JPH01104172A - 酵素の安定化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酵素の安定化方法に関するものである。

（従来の技術） 酵素は中温、中性、常圧付近で効率よく反応を推進する
が、それぞれの酵素には、それぞれ固有の最適ｐＨと最
適温度がある。換言すれば、酵素は最適ｐＨ付近におい
て安定であり、そして、最適温度はその酵素の高温側に
おける安定限界温度を示している。

（発明が解決しようとする問題点） しかるに、酵素を工業的に応用しようとする場合、最適
ｐｌをはずれたところで、利用しなければできるだけ、
高い温度で利用しなければならないことが多い。このた
め、これまで酵素の安定化法、特に、熱安定性を向上す
る方法について、多くの研究が行われてきているが、未
だ普遍的に応用できる方法は知られていない。

（問題点を解決するための手段） 本発明者は澱粉加水分解酵素の一種であるα−１，６−
グルコシダーゼをグルコアミラーゼと併用して澱粉から
高い収量でグルコースを製造するため、α−１，６−グ
ルコシダーゼの安定化法について種々検討してきた結果
、アルミニウム塩が０．０１モル以下の非常に薄い濃度
で、しかも狭い濃度範囲で極めて有効であることを認め
た。そして、この効果は、α−１，６−グルコシダーゼ
に止どまらず、多くのアミラーゼ、セルラーゼ、グルコ
ースイソメラーゼ、プロテアーゼなど種々の酵素の安定
化に適用できることを認めた。本発明はこの知見に基づ
いてなされたものである。

すなわち、本発明は酵素反応をアルミニウム塩の存在下
でおこなうことを特徴とする酵素の熱安定化法に関する
ものである。

（発明の効果） 本発明は多（の酵素に適用することができるが、具体例
として、α−１，６−グルコシダーゼの安定化について
詳説する。

α−１，６−グルコシダーゼは澱粉またはその派生物中
のα−１，６−グルコシド結合あるいは（および）プル
ランのα−１，６−グルコシド結合などを加水分解する
酵素の総称であり、その基質特異性の差からプルラナー
ゼあるいはインアミラーゼと呼ばれる酵素がある。

α−■、６＝グルコシダーゼはβ−アミラーゼと併用し
て、澱粉からマルトースを収量よく製造するのに使用し
たり、また、最近、酵素法による澱粉からのグルコース
の製造において、グルコアミラーゼと併用して、グルコ
ースを増収するために使用されている。

α−１，６−グルコシダーゼは、バシルス属、り産され
ることが知られているが、多くのα−１，６−グルコシ
ダーゼは、最適ａｌ１５〜７、最適温度５０℃前後にあ
る。一方、グルコアミラーゼの最適ｐ＋＋は４．５付近
、温度６０℃にあって、それらの作用条件は一致してい
ない。

そこで、現在、工業的に製造されている、クレブシラ属
、シュードモナス属、バシルス属など細菌の生産スるα
−１，６−グルコシダーゼについて、その安定化法につ
いて検討してきた結果、塩化アルミニウム、硫酸アルミ
ニウム、硫酸アルミニウムアンモニウム、乳酸アルミニ
ウムなどの水溶性のアルミニウム塩が、非常に薄い濃度
で、しかも極めて狭い濃度範囲で添加するとき、該酵素
の安定化が著しい効果のあることを認めた。そして、グ
ルコアミラーゼの最適作用条件であるｐＨ４，５、湯度
６０℃においても、長時間作用できることがわかった。

例えば、プルランを基質として、ｐＨ４，５，６０℃で
反応させるとき、多くのバシルル程度の、乳酸アルミニ
ウムを存在させたときは、少なくとも３日間活性を保持
した。

