JPH0353887A - α―ケト―β―メチル吉草酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、微生物の作用によりＬ−イソロイシンより、
肝臓薬、腎臓薬として有用なα−ケトβ−メチル吉草酸
を製造する方法に関する。

〔従来の技術〕

イソロイシンにはＬ−イソロイシン、Ｌ−アロイソロイ
シン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−アロイソロイシン４種の
光学異性体が存在する。それらを酵素反応を用いて酸化
的脱アミノさーυ−α−ケト酸に変換すると、Ｌ−イソ
ロイシン及びＤ−イソ、ロイシンからは、ｄ−α−ケト
−β−メチル吉草酸、Ｌ−アロイソロイシン及びＤ−ア
ロイソ口，イシンからは、Ｃ＝α−ゲ１・−β−メチル
吉草酸がζＬ成する。しかしながら、その光学活性は容
易に失われることが知られている。

オールＩ・ン・マイスター（＾ｌｔｏｎ　Ｍｅｉｓｔｅ
ｒ）の文献（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，　１９０　，
　２６９　（１９５１）によって、α−ケト−β−メチ
ル吉草酸の光学活性の安定性の研究が行われており、生
戒したα−ケト−βメチル吉草酸の光学活性は、ｐｕｓ
．４を越えると容易に失われ、８．４以下では安定であ
ることを見いだされている。そしてＤ−イソロイシンお
よび、Ｄ−アロイソロイシンに豚の腎臓（Ｈｏｇ　Ｋｉ
ｄｎｅｙ）由来のＤ−アくノ酸オキシダーゼをｐＨ８．
２で作用させ、光学活性を有するα−ケト−β−メチル
吉草酸を得ていた。

本発明者らは、詳細にα−ケト−β−メチル吉草酸の光
学活性の安定性を検討した結果、光学活性の安定のため
には、ｐｌ＋７．２よりもより低いｐｌ＋反応条件が必
要であり、オールトン・マイスターが得たα−ケ１・一
β−メチル吉ｖｌ′（酸は、その比旋光度から既に一部
ラセミ化しているものと考えられた。また、イソロイシ
ンの４種の光学活性体のうち、オールトン・マイスター
が用いた上記２種のイソロイシン等は非常に高価であり
、それらを利用することは産業上において不利にならざ
るを得ない。さらに、Ｌ−イソ口イシンから得られるα
ケ１へ酸はｄ−α−ケト−β−メチル吉草酸（以下、α
−ケト−β−メチル吉草酸と略記する）てあり、天然型
の構造を有するので、医薬として使用する場合望ましい
と考えられる。

〔発明が解決しようとする課題〕

人手容易なＬ−イソロイシンを原料として、医薬として
有用な天然型α−ケト−β−メチル吉草酸を、安価によ
り高い光学純度を有して安定に製造できる方法の開発が
要請されている。

〔課題を解決するための手段〕

前記の課題は、請求項１に記載の方法により達威される
。

ずなわら、本発明のα−ケト−β−メチル六４！酸の製
造方法は、■７−イソｌコイシンをα−ケ１・酸に変換
する能力を有する微生物の培養菌体またはそれらの処理
物と、Ｌ−イソロイシンまたはその塩とをｐＨ７．２以
下の水溶液中で反応させ、光学活性を有するα−ケ１・
−β−メチル店ｉｔ，！，：酸を生成・已しめることを
ｑ、＋ｉｍとする。

本発明によれば、Ｌ−イソロイシンをα−ケＩ・β−メ
チル吉草酸に変換する能力のある微生物を適当な培地で
培養し、得られる培養物、これより分離した菌体または
菌体の処理物をＬ−イソロイシンまたはその塩と水中で
反応させることにより、光学活性を有するα−ケト−β
−メチル吉草酸を生成蓄積させることができる。さらに
、反応液中から光学活性を失せずにα−ケト−β−メチ
ル吉草酸またはその塩を採取することができる。

使用できる菌株の例としては、プロテウス属、プロビデ
ンシア属、ミラビリス属、ノイロスポラ属が挙げられる
が、その他の微生物も有用であり、Ｌ−イソロイシンか
らα−ケト−β−メチル吉草酸を生或する能力のあるも
のであれば、いずれもが用いられる。

微生物を培養する培地は、菌株により異なるが、目的を
達する限り、何ら１、？別の制限はなく、炭素源、窒素
源、無機物、さらに微量の栄養素等を適当に含有する天
然培地及び合或培地が好ましい。

培養条件としては、菌種、培地によって異なるが、通常
温度は２５℃〜４０℃、ｐＨは４〜９で調整される。

菌体処理物としては、培養物の濃縮物、乾燥物、菌体の
アセトン処理物、界面活性剤処理物、乾燥物、酵素処理
物、また、菌体からの抽出酵素および適当な固定化担体
に固定化したもの等が挙げられる。

