JPH06125779A - 組換えｄｎａを有するコリネ型細菌を用いる芳香族アミノ酸の製造法 - Google Patents

組換えｄｎａを有するコリネ型細菌を用いる芳香族アミノ酸の製造法

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JPH06125779A
JPH06125779A JP4063513A JP6351392A JPH06125779A JP H06125779 A JPH06125779 A JP H06125779A JP 4063513 A JP4063513 A JP 4063513A JP 6351392 A JP6351392 A JP 6351392A JP H06125779 A JPH06125779 A JP H06125779A
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coryneform bacterium
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Abstract

(57)【要約】 【目的】芳香族アミノ酸の生産性がより高い微生物を
得、それによって芳香族アミノ酸のより効率のよい製造
法を見い出す。 【構成】コリネ型細菌由来のシキミ酸キナーゼをコード
する遺伝子を取得し、これをコリネ型細菌細胞内で増殖
しうるプラスミドベクターに接続し、これを保持するコ
リネ型細菌を培養することにより芳香族アミノ酸を製造
する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、シキミ酸キナーゼが
組込まれている組換えＤＮＡを有するコリネ型細菌及び
それを用いる芳香族アミノ酸の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】シキミ酸キナーゼ（以下「ＳＫ」と記
す。）は、シキミ酸をシキミ酸３−リン酸に変換する反
応を触媒する酵素であり、シキミ酸３−リン酸は、コリ
スミ酸を経由してフェニルアラニン，チロシン又はトリ
プトファンに変換される。一方、組換えＤＮＡ法により
これら芳香族アミノ酸生産菌を育種することは、いくつ
か知られているが（例えば特開昭５７−２０８９９４，
特開昭５７−７１３９７，特開昭５８−８９１９４，特
開昭５８−１３４９９４等）、ＳＫをコードする遺伝子
（以下「ＳＫ遺伝子」と記す）が組込まれたものではな
い。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】この発明は、芳香族ア
ミノ酸の生産性がより高い微生物を得、それによって芳
香族アミノ酸のより効率のよい製造法を見い出すことに
ある。
【課題を解決するための手段】本発明者等は、叙上の問
題点を解決するため研究の結果、コリネ型細菌細胞内で
発現しＳＫをコードする遺伝子がコリネ型細菌細胞内で
増殖しうるプラスミドベクターに接続されている組換え
ＤＮＡを有するコリネ型細菌を分離することに成功し、
得られたコリネ型細菌が芳香族アミノ酸の高い生産性を
有することを見い出した。すなわち本発明は、図２に示
す制限酵素切断パターンを有し約１．９ｋｂの長さであ
りかつシキミ酸キナーゼをコードする遺伝子を含有する
コリネ型細菌由来のＤＮＡ断片を含む、コリネ型細菌細
胞内で増殖しうる組換えＤＮＡを有するコリネ型細菌を
培養することを特徴とする芳香族アミノ酸の製造法であ
る。また、本発明は、図３に示す制限酵素切断パターン
を有し約２．９ｋｂの長さでありかつシキミ酸キナーゼ
をコードする遺伝子と３−デヒドロキナ酸シンターゼを
コードする遺伝子を含有するコリネ型細菌由来のＤＮＡ
断片を含む、コリネ型細菌細胞内で増殖しうる組換えＤ
ＮＡを有するコリネ型細菌を培養することを特徴とする
芳香族アミノ酸の製造法である。さらに本発明は、図３
に示す制限酵素切断パターンを有し約２．９ｋｂの長さ
でありかつシキミ酸キナーゼをコードする遺伝子と３−
デヒドロキナ酸シンターゼをコードする遺伝子を含有す
るコリネ型細菌由来のＤＮＡ断片を内部に含み、約８．
３５ｋｂの長さであり両端に制限酵素ＰｓｔＩを有しか
つシキミ酸キナーゼをコードする遺伝子と３−デヒドロ
キナ酸シンターゼをコードする遺伝子およびシキミ酸デ
ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含有するコリネ型
細菌由来のＤＮＡ断片を含む、コリネ型細菌細胞内で増
殖しうる組換えＤＮＡを有するコリネ型細菌を培養する
ことを特徴とする芳香族アミノ酸の製造法である。
