍｕｎｅムがマイクロカプセル封じの５ＥＢ）キシド１ｏ。

μｔでのＩＰ免疫化によって開始し、３０日後ＩＰ。

経口又はＩＴルートのいずれかによってマイクロカプセル封じの５ＢＢ）キシド １００μｔで刺激された。これは、マイクロカプセル封じの抗原を利用する混合 免疫プロトコールが誘発されたｓＩｊ’Ａの水準に関して有利でおった否かを直 接決定するために行った。

マイクロカプセル封じのブースター免疫化の２０日後に血漿、腸洗浄液および気 管支−肺胞洗浄液の試料を得て、抗−８ＥＢトキシン抗体の水準およびインタイ ブを終点滴定放射線免疫検定法で決定した（第１０表）。ＩＰ感作マウスのＩＰ ジブ−ティングは、血漿および分泌液の試料における工ｔＧ抗−トキシン抗体の 高水準の出現をもたらしが、試験し念全ての流体における検出可能なＩ？Ａ抗体 の誘発には全く効果がなかった。一方、経口又はＩＴルートによるマイクロカプ セル封じの５ＥＢ）キシドでの二次免疫化は血漿における特異工？Ｇ抗体の水準 を効率的に増強（各グループにおける前−２次免疫タイターは５１，２００であ った）すると共に、腸および気管支−肺胞洗浄液におけるｓＩ＃Ａ抗体の顕著な 水準の出現も誘発した。ＩＰ感作マウスの経口ブースティングは腸分泌液内に分 泌されるｓＩ＃Ａ抗−８ＥＢ　）キシン抗体を３つの間隔で経口免疫化を必要と するものに相当する水準で誘発した（第１８表と第１５表比較）。予めＩＰ免疫 化したマウスの気管内ブースティングは、仲介粘膜反応の誘発に特に有効であっ た、そして気管支−肺胞および腸分泌液の両方の試料におけるＩｔＧおよびｓＩ ＃Ａの高共存水準の出現を誘発した。

これらの結果は、呼吸管に局在する急性感染を介しした病態生理学的効果を発揮 する多数の感染剤に対する免疫化に関して特に重要である。呼吸管内に存在する 抗体は２つの異なる源から出る。分泌工？Ａは鼻咽頭および気管支系を洗浄する 粘液に目立つ（５ｏｕｔａｒ、　０．　Ａ、　＋　“Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ 　ｏｆ　ｉｌａｓｍａ　ｃｅｌｌｓａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｃｅｌｌｓ　ｃｏｎｔ ａｉｎｉｎｇ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　１ｎｔｈｅ　ｒｅｓｐｉｒａｔ ｏｒｙ　ｔｒａｃｔ　ｏｆ　ｎｏｒｍａｌ　ｍａｎ　ａｎｄ　ｃｌａｓｓＭ、　 Ｋ、　Ｌ、　、“Ｔｈｅ　ｃｌａｓｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｇｌ ｏｂｕｌｉｎｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｌｕｉｄｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ 　ｆｒｏｍ　ｖａｒｉｏｕｓ１ｅｖｅｌｓ　　ｏｆ　　ｃａｎｉｎｅ　　ｒｅｓ ｐｉｒａｔｏｒｙ　　ｔｒａｃｔ、、　　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１１６：４２３：　１９７６）、そして上部呼吸管の固有板に位置する局部血漿 細胞の産物である。鼻咽頭および気管支系と対照的に、細気管支および胞は血液 循環から受動的に誘導される工ｔＧを含む（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ、　Ｈ，Ｙ。

ａｎｄ　Ｎｅｗｂｏｌｌ、　Ｈ，Ｈ，、”Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅ ｉｎｓ　ａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｃｅｌｌｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｆｒ ｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｌｕｎｇｓ　ｂｙｂｒｏｎｃｈｉａｌ　Ｉａｖａｇｅ’＋　 Ｊ、Ｌａｂ、Ｃｌ１ｎ、　Ｍｅｄ、、　８４：５５９゜（１９７４））。従って 、肺の効果的保護は循環するＩｔＧと粘膜のＳＩ＃Ａ抗体の両方を必要とする。

