JPH03504200A - トコフエロールの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 トコフェロールの製造方法 本発明はトコフェロール及び関連化合物の製造方法に関する。より詳細には、本 発明は下記式 Ｒ１がメチルで　Ｒ２及びＲ３が水素であり　Ｒ１及びＲ２がメチルで、Ｒ３が 水素であり、Ｒ１及びＲ３メチルでＲ２が水素であるか、又はＲ１−Ｒ２−Ｒ３ −水素又はメチルである、の化合物、及び対応する３’、７’、ｌ　ｌ’−トリ エノールの製造方法に関し、その方法は下記式 上式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は上記の通りである、のフィチルベンゾヒドロキノ ン誘導体又は対応する２′、６″、１０’、１４″−テトラエンーイルヒドロキ ノンを、原核藍藻類（ｐｒｏｃａｒｙｏｌｉｃ　ｂｌｕｅ−ｇｒｅｅｎ　ａ１ｇ ａｅＸシアノフイセ−［Ｃｙａｎｏｐｈｙｃｅａｅｌ　）のスフェロプラスト（ の培養液）、又はそれから得られた酵素分画で処理することから成る方法に関す る。（の培養液）という用語は培養液だけでなく、又藻類のプランクトン個体群 も使用できることを指示するために使用される。

式Ｉは好適には（Ｒ，Ｒ，Ｒ）−α−トコフェロール及び対応するβ。

γ及びδ−トコフェロールを包含する。

既知のように、下記のように対応する：Ｒ’＝Ｒ”＝Ｒ３＝Ｈトコフェロール Ｒ１＝＆Ｒ１耽Ｒ３＝ＣＨ，α−トコフェロールＲ’−Ｒ３−ＣＨ，、Ｒ”−Ｈ β−トコフェロールＲ３−Ｈ，Ｒ’−Ｒ”−ＣＨ３γ−トコフェロールＲ２冨Ｒ ３＝Ｈ，、Ｒ’＝ＣＨ，δ−トコフェロール主として興味の対象となるのはＲ， Ｒ，Ｒ−ａ−）コフェロールでアル。

式Ｉの残りの化合物並びにトリエノールは主としてＲ，Ｒ，Ｒ−ａ−トコフェロ ールの先駆体と考えられる；この点に関してはかような先駆体のメチル化に関す る米国特許第３８１９６５７号及び米国特許第２６４００５８号を参照されたい 。

高等植物又は緑藻類のような真核生物、及び藍藻類のような原核生物においてト コフェロールの生合成は、ホモゲンチシン酸類とフィチルピロ燐酸類の縮合によ るフィチルベンゾキノール誘導体の形成、及び環化及び引き続くメチル化による トコフェロールの生成を含んでいる。例えばＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　（１９７ ０）上土ヱ、５９３−６００に記載されたように、高等植物のラフツカ・サチバ （Ｌａｃｔｕｃａ　５ａｔｉｖａ）及びルメクス・サンギネウス（ＲＬＩＩＩＩ ＩＩ！Ｘ　ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ）において、緑藻類エウグレナ・グラシリス（ Ｅｕｇｌｅｎａ　ｇｒａｃｉｌｉｓ）及びクロレラ・ピレノイドサ（Ｃｈｌｏｒ ｅｌｌａ　ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）において、及び藍藻類アナシスチス・ニヅ ランス（Ａｎａｃｙｓｔｉｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）にむいて、ホモゲンチシン酸 類はプラストキノン、α−トコフェロールキノン及びトコフェロールの生合成的 先駆体であることが報告されている。更にＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　（１９８７ ）　２４２．３６７−３７３において、単細胞藍藻スケネデスムス・オブリクウ ス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｒｎｕｓ　ｏｂｌｉｑｕｕｓ）はａ−トコフェロール及び 種々のフィチルベンゾキノン誘導体を含むことが報告されている。先駆体段階に おける並びにトコフェロール段階における芳香族環のメチル化はＳＡＭ（Ｓ−ア デノシルメチオニン）によって仲介されることが示された。Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ　（１９８０）１旦、２１５−２１８参照のこと。

