JPS63233785A - 新規な３α−ヒドロキシステロイド脱水素酵素とその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 近年、酵素を産業上に利用する種々の試みが展開されて
いる。１つは酵素の基質特異性を利用して雑多な化合物
が混入している組成の中から特定の化合物の濃度を選択
的に測定する臨床診断用酵素として、また１つは従来の
エネルギー多消費型の化学反応工程に酵素を用いて省エ
ネルギープロセスを確立するためのバイオリアクターへ
の利用である。本゛発明中の酵素は、ステロイド化合物
の中ではアンドロステロン、デオキシコール酸、ケノデ
オキシコール酸およびコール酸などの３α−ヒドロキシ
ステロイド化合物に特異的に作用することから、血液中
の胆汁酸を測定する臨床診断用酵素としての利用が期待
される。また当該酵素は３α−ヒドロキシステロイド化
合物以外に、種々のカルボニル基を持つ化合物、例えば
シクロヘキサノンやメチルイソブチルケトンに作用し、
対応するアルコールに還元したり、さらにターメントン
を不斉還元して香料として有用なにメントールに変換で
きるので、バイオリアクターによる有用物質生産に利用
できる。

［従来の技術］ 本発明中の酵素に類似の機能を持つ酵素としてシュード
モナス・テストステロニー　ＡＴＣＣ１１９９６の生産
する３α−ヒドロキシステロイド脱水素酵素（以下３α
−Ｈ８ＤＨと略す）が知られている（例えばｒ　Ｐ、１
．Ｍａｒｃｕｓ、　ｐ、Ｔａ１ａｙら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、、　　１９０巻、　６６１−６７４頁。

１９５５年」）。、３α−Ｈ５ＤＨはアンドロステロン
、コール酸ナトリウム、コール酸やデ１４°キシコール
酸などの、いわゆる３α−ヒドロキシステロイド化合物
に対して大きな活性を持っている。

［発明が解決しようとする問題点コ 酵素を産業上に使用する場合、安定性の高いことが要求
される。従来の３α−ＨＳ　Ｄ　Ｈは６０℃、１０分間
の加熱によって全（活性を失う。この様に熱安定性が低
いという問題点が解決されれば、すなわちもっと安定性
の高い酵素が開発されれば、その実用的価値がさらに高
まることが期待される。

本発明は、このような安定性の高い新規な３α−ヒドロ
キシステロイド脱水素酵素とその製造法を提供するもの
である。

［問題を解決するための手段］ 従来の３α−Ｈ８ＤＨよりも安定性が高い酵素を取得す
る目的で、土壌等から微生物のスクリーニングを行った
。その結果、セルロモナス属にａすると認められる一閃
株がその目的にかなった性質を有していることを見いだ
したものである。すなわちセルロモナス属に属し、新規
な３α−Ｈ３ＤＨ生産能を有する微生−？培養し、培養
物から新規な３α−Ｈ３ＤＨを採取することを特徴とす
る新規な３α−ＨＳ　Ｄ　Ｈの製造法に関するものであ
る。

本発明に係わる新規な３α−Ｉ（ｔＤＨの製造は当該酵
素生産菌を培地に培養することによって行われる。当該
酵素生産菌としては、−例として本発明者らが土壌中よ
り分離したセルロモナス・ツルバタに属する株が挙げら
れる。なお本閑の菌学的性質は第１表および第２表に示
すとおりである。