本発明において使用されるアルミニウム塩としては、例
えば、塩化アルミニウム、硫酸アルミニウム、硫酸アル
ミニウムアンモニウム、硝酸アルミニウム、硫酸アルミ
ニウムカリウムなどの無機酸塩のほか、酢酸アルミニウ
ム、乳酸アルミニウムなどの有機酸塩など、通常、水溶
性の塩が挙げられる。しか（、アルミニウム塩は強い酸
性を示しくｐＨ２〜４）、α−１，６−グルコシダーゼ
など、多（の酵素は直ちに失活するため、ｐＨを低くと
も４以上に上げる必要がある。しかし、ｐｉを上げると
アルミニウム塩は、分解して、水不溶性の水酸化アルミ
ニウムを沈澱するという問題がある。このため、該酵素
に安定なｐＨで、水溶性を維持できるアルミニウム溶液
について検討してきた結果、塩化アルミニウム、硫酸ア
ルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、硫酸アンモニ
ウムア在させて、ｐＨを調整するか、あるいは乳酸アル
ミニウムの溶液をｐＨ！１整して使用するのが適当であ
ることを認めた。特に、乳酸アルミニウムを使用すると
きは、高濃度の溶液を調製することができる。いずれの
アルミニウム塩も反応液に対し、１ｘ　ｌ　Ｑ−４〜１
×１０−”モルの範囲で存在させるとき、無添加の場合
に比べ、著しく酵素を熱安定化する。下記の表はバシル
ス拳ズブチルスの生産するプルラナーゼを、プルラン約
５％、乳酸アルミニウムを表記の量加え、ｐＨ４，５、
温度６０℃で２０時間反応させたときに生成した還元糖
を、グルコースとして表したものである。乳酸アルミニ
ウムは０．５ＸｌＯ−’モル濃度以上で効果を表し、は
ぼ１×１０−’〜７ＸＩＯ”’モルを最適濃度とするピ
ークを示している。アルミニウム塩は反応時に添加して
もよく、また酵素剤にあらかじめ添加処理しておいても
よい。後者の場合、酵素を長期間保存する場合により効
果的である。

表　プルラナーゼの熱安定性に対するアルミニウム塩の
影響 乳酸アルミニウム　　還元糖生成量 （ｘ　１０−’Ｍ）　　　　　　　（ｍｇ／ｍ１）０３
．６ ０、５　　　　　　　　　４．５ １　　　　　　　　　６．０ ５７．５ １０　　　　　　　　　１５．１ ２０　　　　　　　　　１６．１ ３０　　　　　　　　　１６．５ ４０　　　　　　　　　１６．７ ５０　　　　　　　　　１７、８ ７０　　　　　　　　　１７、４ ８０　　　　　　　　　９、９ ９０　　　　　　　　　９、１ １００　　　　　　　　　７．０ 本発明はα−１，６−グルコシダーゼのみでなく、多く
のアミラーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、
グルコースイソメラーゼなど多種の酵本発明の詳細な説
明するが、本発明は、これら実施例に限定されるもので
ない。

実施例　ｌ クレブシラ・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｅ）の生産するプルラナーゼ（英国、Ａ
ＢＭ社製、商品名Ｐｕｌｌｕｚｙｍｅ）　０　、　３　
単位に、プルラン１０　％、酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）
０．１Ｍ。

塩化アルミニウム３Ｘ１０−’Ｍになるように加え、全
量を水で２ｍｌとし、６０℃で反応させた。対照として
、塩化アルミニウム無添加のものを同時に反応させた。

そして、経時的に一定量をとり、生成した還元糖（マル
トトリオース）をソモギー・不ルソン法によりグルコー
スとして定量した。得られた結果を第１表に示す。

反応時間　　　−゛還元糖量（ｍｇ／ｍ１）（時）　　
　　対照　　塩化アルミ添加１　　　　　１、０８　　
　　２．０７３　　　　　１．１１　　　　３．３０５
　　　　　１、１０　　　　３．８５２４　　　　　１
．１１　　　　６．６４４ｇ　　　　　　１．１１　　
　　７．５５表から明らかなように、この酵素は塩化ア
ルミニウムが存在しないとき、ｐＨ４，５，６０℃とい
う条件下では、１時間以内に失活するが、３Ｘ１０−４
モル量の塩化アルミニウムが存在したときは、酵素の安
定性が著しく改善され、高い分解性を示した。