【０００４】本発明にいうコリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅ
ｆｏｒｍ ｂａｃｔｅｒｉａ）は、バージーズ・マニュ
アル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー
（Ｂａｒｇｅｙｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍ
ｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版５
９９頁（１９７４）に定義されている一群の微生物であ
り、好気性，グラム陽性，非抗酸性，胞子形成能を有し
ない桿菌である。このようなコリネ型細菌のうち特に以
下に述べるようなコリネ型グルタミン酸生産性細菌が本
発明においては、最も好ましいものである。
【０００５】コリネ型グルタミン酸生産性細菌の野性株
の例としては次のようなものがあげられる。 ブレビバクテリウム・ディバリカタム ＡＴＣＣ １４０２０ ブレビバクテリウム・サッカロリティクム ＡＴＣＣ １４０６６ ブレビバクテリウム・インマリオフィルム ＡＴＣＣ １４０６８ ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム ＡＴＣＣ １３８６９ ブレビバクテリウム・ロゼウム ＡＴＣＣ １３８２５ ブレビバクテリウム・フラバム ＡＴＣＣ １３８２６ ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ １９２４０ コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム ＡＴＣＣ １３８７０ コリネバクテリウム・アセトグルタミクム ＡＴＣＣ １５８０６ コリネバクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ １５９９１ コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ １３０３２， １３０６０ コリネバクテリウム・リリウム ＡＴＣＣ １５９９０ コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ １７９６５ ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ １５３５４
【０００６】本発明のコリネ型グルタミン酸生産性細菌
には上記のようなグルタミン酸生産性を有する野性株の
ほかにグルタミン酸生産性を有するまたはグルタミン酸
生産性を失った変異株も含まれる。
【０００７】ＳＫ遺伝子を単離する方法は、コリネ型細
菌のＳＫ遺伝子を有している株より、まず染色体遺伝子
を抽出し（例えばＨ．Ｓａｉｔｏ ａｎｄ Ｋ．Ｍｉｕ
ｒａＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７
２，６１９，（１９６３）の方法が使用できる。）、こ
れを適当な制限酵素で切断する。ついで、コリネ型細菌
細胞内で増殖し得るプラスミドベクターに接続し、得ら
れた組換えＤＮＡを用いてコリネ型細菌のＳＫ欠損変異
株を形質転換せしめ、ＳＫ生成活性を保有するにいたっ
た菌株を単離し、これよりＳＫ遺伝子を分離できる。
【０００８】染色体遺伝子を切断するために、切断反応
時間等を調節して切断の程度を調節すれば、幅広い種類
の制限酵素が使用できる。
【０００９】本発明にて使用されるプラスミドベクター
は、コリネ型細菌細胞内において増殖し得るものであれ
ばどのようなものでも良い。具体的に例示すれば、以下
のものがあげられる。 （１）ｐＡＭ ３３０ 特開昭５８−６７６９９参照 （２）ｐＨＭ １５１９ 特開昭５８−７７８９５参照 （３）ｐＡＪ ６５５ 特開昭５８−１９２９００参照 （４）ｐＡＪ ６１１ 同 上 （５）ｐＡＪ １８４４ 同 上 （６）ｐＣＧ １ 特開昭５７−１３４５００参照 （７）ｐＣＧ ２ 特開昭５８−３５１９７参照 （８）ｐＣＧ ４ 特開昭５７−１８３７９９参照 （９）ｐＣＧ １１ 同 上
【００１０】プラスミドベクターＤＮＡの開裂は、当該
ＤＮＡを一箇所で切断する制限酵素を用いて切断する
か、複数部位を切断する制限酵素を用いて部分的に切断
することにより行う。
【００１１】ベクターＤＮＡは、染色体遺伝子を切断し
た際に用いられた制限酵素により切断され、または染色
体ＤＮＡ切断フラグメント及び切断されたベクターＤＮ
Ａのそれぞれの両端に相補的な塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチドを接続せしめて、ついでプラスミドベクタ