しかし５−フィチル−１，４−ヒドロキノン−先駆体及び５−ゲラニルゲラニル −１，４−ベンゾヒドロキノンのγ−及びδ−トコトリエノール夫々への、トコ フェロールへの生合成的転化に関しては実証がない。

本発明により提供される方法は微生物により対応するベンゾキノール誘導体から トコフェロール及びトコトリエノールの製造を新規に可能とするものである。

本発明の方法の予期せざる利点は、Ｅ誘導体■のみが反応する、即ち、誘導体■ のＺ異性体は対象とするスフェロプラストと反応しないという事実にある。言い 換えれば、１００％Ｅ異性体として出発物質■を使用する必要はない；Ｅ誘導体 ■とそのＥ異性体との混合物を出発物質として使用することができる。

化合物■は化合物■よりも極性が大ぎいから、“未反応の“■は例えばクロマト グラフィーによって容易に分離することができる。

本発明において使用される微生物は原核性藍藻類（シアノフイセー）の綱に属す るものである。ベンゾキノール先駆体のトコフェロールへの環化は、その環化機 能によって屡々“トコフェロールサイクラーゼ”と呼ばれる現在まで未知の酵素 によって接触されると考えられる。トコ７エａ−ルサイクラーゼ活性は夫々標識 された又は標識されていないベンゾキノール誘導体の、夫々標識された又は標識 されていないトコフェロール及びトコトリエノールへの転化を、夫々ＴＬＣ−放 射能活性−走査法、ＨＰＬＣ−放射能活性−検査法及びＨＰＬＣ−蛍光検出法の ような標準的方法によって測定することができる。

本発明において好適に使用される菌株はアナバエナ・ヴアリアビリス（Ａｎａｂ ａｅｎａｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）（ＳＡＧ　　１４０３　４ｂ）及びクロログレ オプシス（ＣｈｌｏｒｏＨｌｅｏｐｓｉｓ）（ＳＡＧ　　１４１１　１ａ）であ る。′海草：藻類学概論（Ａｌｇｅｎ：Ｅｉｎｆｉｊｒｕｎｇ　ｉｎ　ｄｅｒ　 Ｐｈｙｋｏｌｏｇｉｅ）”、１９８４、クリスチアンーヴアン・デン・ホエク（ Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ　ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｈｏｅｋ）編、ゲオルゲφチーメ（Ｇｅ ｏｒｇｅ　Ｔｈｉｅｍｅ）社、スツッツガルト、ニューヨーク、による分類によ れば、アナバエナ・ヴアリアビリス及びクロロダレオプシスはシアノバクテリエ −（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｊａｅ）の綱のプロ力υオンツ（ｐｒｏｃａｒｙｏ ｎｔｓ）である。これらの菌株の形態学的及び生理学的特性は上記の教科書に記 載されている。天然資源から単離された菌株又は通常の所蔵品、例えばゲッチン ゲン大学の植物生理学研究所、海草技術所蔵品（Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎＡｌ ｇｅｎｋｕｌｔｕｒｅｎ、　Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌｏｇ、　Ｉｎ５ｔ ｉｔｕｔ　ｄｅｒ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｌｔ　Ｇ５ｔ| ｔｉｎｇｅｎ）　（ＳＡＧ）から公的に入手できる上記の綱に属する任意の菌株 が本発明のために使用できる。

好適な菌株はトコフェロールを含む菌株である。かようなトコフェロールの含量 は藻類の検体を例えばヘキサンで抽出し、次いで適当なガスクロマトグラフ的な 定量を行うことにより、容易に分析することができ本発明の方法はそれ自体既知 な方法により適当な培地中で微生物を培養し、微生物の改質形、即ちこの微生物 のスフェロプラスト、可溶化されｌこスフェロプラスト又は酵素画分、特に純粋 な酵素画分を使用することによって行うことができる。