第１表セルロモナス・ツルバタ・ＫＥ３１の一学的性質
形態的性質 肉汁寒天培地上（ｓｏ”ｃ） Ｓｈｒ　　　　　　　　　　長＃（１〜２μ１）４８ｈ
ｒ　　　　　　　　　短４（０，５〜Ｌμｍ）運動性　
　　　　　　　十 胞子形成　　　　　　　− ダラム染色　　　　　　十 培養的性質 直径１ｍｍの円形で黄色コロニーを形成するゼラチン液
化　　　　＋〈弱い） 生理的性質 カタラーゼ　　　　　＋ オ牛シターゼ　　　　＋（弱い） カゼイン分解　　　　十 セルロース分解性　　十 キサンチンの分解　　− 食塩耐性　７％以下　生育 １０％以上　生育しない クエン酸の利用　　　− 色素の菌体外生成　　− 細胞壁分析　　　　　リジンを含む 生育の温度範囲　　　２０〜４５℃（３３°Ｃが良好）
生育のｐＨ範囲　　　６．５〜８．５（７，２が良好）
酸素に対する態度　　通性嫌気性 第２表　　　炭素源の資化征°−′″ グリセリン　　　＋　　　酢酸　　　　　　十アラビノ
ース　　＋　　　グルフン酸　　　十リボース　　　　
＋　　　乳酸　　　　　　十グルコース　　　＋　　　
プロピオン酸　　十ガラクトース　　＋　　　クエン酸
　　　　−フルクトース　　＋　　　セロビオース　　
十以上の菌学的性質から分類学上、本菌株は　「Ｅ、５
ｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔら、　　Ｚｂｌ、　Ｂａｋｔ、
　ＨＹｇ、、　　１．　Ａｂｔ、Ｏｒ４ｇＣ３，４０１
−４０９頁、１９８２年」に記載されている七本菌を用
いて新規な３α−Ｈ３ＤＨを製造する方法について述べ
る。

培地は資化性炭素および窒素その他無機物、ビタミン、
アミ、°ｊｍ、酵母エキス等を含む微生物の培養に通常
用いられる培地が広く使用される。

炭素源として例えばグルコース、ガラクト−ス、アラビ
ノース、スクロース、フルクトース、ソルボース、ンル
ビトール、グリセリン、エタノール等が挙げられる。窒
素源として例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、コ
ーンステイープリカー。

麦芽エキス、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、
塩化アンモニウム等が挙げられる。無機塩として例えば
リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等が挙げられ
る。

これらの成分を含む培地を用いて２０〜４５℃好ましく
は３０〜３５℃で、培地のｐ■は６．５〜８．５好まし
くはｐｌ＋７〜７．５で１０〜１００ｈｒ、微好気的条
件下で培養する。菌を培養して得られた培養物から当該
酵素を抽出するには、公知の種々の処理方法を用いるこ
とができる。例えば遠心分離あるいは、ろ過等の通常の
方法で菌体を分離したのち、生菌体あるいはアセトン乾
燥処理菌体、凍結乾燥処理菌体を自己消化、フレンチプ
レス、ダイノミル、超音波処理等によって細胞を破砕し
たのち菌体抽パ出液を得る。菌体抽出液から当該酵素を
分離・精製するには、硫安塩析（２０〜８ｏｚ飽和画分
）しで得た沈澱物を１／３０Ｍ　トリス緩衝液（ｐ　Ｈ
７、０）に溶解し、脱塩後この抽出液をあらかじめ同じ
緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セファロース等の陰イオ
ン交換体充填カラムに通し、当該酵素を吸着させる。次
に同じ緩衝液中で塩化カリウム濃度を段階的に上昇させ
る溶出法によってクロマトグラフィーを行うと、塩化カ
リウム濃度０．１Ｍで本酵素は溶出される。当該酵素を
含む活性画分は、公知の種々の精製法、例えばゲルろ過
、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法等に
よりさらに精製される。

［当該酵素の理化学的性質コ 本発明により製造される新規な３α−Ｈ３Ｄ）（の理化
学的性質を以下に示す。

３９作用 当該酵素はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（Ｎ
ＡＤ）の存在下（アルカリ条件が好ましい）で１モルの
５α−アントロスタン−３α−オールールなどの基質を
、１モルの５α−アントロスタン−３，１７−ジオンお
よびにメントンにそれぞれ変換する。

一方、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（
ＮＡＤＨ）存在下（酸性条件が好ましい）では、１モル
の５α−アントロスタン−１７β−オール−３−オン（
４，５−ジヒドロテストステロン）あるいは１−メント
ンなどの基質を、１モルの５α−アントロスタン−３，
１７−ジオールおよび夕、メントールに変換する。その
他カルボニル基を持った種々の化合物を対応するアルコ
ールに変換し、さらにその逆反応も行う。