ーと染色体ＤＮＡフラグメントとのライゲーション反応
に付される。
【００１２】このようにして得られた、染色体ＤＮＡと
ベクタープラスミドとの組換えＤＮＡをコリネ型細菌に
属する受容菌へ導入するには、エシェリヒア・コリＫ−
１２について報告されている様な（Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．
ａｎｄ Ｈｉｇａ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．，Ｂｉｏｌ．，
５３，１５９（１９７０）受容菌細胞を塩化カルシウム
で処理してＤＮＡの透過性を増す方法、またはバチルス
・ズブチリスについて報告されている様に（Ｄｕｎｃａ
ｎ，Ｃ．Ｈ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｇ．Ａ．ａｎｄＹｏｕｎ
ｇ，Ｆ．Ｅ．，Ｇｅｎｅ，１，１５３（１９７７））細
胞がＤＮＡを取り込み得る様に増殖段階（いわゆるコン
ビテントセル）に導入する方法により可能である。ある
いは、バチルス・ズブチリス、放線菌類および酵母につ
いて知られている様に（Ｃｈａｎｇ，Ｓ．ａｎｄ Ｃｈ
ｏｅｎ，Ｓ．Ｎ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．，Ｇｅｎｅ
ｔ．，１６８．１１１（１９７９）；Ｂｉｂｂ，Ｍ．
Ｊ．，Ｗａｒｄ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ Ｈｏｐｗｏｏｄ，
Ｏ．Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７４，３９８（１９７
８）；Ｈｉｎｎｅｎ，Ａ．，Ｈｉｃｋｓ，Ｊ．Ｂ．ａｎ
ｄＦｉｎｋ，Ｇ．Ｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５１９２９（１９７８））、Ｄ
ＮＡ受容菌を、プラスミドＤＮＡを容易に取り込むプロ
トプラストまたはスフェロプラストにしてプラスミドを
ＤＮＡ受容菌に導入することも可能である。
【００１３】プロトプラスト法では上記のバチルス・ズ
ブチリスにおいて使用されている方法でも充分高い頻度
を得ることができるし、特開昭５７−１８３７９９に記
載されたコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属のプロトプラストにポリエチレングリコールまたは
ポリビニルアルコールと二価金属イオンとの存在下にＤ
ＮＡをとり込ませる方法も当然利用できる。ポリエチレ
ングリコールまたはポリビニルアルコールの代りに、カ
ルボキシメチルセルロース、デキストラン、フィコー
ル、ブルロニックＦ６８（セルバ社）などの添加によっ
てＤＮＡのとり込みを促進させる方法でも同等の結果が
得られる。
【００１４】芳香族アミノ酸生産菌として、ＳＫ欠損株
を宿主として形質転換した株を用いることができるが、
以下に示すような宿主を用いればより芳香族アミノ酸の
生産性が高い菌株が得られることがある。
【００１５】チロシンの場合 コリネバクテリウム属にフェニルアラニンを要求し３−
アミノチロシン、ｐ−アミノフェニルアラニン、ｐ−フ
ルオロフェニルアラニン、チロシンヒドロキサメートに
耐性を有する変異株Ｈ．Ｈａｇｉｎｏ，Ｋ．Ｎａｋａｙ
ａｍａ：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７，２
０１３（１９７３），ブレビバクテリウム属のｍ−フル
オロフェニルアラニンに耐性を示す変異株Ｓ．Ｓｕｇｉ
ｍｏｔｏ，Ｍ．Ｎａｋａｇａｗａ，Ｔ．Ｔｓｕｃｈｉｄ
ａ，Ｉ．Ｓｈｉｉｏ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，３７，２３２７（１９７３）等がある。
【００１６】トリプトファンの場合 ブレビバクテリウム属のフェニルアラニン、チロシンを
要求し、５−メチルトリプトファンに耐性を有する変異
株（Ｉ．Ｓｈｉｉｏ，Ｈ．Ｓａｔｏ，Ｍ．Ｎａｋａｇａ
ｗａ，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３６，２３
１５（１９７２））、ブレビバクテリウム属のフェニル
アラニンを要求し、ｍ−フルオロフェニルアラニン，５
−フルオロトリプトファンに耐性を有する変異株（Ｉ．
Ｓｈｉｉｏ，Ｓ．Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｍ．Ｎａｋａｇａ
