JPH0353915B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はＬ−システインの誘導体であるＳ−カ
ルボキシメチル−Ｌ−システイン（以下、単にカ
ルボキシメチルシステイン又はSMCと略す。）の
製造法に関する。 カルボキシメチルシステインは気管支炎の治療
剤、特に去痰剤あるいは解毒剤等に用途を有する
化合物であり、その製造法は人毛の加水分解物か
ら分離されるシスチンを還元してＬ−システイン
とし、このＬ−システインにモノハロゲン酢酸を
反応する方法で製造されている。 Ｌ−システインは上記の如く人毛等を原料とす
るため供給量に限度があり、これに代る工業的生
産方法の開発が望まれていた。 これに対し、本出願人においては既に、２−ア
ミノ−チアゾリン−４−カルボン酸（以下、
ATCと記す。）を原料とし、微生物の作用を利用
してシステイン又はシスチンを製造する方法（特
開昭51−70881、51−54983又は特公昭54−2272号
公報参照）を開発した。 この方法はＬ−システインの工業生産に適した
方法であるが、ATCのシステインへの水解反応
は反応液中に生成されるシステインによつて強く
阻害されるためシステインを直接得ることができ
ない。そこで、この方法に於てはATCを水解し
てシステインを生成する反応とシステインのシス
チンへの酸化反応を同時に行いATC水解反応に
阻害作用のないシスチンを生成させ、このシスチ
ンを還元してシステインとする方法を採用せざる
を得ない。従つて、このATCを原料とする方法
は工程が長くかつ煩雑であり、更に、収率の低い
点についても改善が望まれていた。 そこで本発明者等はATCから直接カルボキシ
メチルシステインを効率良くかつ高収率で製造す
る方法を開発することを目的として鋭意研究を重
ねた結果、ATCを水解してシスチンを生成する
能力を有する微生物を一定量のアセトンの存在下
でATCに作用せしめると２，２−ジメチルチア
ゾリジン−４−カルボン酸が高収率で生産され、
この２，２−ジメチルチアゾリジン−４−カルボ
ン酸にアルカリ条件下でモノハロゲノ酢酸を反応
させるとカルボキシメチルシステインが効率良く
かつ高収率で生産できることを発見した。本発明
はこの発見に基いて完成されたものである。 本発明で使用する微生物はATCを水解してシ
ステイン又はシスチンを生成する能力を有する微
生物であり、例えば特開昭51−54983、51−70881
及び特公昭54−2272号公報に記載されているアク
ロモバクター、アルカリゲネス、バチルス、ブレ
ビバクテリウム、エンテロバクター、エルビニ
ア、エツシエリヒア、フラボバクテリウム、ミク
ロコツカス、ミコプラナ、シユードモナス、サル
シナあるいはセラチアの各属に属し、ATCを水
解してシステイン又はシスチンを生成する能力を
有する微生物であり、より具体的に例示するなら
ば次の如き菌株があげられる：

【表】

【表】 微生物を培養するため培地は炭素源、窒素源、
無機イオン、更に要すれば有機微量栄養素を適宜
含有する培地であり、例えば、炭素源としてグル
コース、シユクロース、キシロース、糖蜜等の糖
類、酢酸等の有機酸、エタノール、グリセロー
ル、メタノール等のアルコール類など、窒素源と
して硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなど、
有機栄養源として、酵母エキス、ペプトン、肉エ
キス、コーン・ステイープリカーなど、無機イオ
ンとして、マグネシウム、鉄、マンガン、カリウ
ム、ナトリウム、リン酸などのイオンが適宜用い
られる。 微生物の培養法は常法に従つて行えば良く、上
記培地のPHを６〜９とし、20〜40℃で好気的に培
養すれば良い。 培養に際してはATCを少量添加することが望
ましくATCの水解活性の高い微生物菌体が得ら
れる。本発明の方法では、このようにして得られ
た微生物を酸素源として使用する。酸素源として
はこのようにして得られた培養液、培養液から分
離した分離菌体、洗滌生菌体、凍結乾燥体、アセ
トン乾燥菌体、物理的、化学的もしくは生化学的
に破壊された菌体、抽出液、粗精製物、精製物、
精製蛋白標晶、または菌体もしくは精製処理物の
固定化物などが酵素源として使用される。 原料であるATCは合成法にて供給されるＤ−
体、Ｌ−体、ラセミ体のいずれもが使用される。 基質濃度は、バツチ式、連続式によつても異な
るが、バツチ式、連続式によつても異なるが、バ
ツチ式では一般に水性媒質中0.1〜30％、好まし
くは0.5〜10％程度で連続式では、これよりやや
濃度を低下させた方が好ましい。 反応はアセトンを２〜40％、望ましくは５〜20
％含む水溶液中で行われる。反応に際してヒドロ
キシルアミン又はセミカルバチドを添加すること
が望ましく、反応収率を向上することができる。 反応温度は15〜60℃、好ましくは30〜50℃であ
り、PHは６〜10、好ましくは７〜9.5の範囲であ
る。このような条件下でATCに微生物を作用さ
せるとATCはシステインに水解されシステイン
はアセトンと縮合してDTCが高収率で蓄積され
る。DTCはシステインと異りATCのシステイン
への水解反応を阻害しないのでDTCの反応収率
は高く90％以上に達し、かつ反応時間も短く１〜
25時間で終了する。 反応終了後、反応液にモノハロゲン酢酸又はそ
の塩類を加え反応後のPHをアルカリ性、望ましく
は10.0以上のアルカリ性に調節し、20〜60℃の温
度に10分〜３時間保持して反応することによりカ
ルボキシメチルシステインが高収率で生成され
る。 モノハロゲノ酢酸としてはモノクロロ酢酸、モ
ノヨード酢酸、モノブロモ酢酸、モノフルオロ酢
酸等が使用され、その添加量はDTCと等モル以
上加えることが望ましい。 反応液からカルボキシメチルシステインを採取
する方法は公知の方法に従つて行えば良く、例え
ばカルボキシメチルシステインは酸性条件で簡単
に結晶化するので反応液から不溶性物質を除去し
た後、酸性化で結晶化する方法によつて簡単に採
取される。 以下、実施例にて説明する。 実施例 １ 第１表に示す組成の培地を調製し、500ml容振
盪フラスコに50ml宛分注し、120℃にて10分間加
熱した。