ｂ、基質特異性 第３表に示したように、３位にケトンを持つステロイド
化合物や文、メントン、４−クロロアセト酢酸エチルな
どをＮＡＤＨの存在下で還元する。しかし不飽和ケトン
を有する４−アンドロステン−３，１７−ジオンやプレ
ドニソロンに対しては活性がない。

第３表　　種々の基質に対するＡり元能５α−アン）−
ｏＸタン−１７β−オール−３−オン　　　０．２４　
　　　１００５α−アンドｎスタン−３，１７−シ゛オ
ン　　　　　　　０．２４　　　　　４３５β−７ンド
０スタン−３，１７−シ゛オン　　　　　　　０．１７
　　　　　　７ブａケ゛ステ０ン　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　０．１６　　　　　　０．０５４
−１ンド０ステン−３，１７−ｖ”オン　　　　　　　
　　０．２４　　　　　　０フ゛レドニソロン　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１４　　　　
　　０トク０ｏアセト酢酸エチｋ　　　　　　　　　　
　　　　６．１°　　　　　２５１−へ゛ンテンー３−
オン　　　　　　　　　　　　　　　　５３°°４．８
３−へ°ンテンー２−オン　　　　　　　　　　　　　
　　　　５　　　　　　　　１．４４−へＡセン−３−
オン　　　　　　　　　　　　　　　　　４５　　　　
　　　　　６．２２−オキフベンタン酸ナトリウム　　
　　　　　　　　　　１４．５°　　　　　　１．６オ
、メントン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　２．４　　　　　　　０．３基質はエタノールに
溶解して（エタノールの最終濃度は１０％）、１／１５
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，６）中、３０℃で反応した。

°　緩衝液中に完全溶解して反応した。

°°号スペンジ゛ｌンの状態で反応した。

また第４１表１坪示すように３α位にヒドロキシル基を
有するステロイド化合物や種々のヒドロキシ化合物など
をＮＡＤの存在下で酸化した。５α−アントロスタン−
３α−オール−１７−オンに対する活性が最も高いが、
類似の５α−アンドロスクン−３β−オール−１７−オ
ンのような３β−オール構造のステロイドには全く作用
しなかった。

第４表　　種々の基質に対する酸化能 ５α−アンド０スタン−３α−オール−１７−オン　　
　０．２４　　　　１００５α−Ｔンドロスタン−３α
　、１フβ−シ゛オール　　０．２４　　　　　８１５
α−７７）”ｏスタン−３β−オール−１７−オン０．
２４　　　　　　０テ゛オ什コール酸　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　０．１７　　　　　　３．１
ケノテ゛オキノコール酸　　　　　　　　　　　　　　
　　　　０．１７　　　　　　２．１コール酸　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１７　　　
　　０．５にメントール　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　２．５　　　　　　　０．１４イ１ブ
０八°ノー＆　　　　　　　　　　　　　　　　　　８
００　　　　　　　　　０．２５４−メチル−２−へ°
ンタノーｋ　　　　　　　　　　　　１５０”　　　　
　　　　４．９シクロへ１号ノール　　　　　　　　　
　　　　　　　　　自り；贈”　　　　　　　　４　、
６（＋、−）６−メチル−５−へブテンー２−オール　
　　　３８°　　　　　　　　１０．４ネロール　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３．３　　
　　　　２．６ケ゛ラニオール　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　３．３　　　　　　　０．１８
基質はエタノールに溶解して（エタノールの最終濃度は
１０１）、１／１５ＭビＵ燐酸緩衝液（ｐＨ８，８）中
、３０℃で反応した。

°　サスベンジ゛１ンの状態で反応した。

°°緩衝液中に完全溶解して反応した。

ｃ、Ｋｍ値（ミハエリ必定数） 当該酵素のに＋ｎ値は５α−アントロスタン−１７β−
オール−３オンが０．２９ｍＭでありにメントンは１４
．３＊Ｍであった。いずれも０．１５ｍＭＮ　Ａ　Ｄ　
Ｈ存在下、１７１５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）中、３
０℃で測定した。