ここで、α−１，６−グルコシダーゼ活性は以下のよう
にして測定した。

０．１Ｍ酢酸緩衝液に溶解した２％プルラン液（ｐＨ５
，０）０．５＋ｓｌに適当量の酵素液を加え、蒸留水で
全ｆｆ１ｌｌとし、４０℃で反応させる。この条件下で
、１分間に１マイクロモルのグルコースにコーン・ステ
イープ・リカー１０％、乳糖２％、燐酸二カリ０．３％
、硫酸マグネシウム（７水塩）０．１％、硝酸ナトリウ
ム０．２５％、ツイーン６００．３％、硫酸銅５Ｘ１０
−’Ｍ、塩化マンガン２．５Ｘ１０−”Ｍ、塩化カルシ
ウムｌＸ１０−’Ｍ、硫酸亜鉛１×１０−’Ｍ、硫酸第
−鉄１×１０−５Ｍからなる培地（ｐ［１７，５）を、
常法によす殺菌後、バシルス・ズブチリスＴＵ（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＴＬＩ）　Ｆ　Ｅ　ＲＭ
　−ＢＰ　６８４を接種し、３０℃で４日間振盪培養し
た。培養後、遠心分離して得た上澄に、硫酸アンモニウ
ムを７０％飽和になるように加えて酵素を沈澱させ、遠
心分離により回収し、蒸溜水で透析したものを酵素液と
して使用した。

木酢素０．０５単位を、プルラン５％、酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ４，’５）Ｏ，ＯＩＭ、塩化カルシウムＩＸ　Ｉ　Ｑ
−”Ｍ、乳酸フルミニラム１×１０−’　〜ＬＸ１０−
”Ｍ加え、全ｆｉｌｅｌで６０℃で反応させた。

反応４２おＪＯ’　５６時間口に、生成した還元糖をグ
ルコースと１−１□定量した。得られた結果を第２表に
示す。

第　　２　　表 乳酸アルミニウム　　反応時間（時） （Ｘ　１０−’Ｍ）　　　　　　４２　　　６６０　　
　　　　　　　　　　　１．５９　　　１．５９０．５
　　　　　　３．４９　　５．２１１　　　　　　　８
．７１　　９．９９２　　　　　　　９．２５　１．２
．７３　　　　　　　　　　　　９．３３　　１２．３
４　　　　　　　１０．９２　１２．９５　　　　　　
　９．８０　１２．９ 表から明らかなように、乳酸ナトリウムを使用した場合
、比較的広い濃度範囲で効果を示すが、最適濃度は４Ｘ
１０−”Ｍ前後に認められた。

実施例３ 本実施例では、α−１，６−グルコシダーゼとして、シ
ュードモナス・アミロデラモサ（Ｐｓｕｕｄｏ−１ｌｌ
ｏｎａｓ　ａｍｙｌｏｄｅｌａＩＩｌｏｓａ）のイソア
ミラーゼを用いて６−グルコシド結合）を分解すること
ができるが、プルランのα！−１，６−グルコシド結合
は分解することはできない。また、この酵素の最適ｐＨ
は３〜４、最適温度は５２°Ｃ（ｐＨ３，５，Ｉ　Ｏ分
反応）にあり、６０℃では急速に失活する［Ｋ、　Ｙｏ
ｋｏｂａｙａ−ｓｉ他、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　
Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ　２１２．４５８（１
９７０）］。本酵素の精製標品は生化学工業（株）より
入手することができる。

本酵素に対するアルミニウム塩による安定性を試験する
ため、植物β−アミラーゼと併用して、澱粉からのマル
トースの生成試験を行った。この場合、β−アミラーゼ
による影響を無くするために、β−アミラーゼは基質に
対して十分量を加えた。

可溶性澱粉５％、酢酸緩衝液（ｐＨ５、０）０．０１Ｍ
、大麦β−アミラーゼ（フィンランド国、フィンシュガ
ー社製、商品名Ｓｐｅｚｙｍｅ　ＢＢＡ）４．２単位、
前記シュードモナス属イソアミラーゼ１００単位、硫酸
アルミニウムアンモニウム、照として、アルミニウム塩
無添加で同時に反応させた。