ｗａ，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍｉ．，３９，６
２７（１９７５））、ブレビバクテリウム属のチロシン
を要求し、５−フルオロトリプトファン，アザセリンに
耐性を有する変異株，コリネバクテリウム属のフェニル
アラニン，チロシンを要求し、５−メチルトリプトファ
ン，４−メチルトリプトファン，６−フルオロトリプト
ファン，トリプトファンヒドロキサメート，ｐ−フルオ
ロフェニルアラニン，チロシンヒドロキサメート，フェ
ニルアラニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株
（Ｈ．Ｈａｇｉｎｏ，Ｋ．Ｎａｋａｙａｍａ，Ａｇｒｉ
ｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３９，３４５（１９７
５））等がある。
【００１７】フェニルアラニンの場合 ブレビバクテリウム属のｍ−フルオロフェニルアラニン
耐性を有する変異株（Ｓ．Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｍ．Ｎａ
ｋａｇａｗａ，Ｔ．Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｉ．Ｓｈｉｉ
ｏ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７，２３
２７（１９７３）），ブレビバクテリウム属のチロシ
ン，メチオニンを要求し５−メチルトリプトファン，ｐ
−フルオロフェニルアラニンに耐性を有する変異株（特
開昭４９−１１６２９４），ブレビバクテリウム属のチ
ロシン，メチオニンを要求し、５−メチルトリプトファ
ン，ｐ−フルオロフェニルアラニン耐性、デコイニン感
受性を有する変異株（特開昭５６−６４７９３）コリネ
バクテリウム属のチロシンを要求し、ｐ−フルオロフェ
ニルアラニン，ｐ−アミノフェニルアラニンに耐性を有
する変異株（Ｈ．Ｈａｇｉｎｏ，Ｋ．Ｎａｋａｙａｍ
ａ，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３８，１５７
（１９７４））等がある。
【００１８】ＳＫ遺伝子のほかに、以下の遺伝子が挿入
されていれば芳香族アミノ酸の生産性がより高くなるこ
とが多い。実施例で示す様に３−デヒドロキナ酸シンタ
ーゼをコードする遺伝子，シキミ酸デヒドロゲナーゼを
コードする遺伝子が挿入された場合や、３−デオキシ−
Ｄ−アラビノ−ヘプチユロン酸−７−リン酸（ＤＡＨ
Ｐ）シンターゼ遺伝子、３−デヒドロキナ酸デヒドラタ
ーゼ遺伝子、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン
酸シンターゼ、コリズミ酸シンターゼ遺伝子があげられ
る。
【００１９】加えてトリプトファン生産菌を得ようとす
るときは、アンスラニル酸シンターゼ遺伝子、アンスラ
ニル酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子，Ｎ−
（５′−ホスホリボシル）アンスラニル酸インメラーゼ
遺伝子，インドール−３−グリセロールリン酸シンター
ゼ遺伝子，トリプトファンシンターゼ遺伝子等が挿入さ
れていればよりよい結果が得られることがある。
【００２０】またフェニルアラニン又はチロシン生産菌
を得ようとするときは、プレフェン酸デヒドラターゼ遺
伝子，プレフェン酸トランセアミナーゼ，プレチロシン
デヒドロゲナーゼ遺伝子，チロシンアミノトランスフェ
ラーゼ遺伝子等がＳＫ遺伝子のほかに挿入されているこ
とが望ましい。
【００２１】このようにして得られた芳香族アミノ酸生
産能を有するコリネ型細菌を培養して芳香族アミノ酸を
生成蓄積せしめる方法は、従来コリネ型細菌による芳香
族アミノ酸の製造のために使用されていた方法と特に大
きく違う点はない。即ち、培地としては、炭素源，窒素
源，無機イオン，更に必要に応じアミノ酸，ビタミン等
の有機微量栄養素を含有する通常のものである。炭素源
としては、グルコース，シュクロース，ラクトース等及
びこれらを含有する澱粉加水分解液，ホエイ，糖蜜等が
用いられる。窒素源としては、アンモニアガス，アンモ
ニア水，アンモニウム塩その他が使用できる。
【００２２】培養は好気的条件下で培地のｐＨ及び温度
を適宜調節しつつ、実質的に芳香族アミノ酸の生産蓄積
が停止するまで行なわれる。
【００２３】
【実施例】
【００２４】（１） ＳＫ遺伝子を含む染色体ＤＮＡの
調製 ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＪ１１２
２５（ＦＥＲＭ−ＢＰ１２１９）を１ｌのＣＭＧ培地