ｄ、金属イオン等の影響 金属イオンおよびその他の添加物（すべて終濃度３＋＋
Ｍ）が酵素活性に及ぼす影響を調べた。第５表に示すよ
うにＰａ５Ｃｕイオンが阻害した。

（＞・人１：／ｉ、ｆｆ！１’） 第５表　金′属イオンその他添加物の影響ＭｇＣｌ２会
６Ｈ２０１００°　ＣＬ１５Ｏ４・５１１２０　　　７
６ＣｏＳＯａ・１ｊ１２０　　　　　　　９６　　　　
　り′リクン　　　　　　　　　　１０５ＣａＣ１２−
２ｔｌｚＯ９５り゛リシルク゛リシン　　　　　１０５
ＺｎＳＯａ・７Ｈ２０９５！／’チオスレイトール　　
　　　　９９ＮａＣ１１００β　−メに′ｈブトエタノ
ール　　９６（Ｎｕｎ）ｇｓＯａ　　　　　９６　　　
ＥＤＴＡ　　　　　　１００ＦｅＳＯ４４Ｈ２０６７無
撚　　　　　１００°無添加を１００としたときの相対
値 ｅ６反応至適ｐＨ ｋメントンを基質として、ＮＡＤＨの存在下で反応至適
ｐｎを調べた。至適ｐＨ−４，５〜５．５（１／１５Ｍ
酢酸緩衝液中）であった。またＮＡＤの存在下で、５α
−アントロスタン−３α−オール−１７−オンを基質と
した場合の反応至適ｐＨは７．５〜８．５（１／１５Ｍ
リン酸緩衝液およびトリス−■Ｃ１緩衝液）であった。

ｆ、安定ｐＨ範囲 当該酵素はｐＨ６〜８（１／１５Ｍリン酸緩衝液中）で
３０　’Ｃ５２４ｈｒ放置しても安定である。またｐＨ
７，０，３０℃で１．１００ｈｒ放置したとき、５０％
の活性が残存している。

ｇ、安定温度範囲 １／１５Ｍ　！７ン酸緩衝液（ｐＨ７，０）中で、温度
を変えて安定性を調べた。当該酵素は、６０℃以下の温
度で２ｈｒ保温したとき失活は全く認められない。

ｈ、精製方法 精製方法を第６表に示す。菌体破砕後、プロタミン処理
、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィーおよびアフ
ィニティークロマトグラフィーを行うことによって、電
気泳動的に均一な酵素を得ることができる。なお酵素活
性は０．２４ｍＭ、　５α−アンＦｏスタンー１７７９
−オール−３−オフ、０．１５＋ｇＭＮ　Ａ　ＤＨの存
在下、１／１５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）中で測定し
た。酵素の力価は３０”Ｃ１１分間に１ＭモルのＮＡＤ
Ｈを減少（３４０ｎｍで追跡）させる量を１単位とした
。

酵素の精製結果を第１０表にまとめた。

（ｙｔＴ−化合） 箪６表　　新規な３α−Ｈ８ＤＩの精製方法画分　　　
　　　　分画方法、条件 １、培養液 ↓　　　　　遠心分離、（９，ＯＯＯｒｐｍ、１５分）
２ＪＩ体 ↓　　　　　　　　　菌体破砕、夕゛イノミル（１０分
）↓　　　　　遠心分離（１ｇ、０ＯＯｒｐ＋ａ、３０
分）３、細胞抽出液 ↓　　　　　プロタミン処理（０，２５＄）↓　　　　
　硫安塩析（２０〜８ｏ飽和２）４、硫安塩析画分 ↓　　　　　透析（ｐＨ７，１、ｌ／１５Ｍ　）リス緩
衝液）５、透析液 ↓　　　　　　　　　　　ＤＥＡＥ−セフ丁ロース・ク
ロマトグラフィー６、活性画分（０，１ＭＫＣｌ溶出画
分）↓　　　　　　　　　　　　Ｂｌｕｅ　　Ａ・りｏ
７）り゛ラフィーフ、精製酵素（０，１Ｍ）［ＣＩ溶出
画分）１、分子量 ネイティブ・ポリアクリルアミド電気泳動に於ける当該
酵素の分子量は９８，０００であった。またＳＤＳ電気
泳動における分子量は２４，０００であった。従って当
該酵素は４つのサブユニットから成ると考えられる。