経時的に一定量をとり、生成した還元糖（マルトース）
をソモギー・ネルフン法により定量した。

得られた結果を第３表に示す。

表から明らかなように、アルミニウム塩が存在したきは
、存在しない場合にくらべ、長時間にわたり活性が維持
され、高い収量でマルトースが得られた。

第　　３　　表 アルミ塩　β−アミ　イソア　反応時間（時）無添加　
　　　＋　　　　　　　２６．４　３０．８ＡＩＮＨ＋
（ＳＯ４）ｔ ３　　　　　　＋　　　　＋　　　　２５．０３２．１
５　　　　　　　　　　　＋　　　　　　　＋　　　　
　　３ａ、ｏ　　　３ａ、２５　　　　　　　　　　　
＋　　　　　　＋　　　　　　　３３．２　　３７．８
１０　　　　　　　　　　＋　　　　　　＋　　　　　
　３２．２３６．８実施例　４ 可溶性澱粉約５％、酢酸緩衝液（ｐＨ５）　０．　Ｏ１
Ｍ１グルコアミラーゼ０．２７単位（ノボ・ジャパン販
売）に、乳酸アルミニウムを第４表記載の量を加え、全
ｆｆ１１ｍ１で、６０℃で反応させた。対照として、ア
ルミニウム塩無添加のものを同時に反応させた。反応１
４０時間時間口成したグルコースをソモギー・ネルフン
法により定量した。

得られた結果は第４表に示す通りであった。

表から明らかなように、この酵素は、乳酸アルミニウム
が存在しないとき、４３時間以降、殆ど反応が進まない
のに対し、乳酸ナトリウムが存在するときは、長時間活
性を保持し、高い分解率を示した。

（時）　　　　（ｘ　１０−３Ｍ）　　　　（ｍｇ／ｍ
１）８　　　　　　　　　　　　２３．２ ４３　　　　　　０、５　　　　　　　　　２３．２１
　　　　　　　　　　　２６．４ ２　　　　　　　　　　　２８、９ ３　　　　　　　　　　　２６、１ １３９　　　　　　０、５　　　　　　　　　２８．０
１　　　　　　　　　　　３３、６ ２　　　　　　　　　　３９、７ ここで、アミラーゼ活性は以下のようにして測定した。

０．１Ｍ酢酸緩衝液に溶解した２％可溶性澱粉液（ｐＨ
５，０）０．５ｍｌに適当量の酵素液を加え、蒸留水で
全ｆｌｔ１ｍｌとし、４０°Ｃで反応させる。この条件
下で、１分間に１マイクロモルのグルコースに相当する
還元力を生成する酵素量を１単位とした。

実施例５ 実施例４；３二おい：て、反応をグルコアミラーゼの最
ｊａｐＨテアＺｒ　ｉｐ・二１１５、ｉ、Ａｒ１６０°
Ｃテロ　６　時１ｉｆｌ　糖化した結果について記載す
る。得られた結果は第５表に示す通りであった。

第　　５　　表 乳酸アルミニウム　　グルコース生成量（Ｘ　１０−’
Ｍ）　　　　　　　　（＋ｎｇ／ｍ１）０　　　　　　
　　　　３３、３ １　　　　　　　　　　４０．３ ３　　　　　　　　　　３８、９ 表から明らかなように、乳酸アルミニウムが存在したと
きは、存在しない場合に比べ高いグルコース収量を示し
た。

添加し、６０°Ｃで反応させた。対照として、アルミニ
ウム塩無添加のものを同時に反応させた。得られた結果
を第６表に示す。

（ＸＩＯ−３Ｍ）　　　　　　１　　　　６　　　２３
　　　１２００　　　　　　　　２．１２　　６．９６
　１２．０　　１７．９３　　　　　　　　２．８９　
　１２．１　　２３．６　３３．３表から明らかなよう
に、硫酸アルミニウムアンモニウムを添加したとき、無
添加の場合に比べ、長時間安定して活性を維持できるこ
とがわかり実施例７ 本実施例においては、バシルス・メガテリウム（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）Ｆ　Ｅ　ＲＭ−Ｐ
　７９７８の生産するマルトース生成アミラーゼ（特開
昭６２−１２６９７３）について、アルミニウム塩の効
果を調べた結果について記載する。本酵素は、澱粉をそ
の非還元性末端からマルトース単位で加水分解してα−
マルトースを生成する酵素である。