（ペプトン１ｇ／ｄｌ、酵母エキス１ｇ／ｄｌ、グルコ
ース０．５ｇ／ｄｌ、及びＮａＣｌ０．５ｇ／ｄｌを含
み、ｐＨ７．２に調製したもの）に植菌し、３０℃で約
３時間振盪培養を行ない、対数増殖期の菌体を集めた。
この菌体をリゾチーム・ＳＤＳで培養させたのち、通常
のフェノール処理法により、染色体ＤＮＡを抽出精製
し、最終的に３．５ｍｇのＤＮＡを得た。
【００２５】（２） ベクターＤＮＡの調製 ベクターとしてｐＡＪ１８４４（分子量５．４メガダル
トン）を用い、そのＤＮＡを次の様にして調製した。ま
ずｐＡＪ１８４４をプラスミドとして保有するブレビバ
クテリウム・ラクトフェルメンタムＡＪ１２０３７（Ｆ
ＥＲＭ−Ｐ５７７）を１００ｍｌのＣＭＧ培地に接種
し、３０℃で対数増殖期後期まで培養したのち、リゾチ
ームＳＤＳ処理により溶菌させ、３０，０００×ｇ，３
０分の超遠心により上清を得た。フェノール処理のの
ち、２容のエタノールを加えてＤＮＡを沈澱回収した。
これを少量のＴＥＮ緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸塩、２
０ｍＭＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））に
溶解後、アガロースゲル電気泳動にかけ分離後、切り出
してｐＡＪ１８４４プラスミドＤＮＡ約１５μｇを得
た。
【００２６】（３） 染色体ＤＮＡ断片のベクターへの
挿入 （１）で得た染色体ＤＮＡ１０μｇと（２）で得たプラ
スミドＤＮＡ５μｇとを制限エンドヌクレアーゼＰｓｔ
Ｉでそれぞれを３７℃に１時間保持し、切断した。６５
℃に１０分間加熱した後、両反応液を混合し、ＡＴＰ及
びジチオスレイトール存在下、Ｔ4 ファージ由来のＤＮ
Ａリガーゼによって１０℃に２４時間保持しＤＮＡ鎖を
連結せしめた。ついで反応液を、６５℃にて５分間加熱
し、反応液に２倍容のエタノールを加えて連結されたＤ
ＮＡの沈澱を採取した。
【００２７】（４） ＳＫ遺伝子のクローニング ＳＫ遺伝子が欠損したブレビバクテリウム・ラクトフェ
ルメンタムＡＪ１２１５７（ブレビバクテリウム・ラク
トフェルメンタムＡＪ１２０３６（ＦＥＲＭＢＰ−７５
５９）を親株とし、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニト
ロソグアニジンにより変異処理することによりフェニル
アラニン，トリプトファン，チロシンの３アミノ酸を生
育に要求する変異株として選択した。）を受容菌として
用いた。
【００２８】形質転換の方法としては、プロトプラスト
トランスフォーメーション法を用いた。まず、菌株を５
ｍｌのＣＭＧ液体培地で対数増殖期の初期まで培養し、
ペニシリンＧを０．６ユニット／ｍｌ添加後、さらに
１．５時間振盪培養し、遠心分離により菌体を集め、菌
体を０．５Ｍシュークロース、２０ｍＭマイレン酸、２
０ｍＭ塩化マグネシウム、３．５％ペナッセイブロス
（Ｄｉｆｃｏ）からなるＳＭＭＰ培地（ｐＨ６．５）
０．５ｍｌで洗浄した。次いで１０ｍｇ／ｍｌのリゾチ
ームを含むＳＭＭＰ培地に懸濁し３０℃で２０時間プロ
トプラスト化を図った。６０００×ｇ、１０分間遠心分
離後、プロトプラストをＳＭＭＰで洗浄し０．５ｍｌの
ＳＭＭＰに再度懸濁した。この様にして得られたプロト
プラストと（３）で調製したＤＮＡ１０μｇを５ｍＭ
ＥＤＴＡ存在下で混合し、ポリエチレングリコールを最
終濃度が３０％になる様に添加した後、ＤＮＡをプロト
プラストに取り込ませるために室温に２分間放置した。
このプロトプラストをＳＭＭＰ培地１ｍｌで洗浄後、Ｓ
ＭＭＰ培地１ｍｌに再懸濁し、形質発現のため、３０℃
で２時間培養した。この培養液をｐＨ７．０のプロトプ
ラスト再生培地上に塗布した。プロトプラスト再生培地
は蒸留水１ｌあたりトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン１２ｇ、ＫＣｌ０．５ｇ、グルコース１０ｇ、Ｍ
ｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ８．１ｇ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ２．２
ｇ、ペプトン４ｇ、粉末酵母エキス４ｇ、カザミノ酸
（Ｄｉｆｃｏ社）１ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4０．２ｇ、コハク酸
ナトリウム１３５ｇ、寒天８ｇ及びクロラムフェニコー
ル３μｇ／ｍｌを含む。
【００２９】３０℃で２週間培養後、約２５０００個の
クロラムフェニコール耐性コロニーが出現してきたので
