JPH0351398B2 - - Google Patents
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- JPH0351398B2 JPH0351398B2 JP62262303A JP26230387A JPH0351398B2 JP H0351398 B2 JPH0351398 B2 JP H0351398B2 JP 62262303 A JP62262303 A JP 62262303A JP 26230387 A JP26230387 A JP 26230387A JP H0351398 B2 JPH0351398 B2 JP H0351398B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- aluminum
- reaction
- produced
- lactate
- Prior art date
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明はたとえば、α−１，６−グルコシダー
ゼ、アミラーゼまたはセルラーゼのような酵素の
安定化方法に関するものである。 〔従来の技術〕 酵素は中温、中性、常圧付近で効率よく反応を
推進するが、それぞれの酵素には、それぞれ固有
の最適PHと最適温度がある。換言すれば、酵素は
最適PH付近において安定であり、そして、最適温
度はその酵素の高温側における安定限界温度を示
している。 〔発明が解決しようとする問題点〕 しかるに、酵素を工業的に応用しようとする場
合、最適PHをはずれたところで、利用しなければ
ならないことが多くある。また、酵素を効率的に
利用し、反応中の雑菌汚染を防止するためには、
できるだけ、高い温度で利用しなければならない
ことが多い。このため、これまで酵素の安定化
法、特に、熱安定性を向上する方法について、多
くの研究が行われてきているが、未だ普遍的に応
用できる方法は知られていない。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明は澱粉加水分解酵素の一種であるα−
１，６−グルコシダーゼをグルコアミラーゼと併
用して澱粉から高い収量でグルコースを製造する
ため、α−１，６−グルコシダーゼの安定化法に
ついて種々検討してきた結果、アルミニウム塩が
0.01モル以下の非常に薄い濃度で、しかも狭い濃
度範囲で極めて有効であることを認めた。そし
て、この効果は、α−１，６−グルコシダーゼに
止どまらず、多くのアミラーゼ、セルラーゼ、グ
ルコースイソメラーゼ、プロテアーゼなど種々の
酵素の安定化に適用できることを認めた。本発明
はこの知見に基づいてなされたものである。 すなわち、本発明は酵素反応をアルミニウム塩
の存在下でおこなうことを特徴とする酵素の熱安
定化法に関するものである。 〔発明の効果〕 本発明は多くの酵素に適用することができる
が、具体例として、α−１，６−グルコシダーゼ
の安定化について詳説する。 α−１，６−グルコシダーゼは澱粉またはその
派生物中のα−１，６−グルコシド結合あるいは
（および）プルランのα−１，６−グルコシド結
合などを加水分解する酵素の総称であり、その基
質特異性の差からプルラナーゼあるいはイソアミ
ラーゼと呼ばれる酵素がある。 α−１，６−グルコシダーゼはβ−アミラーゼ
と併用して、澱粉からマルトースを収量よく製造
するのに使用したり、また、最近、酵素法による
澱粉からのグルコースの製造において、グルコア
ミラーゼと併用して、グルコースを増収するため
に使用されている。 α−１，６−グルコシダーゼは、バシルス属、
クレプシラ属、シユードモナス属など、種々の細
菌や、ストレプトマイセス属などの放線菌により
生産されることが知られているが、多くのα−
１，６−グルコシダーゼは、最適PH５〜７、最適
温度50℃前後にある。一方、グルコアミラーゼの
最適PHは4.5付近、温度60℃にあつて、それらの
作用条件は一致していない。 そこで、現在、工業的に製造されている、クレ
ブシラ属、シユードモナス属、バシルス属など細
菌の生産するα−１，６−グルコシダーゼについ
て、その安定化法について検討してきた結果、塩
化アルミニウム、硫酸アルミニウム、硫酸アルミ
ニウムアンモニウム、乳酸アルミニウムなどの水
溶性のアルミニウム塩が、非常に薄い濃度で、し
かも極めて狭い濃度範囲で添加するとき、該酵素
の安定化が著しい効果のあることを認めた。そし
て、グルコアミラーゼの最適作用条件であるPH
4.5、温度60℃においても、長時間作用できるこ
とがわかつた。例えば、プルランを基質として、
PH4.5、60℃で反応させるとき、多くのバシルス
属やクレブシラ属細菌の生産するプルラナーゼは
１時間以内で失活するのに対し、３×10-3モル程
度の乳酸アルミニウムを存在させたときは、少な
くとも３日間活性を保持した。 また、本発明は、アミラーゼおよびセルラーゼ
に対しても、α−１，６−グルコシダーゼに対す
るのと同様の安定化効果を示す。 本発明は糸状菌、細菌や酵母など種々の微生物
の生産するアミラーゼに適用することができる。
例えば、グルコアミラーゼや、マルトース、マル
トトリオース、マルトテトラオース、マルトペン
タオース、マルトヘキサオースなどのマルトオリ
