JPH0353879A - セファロスポリンｃのグルタリル―７―アミノ―セファロスポラン酸への酵素酸化の改良法 - Google Patents
セファロスポリンｃのグルタリル―７―アミノ―セファロスポラン酸への酵素酸化の改良法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明は、セファロスボリンＣをグルタリル７−アミノ
セファロスポラン酸に酵素酸化する方法の改良法、さら
に詳しくは反応系中に存在するカタラーゼおよびエステ
ラーゼ酵素を不活性化する方法に関する。
セファロスポラン酸に酵素酸化する方法の改良法、さら
に詳しくは反応系中に存在するカタラーゼおよびエステ
ラーゼ酵素を不活性化する方法に関する。
セファロスポリンＣ （Ｃ ｅｐｂ Ｃ ）のグルタリ
ル７−アミノセファロスボラン酸（グルタリル−７−Ａ
ＣＡ）への酵素酸化は、研究室スケールでは可能てある
ことか示されていた［例えば、アーノルト等（Ａｒｎｏ
ｌｄ ｅｔ ａｌ、）、米国特許Ｎ ｏ．３， ８２１
， ２０９、およびフィルテス等（Ｆｉｌｄｅｓ ｅｔ
ａｌ．）、米国特許Ｎｏ．３， ８２１， ２０９を
参照：これらは本明細書中の一部を構成する］。しかし
、工業スケール生産への戊功裏の、かつ、経済的に実現
可能なスケールアンプはこれまで問題を含んでいた。 グルタリル−７ −Ａ Ｃ Ａを７ −Ａ Ｃ Ａに変
える酵素か知られているので、上記の変換によってセフ
ァロスポリンＣから７−アミノセファ口スポラン酸（７
ＡＣＡ）までの完全な酵素法ルートの可能性が開かれ、
従って上記の変換は商業的な重要性が大きい［例えば、
シブヤ等（Ｓｈｉｂｕｙａ ｅｔ ａｌ．，Ａｇｒｉｃ
．Ｂｉｏ１． Ｃｈｅｍ． ， ４５（７）， １５６
１−１５６７． １９８１）、 「７β−（４−カルボ
キシブタンアミド）セファロスポラン酸アシラーゼ産生
細菌の単離および性質」を参照］。さらに、７ −Ａ
Ｃ Ａへの酵素法ルートの他の利点は、水性の製造混合
物を利用することによって、製造工程で生じる危険な溶
媒廃棄物を最少限にし得ることである。
ル７−アミノセファロスボラン酸（グルタリル−７−Ａ
ＣＡ）への酵素酸化は、研究室スケールでは可能てある
ことか示されていた［例えば、アーノルト等（Ａｒｎｏ
ｌｄ ｅｔ ａｌ、）、米国特許Ｎ ｏ．３， ８２１
， ２０９、およびフィルテス等（Ｆｉｌｄｅｓ ｅｔ
ａｌ．）、米国特許Ｎｏ．３， ８２１， ２０９を
参照：これらは本明細書中の一部を構成する］。しかし
、工業スケール生産への戊功裏の、かつ、経済的に実現
可能なスケールアンプはこれまで問題を含んでいた。 グルタリル−７ −Ａ Ｃ Ａを７ −Ａ Ｃ Ａに変
える酵素か知られているので、上記の変換によってセフ
ァロスポリンＣから７−アミノセファ口スポラン酸（７
ＡＣＡ）までの完全な酵素法ルートの可能性が開かれ、
従って上記の変換は商業的な重要性が大きい［例えば、
シブヤ等（Ｓｈｉｂｕｙａ ｅｔ ａｌ．，Ａｇｒｉｃ
．Ｂｉｏ１． Ｃｈｅｍ． ， ４５（７）， １５６
１−１５６７． １９８１）、 「７β−（４−カルボ
キシブタンアミド）セファロスポラン酸アシラーゼ産生
細菌の単離および性質」を参照］。さらに、７ −Ａ
Ｃ Ａへの酵素法ルートの他の利点は、水性の製造混合
物を利用することによって、製造工程で生じる危険な溶
媒廃棄物を最少限にし得ることである。
グルタリル−７ −Ａ Ｃ Ａを良好な収率て得るため
３ には、カタラーセ活性の全てかＩ）−アミノ酸オキンタ
ーセを含む反応混合物から除去されることか必須である
ことか知られていた。」二記の転換において、七ファロ
スボリンＣはＤ−アミノ酸オキシターセと反応して熱的