これを最少培地（２％グルコース、１％硫酸アンモニウ
ム、０．３％尿素、０．１％リン酸二水素カリウム、
０．０４％硫酸マグネシウム７水塩、２ｐｐｍ鉄イオ
ン、２ｐｐｍマンガンイオン、２００μｇ／ｌサイアミ
ン塩酸塩、５０μｇ／ｌビオチン、クロラムフェニコー
ル１０μｇ／ｍｌ、ｐＨ７．０、寒天１．８％）にレプ
リカし、クロラムフェニコール耐性でかつフェニルアラ
ニン，トリプトファン，チロシン要求性の消失した５株
を得た。
【００３０】（５） 形質転換株のプラスミド解析 これらの株より（２）で述べた方法により、溶菌液を調
製し、アガロースゲル電気泳動法により、プラスミドＤ
ＮＡを検出したところ、全ての株でベクターのｐＡＪ１
８４４よりも明らかに大きなプラスミドが検出された。
【００３１】５株のプラスミドをそれぞれ組換えに用い
た制限酵素ＰｓｔＩで切断すると全てのプラスミドに共
通な２．９ｋｂのＤＮＡ挿入断片が認められた。従って
ＳＫ遺伝子２．９ｋｂのＰｓｔＩＤＮＡ断片上に存在す
ると思われる。ベクターｐＡＪ１８４４のＰｓｔＩ切断
点に２．９ｋｂのＤＮＡ断片が挿入された組換プラスミ
ドをｐＡＪ９２７と名付け、２．９ｋｂのＤＮＡ断片以
外に１．１５ｋｂと４．３ｋｂのＰｓｔＩＤＮＡ断片を
有する組換えプラスミドをｐＡＪ１２１９と名付け、ｐ
ＡＪ９２７を保持する株をＡＪ１２１５８ ＦＥＲＭ−
Ｐ７８６５，ｐＡＪ１２１９を保持する株をＡＪ１２１
５９ ＦＥＲＭ−Ｐ７８６６と名付けた。
【００３２】（６） 再トランスホーメーション （５）で検出された２．９キロベースのＤＮＡ断片を含
む組換えプラスミド上にＳＫ遺伝子が存在することを確
認するためこのプラスミドＤＮＡ ｐＡＪ１２１９とｐ
ＡＪ９２７を用い、ブレビバクテリウム・ラクトフェル
メンタムＡＪ１２１５７を再度、形質転換した。生じた
クロラムフェニコール耐性コロニーのうちそれぞれ１０
個を釣り上げフェニルアラニン，トリプトファン，チロ
シンの三重要求性をテストしたところ、これらのいずれ
も要求性が消失しており、上記の組換えプラスミド上に
ＳＫ遺伝子が存在することが明らかとなった。
【００３３】（７） 形質転換株のＳＫ活性 被検株をトリプトファン生産培地（グルコース１３０
ｇ，（ＮＨ4）2ＳＯ4 ２５ｇ，ＫＨ2ＰＯ4１ｇ，ＭｇＳ
Ｏ4・７Ｈ2Ｏ１ｇ，フマル酸１２ｇ，酢酸３ｍｌ，大豆
蛋白酸加水分解液「味液」５０ｍｌ，ＭｎＳＯ4・４Ｈ2
Ｏ１０ｍｇ，ビオチン５０μｇ，サイアミン塩酸塩２０
００μｇ及びＣａＣＯ3 ５０ｇを水１ｌに含む。ｐＨ
６．５）２０ｍｌで３０℃にて２２時間培養した菌体に
より、超音波処理により、溶菌液を調製し、これを３２
０００×ｇ，２０分間遠心分離して上清を得た。この上
清を粗酵素液として用い５０ｍＭ Ｖｅｒｏｎａｌ緩衝
液（ｐＨ９．０），１ｍＭシキミ酸，４ｍＭ ＡＴＰ，
５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，１０ｍＭＮａＦから成る反応液中
で３０℃，３０分間反応させ、反応終了後１Ｍトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）０．２ｍｌを加え、１００℃
で２分間処理し、酵素を失活させる。冷却後３．０ｍｌ
の反応液（シキミ酸を２〜１０μｇ含むように適当に希
釈した反応液）に０．５ｍｌの１％過ヨウ素酸を加え、
３時間室温に放置し、０．５ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウ
ムを加え、ただちに０．３ｍｌの０．１Ｍグリシンを添
加し、３８０ｍμの吸光度を測定することによりシキミ
酸を定量した。反応液中に添加したシキミ酸の量から反
応終了後のシキミ酸の量を差し引き、ＳＫ活性を求め
た。第１表に測定結果を示す。
【００３４】
【表１】
【００３５】（８） 組換えプラスミド ｐＡＪ９２７，ｐＡＪ１２１９上のシキミ酸デヒドロゲ
ナーゼ遺伝子及び３−デヒドロキナ酸シンターゼ遺伝子
の同定 ｐＡＪ９２７及びｐＡＪ１２１９を大腸菌Ｋ−１２株由
来のシキミ酸デヒドロゲナーゼ欠損株ＡＢ２８３４，３
−デヒドロキナ酸シンターゼ欠損株ＡＢ２８４７（Ｊ．
Ｐｉｔｔａｒｄ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．，１４９４，９１，１９６６）に導入した。
【００３６】大腸菌はＫ−１２株の変異株ＡＢ２８３
４，２８４７へはＤＮＡ受容菌細胞を塩化カルシウムで
処理してＤＮＡの透過性を増す方法を用いてｐＡＪ９２
７，ｐＡＪ１２１９を形質転換し、生じたクロラムフェ
ニルコール耐性コロニーのうちそれぞれ１０個を釣り上