ゴ糖生成酵素に対し、本発明は好適に実施するこ
とができる。 さらに、本発明はアスペルギルス属、トリコデ
ルマ属、ペニシリウム属、アクレモニウム属、ス
ポロトリクム属など種々の微生物の生産するセル
ラーゼに適用することができる。 本発明において使用されるアルミニウム塩とし
ては、例えば、塩化アルミニウム、硫酸アルミニ
ウム、硫酸アルミニウムアンモニウム、硝酸アル
ミニウム、硫酸アルミニウムカリウムなどの無機
酸塩のほか、酢酸アルミニウム、乳酸アルミニウ
ムなどの有機酸塩など、通常、水溶性の塩が挙げ
られる。しかし、アルミニウム塩は強い酸性を示
し（PH２〜４）、α−１，６−グルコシダーゼな
ど、多くの酵素は直ちに失活するため、PHを低く
とも４以上に上げる必要がある。しかし、PHを上
げるとアルミニウム塩は、分解して、水不溶性の
水酸化アルミニウムを沈澱するという問題があ
る。このため、該酵素に安定なPHで、水溶性を維
持できるアルミニウム溶液について検討してきた
結果、塩化アルミニウム、硫酸アルミニウム、硫
酸アルミニウムカリウム、硫酸アルミニウムアン
モニウムなどの水溶液または水懸濁液に、糖、グ
リセリン、乳酸ナトリウムなどのいづれかを存在
させて、PHを調整するか、あるいは乳酸アルミニ
ウムの溶液をPH調整して使用するのが適当である
ことを認めた。特に、乳酸アルミニウムを使用す
るときは、高濃度の溶液を調製することができ
る。いずれのアルミニウム塩も反応液に対し、１
×10-4〜１×10-2モルの範囲で存在させるとき、
無添加の場合に比べ、著しく酵素を熱安定化す
る。下記の表はバシルス・ズブチルスの生産する
プルラナーゼを、プルラン約５％、乳酸アルミニ
ウムを表記の量加え、PH4.5、温度60℃で20時間
反応させたときに生成した還元糖を、グルコース
として表したものである。乳酸アルミニウムは
0.5×10-4モル濃度以上で効果を表し、ほぼ１×
10-3〜７×10-3モルを最適濃度とするピークを示
している。アルミニウム塩は反応時に添加しても
よく、また酵素剤にあらかじめ添加処理しておい
てもよい。後者の場合、酵素を長期保存する場合
により効果的である。
ゼ、アミラーゼまたはセルラーゼのような酵素の
安定化方法に関するものである。 〔従来の技術〕 酵素は中温、中性、常圧付近で効率よく反応を
推進するが、それぞれの酵素には、それぞれ固有
の最適PHと最適温度がある。換言すれば、酵素は
最適PH付近において安定であり、そして、最適温
度はその酵素の高温側における安定限界温度を示
している。 〔発明が解決しようとする問題点〕 しかるに、酵素を工業的に応用しようとする場
合、最適PHをはずれたところで、利用しなければ
ならないことが多くある。また、酵素を効率的に
利用し、反応中の雑菌汚染を防止するためには、
できるだけ、高い温度で利用しなければならない
ことが多い。このため、これまで酵素の安定化
法、特に、熱安定性を向上する方法について、多
くの研究が行われてきているが、未だ普遍的に応
用できる方法は知られていない。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明は澱粉加水分解酵素の一種であるα−
１，６−グルコシダーゼをグルコアミラーゼと併
用して澱粉から高い収量でグルコースを製造する
ため、α−１，６−グルコシダーゼの安定化法に
ついて種々検討してきた結果、アルミニウム塩が
0.01モル以下の非常に薄い濃度で、しかも狭い濃
度範囲で極めて有効であることを認めた。そし
て、この効果は、α−１，６−グルコシダーゼに
止どまらず、多くのアミラーゼ、セルラーゼ、グ
ルコースイソメラーゼ、プロテアーゼなど種々の
酵素の安定化に適用できることを認めた。本発明
はこの知見に基づいてなされたものである。 すなわち、本発明は酵素反応をアルミニウム塩
の存在下でおこなうことを特徴とする酵素の熱安
定化法に関するものである。 〔発明の効果〕 本発明は多くの酵素に適用することができる
が、具体例として、α−１，６−グルコシダーゼ
の安定化について詳説する。 α−１，６−グルコシダーゼは澱粉またはその
派生物中のα−１，６−グルコシド結合あるいは
（および）プルランのα−１，６−グルコシド結
合などを加水分解する酵素の総称であり、その基
質特異性の差からプルラナーゼあるいはイソアミ
ラーゼと呼ばれる酵素がある。 α−１，６−グルコシダーゼはβ−アミラーゼ
と併用して、澱粉からマルトースを収量よく製造
するのに使用したり、また、最近、酵素法による
澱粉からのグルコースの製造において、グルコア
ミラーゼと併用して、グルコースを増収するため
に使用されている。 α−１，６−グルコシダーゼは、バシルス属、
クレプシラ属、シユードモナス属など、種々の細
菌や、ストレプトマイセス属などの放線菌により
生産されることが知られているが、多くのα−
１，６−グルコシダーゼは、最適PH５〜７、最適
温度50℃前後にある。一方、グルコアミラーゼの
最適PHは4.5付近、温度60℃にあつて、それらの
作用条件は一致していない。 そこで、現在、工業的に製造されている、クレ
ブシラ属、シユードモナス属、バシルス属など細
菌の生産するα−１，６−グルコシダーゼについ
て、その安定化法について検討してきた結果、塩
化アルミニウム、硫酸アルミニウム、硫酸アルミ
ニウムアンモニウム、乳酸アルミニウムなどの水
