JPH03504919A - ヘパリン結合タンパク、それらをコードするｄｎａ、それらの製造方法およびそれらを含有する治療用調製品 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヘパリン結合タンパク、それらをコードするＤＮＡ。

それらの製造方法およびそれらを含有する治療用調製品技術分野 この発明は、動物モデルにおいて傷口に脈管形成および改良された肉芽形成を供 する、従来知られていなかったヘパリン結合タンパク、または同等の修飾物に関 する。また、この発明は、前記タンパクの製造方法、およびヒトにおＩりるａ織 修復の刺激、特に外傷に対する局所適用に適した、前記タンパクを含有する医薬 調製品の製造方法に関する。さらに、このタンパクは、正常状態において糖タン パクであることを特徴とする。

背景技術 負傷によって始まる正常な組織修復は、細胞のイベントおよび生化学的イベント の秩序だった列の結果として起こるものであり、結果として新しい組織を形成す る。

傷口の端部に静止する繊維芽細胞が、分裂し、無血管の傷口空間（ｗｏｕｎｄ　 ５ｐａｃｅ　）に向かって移動し、かつコラーゲンを産生ずる。新しい毛細血管 が先夜する細静脈および毛細血管から発芽し、傷口の端部に向かって移動する。

これらのプロセスは、治癒している傷口が融合し、傷口空間が血管新生コラーゲ ン繊維芽細胞網（肉芽）で満たされるまで続く。最後に、上皮細胞が分裂して肉 芽を覆い、修復プロセスが終了する。

血小板は、最初の２４時間以内では、鋭利な傷の治癒に対する最初の重要な細胞 要素である。その後、治癒プロセスは中性好性顆粒球、続いてマクロファージお よびリンパ球によって引き継がれる。これらの全てが、組織損傷の後２ないし３ 日の間に、秩序だった列をなして傷口に移動するのを見ることができる。注意深 く適合させたパラ分泌性成長因子の放出によって、最後に適切な治癒を保証する のはこれらの炎症細胞である。近年、この創傷治癒における、血小板由来成長因 子（ＰＤＧＦ）　、変換成長因子ａ　（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔ ｈｆａｃｔｏｒ　ａｌｐｈａ　；　Ｔ　Ｇ　Ｆ　ａ　）　、および変換成長因子 β（Ｔｒａｎｓ−ｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　　β、ＴＧＦ β）と呼ばれるこれらされてきた。ＰＤＧＦは、血小板が新鮮な傷口の端部に付 着したときに血小板のａ−顆粒から最初に放出され、かつ繊維芽細胞に対する強 い走化性を有している（Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ％Ｇ。

Ｒ，ｅｔ　ａｔ、　（１９８１）　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、　７８　：　３６６９−３６７２　）。これに加えて、ＰＤＧＦは、Ｔ ＧＦαまたは表皮性成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏ ｒ　；　Ｅ　Ｇ　Ｆ　）の存在下において、同様の細胞に対して分裂誘発性であ る（　Ｄｅｕｅ　ｌ、Ｔ、Ｐ、ｅｔ　ａｔ、、（１９８５）　　Ｃａｎｃｅｒ　 ５ｕｒｖ、４　：　６３３−８５３　）。

ＰＤＧＦは繊維芽細胞を活性化してコラーゲンを放出させ（Ｂａｕｅｒ、ε、＾ 、　ｅｔ　ａｔ、（Ｉｎ５）　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｆ、ＵＳ Ａ　。

８２　：　４１３２−４１３６　）　、これにより創傷の治癒における必須要素 である細胞間質の再編に貢献する。

ＴＧＦβは血小板中に比較的高い濃度で見出され、血餅形成の間α顆粒から放出 されることも示される。この成長因子は傷口における細胞間質形成に重要な役割 を果たしており、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、およびＴＧＦαのような他の種々の成長因 子に対する調整作用を有することも見出されている。

ＴＧＦβは、単球に対する強い走化性活性を示す。このため、負傷直後に血小板 から最初に放出されるこの成長因子も、炎症細胞の傷口への移動を刺激すること により重要な役割を果たす。ＴＧＦβは、循環系（ｃｊｒｃｕｌａＮｏｎ　）か ら単球を補充し、続いてそれらを活性化して分泌型（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙｐｈｅ ｎｏｔｙｐｅ　）にする（Ｖｉｓｅｍａｎ、Ｄ、Ｍ、　ｅｔ　ａｔ、（１９８ｇ ）Ｂｉｏｃｈｅａｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｌｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈ　Ｃｏ＋ｎｕｎｌｃａｔ１ｏｎｓ１５７．７９３−１１００　）。

単球がこの表現型を獲得し、多くの場合マクロファージと呼ばれるようになると 、血小板に見出されるものと同じ因子および修復プロセスに非常に重要な他のい くつかを分泌することが示され得る。

このように、単球／マクロファージは、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）　、変 換成長因子β（ＴＧＦβ）、変換成長因子α（ＴＧＦα）、塩基性繊維芽細胞成 長因子（Ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ）等の成長調節因子を排出する。インシュリン様成長因 子−１（ＩＧＦ−１）ボンベシン、顆粒球−刺激因子（ＧＳＦ）、顆粒球−マク ロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ３Ｆ）、単球刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ） およびインターロイキン−１（ＩＬ−１）。この分泌生成物には、プロテアーゼ 、補体タンパク質、単球由来好中球刺激因子、アラキトネートおよび腫瘍壊死因 子ａ　（ＴＮＦ（りが含まれる（Ｒｏｍ、Ｗ、Ｎ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８８） 　、Ｊ、ＣｌＩｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　８’２．１８８５−１６９３　：　　Ｒａ ｐｐｏｌｅｅ　Ｄ。

Ａ、　ｅｔ　ａｌ　（１９８ｇ）　　５ｃｉｅｎｃｅ　２４１．７０Ｂ−７１２ ：参考のために、Ｕｎａｎｕｅ、Ｅ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ　　（１９７Ｂ）　　５ｃ ｉｅｎｃｅ　２３６．５５１−５５７を参照）これらのマクロファージ由来パラ 分泌性成長因子は全て治癒プロセスに関与するが、機構およびこれらの因子間の 複雑な相互作用に関する詳細の門＜は未だにほとんど理解されていない。

治癒プロセスの間、酸素および栄養で、成長する組織が十分に得られるというこ とは決定的に重要なことである。これは、その場での新しい血管の形成を導く、 脈管形成として知られる複雑なプロセスによって保証される。このプロセスは、 秩序だった移動、血管細胞の増殖および分化を含む（Ｆｏｌｋｍａｎ、Ｍ、　ｅ ｔ　ａｌ、　　（１９８７）　、５ｃｉｅｎｃｅ　２３５．４４２　）　１１内 皮細胞増殖の直接刺激による脈管形成の開始は、２つのポリペプチドマイトジェ ン、の仮定上の責任である。２つのポリペプチドマイトジェンとは、酸性繊維芽 細胞成長因子としても知られるクラスＩヘパリン結合成長因子（ＨＢＧＦ−１） 　、およびクラス■ヘパリン結合成長因子（ＨＢＧＦ−Ｉｔ）すなわち塩基性繊 維芽細胞成長因子（ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ）である（ＴｈｏｒＡａｓ、に、Ａ。

（１９８５）　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｆ、　８２．６４ｊ１９ ：　　Ｅｓｃｈ、Ｆ、　（１９１１５）ｉｂｉｄ　、　６５０７）。これらの因 子は血小板中には見られないが、塩基性ＦＧＦは、上述のように、活性化単球／ マクロファージから分泌され、動物モデルにおいてイン・ビボで脈管形成を誘発 することが示されている。

したがって、負傷に関連する血小板放出の初期の「突発（ｂｕｒｓｔ　）　Ｊに は、直接の脈管形成因子は含まれない。しかしながら、血小板抽出物は脈管形成 性であることがイン・ビボ実験において示され、これが、上述の関連因子を次々 と導く単球活性化の結果であることが示され得る。血小板における非分裂促進性 脈管形成性因子を単離し、および特徴付けるいくつかの試みがなされているが、 この因子の性質はこの技術においては開示されていない（ｋｎｉｇｈｔｏｎ、Ｄ 、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、１９８６、＾ｎｎ、Ｓｕｒｇ、　２０４．３２３−３３１ 　）。

脈管の形成に欠かすことのできない必要条件は、負傷領域におけるヘパリンの存 在であり、例えばプロタミンを用いたヘパリンの除去は脈管形成を完全に放棄す ることであることが示されている。

したがって、ヘパリン結合特性に加えて、循環系から負傷領域へ単球を補充する 能力および続いてそれらを活性化する能力を有する因子は、脈管形成に対して、 およびさらにその上に全修復プロセスに対して非常に重要なものであるに違いな い。

発明の開示 この発明は、以下に示す理由により脈管形成および組織修復の刺激に非常に適し た、従来知られていなかったタンパク質（以下、ヒトおよびブタ型をｈＨＢＰお よびｐＨＢＰと呼ぶ）を提供する。

ａ）このタンパクは、損傷を受けた組織内で起こるように血小板が活性化された ときに、ミれらの細胞から放出される。

ｂ）このタンパクはヘパリンと結合する。

Ｃ）このタンパクは、単球に対して走化性である。

ｄ）このタンパクは、単球を、分泌型に向けて形態学的に活性化する。

ｅ）このタンパクは、培養下の単球を活性化して、培養下で繊維芽細胞に対する マイトジェンを排出させる。

ｆ）このタンパクの適用は、めんどりの卵の漿尿膜モデルにおいて脈管形成を生 じる。

ｇ）このタンパクは、′巨視的かつ組織学的検査から判断されたラットにおける 実験モデルの傷口チャンバ−（ｗｏｕｎｄ−ｃｈａｍｂｅｒ　）に適用した際に 、上皮形成速度を増加させる。

ｈ）このタンパクは、−視的かつ組織学的検査から判断された同様の傷口チャン バーモデルにおいて、肉芽組織形成を増加させる。

ｉ）このタンパクは、巨視的検査から判断された同様のラット傷口チャンバーモ デルにおいて、血管形成を増加させる。

ブタおよびヒトの血小板から、従来知られていないタンパク質の２つの特別な例 が誘導される。ブタ型のアミノ酸配列は十分に解明されており、請求の範囲第４ 項によってカバーされている。ヒト型は、請求の範囲第４項に開示されたブタ型 のアミノ酸配列を請求の範囲第１０項に開示されたヒト型のアミノ酸配列と比較 することにより明らかなように、ブタ型と高い相同性を有している。

組織修復に関する重要な特徴は、タンパクの強いヘパリン結合特性である。組織 損傷のすぐ後に、炎症に重要ないくつかの成分の中で結合組織肥満細胞もまた大 量のヘパリンを放出することが観察できる（Ｑｕｒｅｓｈｉ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、 （１９８８）、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１４１ ．２０９０−２０９８　）。