に不安定なα−ケ１・ アジボイル７ −Ａ Ｃ Ａ中
間体を生成し、これか同時に生威した過酸化水素によっ
てその場で酸化されて所望のグルタリル−７ −Ａ Ｃ
Ａを勾える。しかし、天然のカタラーセ酵素は過酸化
水素を破壊するように作用する。従って、酸化前にカタ
ラーセを不活性化する手段を講しないと、α−ケＩ・
アシボイル中間体は分解し、それによって所望のグルタ
リル７ −Ａ Ｃ Ａの収量か減少することかわかって
いた。 この汚染物質をクロマトグラフィーによって除去するこ
とは可能であるが、工業スケールでの生産においては、
この規模のクロマＩ・グラフィーは実用的なものではな
い。従って、ｎ１１ｊ−の実際的な解決法はカタラーセ
を何等かの方法によって選択的に不活性化することてあ
る。 他では、アスコルビン酸、３−アミノー１，２．４４ トリアゾール、シアン化ナトリウム、酢酸ナトリウム、
キ酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、またはアジ化ナト
リウムなどのカタラーセ阻害物質を使用することの可能
性が報告されていた。これらの阻害物質の中では、アジ
化ナトリウムが実際に使用されたときに十分に作用する
唯一のものである。しかし、アシ化ナトリウムを用いた
ときの重大な欠点の１つは、最終産物に持ち越され得る
３−アジドメチル−３−セフエム副産物の生成である。 極めて毒性の高いアンドイオンが恐らくは患者に投与し
たときに放出されるので、このアジト不純物は医薬製剤
に受け入れられるものでは決してない。
３ には、カタラーセ活性の全てかＩ）−アミノ酸オキンタ
ーセを含む反応混合物から除去されることか必須である
ことか知られていた。」二記の転換において、七ファロ
スボリンＣはＤ−アミノ酸オキシターセと反応して熱的
に不安定なα−ケ１・ アジボイル７ −Ａ Ｃ Ａ中
間体を生成し、これか同時に生威した過酸化水素によっ
てその場で酸化されて所望のグルタリル−７ −Ａ Ｃ
Ａを勾える。しかし、天然のカタラーセ酵素は過酸化
水素を破壊するように作用する。従って、酸化前にカタ
ラーセを不活性化する手段を講しないと、α−ケＩ・
アシボイル中間体は分解し、それによって所望のグルタ
リル７ −Ａ Ｃ Ａの収量か減少することかわかって
いた。 この汚染物質をクロマトグラフィーによって除去するこ
とは可能であるが、工業スケールでの生産においては、
この規模のクロマＩ・グラフィーは実用的なものではな
い。従って、ｎ１１ｊ−の実際的な解決法はカタラーセ
を何等かの方法によって選択的に不活性化することてあ
る。 他では、アスコルビン酸、３−アミノー１，２．４４ トリアゾール、シアン化ナトリウム、酢酸ナトリウム、
キ酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、またはアジ化ナト
リウムなどのカタラーセ阻害物質を使用することの可能
性が報告されていた。これらの阻害物質の中では、アジ
化ナトリウムが実際に使用されたときに十分に作用する
唯一のものである。しかし、アシ化ナトリウムを用いた
ときの重大な欠点の１つは、最終産物に持ち越され得る
３−アジドメチル−３−セフエム副産物の生成である。 極めて毒性の高いアンドイオンが恐らくは患者に投与し
たときに放出されるので、このアジト不純物は医薬製剤
に受け入れられるものでは決してない。
本発明は、セファロスポリンＣを酵素酸化してグルタリ
ル−７ −Ａ Ｃ Ａを得る際の、カタラーセ活性の減
少化という長い間の問題の解決法を提供するものである
。本発明によれば、水中、室温で、１’ｒｉｇｉｎｏｐ
ｓｉｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓの透過性にした全細胞ま
たは細胞不含の抽出物を塩基で処理してｐＨ約１■〜約
１２とすることによって、Ｄ−アミノ酸オキシターゼ酵
素の存在下でカタラーセ活性を不可逆的に不活性化する
ことができる。最も重要なことは、この処理か所望のオ
キシターゼ醇素に全く影響を及ぼさないことである。 さらに、これまで記載されたことのないエステラーゼ酵
素を、Ｔｒｉｇｉｎｏｐｓｉｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ
の全細胞をアセトン／水で処理することによって不活性
化することもできる（細胞を透過性にするようにも作用
する）。、エステラーゼ酵素は、そこに生成したα−ケ
トアジボイル７ −Ａ Ｃ Ａ中間体ならびにセファロ
スポリンＣおよびグルタリル−７−ＡＣ八を３−デスア
セチル形（対応ずる量のデスアセチルグルタリル−７
−Ａ Ｃ Ａに導く）に変換するので、この、エステラ
ーゼ酵素の不活性化は重要である。 本発明の１つの態様によれば、ＣｅｐｈＣをグルタリル
−７ −Ａ Ｃ Ａに酵素酸化する際に使用する前に、
Ｔｒｉｇｉｎｏｐｓｉｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓの全細
胞をアセトン／水のｕ合液てスラリー化ずることからな
る、デスアセチルグルタリル−７−ＡＣ’Ａを実質的に
含まないグルタリル−７ −Ａ Ｃ Ａの製造方法が提
供される。即ち、Ｔｒｉｇｉｎｏｐｓｉｓ ｖａｒｉａ
ｂｉｌｉｓの全細胞または細胞不含の抽出物をアセトン
／水で処理することからなる、エステラーゼ酵素の不活
性化方法か提供される。 また、本発明は、Ｄ−アミノ酸オキシダーセとカタラー
ゼの水性混合液のｐＨを約ｌ１〜約１２のｌ）Ｈまで高
めることからなる、Ｄ−アミノ酸オキンターセ酵素の存
在下にカタラーセ酵素を不活性化する方法を提供するも
のである。 さらに、本発明は、Ｃｅｐｌ＋Ｃをグルタリル−７ＡＣ
Ａに酵素酸化する際にＴ ｒｉｇｉｎｏｐｓｉｓ ｖａ
ｒｉａｂｉ１ｉｓの透過性にした全細胞を利用する前に
、Ｔｒｉｇｉｎｏｐｓｉｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓの透
過性にした全細胞または細胞不含の抽出物を塩基で処理
してｐＨ約１１〜約１２にすることからなる、セファロ
スポリンＣをグルタリル〜７ −Ａ Ｃ Ａに酵素変換
する方法を提供するものである。 これとは別に、本発明のこの態様を、オキシダーゼおよ
びカタラーセを含有するＴ ｒｉｇｉｎｏｐｓｉｓ ｖ
７ ａｒｉａｂｉｌｉｓの細胞不含の抽出物によるセファロ
スボリンＣのグルタリル７ −Ａ Ｃ Ａへの変換に適
用することがてきる。そのような細胞不含の抽出物は、
通常の方法、例えば溶解または細胞の水性１芭濁液の音
波処理によって得られる。次いで、細胞不含の抽出ｌ夜
を、全細胞について上記したように処理する。 次いで、上記の全細胞のｐＨを硫酸などの希釈した酸に
よって約７に調節し、ＣｅｐｈＣのグルタリル−７ −
Ａ Ｃ Ａへの酵素酸化に直接使用することができる。 上記の方法において使用するのに適当なＴ ｒｉｇｉｎ
ｏｐｓｉｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓの全細胞は、従来技
術の方法を用いて得ることかできる。また、Ｔ ｒｉｇ
ｉｎｏｐｓｉｓｖａｒｉａｂｉｌｉｓは、培養物番号Ｃ
ＢＳ ４０９５のもと、Ｃｅｎｔｒａｌ Ｂｕｒｅ
ａｕ ｖｏｏｒ ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒ Ｂａ
ａｒｎ， Ｈ ｏｌ ｌａｎｄから人手することかでき
る。 上記の方法においては、Ｔ ｒｉｇｉｎｏｐｓｉｓ ｖ
ａｒｉａｂｉ１ｉｓの全細胞ペーストを９０％〜５０％
の水／アセトン（好ましくは２：１、ｖ：ｖ）Ｕ合液で
スラリー８ 化し、Ｄｏｗ Ａｎｔｉｆｏａｍ ＡＴＭなとの／ｉ！
ｌ泡剤で処理する。通常、この混合物を２０〜２５゜Ｃ
で約２時間撹拌する。この方法によって、エステラーゼ
活性の９０％以上が除かれ、見かけのオキシダーゼ活性
が約１０倍に増加する。アセトンを、蒸発によって、ま
たはセラミックス上の透濾過またはあらゆる種類の交差
フローフィルターによって除去することかできる。また
、この方法は細胞を透過性にするように働く（あるいは
、他で記載されているように、細胞を「活ｆ生化する」
ように）。従来技術の方法は、特にアセトンによって透
過性にすることを教示しているが、エステラーゼの存在
およびその３−デスアセチル−７ −Ａ Ｃ Ａ不純物
の同時生産への寄与はここで初めて認識されたものであ
る。即ち、全細胞を透過性にするこの従来技術の方法は
、今では、これまで認識されていなかったエステラーゼ
不活性化という側面をも有しているのである。 次に、細胞／水のスラリーをアルカリ金属水酸化物（水
酸化ナトリウム、水酸化カリウムなど）、または他の普
通の塩基でｐＨが約１１〜１２になるまで処理し、この
混合物を２０〜２５゜Ｃて２時間撹拌する。水酸化ナト
リウムは約２規定の濃度で用いるのか好ましい。この方
法によって、オキシダーゼ活性に影響を及ぼすことなく
、検出可能なカタラーゼ活性の全てが除去される。次い
で、この反応混合物を２０％硫酸などの希釈酸によって
約７に調節する。 次いて、この細胞／水のスラリーをＣｅｐｈＣのグルタ
リル−７ −Ａ Ｃ Ａへの酊素酸化に向接使用するこ
とかできる。通常は、Ｔ ｒｉｇｉｎｏｐｓｉｓ ｖａ
ｒｉａｂｉ１ｉｓのエステラーゼ／カタラーゼ−不活性
化した全細胞を使用するパイロットプラントのスケール
で９０％±２％の収率を得ることかできる。 実験の部 実施例１ 一般的方法 Ｔｒｉｇｉｎｏｐｓｉｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓの全細
胞を用いるＣｅｐｈＣの酸化 湿ったＴ ｒｉｇｉｎｏｐｓｉｓ細胞ペースト（ １
． ４ ｋｇ；乾燥重量０．４２ｋｙ）、水（２ １
Ｑ）、アセトン（１０８Ｑ）、およひＤｏｗ Ａｎｔｉ
ｆｏａｍ ＡＴＭ（２ｚＣ）の混合物を２０〜２５゜Ｃ
で２時間撹拌した。通常、この処理によって、、エステ
ラーゼ活性の〉９０％か除去され、見かけのオキシター
セ活性か１０倍に増加する。アセトンは、真空下の蒸発
によって、まｔこは５７： ｌ’．フローフィノレター
に、上る透＃ｔ’ｌ ；ｌ；ｒ ｌこまって除去するこ
とができる。 次いで、細胞／水スラリーのｐＨを２Ｎ水酸化ナトリウ
ムで１１ ０に調節し、この反応ｄ合物を２０〜２５゜
Ｃで２時間撹拌した。この処理によって検出可能なカタ
ラーセ活性の全てを除去した。 ２時間後に２０％硫酸によってｐＨを７に調節した。１
．４ｋｌ？のナ１−リウムＣｅｐｈ Ｃ（Ｃｅｐｈ Ｃ
ならびに他の塩を用いることもできる）、およびＤｏｗ
Ａｎｔｉｆｏａｍ Ａ”と上記の細胞／水スラリーの混
合物を純酸素の吹き込みによって処理して反応ｄ合物を
酸素で飽和させた。温度は２３゜Ｃに、ｐＨは７．１に
保った。通常、反応は酵母細胞の比活性に依存して６０
〜１２０分て完結ずる。反応か完結したら、反応ｄ合物
をセラミック交差フローフィルターで元の容量の１／３
まて濃縮し、次いて１容量の水で透濾過した。濃縮中は
反応α合物に窒素を吹き込んで酵素活性の保存を助けた
。透過物は生成物として保存し、一方、ヘ１３縮した細