溶性のアルミニウム塩が、非常に薄い濃度で、し
かも極めて狭い濃度範囲で添加するとき、該酵素
の安定化が著しい効果のあることを認めた。そし
て、グルコアミラーゼの最適作用条件であるPH
4.5、温度60℃においても、長時間作用できるこ
とがわかつた。例えば、プルランを基質として、
PH4.5、60℃で反応させるとき、多くのバシルス
属やクレブシラ属細菌の生産するプルラナーゼは
１時間以内で失活するのに対し、３×10-3モル程
度の乳酸アルミニウムを存在させたときは、少な
くとも３日間活性を保持した。 また、本発明は、アミラーゼおよびセルラーゼ
に対しても、α−１，６−グルコシダーゼに対す
るのと同様の安定化効果を示す。 本発明は糸状菌、細菌や酵母など種々の微生物
の生産するアミラーゼに適用することができる。
例えば、グルコアミラーゼや、マルトース、マル
トトリオース、マルトテトラオース、マルトペン
タオース、マルトヘキサオースなどのマルトオリ
ゴ糖生成酵素に対し、本発明は好適に実施するこ
とができる。 さらに、本発明はアスペルギルス属、トリコデ
ルマ属、ペニシリウム属、アクレモニウム属、ス
ポロトリクム属など種々の微生物の生産するセル
ラーゼに適用することができる。 本発明において使用されるアルミニウム塩とし
ては、例えば、塩化アルミニウム、硫酸アルミニ
ウム、硫酸アルミニウムアンモニウム、硝酸アル
ミニウム、硫酸アルミニウムカリウムなどの無機
酸塩のほか、酢酸アルミニウム、乳酸アルミニウ
ムなどの有機酸塩など、通常、水溶性の塩が挙げ
られる。しかし、アルミニウム塩は強い酸性を示
し（PH２〜４）、α−１，６−グルコシダーゼな
ど、多くの酵素は直ちに失活するため、PHを低く
とも４以上に上げる必要がある。しかし、PHを上
げるとアルミニウム塩は、分解して、水不溶性の
水酸化アルミニウムを沈澱するという問題があ
る。このため、該酵素に安定なPHで、水溶性を維
持できるアルミニウム溶液について検討してきた
結果、塩化アルミニウム、硫酸アルミニウム、硫
酸アルミニウムカリウム、硫酸アルミニウムアン
モニウムなどの水溶液または水懸濁液に、糖、グ
リセリン、乳酸ナトリウムなどのいづれかを存在
させて、PHを調整するか、あるいは乳酸アルミニ
ウムの溶液をPH調整して使用するのが適当である
ことを認めた。特に、乳酸アルミニウムを使用す
るときは、高濃度の溶液を調製することができ
る。いずれのアルミニウム塩も反応液に対し、１
×10-4〜１×10-2モルの範囲で存在させるとき、
無添加の場合に比べ、著しく酵素を熱安定化す
る。下記の表はバシルス・ズブチルスの生産する
プルラナーゼを、プルラン約５％、乳酸アルミニ
ウムを表記の量加え、PH4.5、温度60℃で20時間
反応させたときに生成した還元糖を、グルコース
として表したものである。乳酸アルミニウムは
0.5×10-4モル濃度以上で効果を表し、ほぼ１×
10-3〜７×10-3モルを最適濃度とするピークを示
している。アルミニウム塩は反応時に添加しても
よく、また酵素剤にあらかじめ添加処理しておい
てもよい。後者の場合、酵素を長期保存する場合
により効果的である。
【表】
本発明はα−１，６−グルコシダーゼのみでな
く、多くのアミラーゼ、セルラーゼ、プロテアー
ゼ、リパーゼ、グルコースイソメラーゼなど多種
の酵素に適用することができる。 以下に、代表的な酵素について、実施例によ
り、本発明の詳細を説明するが、本発明は、これ
ら実施例に限定されるものではない。 実施例 １ クレブシラ・ニユーモニア（Klebsiella
Pneumoniae）の生産するプルラナーゼ（英国、
ABM社製、商品名Pulluzyme）0.3単位に、プル
ラン10％、酢酸緩衝液（PH4.5）0.1M、塩化アル
ミニウム３×10-4Mになるように加え、全量を水
で２mlとし、60℃で反応させた。対照として、塩
化アルミニウム無添加のものを同時に反応させ
た。そして、経時的に一定量をとり、生成した還
元糖（マルトトリオース）をソモギー・ネルソン
法によりグリコースとして定量した。得られた結
果を第１表に示す。
く、多くのアミラーゼ、セルラーゼ、プロテアー
ゼ、リパーゼ、グルコースイソメラーゼなど多種
の酵素に適用することができる。 以下に、代表的な酵素について、実施例によ
り、本発明の詳細を説明するが、本発明は、これ
ら実施例に限定されるものではない。 実施例 １ クレブシラ・ニユーモニア（Klebsiella
Pneumoniae）の生産するプルラナーゼ（英国、
ABM社製、商品名Pulluzyme）0.3単位に、プル
ラン10％、酢酸緩衝液（PH4.5）0.1M、塩化アル
ミニウム３×10-4Mになるように加え、全量を水
で２mlとし、60℃で反応させた。対照として、塩
化アルミニウム無添加のものを同時に反応させ
た。そして、経時的に一定量をとり、生成した還
元糖（マルトトリオース）をソモギー・ネルソン
法によりグリコースとして定量した。得られた結
果を第１表に示す。
【表】
表から明らかなように、この酵素は塩化アルミ
ニウムが存在しないとき、PH4.5、60℃という条
件下では、１時間以内に失活するが、３×10-4モ
ル量の塩化アルミニウムが存在したときは、酵素
の安定性が著しく改善され、高い分解性を示し
た。 ここで、α−１，６−グルコシダーゼ活性は以