げフェニルアラニン，チロシン，トリプトファン要求性
を調べた。ｐＡＪ９２７，ｐＡＪ１２１９ともＡＢ２８
４７の全ての要求性を消失したが、ＡＢ２８３４の要求
性はｐＡＪ９２７の形質転換株では消失せず、ｐＡＪ１
２１９の形質転換株では全ての要求性が消失した。
【００３７】従ってｐＡＪ９２７にはＳＫ，３−デヒド
ロキナ酸シンターゼ遺伝子が２．９ｋｂの挿入ＰｓｔＩ
ＤＮＡ断片上にクローニングされており、ｐＡＪ１２１
９にはＳＫ，３−デヒドロキナ酸シンターゼ，シキミ酸
デヒドロゲナーゼ遺伝子がクローニングされていること
が判明した。
【００３８】（９） 形質転換株のシキミ酸デヒドロゲ
ナーゼ活性 （７）で述べた方法により野生株ＡＪ１２０３６，及び
ｐＡＪ１２１９の形質転換株の粗酵素液を調製した。
０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４），０．８ｍ
Ｍ ＮＡＤＰ，４ｍＭシキミ酸から成る反応液中に上述
の粗酵素液を添加し、３４０ｎｍの吸光度の増加を測定
しシキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を求めた。結果を第２
表に示す。
【００３９】
【表２】
【００４０】（１０） ＳＫ遺伝子のサブクローニング ｐＡＪ９２７を制限酵素ＢｇｌＩＩで完全に切断し、６
５℃，１０分間加熱した後、ＡＴＰ及びジチオスレイト
ール存在下でＴ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼによっ
て４℃に一晩放置しＤＮＡ鎖を連結せしめた。ついで反
応液を６５℃にて１０分間加熱し、反応液に２倍容のエ
タノールを加えて連結されたＤＮＡの沈澱を採取した。
ＴＥＮ緩衝液に溶解後、制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、
６５℃，１０分間加熱した後、反応液に２倍容のエタノ
ールを加えてＤＮＡの沈澱を採取し、これに少量のＴＥ
Ｎ緩衝液を加え形質転換に用いた。
【００４１】（４）で示した形質転換方法を用いてブレ
ビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＪ１２１５７
を形質転換した。３０℃で２週間クロラムフェニコール
３μｇ／ｍｌを含む再生培地で再生させた後、最少培地
にレプリカし、クロラムフェニコール耐性でかつフェニ
ルアラニン，チロシン，トリプトファンに三重要求性が
同時に消失した株を多数得た。これらの株全てがｐＡＪ
９２７により小型のプラスミドｐＡＪ９１２を有してい
た。尚ｐＡＪ９２７及びｐＡＪ９１２は図１に示す制限
酵素切断地図を有する。
【００４２】ｐＡＪ９１２を用いてＡＪ１２１５７を再
度形質転換し、生じたクロラムフェニコール耐性コロニ
ーを釣り上げフェニルアラニン，チロシン，トリプトフ
ァンの要求性をテストしたところ、これらのいずれもが
同時に三つの要求性を消失しており、上記の組換えプラ
スミド上にＳＫ遺伝子が存在することが明らかとなっ
た。
【００４３】次にｐＡＪ９１２を大腸菌Ｋ−１２株の変
異株３−デヒドロキナ酸シンターゼ欠損株ＡＢ２８４７
に形質転換した。生じたクロラムフェニコール耐性コロ
ニーを釣り上げフェニルアラニン，チロシン，トリプト
ファン要求性を調べたが、いずれもが要求性を回復しな
かった。したがってｐＡＪ９１２は３−デヒドロキナ酸
シンターゼ遺伝子が一部もしくは完全に消失しているも
のと考えられる。
【００４４】（１１） 各形質転換株のトリプトファン
生産能 上記のｐＡＪ９２７，ｐＡＪ９１２，ｐＡＪ１２１９を
用い、ｍ−フルオロフェニルアラニン及び５−フルオロ
トリプトファン耐性株ブレビバクテリウム・ラクトフェ
ルメンタムＭ２４７及びコリネバクテリウム・グルタミ
カム（ＡＴＣＣ１３０６０）を（４）で述べた方法によ
り形質転換し、クロラムフェニコール耐性を指標として
形質転換株を選択した。かくして得られたＡＪ１２１６
０（ＦＥＲＭ−Ｐ７８６７），ＡＪ１２１６１（ＦＥＲ
Ｍ−Ｐ７８６８），ＡＪ１２１６９（ＦＥＲＭ−Ｐ７８
６９），ＡＪ１２１７０（ＦＥＲＭ−Ｐ７８７０），Ａ
Ｊ１２１７１（ＦＥＲＭ−Ｐ７８７１）を培養し、トリ
プトファン生産能を調べたところ第３表に示す結果を得
た。
【００４５】培養はトリプトファン生産培養（グルコー
ス１３０ｇ，（ＮＨ4）2ＳＯ4 ２５ｇ，フマル酸１２
ｇ，酢酸３ｍｌ，ＫＨ2ＰＯ4１ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ
１０ｍｇ，ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ１ｇ，ｄ−ビオチン５０