放出されたヘパリンはコラーゲンと結合することが知られており、一度これが確 立されると、このゆえに、この発明に記載されているヘパリン結合タンパク（Ｈ Ｂ　Ｐ）は固定化される。これは、固定された勾配（ｇｒａｃｌｌｅｎｔ）を形 成することを可能とし、グスタフソン（Ｇｕｓｔａｒｓｏｎ　）らが理論的立場 がら示唆し、カーター（Ｃａｔｅｒ　）が実験的に示しているように、細胞は増 加する基質付着の勾配を上げる傾向にある。カーターは、この現象は「ハブトタ キシス（）Ｉａｐｔｏｔａｘｌｓ）　Ｊ　　（ギリシャ語：ハブテイン（ｈａｐ ｔｅｉｎ　）　ｓ結び付ける；タキシス、配列）と呼ばれるべきであると示唆し ている。これに基づいて、形態発生に係わる細胞移動、炎症、創傷の治癒、腫瘍 の浸潤および実際の全ての組織の細胞移動は、関与する細胞によるハブトタキシ ス的応答の結果であると考えられる（Ｇｕｓｔａｆ’ｓｏｎ、Ｔ、　ｅｔ　ａｌ 、（Ｉｎ２）　　Ｉｎｔｅｒｎ、　Ｒｅｖ、Ｃｙｔｏｌ、　、１５．１３９　。

Ｃａｔｅｒ、Ｓ、Ｂ、　（１９６５）　、Ｎａｔｕｒｅ　２０ｇ、１１８３−１ １１１７　）。

これに基づいて、ここで言うヘパリン結合タンパクは、循環系からの損傷組織領 域への単球の補充に非常に適している。

続く分泌表現型への活性化はその場で行なう。すなわち、単球／マクロファージ 由来サイト力インの完全なカクテルは、傷口における損傷した細胞の近傍に放出 し、治癒を容易にする。

ここに、ヘパリン結合タンパクは、特にヒトの慢性創傷治癒の刺激に適している ことが予見される。慢性脚部潰瘍（ｌｅｇ　ｕｌｃｅｒｓ）および高齢患者の床 ずれに最も重要な病因学的因子は、血管新生（脈管形成）の欠如であると一般に 信じられている。

ヘパリン結合タンパクについて言及した特性を基にして、慢性創傷へのこのタン パク（好ましくはヒト型）の外用は、治癒を促進することが予見される。マクロ ファージの除去は、創傷治癒の応答を遅らせる（Ｌｅｌｂｏｖｌｃｈ、Ｓ、Ｊ、 　ｅｔ　ａｌ、（１９７５）、Ａａ、Ｊ、Ｐａｔｈｏｌ　、７ｇ、７ｉ）　ｏ　 ヒトの診察ニオイテ、ソノヨウなマクロファージの枯渇はいくつかの疾病を伴う ものであり、それはしばしば治療の結果である。したがって、化学療法または放 射線療法で治療している癌患者に重度の白血球減少が観察される。そのような患 者には、外科的治療の後のゆっくりした治癒および慢性潰瘍の発生がしばしば見 られる。ヘパリン結合タンパクが示す特別な特性は、そのような患者群における 治療学的利益である。

ＨＢＰは、重度の火傷の治療に用いることもできる。血管新生の欠如は、治癒の 遅れおよび損傷した組織が感染症にかかりやすくなる結果を招く。したがって、 単球活性特性を有する成分は非常に有益である。活性化した単球、すなわち「マ クロファージ」はスカベンジャーとして作用し、かつそれらは貧食作用によって 損傷組織の残骸を除去する。これは火傷に関連して最も本質的な機能である。

最近、腫瘍成長に関連して、マクロファージの成長調節機能が大きな注目を浴び ている。

高濃度の活性化したマクロファージはｍ癌性細胞に対して細胞増殖抑制性であり 、この効果は腫瘍性標的細胞に対して選択的に向けられる。これに関連して、マ クロファージがらの推定分泌生成物はＴＮＦαであると信じられている（Ｄｉｅ ｇｅｌｌａｎｎ、Ｊ？、Ｆ、　ｅｔ　ａｔ　、１９８１．　Ｐｌａｓｔｉｃ　ａ ｎｄ　Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｆｖｅ　Ｓｕｒｇｅｒｙ　１９ＢＢ　、１０７− １１３　）。

ここでいうヘパリン結合タンパクは、！！瘍治療における治療学的な可能性を有 している。固体層１１４　（ｓｏｌｌｄ　ｔｕｍｏｒｓ）に注入されたＨＢＰは 循環している単球を腫瘍領域に補充することができ、続く活性化によって細胞毒 性効果を仲介する。

上で示唆したように、診療所において、この発明に使用される医薬組成物には、 クリーム、軟膏、ゲル、ファーム、包帯材料、パッチ、パッド、人工皮膚、ガー ゼ色帯を浸漬するための水性担体、乾燥賦形粉末（ｄｒｙ　５ｖｅｌｌａｂｌｅ 　ｐｏｗｄｅｒｓ　）または縫合糸コーティングへのヒトＨＢＰの組み込みが含 まれる。

）ｆＢＰの閉じ込めに使用し得る処方は、凍結乾燥パッドまたは親水コロイド吸 蔵包帯（ｈｙｄｒｏｅｏｌｌｏｌｄ　ｏｃｃｌｕｓｉｖｅ　ｄｒｅｓｓｌｎｇ　 ）である。ＨＢＰの：Ａ節された放出を供給する医用包帯を使用することが好ま しい。

使用可能なゲルは、アルキルセルロース、ヒドロキシアルＬ１　　　　キルセル ロースおよびアルキルヒドロキシアルキルセルロース、例えばメチルセルロース 、ヒドロキシエチルセルロース、ξ　　　　カルボキシメチルセルロース、ヒド ロキシプロピルメチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロース等の水溶 性エーテル化セルロース誘導体を添加することによって高粘度にされた水性ベー スからなる。ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースおよ びヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなヒドロキシアルキルセルロース 誘導体が好ましい。通常、ゲル化剤を添加する前に、ＨＢＰを水相に溶解する。

凍結乾燥パッドは、ゲルの凍結乾燥にょつて形成された合着繊維構造を有する親 水コロイドからなることも可能である。

この親水コロイドは、上述の水溶性エーテル化セルロース誘導体であってもよい 。通常、ＨＢＰは凍結乾燥の前にパッドに閉じ込められている。

医用包帯は、その内部に１（ＢＰを有する粘着性吸蔵包帯であってもよい。この 包帯は、シーリング材料、連続相としての粘着付与剤、および上述のエーテル化 セルロース誘導体のような水溶性または水膨潤性化合物の１種以上を有する連続 相に分散した不連続相を含む。この不連続相の水中で膨潤する能力は、前もって 物理的に閉じ込められたＨＢＰを徐々に放出する可能性を与える。ＨＢＰは、液 体処方の形態で、皮下、筋肉内または静脈内注射によって投与することもできる 。

さらに、ＨＢＰの投与は、鼻、口腔、直腸または腹腔経路によって行なうことも できる。

この発明によると、ＨＢＰは、血小板がら製造することが可能であり、ブタまた はヒトの血液がら得ることができる。

より詳細には、このタンパクは、血小板抽出物の分画によって得ることができる 。ヘパリン−セファ０−スを用いるカラムクロマトグラフィは、この目的に都合 がよい。そのようなりロマトグラフィによる方法には、最初に血小板抽出物が注 がれるカラムからの０．５Ｍから３ＭまでのＮａＣｌを用いた勾配溶出が含まれ 、結果として２つのピークが溶出される。１．２Ｍ　ＮａＣ１周辺の第〕のピー クは、２８０ｎｍで巨大タンパクピークとして測定することができ、それ自体公 知の血小板因子（ＰＦ４）である。ＩＪＭ　ＮａＣ１周辺では、タンパク量は使 用するシステムの検出限界を下回っているが、この領域の分画は脈間形成活性を 有している。この活性分画を、さらに０４カラムを用いた微孔逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃ （ｍｉｃｒｏｂｏｒｅ　ｒｅｖｅｒｓｅｐｈａｓｅ　）ＩＰＬｃ）によって精製 する。完全に純粋なタンパクピークを２１４ｎ１１で検出することができ、この タンパクは、使用する血小板の種類によって、この発明のブタまたはヒト型のい ずれかのＨＢＰと同一である。

ＨＢＰは組換え技術によっても製造することができる。細菌、酵母、真菌または 唾乳動物細胞系を、ＨＢＰ製造のための宿主として使用することができる。ＨＢ ＰをコードｔルＤＮＡ配列の他に、必要な転写または翻訳シグナルを含有する適 切なベクターを用いた宿主細胞の形質転換により、ＨＢＰの製造を達成すること ができる。

生成物が細胞内に産生されるのが、または増殖培地に分泌されるのかを選択する ことが可能である。多くの分泌シグナルが知られている。米国特許４，３３６． ３３８は、原核生物に対する、非細胞質タンパクをコードするリーダー配列の使 用を開示している。この非細胞質タンパクは、通常、細胞表面へ、もしくは細胞 表面をこえて移送され、その結果として融合タンパク（ｆｕｓｅｄ　ｐｒｏｔｅ ｉｎ　）がベリブラスム間隙に移送される。

酵母に対しては、Ｋｕｒｊａｎ＆　Ｈｅｒｓｋｏｖｉｔｚ　、　Ｃｅ１ｌ　（１ ９８２）　、３０．９３３−９４３が、成熟α因子の４つのタンデムコピーを有 し、配列を記述し、および処理機構（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｍｅｃｈａｎｉｓ ｍ）を前提とする推定α因子前駆体を開示している。このシグナル配列は、この シグナル配列の発見の後ずっと、酵母サツカロミセス・セレビシＩ：Ｌ　Ｃ８ａ ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｃｒｅｖｌｓｉａｅ）からの多種のポリペプチドの 分泌に使用されている。Ｂｒａｋｅ　ｅｔ　ａｔ、ＰＮＡＳ　ＬＩＳＡ、　ｇｌ 、（１９８４）　　４６４２−４８４６は、その−例を提供している。

細菌には、タンパク質の糖付加または、最も多くの場合、ヒト起源のポリペプチ ドに正確なジスルフィド架橋を形成することのいずれかが不可能である。しかし ながら、酵母には、正確なジスルフィド架橋を形成することができる。しかし、 高度の真核細胞（ｈｉｇｈｅｒ　ｅｕｃａｒｙｏｔｅｓ　）が行なうのと同様の 方法ではタンパク質の糖付加を行なわない。哺乳動物の細胞系と同様の方法で糖 付加を行ない、このため、将来、酵母を糖附加したタンパク質に対する有用な宿 主にする酵母突然変異体が単離されている。