未改質の形態でスフ　工Ｉ７７’ラストを使用することは事実上輸送の問題を招 き、従って酵素活性の欠如をもｌこらずことが見出された。

適当な培養培地は炭素源、窒素源及び微生物の成長に不可決な無機塩を含む普通 の培地である。

二酸化炭素は炭素源として役立つが、他の物買、例えば炭酸塩も使用することが できる。窒素源としては、硝酸塩又はアンモニウム塩等のような無機塩が使用で きる。無機の栄養源として、例えば燐酸カリウム、硫酸マグネシウム、ト及び第 二塩化鉄、塩化カルシウム等が使用できる。

上記の微生物を培養するためには種々な方法がある。例えば振盪フラスコ培養又 は発酵器培養のような水中培養を使用することができる。パッチ式培養又は連ｊ ！培養も使用することができる。

好適には培養は好気的条件下で行われる。培養は好適には光の存在下で約５．０ なシル約９．０、好適には役立つ６．５ないし８．０のｐＨで行うべきである。

培養を行う好適な温度範囲は約２０’０なシル３７℃、好適には２５℃ないし３ ３℃で行われる。培養期間は特定の微生物及び使用される培地により変わるが、 約４ないし１０日の培養が通常最良の結果を与える。

本発明により提供される方法は上記のようにスフェロプラスト、可溶化された（ 即ち水性媒体中に可溶化された）スフェロプラスト又は培養された微生物の酵素 画分により行われる。

周知のようにスフェロプラストという用語は等優性（又は高張性）の培地中に分 散された細胞の細胞壁の破壊又は部分的な除去によって形成されるような球状又 は近似的に球状の細胞構造物を称する。

藻類のスフェロプラストは普通の方法で、即ち、無傷の細胞をリゾチーム［この 用語は細胞を分解する酵素を表すヒドロラーゼの群を称する］で処理することに よって得られる。これは約２０ないし４０’Ｃの温度範囲で、及び約１ないし１ ０時間に亙り、約６ないし８のｐＨで行うことが便利である。通常のりゾチーム 製剤、例えばメルク（Ｍｅｒｃｋ）、ダルムスタット（ＤａｒｍｓｔａｄＬ）に より製造された“リゾチーム（Ｌｙｓｏｚｙｍ）”が使用できる。適当な使用量 はりゾチーム製剤の約１５０００−２５０００単位／ｇである。

スフェロプラストの製造は高張緩衝液の存在において細胞の破裂を避けて行うこ とが便利である。

高張緩衝液は細胞よりも高い浸透圧を有する緩衝液を定義する用語である。この 高い圧力は例えばスクロースの添加により達成することができる。ＬＪ、セメノ ヴｙ　（Ｓａｍｅｎｏｖａ）等、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１ｏｇｉｙａ旦↓、２５９（ １９８２）を参照のこと。

スフェロプラストが利用される場合に、ベゾキノン誘導体■はｐＨ約６ないし８ において嫌気的条件下で、高張緩衝液中でトコフェロールに転化することができ る。一般に約５ないし９日の培養液からの細胞がスフェロプラストの形成、及び 従ってベンゾキノール誘導体のトコフェロール及びトコトリエノールへの転化に 最も効果的な細胞を得るのに好適である。

この転化の際に栄養素を追加することは不必要である。

他方、可溶化されたスフェロプラスト−この用語は水性系を称する−又は酵素製 剤が使用される場合は、ベンゾキノール誘導体■のトコフェロール及びトコトリ エノールへの転化は普通に使用される非高張緩衝液中でｐＨ約６ないし８におい て嫌気的条件下で行うことができる。この場合は、栄養素の存在は不必要である 。

酵素画分が利用される場合に、該酵素画分は可溶化されたスフェロプラストから クロマトグラフィー、例えばイオン交換クロマトグラフィー、液体クロマトグラ フィー、ゲルクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフ ィー等により好都合に得られる。上記に概説したような緩衝溶液を用いることが 便利である。活性画分は上記に概説したようなサイクラーゼ活性の分析により決 定することができる。必要な精製は界面活性剤、好適には非イオン性界面活性剤 により行うことかでさる。