これらのデータは、マイクロカプセル封じの抗原を利用する混合ルートの免疫化 プロトコールカ共在の循環および粘膜の抗体反応の誘発に最も効率であることを 示している。報告した実験はそれぞれがマイクロカプセル封じの抗原の投与を必 要とした別々の感作およびブースティング工程を検討するが、最高の共在する全 身的および分泌免疫を刺激する１回の投与規制を計画するためにマイクロカプセ ル供給システムによって与えられる制御された拍動的放出に融通性を用いること ができる。−例として、マイクロカプセル封じの抗原は、医師への１回の訪問中 に注射と摂取の両方によって投与することができる。

２つの用量におけるラクチドとグリコリドとの比を変えることによって、全身的 に投与された用量が数日以内に放出されて免疫系を感作させ、そして第２の（経 口）用量が遅れてバイアー斑に放出されて増強された粘膜反応を刺激する。

下、望ましくは１〜５μｍ）が薬並びに抗原の体内への吸収を改善できることを 示す。エトレチナート（（Ａｌ　１−Ｅ）　−９−（４−ｍｅｔｈｏｘｙ−２， ３，６−１ｒｉｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅ６−１ｒｉ、　７−ｄｉｍｅｔｈｙｌ　− ２，４，８−ｎｏｎａｔｅｔｒａｅｎｏｉｃ　ａｃｉｄ。

ｅｔｈｙｌ　ｅｓｔｅｒ）を５０：５０ポリ（ＤＬ−ラクチドーコーグリコリド ）でマイクロカプセル封じした。それらのマイクロカプセルは直径が０．５〜４ μｍで３７．２重量％のエトレチナートを含有した。これらのエトレチナート・ マイクロカプセル並びに非カプセル封じのエトレチナートをビヒクルとして水に １重量％Ｔｗｅｅｎ　８０　　を使用して経口胃管栄養によってマウスに投与し た。５０■エトレチナー）／ＫＰの単一用量のみが与えられた。投与されたマウ スからの血液を特定の時間間隔で収集してこの拘液の血清を高性能クロマトグラ フィーを使用してエントレチナートおよび（ま次は）その代謝生成物を定量した （第１９表）。それらの結果は、エトレチナート・マイクロカプセルで処置され たマウスは非カプセル封じのエントレチナートで処置されたマウスよシも著しく 高いエントレチナートの血液レベルを有したことを示している。６μｍ以下のワ クチン・マイクロカプセルのように、マイクロカプセルは胃腸道におけるリンパ 系組織（バイアー斑）を介して血液へエントレチナートを運ぶと考えられる。こ の同じ方法が他の薬剤の吸収を高める念めに応用できる筈であって、その用途は 、特にペプチド、タンノ（り質。

核酸、等のような生物薬剤の供給に有用′″Ｑある。

浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 第１１表：ＪＥワクチン免疫化研究からの血清試料についてのＯＰＥ抑制の検定 結果 ウィルス−誘発ＣＰＥを５０％まで下げうる血清の希釈（日） 平　　均　　　＜１０　　　　　　　　１１　　　　　　　　　１１最　　大　 　　＜１０　　　　　　　　１６　　　　　　　　　＜２０最　　小　　　＜１ ０　　　　　　　　＜１０　　　　　　　　　＜１０グループ２　＝　３．０１ ９非カプセル封じＪＥワクチンＩＰ（１０日）ＧＭ’ｌ”　　　　　４４　　　 　　　　７３　　　　　　　　５０平　　均　　　　５５　　　　　　　　９５ 　　　　　　　　　７１最　　大　　　１２７　　　　　　　２５４　　　　　 　　　１０００ＭＴ　　　　５０７　　　　　　３，８８０　　　　　　　１． ５７６平　　均　　　９３４　　　　　　　５，３６３　　　　　　　２．９５ １最　　大　　４，０６４　　　　　　＞１０，２４０　　　　　　）１０，２ ４０最　　小　　　１６０　　　　　　　８０６　　　　　　　　２５４平　　 均　　　８０３　　　　　　　１，２３０　　　　　　　２．４６８最　　大　 　　３２０　　　　　　５，１２０　　　　　　１０．２４０浄書（内容に変更 なし） 第１２表：ＪＥワクチン免疫研究からのプールド血清試料についてのａ）非処理 対照品。

ｂ）０日て非カプセル封じＪＥワクチンＩＰ３．０Ｉｆを受けた動物。

ｃ）ＮＤ＝決定せず（試料の量不士分）。

ｄ）０，１４．４２日に非カプセル封じＪＥワクセンＩ　Ｐ　３．０ダを受けた 動物。

ｅ）ｏｉに非カプセル封じＪＥワクチンＩＰ３．０１ｆとマイクロカプセル封じ ＪＥワクチンＩ　Ｐ　３．０　岬を受けた動物。

浄書（内容に変更なし） １００　　　　　微小球　　８０　１２８０　３２０　５Ｊ２０　１，２８０　 ４０．９６０１００　　　　　　　可溶性　　＜２０　　　＜２０　　　８０　 　　＜２０　　６４０　　　＜２０浄書（内容に変更なし） レチナートの濃度 エトレチナートの濃度、ｎυ匍 時間（ｈｒ）　　　　　マイクロカプセル　　非マイクロカブ七ル封じの薬剤Ｎ Ｄ＝検出不能 ５乙桑４１に知っＵ克Ｌ ＦＩＧ、　１ 手続補正書（方式） １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８９１０１０８３ 平成１年　特許願　第５０３６７９号 ２、発明の名称 免疫反応を増強する方法及び組成物 ３、補正する者 事件との関係　特許出願人 住所　アメリカ合衆国アラバマ州３５２５５−５３０５、バーミンガム、ピーオ ーボックス５５３０５、サウス・ナインス・アベニュー２０００名称　サウザン ・リサーチ・インスチチュート（他１名） ４、代理人 住所　　〒１００東京都千代田区大手町２丁目２番１号新大手町ビルディング４ ５０号室 電話　３２４１−１５２６ ６、補正により増加する請求項の数　　　　なし７、補正の対象　　特許法第１ ８４条の５第１項の規定による書面の発明者及び特許出願人の欄、明細書第６２ 〜７５頁の翻訳文、委任状 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）有効量の生物活性剤を生物適合性賦形剤でカプセル封じを行つて約１ ０μｍ以下の大きさのマイクロカプセルを形成する工程と、 （ｂ）治療量の前記マイクロカプセルが粘膜関連リンパ網様組織に到達して該組 織によつて吸収されるように、有効量の前記カプセルを動物に投与する工程、 からなることを特徴とする生物活性剤を動物の粘膜関連リンパ網様組織へ供給す る方法。 ２．前記投与工程は経口、鼻、直腸および眼からの投与からなる群から選ぶ請求 の範囲第１項記載の方法。 ３．前記投与工程が経口吸入による請求の範囲第１項記載の方法。 ４．前記生物活性剤は薬剤、栄養素、免疫調節剤、リンフオカイン、モノカイン 、サイトカイン、抗原およびアレルゲンからなる群から選ぶ請求の範囲第１項記 載の方法。 ５．前記マイクロカプセルが約１μｍ〜約１０μｍの大きさを有する請求の範囲 第１項記載の方法。 ６．前記マイクロカプセルが前記粘膜関連リンパ網様組織に保持されるように、 前記マイクロカプセルが約５μｍ〜約１０μｍの範囲内の大きさを有する請求の 範囲第１項記載の方法。 ７．前記マイクロカプセルが前記粘膜関連リンパ網様組織を通過できるように、 前記マイクロカプセルが約５μｍ以下の大きさを有する請求の範囲第１項記載の 方法。 ８．前記マイクロカプセルが前記粘膜関連リンパ網様組織を通過できるように、 前記マイクロカプセルが約１μｍ〜約５μｍの大きさを有する請求の範囲第１項 記載の方法。 ９．前記生物活性剤が前記動物に粘膜免疫を提供する抗原である請求の範囲第６ 項記載の方法。 １０．前記生物活性剤が前記動物に粘膜免疫を提供するアレルゲンである請求の 範囲第６項記載の方法。 １１．前記生物活性剤が前記動物に全身的免疫を提供する抗原である請求の範囲 第７項記載の方法。 １２．前記生物活性剤が前記動物に全身的免疫を提供するアレルゲンである請求 の範囲第７項記載の方法。 １３．前記マイクロカプセルが約５μｍ以下の大きさを有する複数の第１のマイ クロカプセルと、約５μｍ〜約１０μｍの範囲内の大きさを有する複数の第２の マイクロカプセルからなり、前記投与工程が全身的免疫と粘膜免疫の両方を提供 するために前記動物に前記第１および第２のマイクロカプセルの混合物を供給す ることからなる請求の範囲第４項記載の方法。 １４．前記第１のマイクロカプセルが約１μｍ〜約５μｍの大きさを有する請求 の範囲第１３項記載の方法。 １５．前記マイクロカプセルが前記粘膜関連リンパ網様組織を通過できるように 、前記マイクロカプセルが約５μｍ以下の大きさを有する請求の範囲第４項記載 の方法。 １６．前記マイクロカプセルが約１μｍ〜約５μｍの範囲内の大きさを有する請 求の範囲第１５項記載の方法。 １７．有効量の第１の遊離生物活性剤および第２の生物活性剤を含有し生物適合 性賦形剤壁を有するマイクロカプセルの混合物を動物に投与する工程からなり、 前記マイクロカプセルが約１０μｍ以上の大きさであって、前記第１の生物活性 剤が１次の免疫反応を提供し前記マイクロカプセルが前記第２の生物活性剤を放 出して後続の免疫反応を増強することからなることを特徴とする動物を免疫化す る方法。 １８．前記生物活性剤の少なくとも１つは抗原、アレルゲン、リンフオカイン、 モノカイン・サイトカインおよび免疫調節剤からなる群から選ぶ請求の範囲第１ ７項記載の方法。 １９．約１０μｍ以下の大きさを有して第１の生物活性剤を含有する第１の生物 適応性マイクロカプセルおよび約１０μｍ以上の大きさを有する第２の生物活性 剤を含有する第２の生物適応性マイクロカプセルの有効量の混合物を動物に投与 する工程からなり、前記第１のマイクロカプセルが１次免疫反応を提供し前記第 ２のマイクロカプセルが前記第２の生物活性剤を放出して後続の免疫反応を拍動 的に増強することを特徴とする動物の免疫反応を増強する方法。 ２０．前記第１のマイクロカプセルが約１μｍ〜約１０μｍの範囲内の大きさを 有する請求の範囲第１９項記載の方法。 ２１．前記生物活性剤の少なくとも１つは抗原、アレルゲン、リンフオカイン、 モノカイン、サイトカインおよび免疫調節剤からなる群から選ぶ請求の範囲第１ ９項記載の方法。 ２２．（ａ）有効量の抗原を生物適合性賦形剤でカプセル封じをして約５μｍ以 下の大きさのマイクロカプセルを形成する工程、および （ｂ）前記マイクロカプセルを動物に経口投与する工程、 からなることを特徴とする動物に全身的免疫を提供する方法。 ２３．前記マイクロカプセルが約１〜約５μｍの範囲内の大きさを有する請求の 範囲第２２項記載の方法。 ２４（ａ）有効量の抗原を生物適合性賦形剤でカプセル封じをして約５μｍ以下 の大きさのマイクロカプセルを形成する工程、および （ｂ）前記マイクロカプセルを動物に経口投与する工程、 からなることを特徴とする動物に全身的免疫を提供する方法。 ２５．前記マイクロカプセルが約１〜約５μｍの範囲内の大きさを有する詞宗の 範囲第２４項記載の方法。 ２６．（ａ）有効量の抗原を生物適合性賦形剤でカプセル封じをして約５μｍ以 下の大きさのマイクロカプセルを形成する工程、および （ｂ）前記マイクロカプセルを動物に経口吸入する工程、 からなることを特徴とする動物に全身的免疫を提供する方法。 ２７．前記マイクロカプセルが約１〜約５μｍの範囲内の大きさを有する請求の 範囲第２６項記載の方法。 ２８．（ａ）有効量の抗原を生物適合性賦形剤でカプセル封じをして約５μｍ以 下の大きさのマイクロカプセルを形成する工程、および （ｂ）前記マイクロカプセルを動物に直腸投与する工程、 からなることを特徴とする動物に全身的免疫を提供する方法。 ２９．前記マイクロカプセルが約１〜約５μｍの範囲内の大きさを有する請求の 範囲第２８項記載の方法。 ３０．（ａ）有効量の抗原を生物適合性賦形剤でカプセル封じをして約５μｍ以 下の大きさのマイクロカプセルを形成する工程、および （ｂ）前記マイクロカプセルを動物に経眼投与する工程、 からなることを特徴とする動物に全身的免疫を提供する方法。 ３１．前記マイクロカプセルが約１〜約５μｍの範囲内の大きさを有する請求の 範囲第３０項記載の方法。 ３２．（ａ）有効量の抗原を生物適応性賦形剤でカプセル封じをして約５μｍ〜 約１０μｍの範囲内の大きさを有するマイクロカプセルを形成する工程、および （ｂ）前記マイクロカプセルを前記動物に経口投与する工保、 からなることを特徴とする動物に粘膜免疫を提供する方法。 ３３．（ａ）有効量の抗原を生物適応性賦形剤でかプセル封じをして約５μｍ〜 約１０μｍの範囲内の大きさを有するマイクロカプセルを形成する工程、および （ｂ）前記マイクロカプセルを前記動物に経口投与する工程、 からなることを特徴とする動物に粘膜免疫を提供する方法。 ３４．（ａ）有効量の抗原を生物適応性賦形剤でカプセル封じをして約５μｍ〜 約１０μｍの範囲内の大きさを有するマイクロカプセルを形成する工程、および （ｂ）前記マイクロカプセルを前記動物に口吸入によつて投与する工程、 からなることを特徴とする動物に粘膜免疫を提供する方法。 ３５．（ａ）有効量の抗原を生物適応性賦形剤でカプセル封じをして約５μｍ〜 約１０μｍの範囲内の大きさを有するマイクロカプセルを形成する工程、および （ｂ）前記マイクロカプセルを前記動物に直腸投与する工程、 からなることを特徴とする動物に粘膜免疫を提供する方法。 ３６．（ａ）有効量の抗原を生物適応性賦形剤でカプセル封じをして約５μｍ〜 約１０μｍの範囲内の大きさを有するマイクロカプセルを形成する工程、および （ｂ）前記マイクロカプセルを前記動物に経眼投与する工程、 からなることを特徴とする動物に粘膜免疫を提供する方法。 ３７．抗原を含有すると共に約５μｍ以下の大きさを有する複数の第１のマイク ロカプセルと、抗原を含有すると共に約５μｍ〜約１０μｍの範囲内の大きさを 有する複数の第２のマイクロカプセルを動物に投与する工程からなり、該投与工 程が前記第１および第２のマイクロカプセルの混合物を前記動物へ供給して全身 的免疫と粘膜免疫の両方提供することからなることを特徴とする動物に全身およ び粘膜免疫を提供する方法。 ３８．前記投与工程は経口投与、経鼻投与経口吸入、直腸投与、および経眼投与 からなる群から選ぶ請求の範囲第３７項記載の方法 ３９．前記第１のマイクロカプセルが約１μｍ〜５μｍの範囲内の大きさを有す る請求の範囲第３８項記載の方法。 ４０．有効量の生物活性剤を生物適応性材料でカプセル封じをして約１０μｍ以 下の大きさを有するマイクロカプセルを形成することからなることを特徴とする 動物の粘膜関連リンパ網様組織に生物活性剤を供給する組成物の提供方法。 ４１．前記マイクロカプセルが約１μｍ〜約１０μｍの間の大きさを有する請求 の範囲第４０項記載の方法。 ４２．前記生物活性剤は薬剤、栄養素、リンフカカイン、モノカイン、サイトカ イン、抗原、アレルゲンおよび免疫調節剤からなる群から選ぶ請求の範囲第４１ 項記載の方法。 ４３．前記マイクロカプセルが投与されて前記粘膜関連リンパ網様組織に保持さ れるように、前記マイクロカプセルが約５μｍ〜約１０μｍの範囲内の大きさを 有する請求の範囲第４０項記載の方法。 ４４．前記マイクロカプセルが前記粘膜関連リンパ網様組織を通過できるように 、前記マイクロカプセルが約５μｍ以下の大きさを有する請求の範囲第４０項記 載の方法。 ４５．前記マイクロカプセルが約５μｍ以下の大きさを有する複数の第１のマイ クロカプセルと、約５μｍ〜約１０μｍの間の大きさを有する複数の第２のマイ クロカプセルからなり、前記第１および第２のマイクロカプセルが前記動物に投 与されて全身的および粘膜免疫を提供する請求の範囲第４１項記載の方法。 ４６．前記第１のマイクロカプセルが約１μｍ〜約５μｍの間の大きさを有する 請求の範囲第４８項記載の方法。 ４７．第１の遊離生物活性剤、および生物適応性賦形剤壁を有して第２の生物活 性剤を含有するマイクロカプセルの有効量を一緒に添加して動物に投与される混 合物を生成する工程からなり、前記第１の生物活性剤が一次反応を提供し、前記 マイクロカプセルが前記第２の生物活性剤を放出して後続の反応を増強すること を特徴とする動物の免疫反応を増強する組成物の調製方法。 ４８．前記生物活性剤の少なくとも１つが抗原である請求の範囲第４７項記載の 方法。 ４９．前記生物活性剤の少なくとも１つがアレルゲンである請求の範囲第４７項 記載の方法。 ５０．前記マイクロカプセルが約１０μｍ以上の大きさを有する請求の範囲第４ ７項記載の方法。 ５１．有効量の抗原を生物適合性賦形剤でカプセル封じをして約５μｍ以下の大 きさを有するマイクロカプセルを形成する工程からなり、前記マイクロカプセル が動物に投与されることを特徴とする動物に全身的免疫を提供する組成物の調製 方法。 ５２．前記マイクロカプセルが約１μｍ〜約５μｍの間の大きさを有する請求の 範囲第５１項記載の方法。 ５３．（ａ）有効量の生物活性剤を生物適応性賦形剤でカプセル封じをして約１ ０μｍ以下の大きさのマイクロカプセルを形成する工程：および（ｂ）有効量の 前記マイクロカプセルを前記動物に経口投与する工程、 からなることを特徴とする動物への生物活性剤の生物有効性を高める方法。 ５４．前記マイクロカプセルが約１μｍ〜約１０μｍの大きさを有する請求の範 囲第５３項記載の方法。 ５５．前記生物活性剤は薬剤、栄養素、免疫調節剤、リンフカカイン、モノカイ ンおよびサイトカインからなる群から選ぶ請求の範囲第５３項記載の方法。 ５６．１０μｍ以下の大きさを有するマイクロカプセルを形成する生物適応性賦 形剤にカプセル封じされた生物活性剤を動物へ非経口投与する工程からなること を特徴とする動物に免疫反応を開始させるために生物活性剤を供給する方法。 ５７．前記マイクロカプセルが約１μｍ〜約１０μｍの大きさを有する請求の範 囲第５４項記載の方法。 ５８．前記非経口投与の工程が単一注入からなる請求の範囲第５６項記載の方法 。 ５９．前記非経口投与が多重注入からなる請求の範囲第５６項記載の方法。 ６０．前記生物活性剤は抗原、免疫調節剤、アレルゲン、リンフオカイン、モノ カインおよびサイトカインからなる群から選ぶ請求の範囲第５６項記載の方法。 ６１．約１０μｍ以下の大きさを有するマイクロカプセルを形成する生物適応性 賦形剤にカプセル封じされた有効量の生物活性剤からなることを特徴とする動物 の粘膜関連リンパ網様組織に生物活性剤を供給する組成物。 ６２．前記マイクロカプセルが約１μｍへ約１０μｍの間の大きさを有する請求 の範囲第６１項記載の方法。 ６３．前記生物活性剤は薬剤、栄養素、免疫調節剤、リンフオカイン、モノカイ ン、サイトカイン、抗原およびアレルゲンからなる群から選ぶ請求の範囲第６１ 項記載の方法。 ６４．前記マイクロカプセルが前記粘膜関連リンパ網様組織に保持されるように 、前記マイクロカプセルが約５μｍ〜約１０μｍの範囲内の大きさを有する請求 の範囲第６１項記載の方法。 ６５．前記マイクロカプセルが前記粘膜関連リンパ網様組織を通過できるように 、前記マイクロカプセルが約５μｍ以下の大きさを有する請求の範囲第６１項記 載の方法。 ６６．前記マイクロカプセルが約１μｍ〜約５μｍの大きさを有する請求の範囲 第６５項記載の方法。 ６７．前記マイクロカプセルが約５μｍ以下の大きさを有する複数の第１のマイ クロカプセルと、約５μｍ〜約１０μｍの間の大きさを有する複数の第２のマイ クロカプセルからなり、前記第１および第２のマイクロカプセルが前記動物に投 与されて全身的および粘膜免疫を提供する請求の範囲第６３項記載の方法。 ６８．前記第１のマイクロカプセルが約１μｍ〜約５μｍの間の大きさを有する 請求の範囲第６７項記載の方法。 ６９．一次反応を提供する第１の遊離生物活性剤と、生物適応性賦形剤壁を有し て後続の反応を増強するために拍動的に放出される第２の生物活性剤を含有する マイクロカプセルの混合物からなることを特徴とする動物の免疫反応を増強する 組成物。 ７０．前記第１および第２の生物活性剤が抗原である請求の範囲第６９項記載の 方法。 ７１．前記第１および第２の生物活性剤がアレルゲンである請求の範囲第６９項 記載の方法。 ７２．前記生物活性剤の少なくとも１つが抗原である請求の範囲第６９項記載の 方法。 ７３．前記生物活性剤の少なくとも１つがアレルゲンである請求の範囲第６９項 記載の方法。 ７４．前記生物活性剤の少なくとも１つがリンフオカインである請求の範囲第６ ９項記載の方法。 ７５．前記生物活性剤の少なくとも１つがサイトカインである請求の範囲第６９ 項記載の方法。 ７６．前記生物活性剤の少なくとも１つがモノカインである請求の範囲第６９項 記載の方法。 ７７．前記生物活性剤の少なくとも１つが免疫調節剤である請求の範囲第６９項 記載の方法。 ７８．前記マイクロカプセルが約１μｍ以上の大きさを有する請求の範囲第６９ 項記載の方法。 ７９．前記マイクロカプセルが約１μｍ〜約１０μｍの間の大きさを有する請求 の範囲第６９項記載の方法。 ８０．前記マイクロカプセルが約１０μｍ以上の大きさを有する請求の範囲第６ ９項記載の方法。 ８１．約１μｍ〜約１０μｍの直径を有するマイクロカプセルを形成する生物適 応性賦形剤にカプセル封じされた有効量の生物活性剤からなることを特徴とする 動物に全身的免疫を提供する組成物。 ８２．前記生物活性剤は薬剤、栄養素、免疫調節剤リンフオカイン，モノカイン およびサイトカインからなる群から選ぶ請求の範囲第５３項記載の方法。 ８３．約１０μｍ以下の大きさを有して第１の生物活性剤を含有する第１の生物 適応性マイクロカプセルと、約１０μｍ以上の大きさを有して第２の生物活性剤 を含有する第２の生物適応性マイクロカプセルの有効量の混合物からなり、前記 第１のマイクロカプセルが一次の免疫反応を提供し、前記第２のマイクロカプセ ルが前記第２の生物活性剤を放出して後続の免疫反応を増強することを特徴とす る動物の免疫反応を増強する組成物。 ８４．前記第１のマイクロカプセルが約１μｍ〜約１０μｍの大きさを有する請 求の範囲第８３項記載の方法。 ８５．前記生物活性剤の少なくとも１つは薬剤、栄養素、免疫調節剤、リンフオ カイン、モノカインおよびサイトカインからなる群から選ぶ請求の範囲第８３項 記載の方法。 ８６、有効量の生物活性剤を含有し約１０μｍ以下の大きさを有する生物適合性 マイクロカプセルからなる経口投与を介して生物活性剤の生物有効性を増す組成 物。 ８７．前記マイクロカプセルが約１μｍ〜約１０μｍの間の大きさを有する請求 の範囲第８６項記載の方法。 ８８．前記生物活性剤は薬剤、栄養素、免疫調節剤、リンフオカイン、モノカイ ン、サイトカイン、抗原およびアレルゲンからなる群から選ぶ請求の範囲第８６ 項記載の方法。