胞スラリーは再使用のために再刊川した。 尖胤例２ 上で用いた方法と同様の方法によってアセ１−ン／水で
透過性にしておいたＴ ｒｉｇｉｎｏｐｓｉｓ ｖａｒ
ｉａｂｉ１ｉｓの湿ったペースト（１２ｇ試料）を水（
５０１Ｉ１２）でスラリー化した。次いて、２ＮＮａＯ
Ｈてｐ Ｉ−１を１１に調節し、反応混合物を室温で１
時間４５分撹拌した。次に、反応混合物のｐ Ｉ−１を
ＩＮＨＣＣて６．５に調節し、全細胞をＣｃｐｌ＋Ｃの
グルタリル−７ −Ａ Ｃ Ａへの酵素変換に用いた。 次いで、反応屁合物中に純粋な酸素を吹き込みなから、
全細胞を水（３００ｉＱ）およびナトリウムＣｅｐｈ
Ｃ（１ ４．０ ４９：約８４％の純度）と共ニテスラ
リー化した。７２分後に後処理すると、９２８％（その
場での収率）のグルタリル−７ −Ａ Ｃ Ａかこの実
験によって得られた。
ル−７ −Ａ Ｃ Ａを得る際の、カタラーセ活性の減
少化という長い間の問題の解決法を提供するものである
。本発明によれば、水中、室温で、１’ｒｉｇｉｎｏｐ
ｓｉｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓの透過性にした全細胞ま
たは細胞不含の抽出物を塩基で処理してｐＨ約１■〜約
１２とすることによって、Ｄ−アミノ酸オキシターゼ酵
素の存在下でカタラーセ活性を不可逆的に不活性化する
ことができる。最も重要なことは、この処理か所望のオ
キシターゼ醇素に全く影響を及ぼさないことである。 さらに、これまで記載されたことのないエステラーゼ酵
素を、Ｔｒｉｇｉｎｏｐｓｉｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ
の全細胞をアセトン／水で処理することによって不活性
化することもできる（細胞を透過性にするようにも作用
する）。、エステラーゼ酵素は、そこに生成したα−ケ
トアジボイル７ −Ａ Ｃ Ａ中間体ならびにセファロ
スポリンＣおよびグルタリル−７−ＡＣ八を３−デスア
セチル形（対応ずる量のデスアセチルグルタリル−７
−Ａ Ｃ Ａに導く）に変換するので、この、エステラ
ーゼ酵素の不活性化は重要である。 本発明の１つの態様によれば、ＣｅｐｈＣをグルタリル
−７ −Ａ Ｃ Ａに酵素酸化する際に使用する前に、
Ｔｒｉｇｉｎｏｐｓｉｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓの全細
胞をアセトン／水のｕ合液てスラリー化ずることからな
る、デスアセチルグルタリル−７−ＡＣ’Ａを実質的に
含まないグルタリル−７ −Ａ Ｃ Ａの製造方法が提
供される。即ち、Ｔｒｉｇｉｎｏｐｓｉｓ ｖａｒｉａ
ｂｉｌｉｓの全細胞または細胞不含の抽出物をアセトン
／水で処理することからなる、エステラーゼ酵素の不活
性化方法か提供される。 また、本発明は、Ｄ−アミノ酸オキシダーセとカタラー
ゼの水性混合液のｐＨを約ｌ１〜約１２のｌ）Ｈまで高
めることからなる、Ｄ−アミノ酸オキンターセ酵素の存
在下にカタラーセ酵素を不活性化する方法を提供するも
のである。 さらに、本発明は、Ｃｅｐｌ＋Ｃをグルタリル−７ＡＣ
Ａに酵素酸化する際にＴ ｒｉｇｉｎｏｐｓｉｓ ｖａ
ｒｉａｂｉ１ｉｓの透過性にした全細胞を利用する前に
、Ｔｒｉｇｉｎｏｐｓｉｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓの透
過性にした全細胞または細胞不含の抽出物を塩基で処理
してｐＨ約１１〜約１２にすることからなる、セファロ
スポリンＣをグルタリル〜７ −Ａ Ｃ Ａに酵素変換
する方法を提供するものである。 これとは別に、本発明のこの態様を、オキシダーゼおよ
びカタラーセを含有するＴ ｒｉｇｉｎｏｐｓｉｓ ｖ