各場合共約２５−３５℃の温度範囲が適当である。

この反応に際しては基質はアセトン、メタノール、エタノール等の親水性溶剤の 溶液中で、又はかような親水性溶剤を含む溶液中で使用されることが好ましい。

更に、非イオン性界面活性剤の存在は酵素の活性を保持するために好適である。

実例はドデシル−Ｄ−マルトシド、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）ｌ　００．　　） ウィーン（Ｔｖａｅｎ）８０である。

基質は予備処理された複合体としても使用することができ、利点として下記の点 が挙げられる： １、）親水性の補助溶剤が必要ない［及び従ってこうすれば酵素活性が容易に保 持される］ ２、）還元剤、例えばアスコルビン酸類等の存在において基質の酸化水準がヒド ロキノン状態に容易に保持される。

３、）分析が均一に行われる、即ちスラリーの生成が起こらない。

適当な複合体生成剤はβ−シクロデキストリン、２，６−ジー０−メチルへβ− シクロデキストリン等でアル。

基質ＩはＮａＢＨいＮＡ、Ｓ、Ｏ，、アスコルビン酸塩のような還元剤を添加す ることによって酸化から防止されることが好ましい。

転化の際の基質の最終濃度は、微生物に依存する反応時間に従って約０．０１及 びｌｙ／Ｑの範囲でなければならない。約１５ないし３７℃、好適には約２５な いし３５℃の反応時間、及び約２ないし２０時間の反応時間が通常量も好適な結 果をもたらす。

（可溶化された）スフェロプラストの適当な範囲：化合物Ｉは約１０−２０ｇ　 （遠心分離されたスフェロプラスト）：　ｌ　Ｏ−”−１０−’９である。

反応混合物は抽出され、生成物はクロマトグラフィー及び蒸留のような標準的な 方法によって抽出物から単離されて、鏡像異性体的に純粋な（Ｒ，Ｒ，Ｒ）−ト コフェロール及びトコトリエノール類を得ることができる。

下記の実施例は本発明を説明するものである。

これらの実施例において、基質ｌは２．３−ジメチル−５−［（Ｅ、７″Ｒ，１ １’Ｒ）　−３’、７’、１１″１５″−テトラメチル−２″−へキサデセニル ］−１，４−ベンゾヒドロキノンである。

ＭｇＳＯ４・７ＨｚＯＯ−１５０ｇ Ｋ０−１５Ｏ０，６００ｇ Ｃａ　（ＮＯｘ）　ｚ　・４　ＨｚＯ０，０１０９ＫＮＯｓ　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　０−５００ｇクエン酸Ｎ　ａ　・２　ＨｚＯＯ−１６５ｇ Ｆｅｗ　（Ｓ０４）ｓ’　ａＨ，ｏ　　　　　　　　　　０．００４ｇＡ、溶液 　　　　　　　　　　　　　　　　　１ｍＱＡ、溶液：（微量元素） ＨｓＢｏｉ　　　　　　　　　　　　　　　　　２．８６０ｇＭｎＣ１ｔｉＨｔ Ｏ１，８１０９ ＺｎＳＯ４・７ＨｔＯ’　　　　　　　　　　　０．２２２９Ｍ０Ｏ，０，０１ ５ｇ ＣｕＳＯ４・５Ｈ８００，０７９ｇ 蒸留水を加えて　　　　　　　　　　　　　　１０００＋ｉｆｆ　　とする。