さらに、この発明のＨＢＰは、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単−帯と １−で移動しく第１図および第２図に記載）、約２８　ｋＤａのＭｒを有するこ とを特徴とする。

ブタ血小板から精製されるヘパリン結合タンパクは、下記のアミノ酸配列を有す る。

１１ｅＶａ　ＩＧＩ　ｙＧｌｙＡｒｇＡｒ　ｇＡｌ　ａｌｌ　ｎＰ　ｒｏＧｌ　 ｎＧｌ　ｕＰｈｅ　Ｐ　ｒｏＰｈｅ　Ｌｅ＋＋ＡユａｓｅｒｌユｅＧｌｎＬｙｓ ＧｌｎＧｌｙＡｒｇＰｒｏＰｈｅＣｙｓＡｌａＧｌｙＡｌａＬｅｕνａｌＨｉｓ ＰｒｏＡｒｇＰｈｅＶａｌＬｅｕＴｈｒＡｌａＡｌａＳｅ　ｒＣｙｓＰｈｅＡｒ ｇＧｉ　ｙＧ０ ＬｙｓＡｓｎＳｅ　ｒＧ　１ｙＳｅ　ｒＡｌａ　Ｓｅ　ｒＶａ　ＩＶａ　ｌ　Ｌ ｅｕＧｌ　ｙＡｌａＴｙ　ｒＡｓ　ｐＬｅ　ｕＡｒ　ｇＧｌｎＧｌｎＧｌ　ｕＧ ｌｎｓｅｒＡｒ　ｇＧｌｎＴｈ　ｒ　ＰｈｅＳｅ　ｒ　ｒ　１ｅＡｒ　９Ｓｅ　 ｒ　Ｉ　ｌｅＳｅｒに１ｎＡｓｎｃｌｙ’ｌ’ｙｒＡｓｐＰｒｏＡｒｇＧ１ｎＡ ｓｎＬｅｕＡｓｎＡｓｐνａｌＬｅｕＬｅｕＬｅｕＧｌ　ｎ　ＬｅｕＡｓｐＡｒ ｇＧｌ　ｕＡｌａＡ　ｒｇＬｅｕＴｈ　ｒ　Ｐ　ｒｏｓｅ　ｒＶａ　ＩＡ　ｌ　 ａＡｓｎＣｙｓＧ　ｌ　ｎＶａ　ｌＡ’ｌａＧ　１ｙＴｒｐＧｌ　ｙＴｈ　ｒＧ ｌ　ｎＡｒｑ　ＬｅｕＡｒｇＡ　ｒｇＬｅｕＰｈｅＳｅ　ｒＡｒ　ｇＰｈｅＰ　 ｒ　ｏＡｒｇＶａ　ｌ　ＬｅｕＡｒｇＶａ　ｌＴｈ　ｒＶａ　ｌＴｈ　ｒ　Ｓｅ 　ｒＡｓｎＰｒｏＣｙｓＬｅｉｗＰ　ｒｏＡｒｇＡｓｐＭｅｔＣｙｓＩ　１ｅＧ ｌ　ｙＶａ　ｌ　ＰｈｅＳｅｒＡｒｑ　Ａ　ｒｑＧｌｙＡｒｑ　Ｉ　１ｅｓｅ　 ｒＧｌ　ｎＧｌｙＡｓｐＡｒｇＧ　１ｙＴｈ　ｒ　ＰｒｏＬｅｕＶａ　１ｃｙｓ Ａｓ　ｎＧｌｙＬｅｕＡｌａＧｌ　ｎＧ　１ｙＶａ　ＩＡｌａＳｅ　ｒＰｈｅＬ ｅｕＡｒｇＡｒｇＡ　ｒｇ　ＰｈｅＸｘ　ｘｉ９６　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　２１０ＸｘｘＳｅ　ｒ　Ｓｅ　ｒＧｌｙＰｈｅＰｈｅＴｈ　 ｒＡｒｇＶａｌＡｌａＬｅｕ　ＰｈｅＡ　ｒ　ｇＡｓ　ｎＴｒｐエ１ｅＡｓｐ５ ｅｒＶａｌＬｅｕＡｓｎＸｘｘヒト血小板から精製されるヘパリン結合タンパク は、下記の配列を有する。

Ｎ−末端から ｌ１ｅＶａ　１ＧＩｙＧｌｙＡｒｇＬｙｓＡｌａＡｒｇＰｒｏＡｒｇＧｌｎＰｈ ｅＰｒｏＰｈｅＬｅｕＡｌａＳｅ　ｒ　Ｉ　ｌ　ｅＧｌｎＡｓｎＧｌｎＧ　ｌ　 ｙＡｒｇＨｉ　５ＰｈｅｃｙｓＧｌ　ｙＧｌ　ｙＡｌａＬｅｕ１１　ｅＨｌｓＡ ｌａＡｒｇｐｈｅｖａ　１Ｍｅ　ｔＴｈ　ｒＡｌａＡｌａｓｅ　ｒＣｙＳ　Ｐｈ ｅＧ　ｌ　ｎＳｅ　ｒＧ０ Ｇｌ　ｎＡｓ　ｎ　Ｐ　ｒｏＧｌｙＶａ　ｌｓｅ　ｒＴｈ　ｒＶａ　ｌＶａ　ｌ 　ＬｅｕＧ　１ｙＡｌ　ａＴｙ　ｒＡｓｐＬｅ　ｕＡｒｇＡｒｇＡ　ｒ　ｇＧｌ 　ｕＡｒｇＧｌｎｓｅｒＡｒｇＧｌｎＴｈｒ　ＰｈｅＳｅ　ｒ　Ｉ　１　ｅＵｕ ｕ　Ｌｌｕ　ｕＭｅセ５ｅｒＧｌｕＡｓｎＧｌｙＴｙｒＡｓｐＰｒｏＧｌｎＧｌ ｎ（、、・、、、、、、、、、、。

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ＧｌｕＡｓｐＧｌ　ｎＣｙｓＡ　ｒ　ｇＰ　ｒｏＡｓｎＡｓｎＶａ　１ｃｙｓＴ ｈ　ｒＧ　１ｙＶａ　１ＬｅｕＴｈ　ｒＡｒ９Ｕｕ　ｕＧｌ　ｙＧ　ｌ　ｙ　Ｉ 　ｌ　ｅＣｙｓＡｓ　ｎ（１；１ｙＡｓｐＧｌ　ｙＬｌｕｕＴｈ　ｒ　Ｐ　ｒｏ Ｖａ　ｌ　Ｌｅｕし、　、００．　、、　、、、　、、、　、　、、、、、、、 　、　、、　、　、　ｌｓｅｒＬｅｕＧｌｙＰｒｏｃｙｓＧｌｙＡｒｇＧｌｙＰ ｒｏＡｓｐＰｈｅＰｈｅＴｈｒＡｒｇνａｌＡｌａＬｅｕＰｈｅＡｒｇＡｓｐＴ ｒｐｒｌｅＡｓｐＧｌｙＶａｌＬｅｕＡｓｎＡｓｎＰｒｏＧ１ｙこのタンパクは 、さらに、糖付加されていることを特徴とする。

ＧＥＮＥＴＩＣＣＯＭＰυ丁ＥＲＧＲＯＬＩＰ、ライスコンシン大学からのプロ グラムを用いた、タンパク質データバンクに対する両ヘパリン結合タンパクのコ ンビエータ検索では、この発明のタンパクは従来知られていないことが示された 。

この発明を下記の例によつて説明する。

図面の簡単な説明 第１図　ブタ型ヘパリン結合タンパクの還元条件下における５ＤＳ−ＰＡＧＥで ある。

レーン１：Ｍｒママ−− レーン２　：　ｐＨＢＰ 第２図　ヒト型ヘパリン結合タンパクの還元条件下（例２参照）における５ＤＳ −ＰＡＧＥである。

レーン１　：Ｍｒママ−− レーン２　：　ｈＨＢＰ 第３図　ニワトリ胚漿尿膜を用いたＨＢＰに対する脈管形成の試験。説明のため に例５を参照。

第４、うおよび６図 これらの写真には、ＨＢＰで処理した単球（８ｎｇ／ｍ）（第４図）、エンドト キシン処理した卓球（１００ｎｇ／ｍ）　　（第５図）およびＰＢＳ処理単球（ コントロール細胞）（第６図）が示されている。説明のために例６を参照。

例１ 豚の血液からの血小板５００ｇをＰＢＳ　１．５　Ｎ中に懸濁し、液体窒素（Ｎ ２）により３回冷凍・解凍した（以下、冷凍／解凍物と呼ぶ）。この冷凍／解凍 物を４０．０００Ｘｇで３０分間遠心分離し、得られた上澄みを８００，０００ 　ｘｇで６０分間超遠心分離にかけた。得られた上澄みをｌｈＭリン酸緩衝液（ ０，５Ｍ　ＮａＣ１，ｐＨ７，４）２０容量に４８時間透析した。この透析物を ５ＣＩＯ（１０，）　ｘ１０ａｎヘパリン−セファ０−ス（登録商標：　）Ｉｅ ｐａｒＩｎ−５ｅｐｈａ−ｒｏｓｅ）ＣＩ−４Ｂカラム上に、１２０ｍ１／時の 流速で汲み上げた。前記試料を透析したのと同じ緩衝液（緩衝液Ａ）でこれ以上 蛋白質が溶出しなくなるまで、カラムを洗浄した。次いで、カラムを緩衝液Ａか ら緩衝液Ｂ　（ｌｏｄリン酸緩衝液、３Ｍ　ＮａＣ１゜ｐ）１７．４）への線状 の勾配によって、２０時間、１．７ｍｌ／分の流速で溶出した。２００個の分画 （夫々６分間）を採取して、脈管形成効果を試験した。前記勾配のうち１．ｌ１ Ｍ　ＮａＣｌ分画のあたりに対称的に分布した５０個の分画が活性を示した。こ れらの分画を合わせ、０．５　ｍｇ／ｍｌの濃度になるまでオペ−アルブミン（ ｏｖｅ−ａｌｂｕｍｌｎｎ）と混合した。合わせた分画を２０容量の緩衝液Ａに 透析し、次いで、０．６　ｍｌヘパリン−セファ０−ス（登録商標＞　Ｃｌ−４ Ｂカラム上に６ｍｌ／時の流速で汲み上げた。カラムを、１０時間、線状の勾配 によりて０．０４ｍ１／分の流速で溶出した。夫々２００　ｍｌの分画１２０個 を採取して脈管形成効果を試験し、次いでこれらを合わせた。さらに、合わせた 分画を逆相Ｃ４カラム（０，１ｍｌ容＠）上で、０．１％トリフルオロ酢酸（Ｔ ＦＡ）を含有する０％から８０％のアセトニトリルへの線状の勾配により３０分 間、０．０２５　ｍｌ／分の流速でクロマトグラフにかけた。脈管形成効果は、 ２６分間の保持時間を有するベースラインから離れた頂点に検出された。