下のようにして測定した。 0.1M酢酸緩衝液に溶解した２％プルラン液
（PH0.5）0.5mlに適当量の酵素液を加え、蒸留水
で全量１mlとし、40℃で反応させる。この条件下
で、１分間に１マイクロモルのグルコースに相当
する還元力を生成する酵素量を１単位とした。 実施例 ２ コーン・ステイープ・リカー10％、乳糖２％、
燐酸二カリ0.3％、硫酸マグネシウム（７水塩）
0.1％、硝酸ナトリウム0.25％、ツイーン60 0.3
％、硫酸銅５×10-5M、塩化マンガン2.5×
10-6M、塩化カルシウム１×10-3M、硫酸亜鉛１
×10-4M、硫酸第一鉄１×10-5Mからなる培地
（PH7.5）を、常法により殺菌後、バシルス・ズブ
チリスTU（Bacillus subtilis TU）FERM−
BP684を接種し、30℃で４日間振盪培養した。培
養後、遠心分離して得た上澄に、硫酸アンモニウ
ムを70％飽和になるように加えて酵素を沈澱さ
せ、遠心分離により回収し、蒸留水で透析したも
のを酵素液として使用した。 本酵素0.05単位を、プルラン５％、酢酸緩衝液
（PH4.5）0.01M、塩化カルシウム１×10-2M、乳
酸アルミニウム１×10-4〜１×10-2M加え、全量
１mlで60℃で反応させた。反応42および66時間目
に、生成した環元糖をグルコースとして定量し
た。得られた結果を第２表に示す。
ニウムが存在しないとき、PH4.5、60℃という条
件下では、１時間以内に失活するが、３×10-4モ
ル量の塩化アルミニウムが存在したときは、酵素
の安定性が著しく改善され、高い分解性を示し
た。 ここで、α−１，６−グルコシダーゼ活性は以
下のようにして測定した。 0.1M酢酸緩衝液に溶解した２％プルラン液
（PH0.5）0.5mlに適当量の酵素液を加え、蒸留水
で全量１mlとし、40℃で反応させる。この条件下
で、１分間に１マイクロモルのグルコースに相当
する還元力を生成する酵素量を１単位とした。 実施例 ２ コーン・ステイープ・リカー10％、乳糖２％、
燐酸二カリ0.3％、硫酸マグネシウム（７水塩）
0.1％、硝酸ナトリウム0.25％、ツイーン60 0.3
％、硫酸銅５×10-5M、塩化マンガン2.5×
10-6M、塩化カルシウム１×10-3M、硫酸亜鉛１
×10-4M、硫酸第一鉄１×10-5Mからなる培地
（PH7.5）を、常法により殺菌後、バシルス・ズブ
チリスTU（Bacillus subtilis TU）FERM−
BP684を接種し、30℃で４日間振盪培養した。培
養後、遠心分離して得た上澄に、硫酸アンモニウ
ムを70％飽和になるように加えて酵素を沈澱さ
せ、遠心分離により回収し、蒸留水で透析したも
のを酵素液として使用した。 本酵素0.05単位を、プルラン５％、酢酸緩衝液
（PH4.5）0.01M、塩化カルシウム１×10-2M、乳
酸アルミニウム１×10-4〜１×10-2M加え、全量
１mlで60℃で反応させた。反応42および66時間目
に、生成した環元糖をグルコースとして定量し
た。得られた結果を第２表に示す。
【表】
表から明らかなように、乳酸ナトリウムを使用
した場合、比較的広い濃度範囲で効果を示すが、
最適温度は４×10-3M前後に認められた。 実施例 ３ コーン・ステイープ・リカー10％、乳糖２％、
燐酸二カリ0.3％、硫酸マグネシウム（７水塩）
0.1％、硝酸ナトリウム0.25％、ツイーン60 0.3
％、硫酸銅５×10-5M、塩化マンガン2.5×
10-6M、塩化カルシウム１×10-3M、硫酸亜鉛１
×10-4M、硫酸第一鉄１×10-5Mからなる培地
（PH7.0）を、常法により殺菌後、バシルス・ズブ
チリスTU（Bacillus subtilis TU）FERM−
BP684を接種し、30℃で４日間振盪培養した。培
養後、遠心分離して得た上澄を酵素液として使用
した。該酵素の0.23単位をプルラン５％、酢酸緩
衝液（PH4.5）0.01M、塩化カルシウム１×
10-3M、塩化アルミニウム１×10-4〜５×10-4M
に加え、全量１mlで60℃で反応させた。反応48時
間目に生成した還元糖量をグルコースとして定量
した。結果は第３表に示す通りであつた。 表から明らかなように、塩化アルミニウムの存
在により、プルラナーゼの安定性が著しく改善さ
れた。
した場合、比較的広い濃度範囲で効果を示すが、
最適温度は４×10-3M前後に認められた。 実施例 ３ コーン・ステイープ・リカー10％、乳糖２％、
燐酸二カリ0.3％、硫酸マグネシウム（７水塩）
0.1％、硝酸ナトリウム0.25％、ツイーン60 0.3
％、硫酸銅５×10-5M、塩化マンガン2.5×
10-6M、塩化カルシウム１×10-3M、硫酸亜鉛１
×10-4M、硫酸第一鉄１×10-5Mからなる培地
（PH7.0）を、常法により殺菌後、バシルス・ズブ
チリスTU（Bacillus subtilis TU）FERM−
BP684を接種し、30℃で４日間振盪培養した。培
養後、遠心分離して得た上澄を酵素液として使用
した。該酵素の0.23単位をプルラン５％、酢酸緩
衝液（PH4.5）0.01M、塩化カルシウム１×
10-3M、塩化アルミニウム１×10-4〜５×10-4M
に加え、全量１mlで60℃で反応させた。反応48時
間目に生成した還元糖量をグルコースとして定量
した。結果は第３表に示す通りであつた。 表から明らかなように、塩化アルミニウムの存