ｊ、紫外線吸収スペクトル 当該酵素の紫外線吸収スペクトルを第１図に示した。

λｍａｘ　：　２７５ｎｍ、３ＳＯｎｍｉｆ　　　：　
２６０ｒｖ付近、　２７０ｎｍ付近腕、結晶構造および
元素分析 現在までのところでは晶出するに至らず、したがって元
素分析も行うことができない。

［当該酵素の新規性コ ａ、基質特異性 シクロヘキサノンを還元する酵素は馬肝臓由来のアルコ
ール脱水素酵素［ＥＣ１，１，１，１］が知られている
。しかし当該酵素はエタノールに対する活性一方、当該
酵素は３α−ヒドロキシステロイドに対する活性が強く
、既知の３α−Ｈ５ＤＩに類似している。しかし、シュ
ードモナス・テストステロニー由来の３α−Ｈ３Ｄ）Ｉ
　（シグマ社製、Ａ酵素と略す）やシュードモナス・プ
チダ由来の３α−Ｈ８ＤＨ（Ｂ酵素と略す）などの既知
の酵素と比較すると、第７表に示すように基質特異性に
違いが見られる。

第７表　既知酵素との基質特異性の比較１．５α−アン
トロスタン− ３α　−オール−１７−オン　　　　　　　　　ｔｏｏ
　　　　　　　１００　　　１００２、　コール酸ナト
リウム　　　　　　　　　　　　　１．１　　　　４３
　　　　　−”’３、　テ゛オ今シコール酸　　　　　
　　　　　　　　　３．１　　　　１８　　　３４８４
、　コール酸　　　　　　　　　　　　　　　　　０．
５　　　　３０　　　３７０５、４−メチル−２−へ°
ンタｌ−ル　　　　　　　　４．９　　　　　０．３　
　　−６、５α−γンドロスタンー １７β−オール−３−オン　　　　　　　　　１００　
　　　　　１００　　　　　−７、５α−アンド０スタ
ン− ３，１７−シ゛オン　　　　　　　　　　　　４４　　
　　　１０７　　　　　−８、４−り００アセト酢酸エ
チル　　　　　　　２５　　　　　　　０．２　　　−
°　　シヱート′モナス・テストステロニー　ＡＴＣＣ
１１９９６由来の３α　−■ＳＤ■゛°　シュ・ト′モ
ナス・７°ｆり゛　ＫＹ４６６７　　（特開昭５３−９
９３９２から引用した）由来の３α−１１ＳＤＩ °°°比較データなし Ｎｏ１〜５：ｐＨ８，８における基質の酸化活性（Ｎｏ
ｌ”１ＯＯ）Ｎｏ６〜１１：ｐＨ４，５ニおける基質の
還元活性（Ｎｏ６−１００）、：Ｔｈ、ｖ二・ ｔ　すｂ　チ５．’ｑ・−アントロスタン−３α−オー
ル−１７−オン（アンドロステロン）の酸化活性を１０
０としたとき、当該酵素が有するコール酸ナトリウム、
コール酸およびデオキシフール酸の酸化活性はＡ酵素や
Ｂ酵素に比べて低いが、４−メチル−ペンタノールに対
する酸化活性はＡ酵素より高い。一方、５α〜アントロ
スタン−１７β−オール−３−オン（４，５−デヒドロ
テストステロン）の還元活性を１００としたとき、当該
酵素の４−クロロアセト酢酸エチル還元活性はＡ酵素に
比べて１００倍以上高い。このように基質特異性が大き
く異なるのは、それぞれの酵素のアクティブサイトに違
いがある、すなわち酵素のアミノ酸配列が異なっている
ことを強く示唆しており、これらの酵素は互いに違った
構造を有していると考えられる。