【表】 この培地にシユードモナス・デスモリチカ
AJ3868 FREM−P2816を接種し、30℃にて24時
間振盪培養した、培養液を遠心分離して菌体を採
取し、湿菌体5.0ｇを下記組成の基質溶液100mlに
添加し、30℃に保持し時々軽くかきまぜて16時間
反応を行つた。

【表】 反応終了後、各反応液にモノクロル酢酸ナトリ
ウムを3.3ｇ添加し、苛性ソーダ液を加えてPHを
13.5に調節し、30°に1.0時間保持して反応を行い、
カルボキシメチルシステインを生成せしめ、その
生成量をカチオン交換樹脂「ZYPAX SCX」を
用いる高速クロマトグラフイーにより定量した。
その結果を第３表に示す。

【表】 尚、アセトン5.0％の条件で酵素反応を行つた
反応液についてモノクロロ酢酸ナトリウムの代り
にモノフルオロ酢酸、モノヨード酢酸又はモノブ
ロモ酢酸を用いて同様の反応を行つた結果、生成
されたカルボキシメチルシステインの量は夫々
2.2ｇ、2.2ｇ及び2.3ｇであり、殆んど差は認めら
れなかつた。 次にDTC1.3ｇとモノクロル酢酸1.92ｇを70ml
の水に加え苛性ソーダ液を用いてPHを6.0〜14.0
に調節し、全量を水で100mlとした。この溶液を
夫々30℃に１時間保持して反応を行い反応PHと
SMCの生成との関係を調べた。その結果を第４
表に示す。

【表】 実施例 ２ 実施例１の方法で得られた湿菌体5.0を凍結乾
燥したもの、あるいは湿菌体5.0を0.1M、PH7.0の
リン酸緩衝液50mlに懸濁し、これに超音波処理
（トミー精工社製LIR−200P型、20KC、５分間）
したもの、更には湿菌体5.0ｇを脱イオン水20ml
に懸濁し、これにアクルアミド3.8ｇとメチレン
ビスアクリルアミド225mgを加えN₂ガスを流して
酸素を除去し、過硫酸アンモニウム17.5mg及び
N′，N′−ジメチルアミノプロピオニトリル40μｇ
を加えて固定化した固定化物を夫夫調製した。こ
れらの標品を第２表に示す組成の基質溶液（アセ
トンの量は5.0％）100mlに加え30℃に16時間保持
して酸素反応を行つた。 反応終了後各反応液より不溶性物質を除去し、
モノクロル酢酸ナトリウムを3.3ｇ添加し、苛性
ソーダを加えてPHを13.5に調節した後、30℃に
1.0時間保持して反応を行つた。反応液中に生成
したカルボキシメチルシステインの量を第５表に
示す。

【表】 実施例 ３ 第５表に示す微生物を第１表に示す培地で実施
例１の方法に従つて培養した。夫々の培養液を遠
心分離し、湿菌体5.0ｇを取つてこれを第２表に
示す基質溶液（アセトン量は5.0％）100mlに懸濁
し、30℃に24時間保持して反応を行つた。反応終
了後モノクロル酢酸ナトリウムを3.3ｇ加え反応
液のPHを13.0に調節し、30℃に１時間保持してカ
ルボキシメチルシステインを生成せしめた。高速
液体クロマトグラフイーで定量した結果を第６表
に示す。

【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ２−アミノ−チアゾリン−４−カルボン酸を
   水解してＬ−システイン又はＬ−シスチンを生成
   する能力を有する微生物を、アセトンの存在下で
   ２−アミノ−チアゾリン−４−カルボン酸に作用
   させて、２，２−ジメチルチアゾリジン−４−カ
   ルボン酸を生成せしめ、該２，２−ジメチルチア
   ゾリン−４−カルボン酸をアルカリ性条件下でモ
   ノハロゲノ酢酸と反応させてＳ−カルボキシメチ
   ル−Ｌ−システインを生成せしめることを特徴と
   するＳ−カルボキシメチル−Ｌ−システインの製
   造法。