在により、プルラナーゼの安定性が著しく改善さ
れた。
【表】
実施例 ４
本実施例においては、塩化アルミニウムの代わ
りに、硫酸アルミニウムアンモニウムを使用し
た。反応に使用した酵素は実施例３で使用したと
同じ酵素である。得られた結果を第４表に示す。
りに、硫酸アルミニウムアンモニウムを使用し
た。反応に使用した酵素は実施例３で使用したと
同じ酵素である。得られた結果を第４表に示す。
【表】
実施例 ５
実施例３において調製した酵素を硫酸アンモニ
ウム70％飽和になるように加えて酵素を沈澱さ
せ、遠心分離により回収し、蒸留水で透析したも
のを酵素液として使用した。 本酵素0.05単位を、プルラン５％、酢酸緩衝液
（PH4.5）0.01M、塩化カルシウム１×10-2M、乳
酸アルミニウム0.5×10-3〜５×10-3M加え、全
量１mlで60℃で反応させた。反応42および66時間
目に、生成した還元糖をグルコースとして定量し
た。得られた結果を第５表に示す。
ウム70％飽和になるように加えて酵素を沈澱さ
せ、遠心分離により回収し、蒸留水で透析したも
のを酵素液として使用した。 本酵素0.05単位を、プルラン５％、酢酸緩衝液
（PH4.5）0.01M、塩化カルシウム１×10-2M、乳
酸アルミニウム0.5×10-3〜５×10-3M加え、全
量１mlで60℃で反応させた。反応42および66時間
目に、生成した還元糖をグルコースとして定量し
た。得られた結果を第５表に示す。
【表】
表から明らかなように、乳酸ナトリウムを使用
した場合、比較的広い濃度範囲で効果を示した。 実施例 ６ 本実施例では、α−１，６−グルコシダーゼと
して、シユードモナス・アミロデラモサ
（Pseudomonas amylodelamosa）のイソアミラ
ーゼを用いて試験した結果について記載する。 本酵素はアミロペクチンの長鎖の分岐（α−
１，６−グルコシド結合）を分解することができ
るが、プルランのα−１，６−グルコシド結合は
分解することはできない。また、この酵素の最適
PHは３〜４、最適温度は52℃（PH3.5、10分反応）
にあり、60℃では急速に失活する〔Ｋ、
Yokobayasi他、Bio−chimica et Biophysica
Acta 212、458（1970）〕。本酵素の精製標品は生
化学工業(株)より入手することができる。 本酵素に対するアルミニウム塩による安定性を
試験するため、植物β−アミラーゼと併用して、
澱粉からのマルトースの生成試験を行つた。この
場合、β−アミラーゼによる影響を無くするため
に、β−アミラーゼは基質に対して十分量を加え
た。 可溶性澱粉５％、酢酸緩衝液（PH5.0）0.01M、
大麦β−アミラーゼ（フインランド国、フインシ
ユガー社製（商品名Spezyme BBA）4.2単位、
前記シユードモナス属イソアミラーゼ100単位、
硫酸アルミニウムアンモニウム、または乳酸アル
ミニウムを３×10-4〜５×10-4M、全量１ml60℃
で反応させた。対照として、アルミニウム塩無添
加で同時に反応させた。 経時的に一定量をとり、生成した還元糖（マル
トース）をソモギー・ネルソン法により定量し
た。得られた結果を第６表に示す。 表から明らかなように、アルミニウム塩が存在
したときは、存在しない場合にくらべ、長時間に
わたり活性が維持され、高い収量でマルトースが
得られた。
した場合、比較的広い濃度範囲で効果を示した。 実施例 ６ 本実施例では、α−１，６−グルコシダーゼと
して、シユードモナス・アミロデラモサ
（Pseudomonas amylodelamosa）のイソアミラ
ーゼを用いて試験した結果について記載する。 本酵素はアミロペクチンの長鎖の分岐（α−
１，６−グルコシド結合）を分解することができ
るが、プルランのα−１，６−グルコシド結合は
分解することはできない。また、この酵素の最適
PHは３〜４、最適温度は52℃（PH3.5、10分反応）
にあり、60℃では急速に失活する〔Ｋ、
Yokobayasi他、Bio−chimica et Biophysica
Acta 212、458（1970）〕。本酵素の精製標品は生
化学工業(株)より入手することができる。 本酵素に対するアルミニウム塩による安定性を
試験するため、植物β−アミラーゼと併用して、
澱粉からのマルトースの生成試験を行つた。この
場合、β−アミラーゼによる影響を無くするため
に、β−アミラーゼは基質に対して十分量を加え
た。 可溶性澱粉５％、酢酸緩衝液（PH5.0）0.01M、
大麦β−アミラーゼ（フインランド国、フインシ
ユガー社製（商品名Spezyme BBA）4.2単位、
前記シユードモナス属イソアミラーゼ100単位、
硫酸アルミニウムアンモニウム、または乳酸アル
ミニウムを３×10-4〜５×10-4M、全量１ml60℃
で反応させた。対照として、アルミニウム塩無添
加で同時に反応させた。 経時的に一定量をとり、生成した還元糖（マル
トース）をソモギー・ネルソン法により定量し
た。得られた結果を第６表に示す。 表から明らかなように、アルミニウム塩が存在
したときは、存在しない場合にくらべ、長時間に
わたり活性が維持され、高い収量でマルトースが
得られた。
【表】
実施例 ７
可溶性澱粉約５％、酢酸緩衝液（PH５）
0.01M、グルコアミラーゼ0.27単位（ノボ・ジヤ