還元条件下での５ＤＳ−ＰＡＧＥは、そのピークが、Ｘ「が２８ｋＤａのある成 分（ＨＢＰ）を含有することを示す（第１図参照）。同じピークの蛋白質は請求 の範囲第４項にある配列を有する。

例２ ヒト血小板からのＨＢＰの製造 健康な血液供与者から新しく提供された血小板（ｔｈｒｏＩＩｌｂｏ−ｃｙｔｅ ）　＠縮物１００部を混合し、前記血小板を１７００　ｇで１５分間、２５℃で 遠心沈降させた。

遠心沈降された血小板をＰＢＳ　３容量に懸濁させ、この懸濁物を液体Ｎ２で６ 回冷凍・解凍した。次いで、この懸濁物を４０、　（１（１０ｇで６０分間遠心 分離した。これらの上澄みを２日間、１０ｇＭリン酸緩衝液（０，５Ｍ　ＮａＣ １，ｐＨ７，４）２０容量に透析した。

この透析物を、５ｃｍ　（１，Ｄ、）　！　１０ｃｍヘパリン−セファロース（ 登録商標）　Ｃ１−４Ｂカラム上に、５０ｍ１／時の流速で汲み上げた。前記試 料を透析したのと同じ緩衝液（緩衝液Ａ）で、これ以上蛋白質が溶出しなくなる までカラムを洗浄した。このカラムを緩衝液Ａから緩衝液Ｂ　（１０＋ａＭリン 酸緩衝液、８ＭＮａｃＩ　、ｐＨ７，４）への線状の勾配によって、２０時間、 ０．９０ｍ１／分の流速で溶出して、２００個の分画（夫々６分間）を採取した 。

前記分画を微孔逆相（Ｍｉｃｒｏｂｏｒｅ　Ｒｅｖｅｒｓｅｄ　Ｐｈａｓｅ）　 Ｃａカラム（アクアポール・ブチル（＾ｑｕａｐｏｒｅ　ＢｕＬｙｌ）　＋００ 　Ｘ２．Ｉ　ｌｌｌ１１゜７μｍブラウンリー・ラプス（Ｂｒｏｖｎｌｅｅ　Ｌ ａｂｓ　）　）により、次のような勾配で試験した。： 時間　　緩衝液Ａ　　緩衝液Ｂ　　流速［１，１’Ｘ　ＴＦＡ　　７０％　Ｃ） １３　ＣＮ０．０８５％ＴＰ＾ ０−５分　　　　６０％　　　　　　４０％　　　　　　　２００ｕｌ／分０− ４０分　　　　３０％　　　　　　７０％　　　　　　　２００ｕｌ／分この装 置は、アプライド・バイオシステニス（＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ）　　１３４　Ａ　　分析装置であり、前記蛋白質を２１４　ｎｍで監視した。

２０分間の保持時間を有するピークを採取した。乾燥後、前記試料を０．１Ｍト リス−ＣＩ　　（Ｔｒｉｓ−ＣＩ）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ。

２．５％ＳＤＳ、　０．０１％ブロモフェニルブルー、５％２−メルカプトエタ ノール（ｐｌ＋８．０）で稀釈した。９５℃で５分間後、この試料をＳＤＳフェ ーストゲル（ＳＤＳ　Ｐｈａｓｔ　Ｇｅ１）　　（８〜２５％）のゲルおよびＳ ＤＳ緩衝液両液リップス（ＳＤＳ　ｂｕｆＴｅｒ　５ｔｒｉｐｓ）を有するファ ルマシア・フェースト・ゲル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＰｈａｓｔＧｅｌ）装置に よりＳＤＳ　ＰＡＧＥにかけた。

前記試料を２５０　Ｖ、１０ｍＡ、１５℃、ｅｏｖｈテ試験しり（１３）　。７ ０〜１２０の分画はＭｒ　２ｇ、０００を有するバンドを示した。これらの分画 を合わせて、緩衝液Ａの２０容量に透析した。この透析物を１　ｍｌヘパリン− セファ０−ス（登録商標）Ｃ１−４Ｂ　カラム上に汲み上げ、カラムを、緩衝液 Ａから緩衝液Ｂへの勾配によって、１０時間、０．０４ｒｎｌ／分の流速で溶出 して、２００μｇの分画（、１２０）を採取した。

例３ ヒト組織からのＨＢＰ製造 この目的のために、ヒト細胞系（Ｋ５６２）を使用した。慢性骨髄性白血病（Ｉ 　ｅｕｃｅｍ　ｉ　ａ）患者に由来するこの細胞系は、１２−０−テトラデカノ イルホルボール−１４−アセテート（ＴＰＡ）により循環する血小板の前駆体で ある巨核芽球への分化を引き起こされ得る。アリタＯ（ＡＩｉｔａｌｏ）ら（１ ２）は、ＴＰＡによって処理されると、これらの細胞の中にＰＤＧＦのための遺 伝子が誘導されることを示している。

Ｋ５θ２細胞を、１７５ｃＩＩＩ１３ヌクローン瓶（Ｎｕｃｌｏｎｅ　ｂｏｔｔ ｌｅ）中、１０％胎児血清アルブミンおよび抗菌剤で補ったＲＰＭＩ　１６４０ 培地で培養した。細胞の濃度は、１ｍｌあたり〜ａｏｏ、ｏｏｏ細胞に調節し、 Ｄ）ＩＳＯに溶解したＴＦＡ（シグマ（ｓｉｇｍａ乃を３％Ｍの濃度まで加えた 。３日後、細胞を５００　ｘｇでの遠心分離によって沈降させ後、ＩＯ容量のＰ ＢＳで１回洗浄し、続いて再沈降を行った。

この方法で回収された細胞１０ｇを、３容量のＰＢＳと混合し、その懸濁物を液 体Ｎ２で６回冷凍・解凍した。この懸濁物を３００．０００　Ｘｇで６０分間超 遠心分離し、次いで懸濁物を、０．５ＭＮａＣＩを含有する１　（ｂｎＭリン酸 緩衝液（ｐｌ＋７．４）で３００ｍ１に稀釈した。稀釈した試料を０．５ｍｌヘ パリン−セファ０−ス（登録商標）　Ｃ１−６Ｂ上に７２時間で汲み上げた。次 いで、カラムを、使用している緩衝液（緩衝液Ａ）から緩衝液Ｂ　（３ＭＮａＣ Ｉを含有する１０ｄ　Ｎａ−リン酸緩衝ａ　（＋）１１７．４））への勾配によ って】０時間で溶出させた。

４つの分画（１，８１１ＩＮａＣＩのあたりに相対称である）を、３０分間で、 ０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）が混合された０％がら８０％のアセトニト リルへの勾配によって２５μΩｍｌ／分の流速で、微孔逆相Ｃ４カラム（アクア ボール・ブチル１００Ｘ　２．１ｍｍ、　　７μｍブラウンリー・ラプス）のク ロマトグラフに別個にかけた。

２６分間の保持時間を有する蛋白質のピークは、豚のＨＢＰの保持時間と同一で ある。

例４ ）ＩＢＰの脈管形成特性の検出 約２４０ｇの体重を有し、且つ８０日齢のウィスター・ファミリー（ν１ｓｒａ ｒ　ｆａｒＡｉｌｙ）　Ｃ１？Ｌ：（ν１）Ｂｌ？の雄ラットを使用した。

このラットを、使用前６日間、２１±１℃、相対湿度６０：ｔｈ：１０９６に、 １時間あたり１０回換気し、午前６時３０分から午後６時３０分まで光をあてて 環境馴化させた。ラットを、底におがくずがあるプラスチックケースに入れてお いた。これらのラットに、アルトロミン規定食１３２４　（Ａｌｔｒｏｍｉｎ　 ｄｉｅｔ　１３２４）を不断給餌し、飲料水を自由に飲ませた。

ラットを、ベンドパルビタール５０Ｄ／ｋｇ体重を腹腔内注射して麻酔をかけた 。ラットの背中を剃り消毒した。３印の背部の切り口を介して左の腎臓を露出さ せ、ＨＢＰ　　［３Ｘ３　＋ａ＋ｓゲルファーム（登録商標、　Ｇｅｌｆｉｒｍ ）吸収性ゼラチン（アップジョン（Ｕｐｊｏｈｎ））上に乾燥されたアッフィ／ ゲル（登録商標、　Ａｆｆｉ／Ｇｅ１）ブルー１００−２００メツシユ（ｍａｓ ｈ）　　（湿潤状＝）（７５−１５０μ）１０μｇに予め吸収させたちの］を、 小さい切り口を通して腎臓の繊維性被膜の下に埋設した。この表面を、５つの絹 の縫合によって塞ぎ、術後、テムゲシック（登録商標；Ｔｅｍｇｅｓｉｃ）を毎 日２回０．１ｍｌの投与量で３日間与えた。術後５日、ラットを再びベンドパル ビタールで麻酔にかけ、左の腎臓を露出させた。移植物の周辺の領域は、肉眼的 評価によって明らかに新しい血管形成を示した。

例５ ニワトリの胚の漿尿膜を使用した豚及びヒトＨＢＰによる血管形成試験 妊娠の第１日の受精したニワトリの卵を、加湿された３７℃ふ卵器内に放置した 。第７日に卵の鈍端に２５ＧＳ／８０．８　Ｘ１Ｂ針を使用して穴をあけて、引 き続きふ卵した。第９日に１　ｃｒｎＸ　１ｃｍの“窓″を、卯の尖端に殻を通 してあけ、この窓をテガダーム（登録商標、Ｔｅｇａｄｅｒｍ）で覆った。ふ卵 を続け、第１１日にＨＢＰ　（５〜３０ｎｇ）　　［３ｘ３　＋＋ｍステリル・ ゲルファーム（登録商標、　５ｔｅｒｉｌｅ　ＧｅｌＮｒｍ）吸収性ゼラチン（ アップジョン）上に乾燥されたアッフィ／ゲル（登録商標）ブルー１．００〜２ ゜Ｏメツシュ（湿潤）　　（７５−１，５０μ）３μｇに予め吸収させたちのコ を、胚の漿尿膜の上にアフィゲルを該膜に向けて埋設し、前記窓を再びテガダー ムを使って覆った。３７℃で５日間ふ卵１．た後、反応を肉眼で評価した。

３０および５ｎｇのＨＢＰの両方とも、より大きな血管の明らかな退化及び典型 的な毛細管球（ｃａｐｐｉｌｌａｒｙ−ｂａｌｌ）の形成を伴って、前記アフィ ゲルの領域での微小血管床の密度の大きな増加を誘引した（図参照）。