原料は、Ｌ−イソロイシン又はその塩が用いられる。Ｌ
−イソロイシンの塩としては、塩酸塩等が好ましい。

反応条件は用いる菌種、またその処理方法により異なる
が、ｐＨは７．２以下で行うことが、光学活性を有する
α−ケト−β−メチル吉草酸を反応液中に得るのに必要
である。好ましいｐＨ範囲は６．５〜７．２である。反
応は２５℃〜３５℃、６〜２４時間、通気攪拌して行う
。

反応液から、光学活性をイＪしたα−ゲ１・　βメチル
吉草酸を採取する方法としては、常法が用いられる。そ
の場合も光学活性を失わないために、ｐＨと温度を制御
する必要がある。すなわち反応終了後、直ちにｐＨを塩
酸にて４〜５に調整する。そして、反応液から、酵素源
を遠心分離、膜分離等を用いて除去する。その後、４０
℃以下にて、減圧濃縮を行い塩化カルシウム等のカルシ
ウム塩、得られた結晶を真空乾燥にて採取する。

また、酵素源を除いた後、塩酸、硫酸、硝酸等の鉱酸で
ｐＨを１．０以下に調整し、直ちに酢酸エチル等の溶剤
を用いて抽出後、減圧下にて溶剤を蒸発し、α−ケト−
β−メチル吉草酸を得ることもできる。塩の結晶が必要
な場合は水酸化カルシウムまたは水酸化ナトリウム等を
加え、得られる結晶を真空乾燥して採取する。

以上のような操作にて採取されたα−ケト−βメチル吉
草酸ナトリウム塩の比は、〔α〕Ｄ′。

＋　３　６．　３゜　（１％水溶液）であり、前出のオ
ールトン・マイスターが報告しているα−ケト−βメチ
ル吉草酸ナトリウム塩の比旋光度の〔α〕Ｄ′。

＋３　２．　６゜　（１％水溶液〉よりもより光学純度
が高いと判断される。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明を詳細に述べる。

実施例１ プロテウスブルガリス　Ｉ　Ｆ　Ｏ　３０４５を接種し
た、グルコース０．５％、大豆加水分解物（全窒素）１
５０■／ｄｌ、リン酸第−カリウム０．１％、硫酸マグ
ネシウム０．０４％を含む培地（殺菌前ｐＨ７．０）５
００ｍｊ！を５　０　０　Ｏｎ＋４！容フラスコに仕込
み、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液を
遠心分離して集菌し、その菌に２ｇ／ｄｊｌ！のＩ、−
イソロイシン溶液を５　０　０ｍＩｌを加え、ｐｌ＋７
．０に水酸化ナトリウム溶液または塩酸で調整し、５　
０　０　０ｍ７！容坂口フラスコにて３５℃、６時間振
盪反応させ、転換率９０％でα−ケト−β−メチル吉草
酸の生成が認められた。次いで、塩酸でｐＨを４〜５に
調整後、反応液から菌体を除去し、さらに塩酸でｐｔｔ
ｔ．ｏ以下に調整した後、直ちに等量の酢酸エチルで抽
出した。抽出液中の酢酸エチルを減圧下にて蒸発させ、
冷水酸化ナトリウムをα−ケ１・酸に対して等モル量加
えて、５℃でｌ２時間静置後、得られた結晶を濾紙にて
回収し、２０℃で真空乾燥して、２．４ｇのα−ケ１・
−βメチル吉草酸ナトリウム塩を得た。得られた結晶の
比旋光度を測定したところ、［α］　ｎ”　＋　３６．
３゜（１％水溶液）であった。

実施例２ 実施例１と同様の方法でスケールアンプすることにより
、採取した旋光度〔α〕１°＋　３　６．　３゜（１％
水溶液）のα−ケト−β−メチル吉草酸２０ｇを少量の
水に溶解し、４０℃で減圧濃縮して、得られた結晶の旋
光度を測定したところ変化は見られなかった。同様の操
作をさらに４回繰り返したが旋光度の変化はなかった。