パン販売）に、乳酸アルミニウムを第７表記載の
量を加え、全量１mlで、60℃で反応させた。対照
として、アルミニウム塩無添加のものを同時にに
反応させた。反応140時間目に生成したグルコー
スをソモギー・ネルソン法により定量した。得ら
れた結果は第７表に示す通りであつた。 表から明らかなように、この酵素は、乳酸アル
ミニウムが存在しないとき、43時間以降、殆ど反
応が進まないのに対し、乳酸ナトリウムが存在す
るときは、長時間活性を保持し、高い分解量を示
した。
0.01M、グルコアミラーゼ0.27単位（ノボ・ジヤ
パン販売）に、乳酸アルミニウムを第７表記載の
量を加え、全量１mlで、60℃で反応させた。対照
として、アルミニウム塩無添加のものを同時にに
反応させた。反応140時間目に生成したグルコー
スをソモギー・ネルソン法により定量した。得ら
れた結果は第７表に示す通りであつた。 表から明らかなように、この酵素は、乳酸アル
ミニウムが存在しないとき、43時間以降、殆ど反
応が進まないのに対し、乳酸ナトリウムが存在す
るときは、長時間活性を保持し、高い分解量を示
した。
【表】
ここで、アミラーゼ活性は以下のようにして測
定した。 0.1M酢酸緩衝液に溶解した２％可溶性澱粉液
（PH5.0）0.5mlに適当量の酵素液を加え、蒸留水
で全量１mlとし、40℃で反応させる。この条件下
で、１分間に１マイクロモルのグルコースに相当
する還元力を生成する酵素量を１単位とした。 実施例 ８ 実施例７において、反応をグルコアミラーゼの
最適PHである4.5、温度60℃で66時間糖化した結
果について記載する。得られた結果は第８表に示
す通りであつた。
定した。 0.1M酢酸緩衝液に溶解した２％可溶性澱粉液
（PH5.0）0.5mlに適当量の酵素液を加え、蒸留水
で全量１mlとし、40℃で反応させる。この条件下
で、１分間に１マイクロモルのグルコースに相当
する還元力を生成する酵素量を１単位とした。 実施例 ８ 実施例７において、反応をグルコアミラーゼの
最適PHである4.5、温度60℃で66時間糖化した結
果について記載する。得られた結果は第８表に示
す通りであつた。
【表】
表から明らかなように、乳酸アルミニウムが存
在したときは、存在しない場合に比べ高いグルコ
ース収量を示した。 実施例 ９ 可溶性澱粉約５％、トリス緩衝液（PH5.5）
0.05M、グルコアミラーゼ0.14単位（ノボ・ジヤ
パン販売）に、硫酸アルミニウムアンモニウムを
３×10-4M添加し、60℃で、反応させた。対照と
して、アルミニウム塩無添加のものを同時に反応
させた。得られた結果を第９表に示す。
在したときは、存在しない場合に比べ高いグルコ
ース収量を示した。 実施例 ９ 可溶性澱粉約５％、トリス緩衝液（PH5.5）
0.05M、グルコアミラーゼ0.14単位（ノボ・ジヤ
パン販売）に、硫酸アルミニウムアンモニウムを
３×10-4M添加し、60℃で、反応させた。対照と
して、アルミニウム塩無添加のものを同時に反応
させた。得られた結果を第９表に示す。
【表】
表から明らかなように、硫酸アルミニウムアン
モニウムを添加したとき、無添加の場合に比べ、
長時間安定して活性を維持できることがわかつ
た。 実施例 10 実施例７において、反応をグルコアミラーゼの
最適PHである4.5、温度60℃で66時間糖化した結
果について記載する。得られた結果は第10表に示
す通りであつた。
モニウムを添加したとき、無添加の場合に比べ、
長時間安定して活性を維持できることがわかつ
た。 実施例 10 実施例７において、反応をグルコアミラーゼの
最適PHである4.5、温度60℃で66時間糖化した結
果について記載する。得られた結果は第10表に示
す通りであつた。
【表】
表から明らかなように、乳酸アルミニウムが存
在したときは、存在しない場合に比べ高いグルコ
ース収量を示した。 実施例 11 可溶性澱粉約５％、トリス緩衝液（PH5.5）
0.05M、グルコアミラーゼ0.14単位（ノボ・ジヤ
パン販売）に、硫酸アルミニウムアンモニウムを
３×10-4M添加し、60℃で反応させた。対照とし
て、アルミニウム塩無添加のものを同時に反応さ
せた。得られた結果を第11表に示す。
在したときは、存在しない場合に比べ高いグルコ
ース収量を示した。 実施例 11 可溶性澱粉約５％、トリス緩衝液（PH5.5）
0.05M、グルコアミラーゼ0.14単位（ノボ・ジヤ
パン販売）に、硫酸アルミニウムアンモニウムを
３×10-4M添加し、60℃で反応させた。対照とし
て、アルミニウム塩無添加のものを同時に反応さ
せた。得られた結果を第11表に示す。
【表】
表から明らかなように、硫酸アルミニウムアン
モニウムを添加したとき、無添加の場合に比べ、
長時間安定して活性を維持できることがわかつ
た。 実施例 12 実施例３で調製した酵素を、グルコアミラーゼ
と併用して液化澱粉の糖化試験を行つた。 DE約12の液化澱粉30％、グルコアミラーゼ
（フインシユガー社製、商品名 Spezyme GA
200）0.03％（／固形分）、α−１，６−グルコシ
ダーゼ0.4単位（／基質ｇ）、塩化カルシウム
0.01M、硫酸アルミニウムアンモニウム５×
10-4Mの組成の下、PH4.5、60℃で糖化反応を行
つた。得られた結果は第12表に示す通りであつ
た。 表から明らかなように、アルミニウム塩を添加