ｂ、立体選択的還元性 ）メントンをＡ酵素で還元したときの生成物はにメント
ール：ｄ−ネオメントール嵩１：２である。一方、当該
酵素を用いた場合はえメントール＝ｄ−ネオメントール
＝９？：３であり、当該酵素の立体選択性はＡ酵素に比
べて高いことがわ泣Ｒ＝：、！。：茫′：：こ“ Ｃ９分子量・反応至適ｐＨ・熱安定性 分子ｍ等について当該酵素と既知酵素との比較を行った
。第８表に示すように、本酵素はＡ酵素およびＣ酵素（
シニードモナス・スフエリカス由来の３α−ＩＩ　Ｓ　
Ｄ　ＩＩ　）とは異なった性質を持っていた。

第８表　既知酵素との比較 分子量　　　　９８．０００　　４７，０００　１６Ｇ
、０００反応至適ｐＨ７，５〜８．５　１１〜１１．５
　１０〜１０．５熱安定性””　　　１００　　　　０
　　　　記載なし・°　　シヱードモナス・　テストス
テロニー由来°°ハ′チラス・スフエリカス由来（特開
昭５４−１５７８９４から引用）°°°数値は１７１５
Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）中、６０℃で１０分間
保温した後の残存活性を示す。

すなわち分子量は王者で大きく異なること、反応至適ｐ
ＨはＡ酵素、Ｃ酵素ともに当該酵素に比ベアルカリ側に
：ｌ護、１こと、また当該酵素は６０°Ｃ１１０分間加
熱後も１００％の活性が残存するが、Ａ酵素は、全く活
性を失うので、熱安定性は当該酵素の方が高いこと（第
２図参照）などである。

以上に記述したように、当該酵素は既知の３α−Ｈ３Ｄ
Ｈと比べて、５α−アントロスタン−３α−オール−１
７−オンに対して活性が高いという共通点があるが、基
質特異性、立体選択性、分子量、反応至適ｐＨ、熱安定
性において何れも違いが見られる。

従って当該酵素を新規の３α−Ｈ５ＤＲと命名すること
が適当である。

地１００ｍＬを含む）に植菌し、４８ｈｒ培養した。な
お培養時、誘導基質としてメントン（０，０５ｍＬ）を
２回に分けて添加した（添加したメントンはエタノール
と体積比で１＝１の混合液とした）。この培養液を２Ｌ
容ジャーファーメンタ−（同培地をＩＬ含む）に移し、
回転数４０Ｏｒｐｍ、通気ｆｉｏ、０５ｖｖｍで４８’
ｈ−ｒ培養を行った。

メントンはフラスコ培養と同様の方法で分添した。

次に培養終了液を、３ＯＬ容ジャーファーメンタ−（同
培地２ＯＬを含む）に移し、２００ｒｐｍ、　ｉ！Ｉ気
ｆｆ１ｏ、０５ｙｖｍで、さらに５０ｈｒ培養を行った
。培養途中で１００ｍＬの２５％Ｄ−アラビノースを４
回分添した。またメントンは前培養と同様エタノールと
の混合液２５ｍＬを４回分添した。この培養菌体を用い
て、第６表に示す方法によって、当該酵素の精製を行っ
た。精製過程を第１０表にまとめた。