このことから、光学純度１００％のα−ケト−β−メチ
ル吉草酸ナトリウム塩の旋光度は、（α）　ｎ”＋３　
６．　３゜（１％水溶液）であると考えられた。

実施例３ プロテウスブルガリス　ＩＦＯ３０４５を接種した、グ
ルコース０．５％、大豆加水分解物（全窒素）１５０■
／ｄ７！、リン酸第一カリウム０．　１％、硫酸マグネ
シウム０．０４％を含む培地（殺菌前ｐｌ＋７．０）５
０ｍ６を５　０　０ｗｌ容坂口フラスコに仕９ 込み、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液
１ｍＩｌを、グルコース２．０％、大豆加水分解物（全
窒素）２２０■／ｄ７！、リン酸第一・カリウム０．　
１％、硫酸マグネシウム０．０４％を含むｌａ地（殺菌
前ｐＨ７．０）　３　０　０ｍＡを仕込んだ６基の５　
０　０ｍｊ！容ジャーそれぞれに添加し、３０℃で２０
時間通気攪拌して、培養した。得られた培養液をそれぞ
れ遠心分離して、得られた菌体を３００ｔｎｌ２の０．
９％食塩水に懸濁し、１５ｇのＬ−イソロイシンを添加
した。そして５　０　０ｍ＃容のジャーを用いて、３５
℃で６種のｐＨ条件下、６．５、６．８、７．０、７．
２、７．５、８．０、８．５にて２４時間、通気攪拌反
応した。尚ｐｉは、アンモニアまたは塩酸にて調整した
。得られたα−ケｌ・−β−メチル吉草酸への転換収率
は、６３、８４、９０、９３、９５、９８、９８％であ
った。実施例１の方法に従って、α−ケト−β−メチル
吉草酸ナトリウム塩を得た。得られた比旋光度はそれぞ
れ〔α〕１°ｌ−　３　６．　３゜，＋３６．４゜，ｌ
３６．３゜＋　３　６．　２゜　　→−２８．３゜，＋
２３．２゜，＋７．／Ｉ゜１０ （各１％水溶液）であった。

実施例４ プロビデンシア　レソトゲリ　ＡＴＣＣ　９２５０を接
種した、グルコース０．５％、大豆加水分解物（全窒素
）１５０■／ｄＮ、リン酸第一カリウム０．　１％、硫
酸マグネシウム０．０４％を含む培地（殺菌前ｐｌ＋７
．０）５０ｍｊ！を５　０　０ｍｌｌ容坂口フラスコに
仕込み、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養
液１　０ｎ＋ｎを、グルコース２．０％、大豆加水分解
物２２０■／ｄ１、リン酸第一カリウム０．　１％、硫
酸マグネシウム０．０４％を含む培地（殺菌前ｐｌｌ７
．０）　３　０　０　０ｍ６を仕込んだ５　０　０　０
ｍｊ２容ジャーに添加し、３２℃で１５時間通気攪拌し
て、培養した。得られた培養液をそれぞれ遠心分離して
、得られた菌体を３　０　０　０ｍＡの０．９％ＮａＣ
　Ｉｌ液に懸濁し、１２０ｇのＬ−イソロイシンを添加
した。

５　０　０　０ｍｆｆ容のジャーを用いて３５℃、ｐＨ
７．０で通気攪拌して反応させた。ｐＨは、塩酸および
アンモニアで調整した。８時間後には転換率９２％で、
α−ケ１・−β−メチル吉草酸が得られた。反ｌ１ の限外濾過膜を用いて除菌、除蛋白をした後、４０゜で
減圧濃縮し、α−ケ１・一β−メチル吉草酸に対して、
１／２モルの塩化カルシウムを攪拌しながら徐々に添加
して、５℃で１晩静置した。

得られた結晶を濾紙で回収し、２０℃で真空乾燥した。

得られたα−ケト−β−メヂル吉草酸カルシウム塩はＩ
Ｉ７ｇであった。また比旋光度は〔α）ｎ”＋３５．６
゜　（６Ｎ塩酸１％？容液）であった。

〔発明の効果〕

本発明によれば、α−ケト−β−メチル吉草酸の天然型
の光学活性体が容易に取得でき、α−ゲト酸を用いた治
療方法の検討が容易になることがＩＵ１持される。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｌ−イソロイシンをα−ケト酸に変換する能力を
   有する微生物の培養菌体またはそれらの処理物と、Ｌ−
   イソロイシンまたはその塩とをｐＨ７．２以下の水溶液
   中で反応させ、光学活性を有するα−ケト−β−メチル
   吉草酸を生成せしめることを特徴とするα−ケト−β−
   メチル吉草酸の製造方法。
2. （２）Ｌ−イソロイシンをα−ケト酸に変換する能力を
   有する微生物が、プロテウス属、プロビデンシア属、ミ
   ラビリス属およびノイロスポラ属よりなる群から選ばれ
   たものである請求項１に記載の製造方法。
3. （３）光学活性を有するα−ケト−β−メチル吉草酸へ
   の変換反応温度が通気攪拌下２５〜３５℃の温度範囲で
   ある請求項１に記載の製造方法。
4. （４）光学活性を有するα−ケト−β−メチル吉草酸へ
   の変換反応をする際のｐＨが６．５〜７．２である請求
   項１に記載の製造方法。