するとα−１，６−グルコシダーゼの安定性が増
加するため、高い収量でグルコースが得られた。
モニウムを添加したとき、無添加の場合に比べ、
長時間安定して活性を維持できることがわかつ
た。 実施例 12 実施例３で調製した酵素を、グルコアミラーゼ
と併用して液化澱粉の糖化試験を行つた。 DE約12の液化澱粉30％、グルコアミラーゼ
（フインシユガー社製、商品名 Spezyme GA
200）0.03％（／固形分）、α−１，６−グルコシ
ダーゼ0.4単位（／基質ｇ）、塩化カルシウム
0.01M、硫酸アルミニウムアンモニウム５×
10-4Mの組成の下、PH4.5、60℃で糖化反応を行
つた。得られた結果は第12表に示す通りであつ
た。 表から明らかなように、アルミニウム塩を添加
するとα−１，６−グルコシダーゼの安定性が増
加するため、高い収量でグルコースが得られた。
【表】
実施例 13
本実施例においては、バシルス・メガテリウム
（Bacillus megaterium）FERM−P7978の生産
するマルトース生成アミラーゼ（特開昭62−
126973）について、アルミニウム塩の効果を調べ
た結果について記載する。本酵素は、澱粉をその
非還元性末端からマルトース単位で加水分解して
α−マルトースを生成する酵素である。 本酵素0.075単位に、可溶性澱粉約５％、燐酸
緩衝液（PH6.0）0.01M、乳酸アルミニウムを第
13表記載の量を加え、全量１mlとして、60℃で反
応させた。経時的に一定量をとり、生成したマル
トースを定量した。得られた結果は第13表に示す
通りであつた。
（Bacillus megaterium）FERM−P7978の生産
するマルトース生成アミラーゼ（特開昭62−
126973）について、アルミニウム塩の効果を調べ
た結果について記載する。本酵素は、澱粉をその
非還元性末端からマルトース単位で加水分解して
α−マルトースを生成する酵素である。 本酵素0.075単位に、可溶性澱粉約５％、燐酸
緩衝液（PH6.0）0.01M、乳酸アルミニウムを第
13表記載の量を加え、全量１mlとして、60℃で反
応させた。経時的に一定量をとり、生成したマル
トースを定量した。得られた結果は第13表に示す
通りであつた。
【表】
表から明らかなように、反応液にアルミニウム
塩を添加したとき、無添加の場合に比べ、高いマ
ルトース収量を示した。 実施例 14 本実施例においては、バシルス・ズブチリス
（Bacillus subtilis）FERM−P5854の生産するマ
ルトトリオース生成酵素について、アルミニウム
塩の効果を調べた結果について記載する。 本酵素0.065単位に、可溶性澱粉５％、燐酸緩
衝液（PH６）0.01M塩化カルシウム0.01M、乳酸
アルミニウムを第17表に記載の量を加え、蒸留水
で、全量１mlとし、50℃で反応させた。45時間目
における生成還元糖をグルコースとして定量した
結果は第14表に示す通りであつた。表から明らか
なように、乳酸アルミニウムの存在下で酵素は安
定化された。
塩を添加したとき、無添加の場合に比べ、高いマ
ルトース収量を示した。 実施例 14 本実施例においては、バシルス・ズブチリス
（Bacillus subtilis）FERM−P5854の生産するマ
ルトトリオース生成酵素について、アルミニウム
塩の効果を調べた結果について記載する。 本酵素0.065単位に、可溶性澱粉５％、燐酸緩
衝液（PH６）0.01M塩化カルシウム0.01M、乳酸
アルミニウムを第17表に記載の量を加え、蒸留水
で、全量１mlとし、50℃で反応させた。45時間目
における生成還元糖をグルコースとして定量した
結果は第14表に示す通りであつた。表から明らか
なように、乳酸アルミニウムの存在下で酵素は安
定化された。
【表】
実施例 15
トリコデルマ（Trichoderuma）属のセルラー
ゼ（近畿ヤクルト(株)製造販売、Ｒ−10）１mg、カ
ルボキシメチルセルロース（CMC）５％、酢酸
緩衝液（PH4.5）0.05M、乳酸アルミニウムを第
15表記載の量加え、蒸留水で全量１mlとし、55℃
で反応させた。反応42および66時間目に一定量を
とり、生成糖をグルコースとして定量した。対照
として、乳酸アルミニウム無添加のものを同時に
反応させた。得られた結果を第15表に示す。
ゼ（近畿ヤクルト(株)製造販売、Ｒ−10）１mg、カ
ルボキシメチルセルロース（CMC）５％、酢酸
緩衝液（PH4.5）0.05M、乳酸アルミニウムを第
15表記載の量加え、蒸留水で全量１mlとし、55℃
で反応させた。反応42および66時間目に一定量を
とり、生成糖をグルコースとして定量した。対照
として、乳酸アルミニウム無添加のものを同時に
反応させた。得られた結果を第15表に示す。
【表】
表から明らかなように、この酵素は乳酸アルミ
ニウムが存在しないとき、42時間目以降におい
て、生成還元糖の増加が認められなかつたが、乳
酸アルミニウムが存在したときは、酵素の安定性
が改善され糖化率の向上が認められた。 実施例 16 実施例15において、乳酸アルミニウムの代わり
に、硫酸アルミニウムアンモニウムを使用し、55
℃で反応させた。得られた結果を第16表に示す。
ニウムが存在しないとき、42時間目以降におい
て、生成還元糖の増加が認められなかつたが、乳
酸アルミニウムが存在したときは、酵素の安定性