μｇ，サイアミン塩酸塩２０００μｇ，メチオニン４０
０ｍｇ，チロシン６５０ｍｇ，大豆蛋白酸加水分解液
「味液」５０ｍｌ，ＣａＣＯ3 ５０ｇを水１ｌに含む、
ｐＨ６．５）２０ｍｌを５００ｍｌの坂口フラスコに入
れたものに被検菌株を植えつけ、３０℃にて７２時間，
振盪下に行なった。培養後、遠心上清中のＬ−トリプト
ファンをロイコノストック・メセントロイデス（Ｌｅｕ
ｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＡＴ
ＣＣ８０４２を定量菌株として用いるバイオアッセイ法
によって求めた。
【００４６】
【表３】
【００４７】尚、ＡＪ１２１５７，Ｍ２４７を得るため
には寄託されたＡＪ１２１５８及びＡＪ１２１６０より
宿主細胞を損うことなく宿主細胞中の複合プラスミドを
除去することが可能である。即ち、プラスミドは宿主よ
り自然に失なわれることもあるし、「除去」操作によっ
て除くこともできる（Ｂａｃｔ．Ｒｅｖ．，３６，ｐ３
６１−４０５（１９７２））。他の除去操作の例は以下
の通りである。ＡＪ１２１５８，ＡＪ１２１６０をＣＭ
Ｇ液体培地に接種し、３７℃で一晩培養（高温処理）
後、培養液を適当に希釈し、クロラムフェニコールを含
有しないＣＭＧ寒天培地に塗布し、３０℃で１〜３日間
培養する。かくしてクロラムフェニコール感受性株とし
て分離される株がＡＪ１２１５７，Ｍ２４７である。
【００４８】
【発明の効果】コリネ型細菌細胞内で発現しＳＫをコー
ドする遺伝子がコリネ型細菌細胞内で増殖しうるプラス
ミドベクターに接続されている組換えＤＮＡを有するコ
リネ型細菌を分離することに成功し、得られたコリネ型
細菌を用いて芳香族アミノ酸のより効率のよい製造法を
提供することに成功した。
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＡＪ９２７及びｐＡＪ９１２の制
限酵素切断地図を示す。
【図２】プラスミドｐＡＪ９１２の挿入断片の制限酵素
地図を示す。
【図３】プラスミドｐＡＪ９２７の挿入断片の制限酵素
地図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/60 // Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ 15/54 15/77 (Ｃ１２Ｎ 15/53 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 15/60 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 15/54 Ｃ１２Ｒ 1:13）

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】図２に示す制限酵素切断パターンを有し約
    １．９ｋｂの長さでありかつシキミ酸キナーゼをコード
    する遺伝子を含むコリネ型細菌由来のＤＮＡ断片を含有
    する、コリネ型細菌細胞内で増殖しうる組換えＤＮＡを
    保持するコリネ型細菌を培養することを特徴とする芳香
    族アミノ酸の製造法。
  2. 【請求項２】図３に示す制限酵素切断パターンを有し約
    ２．９ｋｂの長さでありかつシキミ酸キナーゼをコード
    する遺伝子と３−デヒドロキナ酸シンターゼをコードす
    る遺伝子を含むコリネ型細菌由来のＤＮＡ断片を含有す
    る、コリネ型細菌細胞内で増殖しうる組換えＤＮＡを保
    持するコリネ型細菌を培養することを特徴とする芳香族
    アミノ酸の製造法。
  3. 【請求項３】図３に示す制限酵素切断パターンを有し約
    ２．９ｋｂの長さでありかつシキミ酸キナーゼをコード
    する遺伝子と３−デヒドロキナ酸シンターゼをコードす
    る遺伝子を含むコリネ型細菌由来のＤＮＡ断片を内部に
    含有し、約８．３５ｋｂの長さであり両端に制限酵素Ｐ
    ｓｔＩ部位を有しかつシキミ酸キナーゼをコードする遺
    伝子と３−デヒドロキナ酸シンターゼをコードする遺伝
    子およびシキミ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子
    を含むコリネ型細菌由来のＤＮＡ断片を含有する、コリ
    ネ型細菌細胞内で増殖しうる組換えＤＮＡを保持するコ
    リネ型細菌を培養することを特徴とする芳香族アミノ酸
    の製造法。
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