単核球を、健康な血液供与者からのクエン酸塩添加血液（ｃｉｔｒａｔｅｒｌ　 ｂｌｏｏｄ）の“バフィーコ・−ト（ｂｕｆＴｙ　ｃｏａｔ）−がら単離した。

単核細胞を、次のようにして単離した。；　“バフィーコートを冷却されたｌ？ ＰＭ＋　１６４０　１容量で稀釈し、５０ｍ１フアルコン（Ｆａｌｃｏｎ）試験 管内のフィコ−ルーパキュ（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）１５ｍｌの頂部に積層 した。スイングアウトローターで４００　Ｘｇ３０分間遠心分離後、フィコ−ル ーパキュとＲＰＭＩ　１６４０−血漿の間の層（単核細胞及び血小板を含有する ）を取り陥いた。１゜ＱＸｇで３回洗浄して血小板を取り除いた。単核細胞を、 パーコール勾配（Ｐｅｒｃｏｌｌ　ｇｒａｄｊｅｎｔ）で分画【、た。：ＩＯＸ ＭＥＭおよび！？ＰＭ＋　１６４０をパーコールの＠蓄溶液（濃度：　１．１３ ｒ／ｍりに添加し、１．０６８　ｇ、／ｍｌの濃度を有する等張液にした。

パーコール勾配を、３５″に固定された角度のローターを有するヘレアウス・メ ディフユーグ（ｌｌｅｒｅａｕｓ　ｆｆｉｅｄｉｆｕｇｅ）によって３０００　 Ｘ　ｇで１５分間遠心分離して実行した。この勾配の頂部に、単核細胞を積層し 、スウィングアウトローターで２０分間、２．７００　Ｘｇで遠心分離した。一 番上のバンドに、単核球が非特徴的エステラーゼ染色によって決定された９０％ 以上の純度で検出された。単核球を、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有す るＲＰＭＩ　Ｉ［ｉ４０中で２４ウエルのマクロウェル・プッシュにおいてｌＸ ｌ０６細胞／ｍｌの濃度に培養した。この培養液は、８　ｐｑ／　ｍ１以上のエ ンドトキシンは含有しなかった。

単核球の培養液における分裂誘発活性を試験する前に、ＭＲＣ−５ヒトの肺の胚 繊維芽細胞を、２％ＦＣ９を有するＨＥＭ中で９６ウエルのミクロウェルにおい て、１Ｘｉｏ’細胞／　ｍｌの開始濃度で４日間培養した。単核球の培養液１０ ０μｇにおける分裂誘発活性は、単核球の培養液を添加した２４−４２時間後、 ＭＩ？Ｘ−５細胞を３Ｈ−チミジン（１μＣＩ／ｍｌ）でパルス標識することに よって決定した。

結果： 単核球をＨＢＰ　５ｎｇと共に培養した場合、培養後１日及び２日間で形態学的 変化がＵ察される。前記単核球は、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ　（ウシ血清アルブミ ン）を含有するエンドトキシン（ｅｎｄｏｔｏｘｊｎｌｎ）１００ｎｇ／ｌｏｌ と共に培養された単核球（第５図）と同様に伸長された（第４図）。コントロー ルの細胞は、活性化された形態をもたず、はとんどの細胞は均一な球形のままで ある（第６図）。単核球を添加する前に、ウェルの底にＨＢＰをスポット付けし て乾燥した場合に、単核球の形態学的変化が最も明確に観察された。このことは 、固定化されたＨＢＰが、固定化されていないＨＢＰに比べて単核球をより活性 化するのに優れていることを示１．４る。

単核球からの培養液をＭｌ？Ｃ−５ヒト繊維芽細胞に対する分裂誘発活性につい て試験した場合、前述のＨＢＰと共に２日間培養した単核球が、コントロール単 核球の約２倍量の分裂誘発活性を分泌することがわかった。ＬＰＳ　１１００ｎ 及びＢＳＡ　２１ｍｇ／ｍｌと共に培養した単核球は、コントロールの単核球を 培養した場合の約５倍の分裂誘発活性を示した。

）ＩＢＰは局所投与のために次のような組成で処方された。

成分　　　　　　　　　％ｖ　／ｖ 蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　　　９２．９８ヒドロキシエチルセル ロース　　　　　　　　　４．０塩化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　 　　０１４１リン酸水素二ナトリウムニ水和物　　　　　　　０．８３リン酸二 水素カリウム　　　　　　　　　　　　０ｏ２８加水分解ゼラチン　（ｈｙｄｏ ｌｙｚｅｄ　ｇｅｌａｔｊｎｃ）　　　０．５ベンジルアルコール　　　　　　 　　　　　　　１・０上述の組成物１０ｇに、ＨＢＰ　２５０ｎｇを添加した。

例８ ）ＩＢＰの非経口投与に適した注射可能な組成物は、安定化剤、塩、緩衝液、防 腐剤及びそれらの混合物を含有する。ＨＢＰをその生物学的活性を維持するに足 りるだけ安定化する簡単な組成物は、皮下、筋肉内、または静脈内に注射するこ とかできる。

注射可能な組成物 成　　　分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　％ｖ　／ｖグリシ ン　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１５リン酸水素ニナトリウム　　 　　　　　　　　　０．０２８リン酸二水素カリウム　　　　　　　　　　　　 ０．０２６マンニトール　　　　　　　　　　　　　　　０．７４蒸留水　　　 　　　　　　　　　　　　　　　１００この処方に、防腐剤である０６９％（Ｖ ／Ｖ）ベンジルアルコールを自存させることもできる。上述の組成物１　ｍｌに 、）ＩＢＰ　２５ｎｇを添加する。

概要 傷口治急試験において、２５匹のラットの４つの群に、ラットの首すじの皮膚を 筋膜（ｒＡｕｓｃｕｌａｒ　ｆａｓｃｉａ）に至るまで除去した後、直径約１５ ｍｍの領域に傷口チャンバをつけた。これらの群にヘパリン結合タンパク（ＨＢ Ｐ）１２．５ｎｇ、２．５ｎｇ　、　０．５ｎｇまたは偽薬を、８日間毎日２回 、局部的に投与した。０．１％ラットアルブミンを有する０、９９６生理食塩水 の溶液を偽薬及び溶解培地として使用し、すべての投与量を１００μｇ容二で投 与した。２つの最も高い投与量レベルでは、）ＩＢＰは傷口治疼について十分な 促進効果を有していた。この促進効果は、上皮形成の度合いに基づいて判断した 。一番高い投与量の群の傷口は、には豊富な血管新生が見られた。

物質及び方法 実験動物 １００匹の雌のウィスター・ラット（Ｗｆｓｔｅｒ　ｒａｔ）　　（系統ＣＲＬ ：　（ｖＩ）Ｂｌ？、体！（ｂ、ｔ、）約２４０　ｇ　、　Ｅｌａ６８０Ｅ３） を使用した。

このラットをチャールズ・リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ、ＢＲＤ）から 購入し、使用前６日間、２１±１℃、相対湿度６０±１０％、１時間あたり１０ 回の換気及び６時３０分から１８時３０分の日光で環境馴化させた。ラットは、 松の床がある正長方形のプラスチックケースに入れておいた。これらのラットに 、アルトロミン規定食１３２４を不断給餌し、飲料水を自由に飲ませた。

手術 前記ラットをベント・バルビツール（５０ＩＩ１ｇ／ｋｇ体重）を腹腔内注射し て麻酔にかけた。ラットの首すじを剃り、直径５０＋ｏ＋ｍの手術領域を洗浄・ 消毒して、何名物質をはぎ取って小さい粒子や毛を除去した。プラスチック内部 リング及び付着物質の中のナイロンメツシュからなる傷口チャンバは、皮膚の上 に張り付けた。傷口チャンバの内径は１８ｍｍであり、総直径は４５ｍｍであ− クた。更に、前記ナイロンメツシュを皮膚に１２か所の絹の目金で固定１−た。

プラスチック内部リングの内側の皮膚を、筋膜に至るまで除去した。この傷口を ポリウレタンの蓋で覆い、亜鉛硬膏て前記傷口チャンバに張り付けた。

術後、ラットにテｌゲシノク（登録商標）をＯ，１ｍｌの投与量で３日間毎口２ 回与えた。

Ａ４５ａ＆）を含む０．９　ＮａＣｌ溶液１００　μｌｌにより投与した。この 溶解液を偽薬として使用した。

術後、ラットを、２５匹のラットからなる４つの群に無作為抽出し、それらの群 に、手術の日（第１日）には１回、第２日〜第８日には１日２回次のように投薬 を行った。

これらの投与量を、傷口チャンバの蓋のちょうど下に局所的に投与した。カニユ ーレをポリウレタンの蓋を通して挿入した。

体重ｉ９ｊ定した。第９日に、ベンジルアルコ−ルで麻酔をかけながら傷口チャ ンバを取り除いた。傷口を肉眼及び写真で評価した。後の組織学的試験のために 、手術部位及びその周囲の領域を切開し、リン緩衝中性４％ホルムアルデヒド中 に固定した。最後に、ラットは、腹部大動脈からの出血によって致死された。こ の血液は、ＩＣＰ−１，ＰＩＩＩＮＰ及びヒアルロン酸の分析のだめの血清とし てサンブリラグされた。

表１は、４つのラットの群についての群平均体重（ｇｒｕｏｐ　ｌｌ１ｅａｎ　 ｂｏｄｙ　ｗｅｉｇｈｔ）を示す。すべてのラットは、術後体重が減少し、第５ 日に、最も減少した体重が記録された。

体重について、群相互間に著しい違いは見られながった。

傷口の肉眼による試験の結果、第９日に新しい上皮で覆われた傷口及びその周囲 の領域を次のようにして計算した。：頭蓋−尾、左−石の２つの直径を測定し、 平均直径（Ｄ、。１１）を使用して傷口の総面積を計算した。

新しく形成された上皮を、最も広い箇所及び最も狭い箇所について両縁間を夫々 計測した。２つの結果を加算し、Ｄｌ。９．１から減じて、開いている傷口につ いてＤ　ａ　ｐ　＊　ｅを得た。

開いている傷口の面積を計算した。： 総面積から開いている傷口の面積を減して新しい上皮で覆われた面積を得た。こ の面積を、さらに総面積に対する百分率として計算した。１日２回、）ＩＢＰ　 １２．５ｎｇ（１２，５ｎｇＸ　２　）ＩＢＰ　）を投薬した３匹のラットにお いて、開いている傷口の領域内に上皮化された半島（ｅｐｌｔｈｅｌｉａｌｉｚ ｅｄ　ｐｅｎｉｎｓｕｌａｓ）の通常でない形成を観察した。