７ ａｒｉａｂｉｌｉｓの細胞不含の抽出物によるセファロ
スボリンＣのグルタリル７ −Ａ Ｃ Ａへの変換に適
用することがてきる。そのような細胞不含の抽出物は、
通常の方法、例えば溶解または細胞の水性１芭濁液の音
波処理によって得られる。次いで、細胞不含の抽出ｌ夜
を、全細胞について上記したように処理する。 次いで、上記の全細胞のｐＨを硫酸などの希釈した酸に
よって約７に調節し、ＣｅｐｈＣのグルタリル−７ −
Ａ Ｃ Ａへの酵素酸化に直接使用することができる。 上記の方法において使用するのに適当なＴ ｒｉｇｉｎ
ｏｐｓｉｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓの全細胞は、従来技
術の方法を用いて得ることかできる。また、Ｔ ｒｉｇ
ｉｎｏｐｓｉｓｖａｒｉａｂｉｌｉｓは、培養物番号Ｃ
ＢＳ ４０９５のもと、Ｃｅｎｔｒａｌ Ｂｕｒｅ
ａｕ ｖｏｏｒ ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒ Ｂａ
ａｒｎ， Ｈ ｏｌ ｌａｎｄから人手することかでき
る。 上記の方法においては、Ｔ ｒｉｇｉｎｏｐｓｉｓ ｖ
ａｒｉａｂｉ１ｉｓの全細胞ペーストを９０％〜５０％
の水／アセトン（好ましくは２：１、ｖ：ｖ）Ｕ合液で
スラリー８ 化し、Ｄｏｗ Ａｎｔｉｆｏａｍ ＡＴＭなとの／ｉ！
ｌ泡剤で処理する。通常、この混合物を２０〜２５゜Ｃ
で約２時間撹拌する。この方法によって、エステラーゼ
活性の９０％以上が除かれ、見かけのオキシダーゼ活性
が約１０倍に増加する。アセトンを、蒸発によって、ま
たはセラミックス上の透濾過またはあらゆる種類の交差
フローフィルターによって除去することかできる。また
、この方法は細胞を透過性にするように働く（あるいは
、他で記載されているように、細胞を「活ｆ生化する」
ように）。従来技術の方法は、特にアセトンによって透
過性にすることを教示しているが、エステラーゼの存在
およびその３−デスアセチル−７ −Ａ Ｃ Ａ不純物
の同時生産への寄与はここで初めて認識されたものであ
る。即ち、全細胞を透過性にするこの従来技術の方法は
、今では、これまで認識されていなかったエステラーゼ
不活性化という側面をも有しているのである。 次に、細胞／水のスラリーをアルカリ金属水酸化物（水
酸化ナトリウム、水酸化カリウムなど）、または他の普
通の塩基でｐＨが約１１〜１２になるまで処理し、この
混合物を２０〜２５゜Ｃて２時間撹拌する。水酸化ナト
リウムは約２規定の濃度で用いるのか好ましい。この方
法によって、オキシダーゼ活性に影響を及ぼすことなく
、検出可能なカタラーゼ活性の全てが除去される。次い
で、この反応混合物を２０％硫酸などの希釈酸によって
約７に調節する。 次いて、この細胞／水のスラリーをＣｅｐｈＣのグルタ
リル−７ −Ａ Ｃ Ａへの酊素酸化に向接使用するこ
とかできる。通常は、Ｔ ｒｉｇｉｎｏｐｓｉｓ ｖａ
ｒｉａｂｉ１ｉｓのエステラーゼ／カタラーゼ−不活性
化した全細胞を使用するパイロットプラントのスケール
で９０％±２％の収率を得ることかできる。 実験の部 実施例１ 一般的方法 Ｔｒｉｇｉｎｏｐｓｉｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓの全細
胞を用いるＣｅｐｈＣの酸化 湿ったＴ ｒｉｇｉｎｏｐｓｉｓ細胞ペースト（ １
． ４ ｋｇ；乾燥重量０．４２ｋｙ）、水（２ １
Ｑ）、アセトン（１０８Ｑ）、およひＤｏｗ Ａｎｔｉ
ｆｏａｍ ＡＴＭ（２ｚＣ）の混合物を２０〜２５゜Ｃ
で２時間撹拌した。通常、この処理によって、、エステ
ラーゼ活性の〉９０％か除去され、見かけのオキシター
セ活性か１０倍に増加する。アセトンは、真空下の蒸発
によって、まｔこは５７： ｌ’．フローフィノレター
に、上る透＃ｔ’ｌ ；ｌ；ｒ ｌこまって除去するこ
とができる。 次いで、細胞／水スラリーのｐＨを２Ｎ水酸化ナトリウ
ムで１１ ０に調節し、この反応ｄ合物を２０〜２５゜
Ｃで２時間撹拌した。この処理によって検出可能なカタ
ラーセ活性の全てを除去した。 ２時間後に２０％硫酸によってｐＨを７に調節した。１
．４ｋｌ？のナ１−リウムＣｅｐｈ Ｃ（Ｃｅｐｈ Ｃ
ならびに他の塩を用いることもできる）、およびＤｏｗ
Ａｎｔｉｆｏａｍ Ａ”と上記の細胞／水スラリーの混
合物を純酸素の吹き込みによって処理して反応ｄ合物を
酸素で飽和させた。温度は２３゜Ｃに、ｐＨは７．１に
保った。通常、反応は酵母細胞の比活性に依存して６０
〜１２０分て完結ずる。反応か完結したら、反応ｄ合物
をセラミック交差フローフィルターで元の容量の１／３
まて濃縮し、次いて１容量の水で透濾過した。濃縮中は
反応α合物に窒素を吹き込んで酵素活性の保存を助けた
。透過物は生成物として保存し、一方、ヘ１３縮した細
胞スラリーは再使用のために再刊川した。 尖胤例２ 上で用いた方法と同様の方法によってアセ１−ン／水で
透過性にしておいたＴ ｒｉｇｉｎｏｐｓｉｓ ｖａｒ
ｉａｂｉ１ｉｓの湿ったペースト（１２ｇ試料）を水（
５０１Ｉ１２）でスラリー化した。次いて、２ＮＮａＯ
Ｈてｐ Ｉ−１を１１に調節し、反応混合物を室温で１
時間４５分撹拌した。次に、反応混合物のｐ Ｉ−１を
ＩＮＨＣＣて６．５に調節し、全細胞をＣｃｐｌ＋Ｃの
グルタリル−７ −Ａ Ｃ Ａへの酵素変換に用いた。 次いで、反応屁合物中に純粋な酸素を吹き込みなから、
全細胞を水（３００ｉＱ）およびナトリウムＣｅｐｈ
Ｃ（１ ４．０ ４９：約８４％の純度）と共ニテスラ
リー化した。７２分後に後処理すると、９２８％（その
場での収率）のグルタリル−７ −Ａ Ｃ Ａかこの実
験によって得られた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ酵素の存在下でカタラー
ゼ酵素を不活性化する方法であって、該酵素群をｐＨ約
１１〜約１２の塩基性水溶液と接触させることを特徴と
する方法。 ２、オキシダーゼおよびカタラーゼがＴｒｉｇｉｎｏｐ
ｓｉｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓの透過性にした全細胞中
に存在している請求項１記載の方法。 ３、オキシダーゼおよびカタラーゼが細胞不含の水性抽
出物中に存在している請求項１記載の方法。 ４、セファロスポリンＣをグルタリル−７−ＡＣＡに酵
素変換する方法であって、セファロスポリンＣのグルタ
リル−７−ＡＣＡへの酵素酸化においてＴｒｉｇｉｎｏ
ｐｓｉｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓの透過性にした全細胞
または細胞不含の抽出物を用いる前に、該Ｔｒｉｇｉｎ
ｏｐｓｉｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓの透過性にした全細
胞または細胞不含の抽出物を塩基で処理して約１１〜約
１２のｐＨとすることを特徴とする方法。 ５、エステラーゼ酵素を不活性化する方法であって、Ｔ
ｒｉｇｉｎｏｐｓｉｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓの全細胞
または細胞不含の抽出物をアセトン／水で処理すること
を特徴とする方法。
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