Ｂ、使用された微生物／基質及び適当な培地種／　　　　　　　最適基質　培地 コレクション（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ）番号　　濃　度　Ｃｍｇ／Ｑ　］アナバエ ナ・パリアビリス　　　　　　２−２０　　　　　　１（Ａｎａｂａｅｎａ　ｖ ａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＳＡＧ　　Ｂ　　１４０３−４ｂ クロロダレオプシス　　　　　　　　　２−２０　　　　　　１（Ｃｈｌｏｒｏ ｇｌｅｏｐｓｉｓ） ＳＡＧ　　Ｂ　　１４１１−１ａ Ｃ１適当な緩衝溶液の組成：いずれの場合も燐酸塩を基剤としている高張緩衝液 （ｐＨ７）（スフェロプラストの製造用）［緩衝液２］スクロース　　　　　　 　　　　　　　　１７１．１５０９ＫｔＨｐｏ４　　　　　　　　　　　　　　 ３．４８．３９ＫＨ２ＰＯ４１，３６１ｇ Ｍｇ５０４・７Ｈ，ＯＯ，９９０ｇ ＥＤＴＡ・２Ｎａ　　　　　　　　　　　　　Ｏ，０６５ｇ高張緩衝液（ｐＨ７ ）（可溶化されていないスフェロプラストから化合基質　１　　　　　　　　　 　　　　　　　　０．１００９スクロース　　　　　　　　　　　　　　１７１ ．１５０ｇアスコルビン酸塩　　　　　　　　　　　４４．０３３９に２ＨＰ０ ４　　　　　　　　　　　　　　　３．４８３９ＫＨｆｆｉＰＯ４１，３６ｉｔ ＭｇＳＯ＋’　７Ｈ，ＯＯ，９９０ｇ ＥＤＴＡ・２Ｎａ　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，０６５９２，６−ジーＯ− メチル−β−シクロデキストリン緩衝液（ｐＨ７）（可溶化されたスフェロプラ ストの製造用）［緩衝液Ｕ Ｋ２ＨＰ　０４　　　　　　　　　　　　　　１１−６１２ｇＫＨ２ＰＯ４４， ５３６ｇ ’）”）　セロール２００．０００９　（Ｃ，Ｃ，（Ｃｏｎｔａｘドデシル−〇 −マルトシド　　　　　　　　６．６３９ｇ１．４−ジチオ−Ｄ、Ｌ−トレイト ール　　　０．３０８ｇ蒸留水を加えて　　　　　　　　　　　　　１０００− 　とする。

緩衝液（ｐＨ７）（可溶化された気フェロプラストから化合物■の製造のための 希釈剤）［緩衝液４］　　（Ｐ、ロゼヴ７−ル（Ｒｏｓｅｖｅａｒ）等、Ｂｉｏ −ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｌ　９　（１９８０）　４１０５以下参照）Ｋ２ＨＰ　 ０４　　　　　　　　　　　　　　１１．６１２９Ｋ　Ｈ２Ｐ　Ｏ４４，５３６ ｇ 緩衝液（ｐＨ７）（ゲル濾適用）［緩衝液５］Ｋ、ＨＰＯ４１１，６１２ｇ Ｋ　Ｈ２Ｐ　Ｏａ　　　　　　　　　　　　　　　　４−５３６　ｇグリセロー ル　　　　　　　　　　　２００．００（ｈドデシル−Ｄ−マルトシド　　　　 　　　　０．５１１９１．４−ジチオ−Ｄ、Ｌ−）レイトール　　　０．０７７ ｇ蒸留水を加えて　　　　　　　　　　　　　１０００ＩｌＩＱ　　とする。

実施例　ｌ アナバエナ・パリアビリスＳＡＧ　　１４０３−４ｂの寒天傾斜培養物を２００ ｍ１２のフラスコに入れたｌｏｏ＋ｍＱの培地１中に接種し、６個の電球（フィ リップス（Ｐｈｙｌｉｐｓ）ＴＬＤ　　１５Ｗ／　３３）を用いた永久的照明下 で空気７ｃｏｔ　（０，５％ＣＯ，）の混合物で培地ｌをバブリング（ｂｕｂ− ｂｌ　ｉｎｇ）　Ｌながら６日間３ピＣで培養した。１０分間沈降させ、及び培 地をデカンテーションした後、残りの培養基を２Ｑフラスコ中の１．８１２の培 地ｌ中に接種した。上記の条件下で６日間培養を行った。１０分間沈降させ、及 び培地をデカンテーションした後、残りの培養基を１ＯＩ２フラスコ中の８ａの 培地ｌ中に接種した。