測定値及び計算された面積の結果を、同封のデータ・シートに示した。これらの 結果の概観を表■に提供した。

最も高い投与量でＨＢＰを投与した多くのラットにおいて、上皮の縁の直ぐ内側 及びその全体に赤い８血領域を観察し、その傷口には豊富な血管新生が生じてい るように見えた。この投与量の群及び中間の投与量の群（２，５ｎｇ）において 、十分に高い度合いの上皮化が観察された。揮々の群における傷口の総面積につ いては、偽薬を投与した群の面積とあまり著しい違いはなかった。

フィブリンで覆われた傷口を、傷口チャンバの蓋の大部分と共に取り除いたので 、蓋＋フィブリンを組織学的試験のための組織と一緒に固定した。

結論 傷口の肉眼的試験に基づいて、）ＩＢＰ　　（毎日２回１２．５ｎｇ及び２．５ ｎｇを投与したもの）が、上皮化の度合いから判断して、傷口治癒を十分に促進 したと結論を下すことができる。最も高い投与量の群における傷口の血管新生の 高い度合いは、ＨＢＰの脈管形成効果によるものである。

ラットにおける傷口治癒 ｐ）ＩＢＰまたは偽薬を投与した傷口チャンバを有する酸ラットの群平均体重　 ラットは第１日に手術した。

ｐＨＢＰ、１２．５ｎｇ　　２３　　２４９　　２４０　　２３３　　２３８　 　２４２工２　　±２　　±２　　±２　　工〕ｐＨＢＰ、　　２．５　　ｎｇ 　　　　　２４　　　　　２４５　　　　２４コ　　　　２３２　　　２コア　 　　　２４゜±２　　　　　±３　　　　　±３　　　　　士コ　　　　　±３ ラットにおける傷口治癒 試験−偽薬　ｐＨＢＰの　　　総面積　　　上皮化した傷口投与量　　（ｍ＋ｅ ２） （ＩＢ２龍与）平　均　　關２　　　　総面積に±Ｓ、Ｅ、Ｍ、　　平　均　　 　対する±Ｓ、Ｅ、Ｍ、　　　百分率％ ±Ｓ、Ｅ、Ｍ。

１２．５ｎｇ　　　１１８．３　　５２．２”　　　　　４６．３　”８．３　 　　４．１　　　　　３．６ ■　０．１％ ラフトアルブミン　　　２．５ｎｇ　　　　　　　１１４．３　　　　　５３Ｊ ”　　　　　　　　　３９．８を含む　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　７．８　　　　　　４．２　　　　　　　　　　３．０１食１木　　　　　 　　０．５ｎｇ　　　　　　　　１３０．２　　　　　４４．５　　　　　　　 　　　３５．１１１？、４　　　３．８　　　　　３．１ −（偽薬）　１２５．１　　３８，５　　　　３１．６Ｂ、２　　　４．２　　 　　　３．４ １　　　　　１３２．７］　　　　　　　９２．１０　　　　　　　　　４０． ６３　　　　３０．６１２　　　　　１６５．１３　　　　　　１０３．８７　 　　　　　　　　６１．２６　　　　１？、１０３　　　　　１４３．１＜　　 　　　　　６１．８８　　　　　　　　８１．２６　　　　５６．７７４　　　 　　１５３．９４　　　　　　５０．２７　　　　　　　　１０３．６７　　　 　　６７．３５５　　　　　　８６．５９　　　　　　３３．１Ｂ　　　　　　 　　　　５３．４１６１．６８６　　　　　１６５．１３　　　　　　１２２． ７２　　　　　　　　　４２．４１　　　　２５．６８Ｂ　　　　　　１５３． ９４　　　　　　８６．５９　　　　　　　　　６７．３５　　　　　４３．７ ５９９５．０３　　　　　　５０．２７　　　　　　　　　４４．７６　　　　 ４７．１０１０　　　　　９５．０３　　　　　　４４．１８５０．８５　　　 　５３．５１１１　　　　１１３．１０　　　　　　７０．８８　　　　　　　 　　４２．２２　　　　３１．３３１２　　　　　７Ｂ、５４　　　　　　５０ ．２７　　　　　　　　　２Ｂ、２７３５．９９１３　　　　１４３．１４　　 　　　１２２．７２　　　　　　　　２０．４２　　　　１４．２７１４　　　 　　７８．５４　　　　　　２Ｂ、２１　　　　　　　　　５０．２７　　　　 ６４．０１１５　　　　　Ｄ２．７３　　　　　　１０３．８７　　　　　　　 　　２Ｂ、８６　　　　２１．７＜１６　　　　１２２．７２　　　　　　９５ ．０３　　　　　　　　　２７．６９　　　　２２．５６１７　　　　１２２． ７２　　　　　　　Ｇ３．６２　　　　　　　　５９．１０　　　　４Ｂ、Ｌ６ １８　　　　　９５．０３　　　　　　２８．２７　　　　　　　　　６６．７ ６　　　　７０．２５１９　　　　１０３．８７　　　　　　４ｏ、１８　　　 　　　　　６１６９　　　　６１ｊ２２０　　　　　５６．７５　　　　　　１ ２．５７　　　　　　　　　４４．１８　　　　７７．８５２１１４３．１４１ ０３．８７３９．２７２１．＜４２２　　　　　　　　　９５．０３　　　　　 　　　　　　５０．２１　　　　　　　　　　　　　　　４４．７６　　　　　 　　　４７．P０ ２４　　　　　１ｉ３．ｉｏ　　　　　　　５０．２７　　　　　　　　　６２ ．８３　　　　　５５．５５２５　　　　　１３２．７］　　　　　　　５６． ７５　　　　　　　　　７５．９８　　　　　５７．２４Ｘ　　　　　　　、１ １８ｊ＜　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ５２．１７”　　　　　　　　４６．Q４”−” Ｓ、Ｅト１．６，２６４，０５３．６３２６　　　　　２ｄ１．０６　　　　　 　１６ｓ、１３　　　　　　　　　　３５．９３　　　　　１７．８７２７　　 　　　１３２．７３　　　　　　　　Ｂ６．５９　　　　　　　　　　４６．１ ４　　　　　３＜、７６２８　　　　　１ｉ３．１０　　　　　　　８６．５９ 　　　　　　　　　　２６．５１　　　　　２３．４４２９　　　　　１８８． ６９　　　　　　１１３．１０　　　　　　　　　　７５．５９　　　　　４０ ．０６３０　　　　　１３２．７３　　　　　　　９５．０３　　　　　　　　 　３１．１０　　　　　２８．４０３２　　　　１４１ｉ４　　　　　　７０． ８８　　　　　　　　　７２．２６　　　　５０．４８３３　　　　　１０３． ８７　　　　　　４４．１Ｂ　　　　　　　　　　５９．６９　　　　　５７． ４７３４　　　　　１２２．７２　　　　　　５０−２７　　　　　　　　　７ ２．４５５９．０４３５　　　　　５０．２７　　　　　　　２８．２７　　　 　　　　　　２２．００　　　　　４３．７６３６１３２．７３６５．７５ＶＳ 、９８Ｓフ、２４３７　　　　　１０３．８？　　　　　　　　７８．５４　　 　　　　　　　２５．３３　　　　　２４．３９３８　　　　　９５．０３　　 　　　　　５６．７５　　　　　　　　　３Ｅ１．２Ｂ　　　　　　４０．２８ ３９　　　　　９５．０３　　　　　　６３．６２　　　　　　　　　：１１． ４１　　　　３３．０５４０　　　　　　　Ｂ６．５９　　　　　　　２Ｂ、２ ７　　　　　　　　　　５８．：１２　　　　　６７．３５４１　　　　　１５ ３．９＜　　　　　　　１１３．１０　　　　　　　　　４０．８４　　　　　 ２６．５３４２１Ｌ３．１Ｏ７０，１１８４２，２２３７，３３４３１７６，７ １１５１９４２２，７７’　　　　　　１２．８９４４　　　　　１０３．８７ 　　　　　　　８６．５９　　　　　　　　　　１７．２８　　　　　１６．６ ４４５　　　　１Ｑ、１４　　　　　　７８．５４　　　　　　　　　６４．６ ０　　　　４５．１３４６　　　　　１０．１４９５．０３　　　　　　　　　 　＜８．１１　　　　　３３．６１４７　　　　　１４１１４　　　　　　１０ ３．８７　　　　　　　　　　　：１９．２７　　　　　２７．＜４４９　　　 　　　　　１５３．９４　　　　　　　　　　　９５．０３　　　　　　　　　 　　　　　　５８．９１　　　　　　　　１Ｂ、Qフ ５０　　　　　　　１８［１，６９１６５，１３２１，５６ｉ２．＜９Ｘ　　　 　　　　１３０．２１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＜４．５ １　　　　　３５．８２Ｓ、Ｅ、Ｍ、　　　　　７．：ｉ７　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　３．７９　　　　　　３．０６７７　　　　１０３． ８７　　　　　　７０．８８　　　　　　　３２．９９　　　　３１．７６７Ｂ 　　　　　９５．０３　　　　　　５６．７５　　　　　　　３８．２８　　　 　４（Ｌ２ｇ８０　　　　　７０．８８　　　　　　５０．２７　　　　　　　 　７０．６１　　　　２９．０８８１　　　　１３２．７３　　　　　　　５６ ．７５　　　　　　　　７５．９８　　　　５７．２４８２　　　　　８６．５ ９　　　　　　　６３．６２　　　　　　　　２２．９７　　　　　２６．５３ ８３　　　　１１３．１０　　　　　　　９５．０３　　　　　　　　１８．０ ７　　　　１ｓ、９８８４　　　　１７６．７１　　　　　　１５１９４　　　 　　　　２２−’７１　　　　１２．８９８７　　　　１１３．１０　　　　　 　　６３．６２　　　　　　　　４９．４８　　　　０．７５８８　　　　１２ ２．７２　　　　　　　４４．１８　　　　　　　　７Ｂ、５４　　　　６４． ００８９　　　　１３２．７２　　　　　　６３．５２　　　　　　　　６９． １１　　　　５２．０７９０　　　　１（Ｌｌ、８７　　　　　　　７０．８Ｂ 　　　　　　　　　３２．９９　　　　　３１．７６９１　　　　１５３．９４ 　　　　　　１３２．７１　　　　　　　　２１．２１　　　　１３．７８９２ 　　　　１５３．９４　　　　　　１１３．１０　　　　　　　　４０．８４　 　　　　２６．５３９３　　　　１５３．９４　　　　　　１３２．７３　　　 　　　　　２１．２１　　　　１３．７８９４　　　　１１３−１０　　　　　 　　９５．０３　　　　　　　　１８．０７　　　　　　］、５．９８９５　　 　　　１７６、’７１　　　　　　　１５３．９４　　　　　　　　　２２．７ ７　　　　　１２．Ｂ９９６　　　　　１１３、ｉｏ　　　　　　　　　９５． ０３　　　　　　　　　１８．０７　　　　　１５．９［］９７　　　　　１５ ３．９４　　　　　　　　７Ｂ、５４　　　　　　　　　７５．４０　　　　　 ４８．９８９８　　　　　１：１２．７３　　　　　　　１０：１．８７　　　 　　　　　　２Ｂ、８６　　　　　２１．７４９９　　　　　　＋７６．７Ｌ　 　　　　　　　Ｄ２，７３　　　　　　　　　０．９８　　　　　２４．Ｂ９１ ００　　　　１１３．１０　　　　　　　７０．８８　　　　　　　　　４２． ２２　　　　　３７．３３＝ Ｘ　　　　　　’Ｌ２６．１２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３ ８．５０　　　　　３１．６２Ｓε、Ｍ、６．２０Ｃ１９３，３７ 組織学的評価 厚さ５μｍの切片を、パラフィンに埋設した傷口から中央（頭蓋−尾方向）で切 りａした。