第９表　培地組成 ＮＨａＮＯ３０，１ｇ　　Ｆｅ５Ｏａ、７Ｈ２０１０ｎ
ｇＮａ２ＨＰＯ４，１２Ｈ２００，９ｇ　　Ｎａ２Ｍｏ
Ｏ＊　　　　０．６ｖａｇＫＩ１２ＰＯ４９０ｍｇ　　
Ｍｎ５Ｏａ、６Ｈ２００，６ｍｇＭｇ５Ｏａ、’１Ｈ２
００，１ｇ　　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　　１．０
ｇＣａＣｌ２．２Ｈ２０５０ｍｇ　　　　　Ｄ−７ラヒ
゛ノース　　　　　　　　Ｄ、５ｇ蒸留水１００ｍ１、
ｐＨ７，２ 第１０表　酵素精製結果 分画液　　　　　　総活性　比活性　回収率ｕｎｉｔ（
υｌ、、　　　　％ 細胞抽出液　　　　　　１９３００　　０．４０　　１
００プロタミン処理液　　１６９００　　０．４８　　
８８硫安分画液　　　　　　１５６００　　０．６！ｌ
　　　８１ＤＥＡＥ・セフ７ｏ４溶出画分　　９７５０
　　１５．３　　　５１ＢＩｕｅＡケ゛ル溶出画分　　
　８４７０　　２０．４　　　４４実施例２ 当該酵素は、メチルイソブチルカルビノールを基質に用
いた場合、ＮＡＤＨの再生を行うことができる。そこで
、補酵素再生系の存在下でトメントンから）メントール
の生産を行った。

実施例１で調製した精製酵素を０．１１単位（１単位は
３０℃、ｐＨ４，５の１／１５Ｍ酢酸緩衝液中で、１分
間に１μモルのにメントールを生成する酵素量とするン
′およびＮＡＤＨｏ、１μｉをＯ，１ＩｌｌＬ（７）　
１／１５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解したものと
、Ａ、メント：！”’Ｏ’、’１ｌｌｌＬ（５７８μモ
ル）およびメチルイソブチルカルビノールＯ，１ｍＬ（
７７５μモル）とを混ぜて、３０　’Ｃで４ｈｒ反応を
行った。

反応後の液に０．６ｍＬのへキサンを添加し、ヘキサン
相をガスクロマトグラフィーで分析した（　）ＩＲ−１
０Ｍカラム、１００℃、ヘリウム　５０ｍＬ／＋ｎｆｎ
）。反応液中には添加したＮＡＤＨのほぼ１７０倍モル
に相当するにメントール１６．７ｇモルとメチルイソブ
チルケトン２ｏ、８μモルが検出された。

【図面の簡単な説明】

第１図は当該酵素の紫外線吸収スペクトルを示す。第２
図は当該酵素（←・）および既知の３α−Ｈ５ＤＨ（シ
ヱードモナス・テストステミニ−由Ｌ　　　ｏ−ベフ　
）　の安定温度範囲を示す。何れも各温度で、１７１５
Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，０）中、１０分間保温後の残存
活性を示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の特性を有し、安定性の高い３α−ヒドロキ
   システロイド脱水素酵素 （ａ）３位にオキソ基を有するステロイド化合物やカル
   ボニル基含有化合物に対して還元能を有する。 （ｂ）ネイティブ・ポリアクリルアミド電気泳動法で測
   定した分子量が９８，０００であり、ＳＤＳ電気泳動法
   で測定した分子量が２４，０００である。 （ｃ）ｐＨ６〜８（１／１５Ｍリン酸緩衝液中）で３０
   ℃、２４ｈｒ放置した場合およびｐＨ７で６０℃、２ｈ
   ｒ放置した場合何れも安定である。
2. （２）セルロモナス属に属し、下記の特性を有する３α
   −ヒドロキシステロイド脱水素酵素生産能を有する微生
   物を培養し、該培養物から３α−ヒドロキシステロイド
   脱水素酵素を採取することを特徴とする３α−ヒドロキ
   システロイド脱水素酵素の製造方法。 （ａ）３位にオキソ基を有するステロイド化合物やカル
   ボニル基含有化合物に対して還元能を有する。 （ｂ）ネイティブ・ポリアクリルアミド電気泳動法で測
   定した分子量が９８，０００であり、ＳＤＳ電気泳動法
   で測定した分子量が２４，０００である。 （ｃ）ｐＨ６〜８（１／１５Ｍリン酸緩衝液中）で３０
   ℃、２４ｈｒ放置した場合およびｐＨ７で６０℃、２ｈ
   ｒ放置した場合何れも安定である。