上記の条件下で７日間培養を行った時点において、ｌｏｎｇで遠心して細胞を集 めると、１１２当たり正味の重量で３−３．５ｇでペレット状の沈降物が得られ た。

０．２＋ｌＩｇのヒドロキノン基質ｌを含み、微量の夫々のベンゾキノンを含む ５０ｍＱのフラスコに、アルゴン気流下に２０ｍＱの緩衝液ｌ（脱気した）を移 した。１２０ｍｇの２，６−ジー０−メチル−β−シクロデキストリンを添加し 、室温で強力に撹拌すると、均質で黄色味をおびた溶液が得られた。０．８８ｇ のアスコルビン酸を添加し、穏やかに３時間撹拌すると均質な無色の溶液（緩衝 液２）が得られた。基質ｌ中のベンゾキノンのヒドロキノンへの完全な転化は、 ヘキサン／メタノール２：ｌの混合物１．５ｍ１２で１ｍ＋２の緩衝液２を抽出 し、浮上するヘキサン層０．０２ｍＱをＨＰＬＣ分析することによって測定する ことができた。

上記の方法で得られた正味の重量６０ｇの藍藻を２００ｍ１２の緩衝液１で二度 洗浄し、２００＋Ｊの緩衝液ｌを容れた５００ｒｎｆ２のフラスコ中に再度懸濁 させた。細胞のスフェロプラストへの転化は１００＋１ｇのリゾチーム（Ｌｙｓ ｏｚｙｉ）　（１５０００単位／＋Ｉ１ｇ、メルク）を添加し、フラスコを３５ °Ｃで２時間緩やかに回転させることによって行われた。スフェロプラストへの 転化は位相差顕微鏡により２０分間毎に監視された。スフェロプラストは４℃及 び１０００ｇで５分間遠心することにより集められた。

２００ｍｇの緩衝液ｌ（脱気した）を用いて４°Ｃにおいてアルゴン気流下で二 回洗浄後、スフェロプラストは使用するまでアルゴン中に４°Ｃで保存された。

５０蛯の緩衝液１（脱気した）を含む１００ｎ＋Ｑのフラスコ中に２０９のスフ ェロプラストを４°Ｃでアルゴン下に懸濁し、“ピロガロール栓（ピロガロール に浸漬した脱脂綿の詰綿）で閉じた。スフェロプラストを渦巻式振盪機で５秒間 振盪した後、０．２ｍ９の基質１を含む２ｍＱの緩衝液２を添加し、更に５秒間 振盪することによって酵素反応を開始した。

回転式振盪機を用いて１２Ｏｒｐｍで１５時間３５°Ｃでフラスコをインキュベ ートした。集積した（２Ｒ，４’Ｒ，８″Ｒ）−γ−トコフェロールは０．１８ ３ｍｇ（９３％）であツタ。

実施例　２ ＬＯｒｎＱの緩衝液３を含む１００ｍ＜１のフラスコ中に、２０ｇのスフェロプ ラスト（実施例１）を４℃でアルゴン下に懸濁し、“ピロガロール”栓で閉じた 。４°Ｃで１時間積やかに撹拌した後、可溶化されたスフェロプラストが得られ 、使用するまでアルゴン中に４℃で貯蔵された。

４℃においてアルゴン中で可溶化されたスフェロプラスト２０蛯に緩衝液４を添 加した。懸濁液を３０秒間撹拌した後、０　、２　ｍｇの基質ｌを含む２ＩＩＩ Ｑの緩衝液２を加え、更に５秒間撹拌することにより酵素反応を開始した。回転 式振盪機を用いて１２Ｏｒｐｍで１５時間３５℃でフラスコをインキュベートし た。集積した対応するトコフェロールは０．１３６１１１９（６８％）であった 。