該スライスをヘマトキシリジン−エオシン（ｃｏｓｉｎ）で染色し、光学顕微鏡 で観察した。

結果 顕微鏡による評価の結果、第９日における新しい上皮を次の方法で計算した。： 全傷口の直径を測定し、開いている傷口の直径を測定して減じた。： 全傷ロー開いている傷口 等級尺度を、ラットにおける傷口治捻の定量的な組織学的評価と組み合せて使用 した。

第９日での傷口の面積および新しい上皮に覆われた面積を、次の方法で計算した 。： 新しい上皮の面積： 計算した。

測定結果並びに算出した等級及び面積を表に示す。

結論 傷口の顕微鏡による試験及び等級尺度ついてのデータの評価に基づいて、ｐ−Ｈ ＢＰ　　（投与量１２．５ｎｇ及び０．５ｎｇ　）は傷口治癒効果を有している と結論を下すことができる。

前記効果は、第１群及び第■群（ｐＨＢＰの投与量１２．５ｎｇおよび０．５　 ｎｇ）における高い顆粒化組織によって生じる（表■）。

第１群（ｐ）ＩＢＰ投与量１２．５ｎｇ）において、顆粒化組織は偽薬の群と比 較してよりも成熟している。前記面積計算より、上皮化の度合いは各群の間に著 しい違いがないことを示す。

纒Ｘ７ｍ＆　”Ｈ’１９−　　ＶＩ　Ｉ坪妨μＳ、Ｅ、Ｈ。

１２、ｓ　ｎｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．５：ｌ 　”’ｐ−ＨＢＰ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０　 、０　（＋０．５　　ｎｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　２ｊ５　　”ｐ−ＨＢＰ　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，０７２，５ｎｇ　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　２．２６ｐ−ＨＢＰｏ、０７ ０．０９ ★ｐ　＜　０．０５ Ｆ工Ｇ、１ Ｆ工Ｇ、　　２ ＦＩ（、３ Ｆ工Ｇ、　　４ 補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成２年９月１７日 特許庁長官　植　松　　　敏　敗 １、国際出願番号 ＰＣＴ／ＤＫ８９１０００５９ ２、発明の名称 ヘパリン結合タンパク、それらをコードするＤＮＡ。

それらの製造方法およびそれらを含有する治療用調製品３、特許出願人 住所　デンマーク国　ディ・ケイ−２８８０−、バックスバアード。

ノボ・オーー（番地なし） 名称　ノボ・ノルディスク　ニー／ニス国籍　デンマーク国 ４６代理人 東京都千代田区霞が関３丁目７番２号 〒１００　　電話　０３　（５０２）３１８１　（大代表）（５８４７）　　弁 理士　　鈴　　江　　武　　彦（ほか３名） ５、補正書の提出年月日 １９９０年２月２３日 ６、添付書類の目録 （１）補正書の翻訳文　　　　　１通 請求の範囲 １、ヘパリン結合ヤリ、ンブロテアーゼ相同体であって、該タンパクが分子間ジ スルフィド結合を含むと共に、還元条件下での５ＤＳ−ＰＡＧＥにより測定され た約２８ｋＤａのみかけの分子量を有し、更にイン・ビボにおいて脈管形成特性 を示すヘパリン結合セリンプロテアーゼ相同体。

２、　Ａｓｎ　１１３の位置でグリコジル化されていることを特徴とする請求の 範囲第１項に記載のブタ型ヘパリン結合タンパク。

３、下記のアミノ酸配列を有することを特徴とするブタ型ヘパリン結合タンパク （但し、Ｘ　１９５及びＸ１９Ｂは任意のアミノ酸であり、Ｘ２１７は一つまた は二つの任意のアミノ酸である）。

３゜ ＶａｌＨｌＳＰｒｏＡｒｇＰｈｅＶａｌ　ＬａｕＴｈｒＡｌａＡｌａｓａｒｃｙ ｓＰＩＭＬＡｒ９ＧｌｙＬｙｓＡｓｎｓｅｒＧｌｙｓａｒＡｌａｓａｒＶａｌＶ ａｌｒＪ＠ｕＧｌｙＡｌａＴｙｒＡｓｐＬｅｕＡｒ９Ｇ１ｎＧｌｎＧｌｕＧｌｎ ｓｅｒＡｒ９ＧｌｎＴｈｒＰｈａｓｅｒ工ｌｅＡｒｇｓａｒ工１ｅＳｅｒＧｌｎ ＡｓｎＧｌｙＴｙｒＡｓｐＰｒｏ入ｒｇＧ１ｎＡｓｎＬｅｕＡｓｎＡｓｐＶａｌ ＬａｕＬｅｕＬ＠ｕＧｌｎＬａｕＡｓｐＡｒｇＧｌｕＡｌａＡｒｇ１．ａｕＴｈ ｒＰｒｏＳａｒＶａｌＡｌａＩ、ｅｕＶａｌＰｒｏｆ、ｅｕＰｒｏＰｒｏＧｌｎ ＡｓｎＡｌａＴｈｒＶａｌＧｌ貼１ａＧｌｙ’ｌ’ｈｒＡｓｎＣｙｓＧｌｎＶａ 　ｌＡｌ　ａＧｌｙＴｒｐＧ１ｙＴｈｒＧｌｎＡｒｇＬｅｕＡｒｇＡｒｇＬａｕ ＰｈｅＳｅｒＡｒｇＰｈｅＰｒｏＡｒｇＶａ　ｌＴＡｕＡｒｇＶａｌＴｈｒＶａ 　１ＴｈｒｓａｒＡｓｎＰｒｏＣｙｓＬｅｕＰｒｏＡｒｇＡｓｐＭｅｔＣｙｓ工 １ｅＧｌｙＶａｌＰｈｅＳｅｒＡｒｇＡｒｇＧｌｙＡｒｇ　Ｘ　１ｅｓｅｒＧｌ ｎＧ　１ｙＡｓ　ｐＡｒｇＧｌｙＴｈｒＰｒｏ　ＬａｕＶａ　１ｃｙｓＡｓｎＧ ｌｙＬａｕＡ’１ａＧｌｎＧｌｙＶａＩＡＩａＳｅｒＰｈ＠ＴＡｕＡｒｇＡｒｇ ＡｒｇＰｈａＸｘｘ１１ａＡｓｐＳａｒＶａｌＬｅｕＡｓｎＸｘｘ４、　Ｘ１９ ５−Ａｓｎ　、　　Ｘ１９Ｂ−Ｌｙｓであることを特徴とする請求の範囲第３項 に記載のブタ型ヘパリン結合タンパク。

５、　Ｘ２１ＢがＡｓｎ　Ｐｒｏの配列で示される二つのアミノ酸であることを 特徴とする請求の範囲第３項または第４項に記載のブタ型ヘパリン結合タンパク 。

６、下記のアミノ酸配列を有することを特徴とする、ヒト型ヘパシン結合タンパ ク。

Ｎ末端から ＡｌａＳｅｒ工１ａＧｌｎＡｓｎＧｌｎＧｌｙＡｒｇＨ１ｓＰｈａＣｙｇＧｌｙ ＧｌｙＡｌａＴＡｕ工ｌｅＨ１ｓＡｌａＡｒｇＰｈｅ Ｃ末端から 但し、ｎは当該タンパクにおけるアミノ酸の全数を表す。

７、下記のアミノ酸配列を有することを特徴とする、ヘパリン結合タンパク。

Ｎ末端から 人Ｌａ５ｅｒ工ｌｅＧｌｎＡｓｎＧｌｎＧｌｙＡｒｇＨｉｓＰｈｅＣｙｓＧｌｙ ＧｌｙＡｌａＬａｕ工ｌａＨ１ｓＡｌａＡｒｇＰｈａＶａ１ＭｅｔＴｈｒＡｌａ ＡｌａＳｅｒｃｙｓＰｈｅＧ１ｎＳｅｒＧｌｎＡｓｎＰｒｏＧｌｙＶａｌＳｅｒ ＴｈｒＶａｌＶａｌＬｅｕＧ１ｙＡｌａＴｙｒＡｓｐＬａｕＣ末端から ＳｓｒＬｅｕＧｌｙＰｒｏＣｙｓＧｌｙＡｒｇＧ１ｙＰｒｏＡｓｐＰｈｅＰｈａ ＴｈｒＡｒｇＶａ１但し、ｎは請求の範囲第７項に定義したのと同じ意味を有す る。

８、２１１求の範囲第７項のヘパリン結合タンパクにおいて、Ｇｌｎ（ｆ１９） と５ｅｔ（ｎ−２９）の二つのアミノ酸の間に、更に下記のアミノ酸酸配列を有 するヘパリン結合タンパク。

Ｎ末端から ３〇 へ１ａｓａｒ工１ｅＧｌｎＡｓｎＧｌｎＧｌｙＡｒｇＨ１ｓＰｈｅＣｙｓＧｌｙ ＧｌｙＡｌａＬａｕ工ｌｅＨ１ｓＡｌａＡｒｇＰｈａＶａ１ＭｅｔＴｈｒＡｌａ ＡｌａｓｅｒｃｙｓＰｈｅＧｌｎｓｅｒＧｌｎＡｓｎＰｒｏＧｌｙＶａｌｓｅｒ ’ｒ’ｈｒＶａ１ＶａｌＬｅｕＧｌｙＡｌａＴ’ｙｒＡｓｐＬｅｕＡｒｇＡｒｇ ＡｒｇＧｌｕＡｒｇＧｌｎＳｅｒＡｒｇＧｌｎ’ｒ’ｈｒＰｈａＳｅｒＸ　ｌａ ＧｌｎＴｈｒＰｈｅＳａｒｌｌｅＬＪｕｕυｕｕＭｅｔＳｅｒＧｌｕＡｓｎＧｌ ｙ’ｒ’ｙｒＡｓｐＰｒ。