本酵素０．０７５単位に、可溶性澱粉約５％、燐酸緩衝
液（ｐＨ６，０）Ｏ，ＯＩＭ、乳酸アルミニウムを第７
表記載の量を加え、全量１ｒ６１として、６０℃で反応
させた。経時的に一定量をとり、生成したマルトニスを
定積した。得られた結果は第７表に示す通りであった。

第　　７　　表 乳酸アルミニウム　　　　反応時間（時）（Ｘ　１０−
’Ｍ）　　　　　　１．５　　２．５　　１８０　　　
　　　１１．７　１９．８　３１．８１　　　　　　１
２．９　２２．０　４０．６２　　　　　　１２．５　
２１．０　３８．０表から明らかなように、反応液にア
ルミニウム塩を添加したとき、無添加の場合に比べ、高
いマルトース収１を示した。

実施例８ 本実施例においては、バシルス・ズブチリス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）Ｆ　Ｅ　ＲＭ　−Ｐ　５
８５４の生産するマル、トトリオース生成酵素について
、アルミニウム塩の効果を調べた結果について記載する
。

本酵素０．０６５単位に、可溶性澱粉５％、燐酸緩衝液
（ｐＨ６）０．０１Ｍ塩化カルシウム０゜０１Ｍ、乳酸
アルミニウムを第１１表に記載の量を加え、蒸留水で、
全量１ｍｌとし、５０°Ｃで反応た。表から明らかなよ
うに、乳酸アルミニウムの存在下で酵素は安定化された
。

第　　８　　表 乳酸アルミ　　　　生成還元糖 ０３．６ ０、５　　　　　　　　４．０ １　　　　　　　　　　　　　　４．８実施例９ トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｕｍａ）属のセルラ
ーゼ（近畿ヤクルト（株）製造販売、Ｒ−１０）　１　
ｍｇ、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）５％、酢
酸緩衝液（ｐＨ４，５）０．０５Ｍ、乳酸アルミニウム
を第９表記載の量加え、蒸留水で全ｆｆ１１ｍ１とし、
５５０Ｃで反応させた。反応４２および６６時間目に一
定量をとり、生成糖をグルコースとして定量した。

対照として、乳酸アルミニウム無添加のものを同０　　
　　　　　　　　１９．４　　　　　　１９．４１　　
　　　　　　　　１９．９　　　　　　２２．２２　　
　　　　　　　　１９．８　　　　　　２５．３３　　
　　　　　　　　１９、７　　　　　　２３．９表から
明らかなように、この酵素は乳酸アルミニウムが存在し
ないとき、４２時時間量降において、生成還元糖の増加
が認められなかったが、乳酸アルミニウムが存在したと
きは、酵素の安定性が改善され糖化率の向上が認められ
た。

実施例１０ 実施例９において、乳酸アルミニウムの代わりに、硫酸
アルミニウムアンモニウムを使用し、５５°Ｃで反応さ
せた。得られた結果を第１０表に示す。

０　　　　　　　　　８．３　　　　　　８．３３　　
　　　　　　１１．０　　　　　１１．６表から明らか
なように、硫酸アルミニウム　アンモニウムが３〜５Ｘ
１０−’Ｍ程度の極めて少量存在することにより、酵素
は安定化され、還元糖の著しい増加が認められた。

実施例１１ 実施例９において、基質として、カルボキシルメチルセ
ルロースの代わりに、アビセル５％を使用し、５５℃で
反応させた。得られた結果を第１１表に示す。

第　　１１　　表 乳酸アルミニウム　　　反応時間（時）（Ｘ　１０−’
Ｍ）　　　　　４３　　６７　１１５０　　　　　１０
．６　１１．１　１１．１３　　　　　１２．５　１３
．３　１４．９られないが、１×１０−’Ｍ程度の乳酸
アルミニウムが存在したときは、６７時間目以降におい
ても還元糖の生成がみとめられた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 酵素反応を１×１０＾−＾４〜１×１０＾−＾２モル濃
   度の水溶性アルミニウム塩の存在下で行うことを特徴と
   する酵素の熱安定化法。