実施例　３ ５０＋ｉ（２の緩衝液１（脱気した）を含む１００ＴｎＱのフラスコ中に２０ｇ のスフェロプラスト（実施例１）を４°Ｃでアルゴン下に懸濁し、′ピロガロー ル”栓で閉じた。スフェロプラストを渦巻式振盪機で５秒間振盪した後、０　、 ２　ｍｙの基質ｌ及びｌＩ＋ＩｇのＮ　ａ　Ｂ　Ｈａを含む１．Ｑｍ（２のＥｔ ＯＨを添加し、更に５秒間撹拌することによって酵素反応を開始した。回転式振 盪機を用いて１２Ｏｒｐｍ″ｃ１５時間３５°Ｃでフラスコをインキュベートし た。集積したトコフェロールの量は０．０７０１１１ｇ（３５％）で２０ｇのス フェロプラスト（実施例１）を５０ｍＱの緩衝液ｌ（脱気した）を含む１００ｍ ０．のフラスコ中に４°Ｃでアルゴン下に懸濁し、ピロガロール栓で閉じた。ス フェロプラストを渦巻式振盪機で５秒間振盪した後、０　、２　ｍｇの基質ｌ、 ５０ｒｎｇの２．６−ジー０−メチル−β−シクロデキストリン及び１ｍｇのＮ ａＢＨ４を含む１．Ｑｍ１２のＥｔＯＨを添加し、更に５秒間撹拌することによ って酵素反応を開始した。回転式振盪機を用いて１２ｏｒｐｍで１５時間３５℃ でフラスコをインキュベートした。

集積したトコフェロールの量は０．１２０１１１ｇ（６０％）であった。

実施例　５ ゲル濾過（液体排除［１ｉｑｕｉｄ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ］クロマトグラフィー （ＳＥＣ））のために、カラムに７ラクトゲル（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ）Ｔ　Ｓ　 Ｋ　ＨＷ６５　Ｆ　（メルク製のポリエチレングリコールジメチルアクリレート ）を充填し、３カラム容量の緩衝液５を２ｍＱ１分／４℃の一定流量で流して平 衡化させた。２０ｒｎＱの可溶化されたスフェロプラストを１００．０００ｇ／ ４℃で５時間遠心した。上澄液を沈降物から分離し、温度４℃及び１　ｍＱ／分 の一定流量でゲル濾過を行った。溶離液を１ＱｔａＱづつの両分として集め、緩 衝液５中で行われｔ；同様な実験と比較することによりサイクラーゼ活性を分析 した。サイクラーゼは２９０ＩＩｌＱ及び３８０ｍ１２の間で溶離することが見 出され、最高の活性は３３Ｏ１ＩＩＱ付近で検出された。

上記と類似の結果が式■の残余の誘導体を用いて得られた、即ち３−メチル−５ −［（Ｅ、７’Ｒ，ｌ　ｌ’Ｒ）−３’、７’　ｌ　ｌ’ｌ　５’−テトラメチ ル−２′−ヘキサデセニル］−１，４−ベンゾヒドロキノンを用いて（２Ｒ，４ ’Ｒ，８’Ｒ）−δ−トコフェロールが得られ、２，３．６−１−ジメチル−５ −［（Ｅ、７″Ｒ，１１’Ｒ）−３’、７°ｌｌ’１５’−テトラメチル−２° −へキサデセニル］−１，４−ベンゾヒドロキノンを用いて、（２Ｒ。

４″Ｒ，８’Ｒ）−α−トコフェロールが得られ、３−メチル−５−［（ａｌｌ 　Ｅ）−３’、７’、１１’、１５’−テトラメチル−２’、６’、Ｉ　Ｏ’、 ｌ　４’−へキサデカテトラエニル］−１，４−ベンゾヒドロキノンを用いて、 （２Ｒ）−δ−トコフェロールが得られ、２，３−ジメチル−５−［（ａｌｌＥ ）−３’、７’、ｌ　ｌ’、Ｉ　５’−テトラメチル−２″、６’、１０″、１ ４′−へキサ・　デカテトラエニル］−１，４−ベンゾヒドロキノンを用いて、 （２Ｒ）−γ−トコトリエノールが得られ、２．３．６−ドリメチルー５−　［ （ａｌｌＥ）−３’、７’、ｌ　ｌ’、ｌ　５’−テトラメチル−２’、６’、 １０’、１４’−へキサデカテトラエニル］−１，４−ベンゾヒドロキノンを用 いて、（２Ｒ）−α−トコトリエノールが得られ、２−［（Ｅ、７″Ｒ，１１’ Ｒ）−３″。

７’、１１″、１５′−テトラメチル−２′−テトラメチル−２′−へキサデセ ニル］−１，４−ベンゾヒドロキノンを用いて、（２Ｒ）−トコールが得られた 。

国際調査報告 １ｍｓ、、＊１１゜ｒｈｌ　Ａｓユｌｃ＋ｌ、ａｓ　ｌ＋。ＰＣＴ／ＥＰ　８９ １００８９０国際調査報告 Ｅ？　Ｂ９ＣＣＢ９０

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．下記式 ▲数式、化学式、表等があります▼Ｉ 上式中 Ｒ１がメチルで、Ｒ２及びＲ３が水素であり、Ｒ１及びＲ２がメチルで、Ｒ３が 水素であり、Ｒ１及びＲ３がメチルで、Ｒ２が水素であるか、又はＲ１＝Ｒ２＝ Ｒ３＝水素又はメチルである、の化合物及び対応する３′，７′，１１′−トリ エノールを製造する方法であって、 下記式 ▲数式、化学式、表等があります▼ＩＩ上式中 Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は上記の通りである、のフイチルベンゾヒドロキノン誘導体 、又は対応する２′，６′，１０′，１４′−テトラエン−イル　ヒドロキノン を、原核藍藻類（シアノフィセー）のスフェロプラスト（の培養液）、又はそれ から得られた酵素分画で処理することから成る方法。
2. ２．使用された藍藻類がアナバエナ・ヴアリアビリス（ＳＡＧ　１４０３−４ｂ ）又はクロログロエオブシス（ＳＡＧ　１４１１−１）である、請求の範囲１項 に記載の方法。
3. ３．原核藍藻類の可溶化されたスフェロプラストが使用される、請求の範囲１項 又は２項に記載の方法。
4. ４．式ＩＩの基質の濃度が０．０４ないし１ｇ／ｌである、請求の範囲３項に記 載の方法。
5. ５．基質が予備処理された複合体として加えられる、請求の範囲１ないし４項の いずれかの項に記載の方法。
6. ６．基質が還元剤、好適にはアスコルビン酸塩、Ｎａ２Ｓ２Ｏ４又はＮａＢＨ４ を含有する、請求の範囲１ないし５項のいずれかの項に記載の方法。
7. ７．非イオン性界面活性剤が存在する、請求の範囲１ないし４項のいずれかの項 に記載の方法。
8. ８．Ｒ１がメチルで、Ｒ２及びＲ３が水素であり、Ｒ１及びＲ２がメチルで、Ｒ ３が水素であり、Ｒ１及びＲ３がメチルで、Ｒ２が水素であるか、又はＲ１＝Ｒ ２＝Ｒ３＝水素又はメチルである、請求の範囲１ないし４項のいずれかの項に記 載の方法。
9. ９．出発物質がＲ１＝Ｒ２＝メチルでＲ３が水素である式ＩＩの化合物、又は対 応するテトラエン−イルヒドロキノンである、請求の範囲１ないし７項のいずれ かの項に記載の方法。
10. １０．出発物質ＩＩがＲ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝水素又はメチルであるか又は対応する テトラエン−イルヒドロキノンである、請求の範囲１ないし７項のいずれかの項 に記載の方法。