ＧｌｎＧ工ｎ ＬｅｕＰｒｏＬｅｕＰｒ。

ＧｌｕＡｌａＧｌｙＴｈｒＡｒｇＣｙｓＧｌｎＶａｌＡ工ａＧｌｙＴｒｐＧｌｙ ｓａｒＧｌｎＡｒｇＬ＠ｕＳａｒＡｒｇＰｈ＠ＰｒｏＡｒｇＰｈａＶａｌＸｘｘ ＶａｌＴｈｒＶａｌＴｈｒＰｒｏＧｌｕＡｓｐＧｌｎｃｙｓＡｒｇＰｒｏＡｓｎ 但し、Ｕｕｕは未知のアミノ酸であり、ＸＸＸは可能なグリコジル化部位（多分 Ａｓｎである）。

Ｃ末端から ｎ−２９ｎ−１５ ＳｅｒＬｅｕＧｌｙＰｒｏＣｙｓＧｌｙＡｒｇｎ−１５ＳｅｒＬｅｕＧｌｙＰｒ ｏＣｙｓＧｌｙＡｒ但し、ｎは請求の範囲第６項に定義したのと同じ意味を有す る。

９、　　ｎが請求の範囲６に定義したと同じ意味を有し、ＵｕｕおよびＸｘｘが 請求の範囲第８項に定義したと同じ意味を有するものとして、下記の構造を有す る請求の範囲７に記載のヘパリン結合タンパク。

エユａＶａｌＧ１ｙＧユｙＡｒｇＬｙｓＡｌａＡｒｇＰｒｏＡｒｇＧユｎＰｈｅ ＰｒｏＰｈｅＬｅｕ３゜ ＡｌａＳａｒ工１ａＧｌｎＡｓｎＧユｎＧｌｙＡｒｇＨｉｓＰｈｅＣｙｓＧｌｙ Ｇ１ｙＡｌａＬａｕ１１ａＨ１ｓＡユａＡｒｇＰｈａＶａ１ＭｅｔＴ’ｈｒＡｌ ａＡｌａＳｅｒＣｙｓＰｈｅＧｌｎＳｅｒＧｌｎＡｓｎＰｒｏＧｌｙＶａｌＳ＠ ｒＴｈｒＶａｌＶａｌＩ、ｅｕＧｌｙＡｌａＴｙｒＡｓｐＬａｕＡｒｇ＾ｒ９八 ｒｇＧｌへＡｒｇＧｌｎＳ＠ｒＡｒｇＧｌｎＴｈｒＰｈａＳｅｒ工１ｅＵｕｕＬ ＪｕｕＭａｔＳｅｒＧｌｕＡｓｎＧ１ｙ’！’ｙｒＡｓｐＰｒｏＧ１ｎＧｌｎ（ 、、、、、、、、、、、、、。

＋　、、、、）ＬｅｕＧｌｎｒ、ｅｕＡｓｐＡｒｇＧｌｕＡｌａＸｘｘＬａｕＴ ｈｒＳｅｒＸｘｘＶａｌＴｈｒｒユｅＬｅｕＰｒｏＬａｕＰｒｏ（−、、、、、 、、、、、、、、、、）ＧｉｕＡユａＧユｙＴｈｒＡｒｇＣｙｓＧｌｎＶａｌＡ ｌａＧｌｙＴｒｐＧｌｙＳａｒＧｌｎＡｒｇ（、、、、、、、。

、　、　）Ｉ、ａｕＳａｒＡｒｇＰｈｅＰｒｏＡｒｇＰｈ＠ＶａｌＸｘｘＶａｌ ？ｈｒＶａｌＴｈｒＰｒ。

ＧｌｕＡｓｐＧｌｎＣｙｓＡｒｇＰｒｏＡｓｎＡｓｎＶａｌＣｙｓＴｈｒＧｌｙ ＶａｌＩ４ｕＴｈｒＡｒｇＵｕｕＧｌｙＧｌｙＸ　１ｅＣｙｓＡｓｎＧｌｙＡｓ ｐＧｌｙｔＪｕｕＴｈｒＰｒｏＶａｌＬａｕ（−−、、−０，、−、−−−−。

、−、、、、、、＋＋）ＳｅｒＬ＠ｕＧｌｙＰｒｏＣｙｓＧｌｙＡｒｇＧｌｙＰ ｒｏＡｓｐＰｈａＰｈｅＴｈｒＡｒｇＶａＩＡＩａＬｅｕＰｈａＡｒｇＡｓｐ？ ’ｒｐｘｌｅＡｇｐＧｌｙＶａｌＬｅｕＡｓｎＡｓｎＰｒｏＧｌｙ１０、治療的 活性量の、請求の範囲１〜５に記載のブタ型ヘパリン結合タンパクを含有するこ とを特徴とする治療用製剤。

１１、治療的活性量の、請求の範囲第６項〜第９項に記載のヒト型ヘパリン結合 タンパクを含有することを特徴とする治療用製剤。

１２、請求の範囲第１項〜１５項に記載のブタ型ヘパリン結合タンパクの製造方 法であって、ブタの血小板を抽出することと、ヘパリン結合タンパクを単離する ために、ペパリンーセファロース上のクロマトグラフィー及び逆相）ＩＰＬＣに よって前記抽出物を精製することとを特徴とする方法。

１３、請求の範囲第７項〜第９項に記載のヒト型ヘパリン結合タンパクの製造方 法であって、ヒトの血小板を抽出することと、前記タンパクを単離するために、 ベバリンーセファロース上のクロマトグラフィーおよび逆相ＨＰＬＣによって前 記抽出物を精製す°ることとを特徴とする方法。

１４、前記細胞抽出物のペパリンーセファロースへの適用を、ｐＨ値が７．２〜 ７．８１好ましくは７．４に調節された０、５モルのＮａＣＩＪ溶液として行う ことを特徴とする請求の範囲第１２項または第１３項に記載の方法。

１５、生合成的組替え技術を用いることを特徴とする請求の範囲第１項〜第９項 の何れか１項に記載のヘパリン結合タンパクの製造方法。

１６．Ｘｉ求の範囲第１項〜第５項、第１０項または第１２項の何れか１項に記 載のヘパリン結合タンパクをコードするＤＮＡ構造。

１７、請求の範囲第６項〜第９項、第１１項または第１３項の何れか１項に記載 のヒト型ヘパリン結合タンパクをコードするｃＤＮＡ。

国際調査報告 ｌｌｌｌｌ１１ｗ１．．１〜−一−ｍ、　　ＰＣＴ／ＤＫ８９１０００５９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．グリコシル化された状態において、還元条件の下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによ り測定された約２８ｋＤａのみかけの分子量を有し、且つイン・ビボでの脈管形 成特性を示すヘパリン結合タンパク。 ２．グリコシル化されていることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載のヘパ リン結合タンパク。 ３．Ａｓｎ１１３の位置でグリコシル化されていることを特徴とする、請求の範 囲第２項に記載のブタ型ヘパリン結合タンパク。 ４．下記のアミノ酸配列を有することを特徴とするブタ型ヘパリン結合タンパク （但し、Ｘ１９５及びＸ１９６は任意のアミノ酸であり、Ｘ２１７は一つまたは 二つの任意のアミノ酸である）。 【配列があります】５．Ｘ１９５＝Ａｓｎ，Ｘ１９６＝Ｌｙｓであることを特徴 とする、請求の範囲第４項に記載のブタ型ヘパリン結合タンパク。 ６．Ｘ２１６がＡｓｎＰｒｏの配列で示される二つのアミノ酸であることを特徴 とする、請求の範囲第４項または第５項に記載のブタ型ヘパリン結合タンパク。 ７．下記のアミノ酸配列を有することを特徴とする、ヒト型ヘパリン結合タンパ ク。 Ｎ末端から 【配列があります】 Ｃ末端から 【配列があります】 但し、ｎは当該タンパクにおけるアミノ酸の全数を表す。 ８．下記のアミノ酸配列を有することを特徴とする、ヘパリン結合タンパク。 Ｎ末端から 【配列があります】 Ｃ末端から 【配列があります】 但し、ｎは請求の範囲第７項に定義したのと同じ意味を有する。 ９．請求の範囲第８項のヘパリン結合タンパクにおいて、Ｇｌｎ（６９）とＳｅ ｒ（ｎ−２９）の二つのアミノ酸の間に、更に下記のアミノ酸酸配列を有するヘ パリン結合タンパク。 Ｎ末端から 【配列があります】 但し、Ｕｕｕは未知のアミノ酸であり、Ｘｘｘは可能なグリコシル化部位（多分 Ａｓｎである）。 Ｃ末端から 【配列があります】 但し、ｎは請求の範囲第７項に定義したのと同じ意味を有する。 １０．ｎが請求の範囲第７項に定義したと同じ意味を有し、ＵｕｕおよびＸｘｘ が請求の範囲第９項に定義したと同じ意味を有するものとして、下記の構造を有 する請求の範囲第８項に記載のヘパリン結合タンパク。 【配列があります】 １１．治療的活性量の、請求の範囲第１項〜第６項に記載のブタ型ヘパリン結合 タンパクを含有することを特徴とする治療用製剤。 １２．治療的活性量の、請求の範囲第７項〜第１０項に記載のヒト型ヘパリン結 合タンパクを含有することを特徴とする治療用製剤。 １３．請求の範囲第１項〜第６項に記載のブタ型ヘパリン結合タンパクの製造方 法であって、ブタの血小板を抽出することと、ヘパリン結合タンパクを単離する ために、ヘパリン−セファロース上のクロマトグラフィー及び逆相ＨＰＬＣによ って前記抽出物を精製することとを特徴とする方法。 １４．請求の範囲第７項〜第１０項に記載のヒト型ヘパリン結合タンパクの製造 方法であって、ヒトの血小板を抽出することと、前記タンパクを単離するために 、へパリン−セファロース上のクロマトグラフィーおよび逆相ＨＰＬＣによって 前記抽出物を精製することとを特徴とする方法。 １５．前記細胞抽出物のヘパリン−セファロースヘの適用を、ｐＨ値が７．２〜 ７．６、好ましくは７．４に調節されたモル濃度０．５のＮａＣｌ溶液として行 うことを特徴とする請求の範囲第１３項または第１４項に記載の方法。 １６．生合成的組替え技術を用いることを特徴とする、ヘパリン結合タンパクの 製造方法。 １７．請求の範囲第１項〜第６項、第１１項または第１３項の何れか１項に記載 のヘパリン結合タンパクをコードするＤＮＡ構造。 １８．請求の範囲第７項〜第１０項、第１２項または第１４項の何れか１項に記 載のヒト型ヘパリシ結合タンパクをコードするｃＤＮＡ。