が改善され糖化率の向上が認められた。 実施例 16 実施例15において、乳酸アルミニウムの代わり
に、硫酸アルミニウムアンモニウムを使用し、55
℃で反応させた。得られた結果を第16表に示す。
【表】
表から明らかなように、硫酸アルミニウムアン
モニウムが３〜５×10-4M程度の極めて少量存在
することにより、酵素は安定化され、還元糖の著
しい増加が認められた。 実施例 17 実施例15において、基質として、カルボキシル
メチルセルロースの代わりに、アビセル５％を使
用し、55℃で反応させた。得られた結果を第17表
に示す。
モニウムが３〜５×10-4M程度の極めて少量存在
することにより、酵素は安定化され、還元糖の著
しい増加が認められた。 実施例 17 実施例15において、基質として、カルボキシル
メチルセルロースの代わりに、アビセル５％を使
用し、55℃で反応させた。得られた結果を第17表
に示す。
【表】
表から明らかなように、アルミニウム塩が存在
しないとき、67時間目以降還元糖の生成は認めら
れないが、１×10-3M程度の乳酸アルミニウムが
存在したときは、67時間目以降においても還元糖
の生成がみとめられた。
しないとき、67時間目以降還元糖の生成は認めら
れないが、１×10-3M程度の乳酸アルミニウムが
存在したときは、67時間目以降においても還元糖
の生成がみとめられた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 酵素反応を１×10-4〜１×10-2モル濃度の水
溶性アルミニウム塩の存在下で行うことを特徴と
する酵素の熱安定化法。 ２ 反応に関与する酵素がα−１，６−グルコシ
ダーゼである特許請求の範囲第１項記載の酵素の
熱安定化法。 ３ 反応に関与する酵素がアミラーゼである特許
請求の範囲第１項記載の酵素の熱安定化法。 ４ 反応に関与する酵素がセルラーゼである特許
請求の範囲第１項記載の酵素の熱安定化法。 ５ 水溶性アルミニウム塩が無機酸塩である特許
請求の範囲第１，２，３または４項のいずれかに
記載の酵素の熱安定化法。 ６ 水溶性アルミニウム塩が有機酸塩である特許
請求の範囲第１，２，３または４項のいずれかに
記載の酵素の熱安定化法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62262303A JPH01104172A (ja) | 1987-10-16 | 1987-10-16 | 酵素の安定化法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62262303A JPH01104172A (ja) | 1987-10-16 | 1987-10-16 | 酵素の安定化法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01104172A JPH01104172A (ja) | 1989-04-21 |
| JPH0351398B2 true JPH0351398B2 (ja) | 1991-08-06 |
Family
ID=17373912
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62262303A Granted JPH01104172A (ja) | 1987-10-16 | 1987-10-16 | 酵素の安定化法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01104172A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107760664B (zh) * | 2017-11-02 | 2020-06-09 | 江南大学 | 一种提高直链麦芽低聚糖生成酶热稳定性的方法 |
| EP4223884A4 (en) * | 2020-09-29 | 2024-12-11 | Kikkoman Corporation | METHOD FOR IMPROVING THE STABILITY OF A COMPOSITION CONTAINING FLAVIN-DEPENDENT LACTATE DEHYDROGENASE |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL8601092A (nl) * | 1986-04-29 | 1987-11-16 | Philips Nv | Elektrische lamp. |
| JPS62262305A (ja) * | 1986-05-07 | 1987-11-14 | 三菱マテリアル株式会社 | 電気絶縁充填材料 |
| JPH0687365B2 (ja) * | 1986-05-09 | 1994-11-02 | 宇部興産株式会社 | 高誘電率磁器組成物 |
-
1987
- 1987-10-16 JP JP62262303A patent/JPH01104172A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01104172A (ja) | 1989-04-21 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |