JPH01252289A - メチオニンエンケファリン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は２モルヒネ様鎮痛作用を示すペプチドであるメ
チオニンエンケファリン（チロシン（Ｔｙｒ）−グリシ
ン（Ｇ　ｌ　ｙ）−グリシン（Ｇｌｙ）−フェニルアラ
ニン（Ｐｈｅ）−メチオニン（Ｍｅｔ）の５個のアミノ
酸配列よりなるペプチド。

以下、ＭＥＫと略す。）を含む融合タンパク質を大量に
生産可能とする新規組換えプラスミドｐＭＥＫ２．ｐＭ
ＥＫ２を含有する大腸菌、ＭＥＫを酵素のカルボキシ末
端側に有するジヒドロ葉酸還元酵素−ＭＥＫ融合タンパ
ク質（以下、ＤＨＦＲ−ＭＥＫと略す。）、ＤＨＦＲ−
ＭＥＫの分離精製方法、およびＭＥＫの製造方法に関す
るものである。本発明の新規組換えプラスミドｐＭＥＫ
２は、第１図ここおいて示されるＤＮＡ配列を有する。

本発明は１発酵工業、医薬品工業等の分野に好適である
。

従来の技術 ＭＥＫは、コイシンエンケファリン（以下、ＬＥＫと略
す。）と同様９モルヒネ様鎮痛作用を示す内因性ペプチ
ドとして知られ、習慣性のない鎮痛剤または麻酔薬とし
ての利用が期待される興味深い生理活性ペプチドである
。ＭＥＫの鎮痛効果は、ＬＥＫの約１．５倍であるとさ
れている。

本発明の技術的背景としては、いわゆる遺伝子操作技術
がある。しかしながら、遺伝子操作を利知ら←・５Ｆ゛
な国 一ガ７−既に２本発明者らは、大腸菌由来のジヒドロ葉
酸還元酵素（以下、ＤＨＦＲと略す。）遺伝子に関して
、その遺伝子の改変の結果、異種遺伝子発現用プラスミ
ドベクターｐＴＰ７０−１（特願　昭６１−３１２８３
６）及びそれを利用した融合遺伝子の作成方法（特願　
昭６２−３０２１５３）を開発している。これらの方法
を利用した場合、融合遺伝子の発現の結果得られる融合
タンパク質の大腸菌面体の蓄積量は、全菌体タンパク質
の約２０％が期待される。しかしながら２ＭＥＫの生産
に上記発現ベクターを用いた例はない。

発明の目的 本発明の目的は、いまだ確立されていない、遺伝子操作
の手法を用いたＭＥＫの大量生産方法を開発することに
ある。

既に２本発明者らは（１）大腸菌のＤＨＦＲを大量に発
現する発現プラスミドを構築していること（特願　昭６
Ｏ−２１０８１３）、（２）大腸菌のＤＨＦＲのカルボ
キシ末端側の配列を変化させても、酵素活性か失われな
いこと、　く３）大腸菌のＤＨＦＲのカルボキシ末端側
に異種ペプチドを融合させることを可能とするプラスミ
ドベクターｐＴＰ７０−１を構築していること（特願　
昭６ｌ−３１２８３６）、　　（４）ｐＴＰ７０−１上
の改変ＤＨＦＲは、大腸菌て効率良く発現すること。

を明らかにしている。

本発明者らは、上記の知見を利用し、鋭意研究の結果、
ＭＥＫ遺伝子を化学合成し、ｐＴＰ７０−１に絹み込む
ことにより、ＭＥＫ遺伝子とＤＨＦＲ遺伝子の融合遺伝
子を作成し、融合遺伝子を大腸菌て発現させることによ
り、ＤＨＦＲ−ＭＥＫを大量に生産できることを見いた
し、さらに。

ＤＨＦＲ−ＭＥＫを用いることにより効果的にＭＥＫを
作成てきることを明らかにい本発明を完成させた。

発明の構成 本発明は、　　（１）ＤＨＦＲ−ＭＥＫの大量発現□１
１１１ を可能にす：る新規組換えプラスミドｐ　ＭＥ　Ｋ　２
゜、２几轟。、＠、□６□□ヶ２，３、 ｐＭＥＫ２を含有する大腸菌が生産するＤＨＦＲ−ＭＥ
Ｋ、　　（４）ｐＭＥＫ２を含有する大腸菌からのＤＨ
ＦＲ−ＭＥＫの分離精製、および（５）Ｄ　ＨＦ　Ｒ−
ＭＥ　Ｋを用いたＭＥＫの製造方法、の発明により構成
される。

（１）新規組換えプラスミドｐＭＥＫ２第１図は５本発
明のｐＭＥＫ２の全塩基配列を示している。図は、２本
鎖環状ＤＮＡのうち片方のＤＮＡ鎖配列配列を、プラス
ミド中に２箇所存在する制限酵素Ｃ１ａＩ部位のうちＨ
ｉｎｄ１１１部位に近い方の切断認識部位、　５’−Ａ
ＴＣＧＡＴ−３’、の最初の”Ａ”を１番として数えて
、５′末端から３′末端の方向に記述している。本発明
のｐＭＥＫ２は。

新規な組換えプラスミドである。ｐＭＥＫ２は。

４６４０塩基対の大きさであり、宿主である大腸菌にト
リメトプリムおよびアンピシリン耐性を付与することが
できる。ｐＭＥＫ２は、ｐＴＰ７０−１０ＢａｍＨＩ部
位にＭＥＫを暗号化する配列を含む３２塩基対の化学合
成りＮＡが結合した構造をしていてる。第１図において
、５３３番目から５６４番目迄の配列が化学合成りＮＡ
由来の配列である。それ以外の配列がｐＴＰ７０−１由
来の配列である。

化学合成したＤＮＡの配列には、制限酵素Ｘｈ。

■の認識切断部位、　５’−ＣＴＣＧＡＧ−３’　（第
１図の、５５８番目から５６３番目までの配列）、を含
ませである。ｐＴＰ７０−１由来の部分には、Ｘｈ。

１部位が存在しない。従って、ｐＭＥＫ２のＢａｍＨＩ
部位（第１図の５３２番目から５３７番目までの配列）
からＸｈｏ　１部位までの配列を他の配列に置き換える
ことにより、方向を定めて異種ＤＮＡの導入を行い、Ｄ
ＨＦＲ遺伝子との融合遺伝子の作成をさらに容易に行う
ことができる。

第１図の５７番目から５５４番目まで配列は。

ＤＨＦＨのカルボキシ末端側にＭＥＫがアルギニンを介
して結合したＤＨＦＲ−ＬＥＫを暗号化しる配列が存在
する（特願　昭６１−３１２８３６）。即ち、４３番目
から５０番目までの配列がＳＤ配列と呼ばれるもので、
効率の良い翻訳に、また。

４５９８番目から４６２６番目までが、コンセンサス転
写プロモーターであり、効率の良い転写に貢献する。こ
のことから、ｐＭＥＫ２は、大腸菌に導入された場合、
多量のＤＨＦＲ−ＭＥＫを作る。作られたＤＨＦＲ−Ｌ
ＥＫは、菌体内に可溶性の状態で、菌体タンパク質の約
２０％程度蓄積する。このことによって、ｐＭＥＫ２を
含有する大腸菌はトリメトプリム耐性を示すようになる
。

また、ｐＭＥＫ２は、ｐＴＰ７０−１由来の、アンピシ
リン耐性遺伝子を有している。このことから＋　　ｐＭ
ＥＫ２が導入された大腸菌は、アンピシリン耐性をも示
す。ｐＭＥＫ２は、大腸菌に導入されて安定状態に保た
れ、ｐＭＥＫ２を含有する大腸菌は、微工研にＦＥＲｒ
１３Ｐ−１８１８として寄託されている。

このような特長を有するｐＭＥＫ２は、実施例１に従っ
て作成することができるが２Ｍｉ換えプラスミドの作成
方法によって本発明が制限されるものではない。

（２）　ｐＬＥＫｌを含有する大腸菌 ｐＭＥＫ２を含有する大腸菌は、トリメトプリム及びア
ンピシリンに対して耐性を示す。ｐＭＥＫ２を含有する
大腸菌は、ｐＭＥＫ２上のＤＨＦＲ−ＭＥ　Ｋ遺伝子の
効率のよい発現の結果、　ＤＨＦ　Ｒ−ＭＥ　Ｋを菌体
内に可溶性の状態で大量に蓄積する。ｐＭＥＫ２を含有
する大腸菌をＹＴ＋Ａｐ培地（培地１１中に、５ｇのＮ
ａＣＬ　　８ｇのトリプトン、５ｇのイーストエキス、
及び５０ｍｇのアンピシリンナトリウムを含む液体培地
）を用いて、３７℃で定常期まで培養した場合、蓄積す
るＤＨＦＲ−ＭＥＫは５面体タンパク質の約２０％に達
する。培養菌体を、リン酸緩衝液などの適当な緩衝液に
懸濁し、フレンチプレス法もしくは音波−暖酔法で破砕
し、これを遠心分離法によりＦ　Ｒ−ＭＥ　Ｋは上溝中
に回収される。ｐＭＥＫ２を含有する大腸菌は、微工研
にＦＥＲＭＩ３Ｐ−１８１６として寄託されている。

（３）ＤＨＦＲ−ＭＥＫ 第２図は、　　ＤＨＦＲ−ＭＥＫを暗号化する部分のＤ
ＮＡ配列とそれから作られると予想されるタンパク質の
アミノ酸配列を示している。ＤＨＰＲ−ＭＥ、には、１
６６アミノ酸よりなる新規なタンパク質である。アミノ
末端側から数えて、１から１５９番目までの配列が、大
腸菌の野生型ＤＨＦＲに１筒所アミノ酸置換置換が起こ
った（Ｃｙｓ−１５２（ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ）　＋　Ｇ
ｌｕ−１５２）配列であり、１６２番目から１６６番目
までがＭＥＫの配列である。ＭＥＫの配列の直前のアミ
ノ酸はアルキニン（Ａｒｇ）である。このことにより、
ＤＨＦＲ−ＭＥＫをトリプシンで処理することにより、
ＭＥＫを特異的に切り出すことができる。１６０番目の
イソロイシン（ｌｌｅ）は、ｐＴＰ７０−１のＢａｍＨ
Ｉ部位にＭＥＫを暗号化するＤＮＡを導入する際に、遺
伝暗号の読み取り枠を合わせるために生じた配列である
。ｐＴＰ７０−１が作るＤＨＦＲは、１６２個のアミノ
、酸よりなり、第２図のＤＨＦＲ−ＭＥＫのアミノ酸配
列のうち、アミノ末端側から数えて。

１から１６０番目までの配列に、　Ｇｌｎ−１１ｅの２
個のアミノ酸配列が結合した配列をしている。ＤＨＦＲ
−ＭＥ　Ｋの分子量は、１８，８５０である。

ＤＨＦＲ−ＭＥＫは、新規なタンパク質である。

ＤＨＦＲ−ＭＥＫはＤＨＦＲのカルボキシ末端側に、Ｍ
ＥＫが融合した構造をしているにもかかわらず、ＤＨＦ
Ｒ酵素活性を有する。このため、大腸菌がＤＨＦＲ−Ｍ
ＥＫを多量につくると、　ＤＨＦＲの阻害剤であり抗細
菌剤であるトリメトプリムに対して、耐性を示すように
なる。

（４）ＤＨＦＲ−ＭＥＫの分離精製 本発明のＤＨＦＲ−ＭＥＫの分離精製法は、■面体の培
養、■菌体の破砕、■ＤＥＡＥ−）ヨパール力うム処理
、■メソトリキセート（ＭＴＸ）結合アーｉ、：ｌ：□
′１４ティクロマトグラフィー、および■Ｄ　ＥＡＥ“
“°二一ンヨパール力うムク口マトグラフイーの過程よ
り成り立っている。

■菌体の培養 ｐＭＥＫ２を含有する大腸菌の培養は、ＹＴ＋Ａｐ培地
（培地ｌｌ中に、５ｇのＮａＣｌ、　８ｇのトリプトン
、５ｇのイーストエキスおよび５０ｍｇのアンピシリン
ナトリウムを含む液体培地。）で培養することができる
。培地としては、この他にＳＴ＋Ａｐ培地（培地ｌｌ中
に、２ｇのグルコース、１ｇのリン酸２カリウム、５ｇ
のポリペプトン、５ｇのイーストエキスおよび５０ｍｇ
のアンピシリンナトリウムを含む液体培地。）など。

菌体が成長する培地であれは、との様な培地でも用いる
ことができるが、調べた限りでは、ＤＨＦＲ−ＭＥＫの
生産にはＹＴ＋Ａｐ培地が最適であった。

ｐ、ＭＥＫ２を含有する大腸菌を、培地に接種い３７６
Ｃで対数成長期の後期もしくは定常期まで培養する。培
養温度により菌体中のＤＨＦＲ−Ｍ１ｌ− ＥＫの蓄積量が変動い調べた限りでは、培養温度が高い
ほど蓄積量が大であった。培養した菌体は、５，０００
回転／分の遠心分離により集める。

培地１１より湿重量２から４ｇの菌体が得られる。

集菌およびこれ以後の操作は、特に断わらない限り低温
（０から１０°Ｃの間、４°Ｃが望ましい）で行う。

■面体の破砕 培養して得られた面体を、湿重量の３倍の緩衝液１　（
０，１ｍＭ　　エチレンジアミン４酢酸ナトリウム（Ｅ
ＤＴＡ）を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７
，０）に懸濁いフレンチプレスを用いて菌体を破砕する
。菌体破砕液を５，０００回転、１０分間遠心分離し、
上溝を得る。さらに、上清を、３５，０００回転、１時
間超遠心分離し、上清を得る（無細胞抽出液）。

■ＤＥＡＥ−）ヨバール力ラム処理 この操作は２次の精製過程の前処理の目的で行う。無細
胞抽出液を、あらかじめＯ，ＩＭのＫＣｌを含む緩衝液
１で平衡化したＤＥＡＥ）ヨバーｌ２− ＣＩを含む緩衝液１を用いて行う。溶出液を一定量ずつ
フラクションコレクターを用いて分画する。

分画した溶出液についてＤＨＦＲ活性を測定い酵素活性
が含まれる両分を集める。

■ＭＴＸ結合アフィニティクロマトグラフィー上記の操
作により得られた酵素液を、あらかじめ緩衝液１て平衡
化したＭＴＸ結合５ｅｐｈａｒｏｓｅアフィニティカラ
ムに吸着させる。吸着後、ＩＭのＫＣｌを含む緩衝液２
　（０，１ｍＭ　　ＥＤＴＡを含む１０ｍＭリン酸カリ
ウム緩衝液、ｐＨ８，５）で洗う。洗いは、カラムから
の溶出液の２８０ｎｍの吸光度を測定し、吸光度が０．
　１以下になるまで同緩衝液を流し続ける。酵素の溶出
は、ＩＭのＫＣＩと３ｍＭの葉酸を含む緩衝液２を用い
て行い、溶出液を一定量ずつフラクションコレクターを
用いて分画する。分画した溶出液についてＤＨＦＲ活性
を測定し、酵素活性が含まれる画分を集める。得られた
酵素液を、緩衝液１に対して。

３回透析する。この段階で、純度９０％以上のＤＨＦＲ
−ＭＥＫが得られる。

■ＤＥＡＥ−）ヨバール力ラムクロマトグラフィ透析し
た酵素液を、あらかじめ緩衝液１て平衡化したＤＥＡＥ
−１ヨパール力ラムに吸着させる。

吸着後、０．１ＭＫＣｌを含む緩衝液１で洗う。

洗いは、カラムからの溶出液の２８０ｎｍの吸光度を測
定し、吸光度が０．０１以下になるまで同緩衝液を流し
続ける。酵素の溶出は、緩衝液１を用いてＯ，１Ｍから
０．３ＭのＫＣＩの直線濃度勾配を用いて行い、溶出液
を一定量ずつフラクションコレクターを用いて分画する
。分画した溶出液について２８０ｎｍの吸光度とＤＨＦ
ＲＨＦ上を測定する。酵素活性／２８０ｎｍの吸光度の
値が、一定な画分を集める。

以上の操作により、ＤＨＦＲ−ＭＥＫの高度精製均一化
を、再現性良く行うことができる。

本発明に従うと、ＤＨＦＲ−ＭＥＫの精製は。

培養を含−めで−週間以内に行うことができ２回収きる
シー−−一−− ＤＨＦＲ酵素活性は２反応液　（０，０５ｍＭのジヒド
ロ葉酸、０．０６ｍＭのＮＡＤＰＨ，１２ｍＭの２−メ
ルカプトエタノール、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０））を、１ｍｌのキュベツトとり、これに酵素液を
加え、３４０ｎｍの吸光度の時間変化を測定することに
より行う。　酵素１ユニツトは、上記反応条件において
、１分間に１マイクロモルのジヒドロ葉酸を還元するの
に必要な酵素量として定義する。この測定は２分光光度
計を用いて容易に行うことができる。

（５）ＤＨＦＲ−ＭＥＫを用いたＭＥＫの製造精製した
ＤＨＦＲ−ＭＥＫからのＭＥＫの切断・分離は、トリプ
シン処理することにより行う。

緩衝液１中、３０°Ｃで、ＤＨＦＲ−ＭＥＫの百分の１
量のトリプシンを作用させる。トリプシンによる切断反
応は、約９０分でほぼ完全に完了する。

トリプシン処理液に、２分の１容の酢酸を加える。

−１５＝ トリプシン処理した試料をＨＰＬＣ装置（品性Ｌ　Ｃ−
４Ａ　、　１ｎｅｒｔｓｉ　ｌ−０ＤＳカラム）を用い
て、０゜１％トリフルオロ酢酸中、１５％から５０％の
アセトニトリルの濃度勾配を用いて溶出・分離すること
ができる。溶出物は、２２０ｎｍにおける吸光度の測定
により検出することができる。第３図は、トリプシン処
理したＤＨＦＲ−ＭＥＫ試料の高速液体クロマトグラム
を示している。試料注入後約１５分後のピークがＭＥＫ
である。このピーク画分を分離する。分離した溶出液を
エバボレーターで乾燥後、少量の水を加え凍結乾燥し溶
媒を除き、ＭＥＫを得ることができる。また、得られた
ペプチドを酸加水分解後、アミノ酸分析することにより
アミノ′＃組成を確かめることができる。

本発明の実施例においては、３１の培地から湿重量的１
１ｇの菌体が得られ、この菌体く計算上。

約１１５ｍｇのＤＨＦＲ−ＭＥＫ、約３．５ｍｇのＭＥ
Ｋを含む。）から、約６３　ｍ　ｇのＤＨＦＲ−ＭＥＫ
　（収率、５４．７％、計算上約１．９ｍｇのＭＥＫを
含む。）を精製して得ることができ。

８ｍｇのＭＥＫを得ることができた。

次に本発明の実施例および参考例を示す。

実施例１ ｐＭＥＫ２の作成 ＭＥＫを暗号化するＤＮＡとしては。

１、５’−ＧＡＴＣＣＧＴＴＡＣＧＧＴＧＧＴＴＴＣＡ
ＴＧＴＡＡＣＴＣＧＡＧＡ−３’２、５’−ＧＡＴＣＴ
ＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＡＴＧＡＡＡＣＣＡＣＣＧＴＡＡ
ＣＧ−３’の２本の３２ヌクレオチドからなるＤＮＡを
ホスホアミダイト法に従って化学合成い精製後、ポリヌ
クレオチドキナーゼを用いて、各ＤＮＡの５′末端をリ
ン酸化した。リン酸化したＤＮＡを約０．１ｍ１（約０
．０１μｇのＤＮＡを含んでいる。）ずつ取り、これを
６０°Ｃでインキュベートすることによって両ＤＮＡを
７二−ルさせた（これをＤＮＡＩと呼ぶ）。

約１μｇのｐＴＰ７０−１を、ＢａｍＨＩて切断した後
、アルカリホスファターゼ処理をした。

アルカリホスファターゼ処理したＤＮＡをフェノール処
理することにより、共存する酵素タンパク質を変性除去
し、その後エタノールでＤＮＡを沈澱させた。沈澱した
ＤＮＡを７０％エタノールで洗った後、エタノールを除
き、減圧下に沈澱を乾燥させた。ＢａｍＨＩによるＤＮ
Ａの切断、アルカリホスファターゼ処理、フェノール処
理、およびエタノール沈澱の各操作は、いずれも、　”
Ｍｏ　ｌ　ｅｃｕｌａｒ　ＣｌｏｎｉｎｇＡ　Ｌｏｂｏ
ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”　　（Ｔ、Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ、　Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｊ、Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ、ｅｄｓ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２）、以下２文献１
と呼ぶ。

）ζこ記載している方法に従って行った。乾燥させたＤ
ＮＡを５０μｍのリガーゼ用反応液（ＩＯｍＭＴｒｉｓ
−）ＩＣＩ、ｐ）ｌ　７．４．５　ｍＭ　Ｉ’１ｇＣＩ
２．１０ｍＭ９チオトレイトール、５　ｍＭ　ＡＴＰ）
に溶解後、５μｍのＤＮＡＩを加え、これに１ユニツト
のＴ４−ＤＮＡリガーゼを加えて、１０６Ｃで、１２時
間ＤＮＡの連結反応を行わせた。この反応物を、形質転
換法（ｔｒａｎｓ−ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　、ｍｅ、ｔｈ
ｏｄ、上記文献１に記載）に従って。

大腸菌に鹸：Ｑｌ１４ませた。この処理をした菌体を。

５０　ｍ　ｇ　／　ｍ　１のアンピシリンナトリウムお
よび１０ｍｇ／ｍｌのトリメトプリムを含む栄養寒天培
地（培地１１中に、２ｇのグルコースｒ１ｇのリン酸２
カリウム、５ｇのイーストエキス、５ｇのポリペプトン
、１５ｇの寒天を含む。）上に塗ｆし、３７°Ｃで２４
時間培養することにより。

１９個のコロニーを得ることができた。これらのコロニ
ーから適当に８個選び、１．５ｍｌのＹＴ＋Ａｐ培地（
培地１１中に、５ｇのＮａＣ１，５ｇのイーストエキス
、８ｇのトリプトン、５０ｍｇのアンピシリンナトリウ
ムを含む。）で、３７℃、１晩、菌体を培養した。培養
液を、各々エツペンドルフ達心ｖごことり、１２，００
０回転回転下１０分間遠心分離い菌体を沈澱として集め
た。

これに、０．１ｍｌの電気泳動用サンプル調製液（０，
０６２５７’ｌのＴｒｉｓ−）ＩＣＩ、　ｐ）Ｉ　６．
８．２ＺのラウリルＴｉ１ｔ酸ナトリウム（ＳＤＳ）、
ＩＯＸのグ刃セリン、５χの２−メルカブトエタノール
、　Ｏ，０ＯＩＸのブロムフェノールブルーを含む。）
を加え、菌体を懸濁し、これを沸騰水中に５分間保ち、
菌体を溶かした。この処理をしたサンプルを５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法（Ｕ、に、Ｌａｍｍ１
ｉ；　Ｎａｔｕｒｅ、　ｖｏｌ。

２２７、　ｐ、６８０（１９７０））に従って分析した
。標準サンプルとしてｐＴＰ７０−１を含有する大腸菌
に同様な処理をしたもの、および分子量マーカーとして
ラクトアルブミン（分子ＩＬ１４，２００）　、　　）
リブシンインヒヒター（分子量２０，１００）　、）リ
ブシノーゲン（分子ｊ１２４，０００）　、カルボニッ
クアンヒドラーゼ（分子４１２９．０００）　、り刃セ
ロアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（分子ｆｆ１
３６，０００）　、卵アルブミン（分子ｆ１４５，００
０）　、および牛血清アルブミン（分子ｆｆ１６６．０
００）を含むサンプルをポリアクリルアミド濃度の１０
から２０％濃度勾配ゲルで泳動した。

その結果、８個のコロニーのうち、４個では（以下、こ
れを、Ｃ型の紺換え体と称する。）、ｐＴＰ７０−１の
ＤＨＦＲのバンドが消失し、それより明らかに分子量が
大きくなったタンパク質（分子量的２２　、０００と推
定される。）を新たに生産していること、また、３個の
コロニーでは（以下、こかに分子量が大きくなったタン
パク質が２種類（それぞれ２分子量約２１，５００と２
３　、５００推定される。）が新たに生産されている。

また、残りの１個では。

ＤＨＦＲとほぼ同じ大きさのタンパク質を生産すること
、１）ＴＰ７０−１（７）ＤＨＦＲ（分子量１８，３７
９）は、この条件で分子量的２１，０００のタンパク質
として泳動することが明らかになった。　　Ｃ型および
Ｒ型の組換え体から、それぞれ−株づつ選び。

各々、これをＹＴ十Ａｐ培地で培養し、　Ｔａｎａｋａ
とＷｅｉｓｂｌｕｍの方法（Ｔ、Ｔａｎａｋａ、　Ｂ、
Ｗｅｉｓｂｌｕｍ；　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
、　ｖｏｌ、１２１．ｐ、３５４（＋９７５））に従っ
て、プラスミドを調製した。得られたプラスミドをｐＭ
ＥＫ２およびｐＭＥＫＩと名づけた。ｐＬＥＫｌもしく
はｐＭＥＫ、２は、ｐＴＰ７０−１のＢａｍＨ１部位に
、化学合成したＤＮＡ配列が挿入した構造をしているは
ずである。合成りＮＡとこは、制限酵素Ｘｈｏ　Ｉで切
断認識される配列、５′−ＣＴＣＧＡＧ−３′、が含ま
れているので、ＸｈｏｌでｐＬＥＫ１およびｐＭＥＫ２
の切断を試みたところ、確かに切断された。また、ｐＭ
ＥＫｌおよびｐＭＥＫ２のＥｃｏＲＩ　　（第１図の４
７１−４７６番目の配列）と５ａｌｌ（第１図の８５７
−８６２番目の配列）による切断によって得られる約４
００ヌクレオチド長のＤＮＡについて２Ｍ１３フアージ
を用いたジデオキシ法（Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ；　Ｍｅｈ
ｔｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ、Ｉ
ｏｌ、ｐ、２０（１９８３））に従って、塩基配列を決
定した。その結果、ｆ）ＭＥＫ２については、第１図に
示す配列の４７１番目から約８５７番目迄の配列が確か
められた。一方、ｐＭＥＫｌでは、５３３番目から５６
７番目の配列が逆転している配列であることが明らかに
された。即ち、ｐＭＥＫｌとｐＭＥＫ２は、化学合成し
たＤＮＡ配列が、ｐＴＰ７０−１のＢａｍＨＩ部位に互
いに逆向きに挿入された構造をしていることが明らかに
された。また。

塩基配列を検討することにより、ｐＭＥＫ２がＤＨＦ　
Ｒ−ＭＥ　Ｋを暗号化することが明らかとなった。従っ
て、ｐＭＥＫ２が、目的の組換えプラス：；、、・、１
１，１ って明らかにされている（特願　昭６ｌ−３１２８３６
）。ｐＭＥＫ２のＥｃ　ｏＲｌ−３ａ　ｌ　Ｉの配列は
、ｐＴＰ７０−１のＥｃｏＲＩ−５ａｌｌの間にあるＢ
ａｍＨ１部位に、３２ヌクレオチド長の配列が挿入され
た配列である。

また、ｐＭＥＫ２のＥｃｏＲＩ−９ａｔ　Ｉ切断によっ
て得られる約４．２キロ塩基対のＤＮＡは。

Ｐｓｔｌ、Ｈｉｎｄｍ、ＨｐａＩ、ＡａｔＩ［、Ｐｖｕ
ｎ、ＢｇｌＩＩ、　　およびＣ１ａＩを用いた制限酵素
による切断実験の結果、ｐＴＰ７０−１のＥｃｏＲＩ−
５ａｌＩ切断によって得られる約４゜２キロ塩基対のＤ
ＮＡと全く同一であることが示された。

以上の結果から、ｐＭＥＫ２の全塩基配列が第１図に示
した配列であることが決められた。

実施例２ ｐＭＥＫ２を含有する大腸菌が作るＤＨＦＲ−ＭＥＫ ・・’′’、ｊ 内　−２３− ｐＭＥＫ２を含有する大腸菌が作るＤＨＦＲ−ＭＥＫの
アミノ酸配列は、ＤＨＦＲ−ＭＥＫ遺伝子の塩基配列か
ら予想することができる。第１図の５７番目から５５４
番目の配列がＤＨＦＲ−ＭＥＫを暗号化していることか
ら、トリプレット暗号表を用いて、アミノ酸配列を推定
した。その結果第２図に示すアミノ酸配列が得られた。

ｐＭＥＫ２を含有する大腸菌から、ＤＨＦＲ−ＭＥＫを
分離精製し、精製したタンパク質の性質を調べた。

ＤＨＦＲ−ＭＥＫの精製 Ａ、用いた菌体量：湿重量　１１ｇ Ｂ、酵素精製表 表における精製過程は■無細胞抽出液、■ＤＥＡＥ−）
ヨバール力うム処理、■メソトリキセート結合アフィニ
ティクロマトグラフイー、および■ＤＥＡＥ−）ヨバー
ル力ラムクロマトグラフイーを表す。

■　　　　４５　　　　　７５０　　　５，３１２　　
１００■　　　　３３　　　　　３３０　　　５，１２
５　　　９６．５■　　　　５６　　　　　　８４　　
　３，８６４　　　７２．４■　　　　２８　　　　　
　６３　　　２，９０５　　　５４．７ＤＨＦＲ酵素活
性は２反応液　（０，０５ｍＭのジヒドロ葉酸、０．０
６ｍＭのＮＡＤＰＨ，１２ｍＭの２−メルカプトエタノ
ール、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７，０））を、１
ｍｌのキュベツトとり、これに酵素液を加え、３４０ｎ
ｍの吸光度の時間変化を測定することにより行った。

酵素１ユニツトは、上記反応条件において、１分間に１
マイクロモルのジヒドロ葉酸を還元するのに必要な酵素
量として定義した。

得られた酵素タンパク質をＳＤＳ電気泳動法（上記実施
例に記載の方法）により分析したところ。

約２２　、０００の単一なタンパク質バンドが示され、
得られた酵素標品が均一であることが示された。

分離精製したＤＨＦＲ−ＭＥＫの性質 精製したＤＨＦＲ活性を示すタンパク質をエンザイムイ
ムノアッセイにより検討したとこる２ＭＥＫに対する抗
体と反応することが示された。即ち、精製して得られた
タンパク質は免疫学的にＭＥＫと同等の構造を有するこ
とが明らかとなった。

精製して得られたタンパク質のカルボキシ末端側のアミ
ノ酸配列を明らかにするために、カルボキシペプチダー
ゼＹを、精製タンパク質に時間を変化させて作用させ、
遊離してくるアミノ酸を定量した（カルボキシペプチダ
ーゼ法によるカルボキシ末端側のアミノ酸配列の決定法
）。その結果。

−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ　（カルボキシ末端）である
ことが予想された。また、精製して得られたタンパク質
を酸加水分解した後、アミノ酸分析したところ、塩基配
列の結果予想されるアミノ酸組成と一致した結果が得ら
れた。

実施例３ 精製分離したＤＨＦＲ−ＭＥＫからのＭＥＫの分離 実施例２で得られた２ｍｌの精製タンパク質溶液（緩衝
液１中、約２０ｍｇ、約１１０６０ｎ。

ｌｅのＤＨＦＲ−ＭＥＫを含む）に、０．２ｍｇのトリ
プシンを加え、３０℃で９０分反応させる。

反応後、１ｍｌの酢酸を加える。そのうちの、帆５ｍ１
（約１７７ｎｍｏｌｅのＤＨＦＲ−ＭＥＫを含むはず）
をとり、高速液体クロマドグフィー装置（品性ＬＣ−４
Ａ）を用いｌ　ｎｅｒｔｓ　ｉ　ｌ−００Ｓ５　μｍカ
ラムで分離した。溶出は、０．１％トリフルオロ酢酸中
、アセトニトリルの濃度勾配（１５％から５０％）をか
けることここより行った。０から２分までは、１５％の
アセニトリルを用い、２分から３２分までは、１５％か
ら５０％のアセトニトリルの直線濃度勾配をかけた。そ
の結果、第３図に示すような溶出曲線が得られた。試料
注入後約１５分後のピーク画分を分離し２分離した溶出
液をエバホレーターで乾燥後、少量の水を加え凍結乾燥
し溶媒を除き、ペプチドを得た。得られたペプチドを酸
加水分解後、その１０分の１をアミノ酸分析に用いた。

その結果、チロシン、グリシン、フェニルアラニン、お
よびメチオニンがそれぞれ、１４．１，２７．５，１３
．８および１３゜９ｎｍｏｌｅずつ検出された。アミノ
酸組成は。

ＭＥＫのそれと一致した値であり、また分析した試料は
、約１３．９ｎｍｏｌｅ　（約８．０ｎｇ）のＭＥＫを
含んでいることが明かとなった。この結果を用いると、
トリプシン処理して得られたサンプル０．５ｍｌをＨＰ
ＬＣを用いて分離することにより、収率的７９％（１３
，９ｘ　Ｉ　Ｏｎｍ。

１　ｅ／１７７ｎｍｏ　ｌｅ）でＭＥＫを回収できたこ
と、またこの操作を繰り返すことにより、２０ｍｇのＤ
ＨＰＲ−ＭＥＫから約４８０μｇ（８゜０ｎｇｘｌｏｘ
６）のＭＥＫが得られることが示される。

また、ＤＨＦＲ−ＭＥＫの精製の収率が約５５％であり
、ＤＨＦＲ−ＭＥＫからＬＥＫの分離の収率が約８０％
であることから、大腸菌がつくるＭＥＫのべ不（イ）叩
ｊ部分の単離収率が、約４４％程度であることが算出さ
れる。

発明の効果 上記のように、新規組換えプラスミドＩ）ＭＥＫ２は、
ＤＨＦＲ−ＭＥＫを暗号化しており、かつｐＭＥＫ２を
有する大腸菌は、ＤＨＦＲ−ＭＥＫを可溶性の状態で大
量に蓄積生産する。さらに。

生成したＤＨＦＲ−ＭＥＫは、ＤＨＦＲ酵素活性を保持
しており、精製を容易に行うことができる。

また、ＤＨＦＲ−ＭＥＫをトリプシン処理後、ＨＰＬＣ
で分離することにより、ＭＥＫを容易に単離することが
できる。このような性質を有することから２本発明は、
ＤＨＦＲ−ＭＥ、にとそれを利用したＭＥＫの生産に有
益である。

また、Ｉ）ＭＥＫ２には、ＸｈｏＩ部位が新たに付は加
えられており、異種遺伝子の発現ベクターとして有用で
あると考えられる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｉ）ＭＥＫ２の全塩基配列を示した図であり
、２本鎖ＤＮＡのうち片方のＤＮＡ鎖配列だけを、５′
末端から３′末端の方向に記述している。図中符号は、
核酸塩基を表いＡはアデニンを、Ｃはシトシンを、Ｇは
グアニンを、Ｔはチミンを示している。図中番号は、Ｉ
）ＬＥＫ２に２箇所存在する制限酵素Ｃ１ａＩのうち、
Ｈｉｎｄ■部位に近い方のＣ１ａｌ切断認識部位、５′
−ＡＴＣＧＡＴ−３’　、の最初の”Ａ”を１番として
数えた番号を示している。 第２図は、Ｉ）ＭＥＫ２中に存在するＤＨＦＲ−ＭＥＫ
を暗号化する部分の塩基配列およびタンパク質のアミノ
酸配列を示す図である。図中符号は。 核酸塩基および゛アミノ酸を表し、Ａはアデニンを。 Ｃはシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを。 Ａ　ｌ　ａはアラニンを、Ａｒｇはアルギニンを、Ａｓ
ｎはアスパラギンを、Ａｓｐはアスパラギン酸を、Ｃｙ
ｓはシスティンを、Ｇｌｎはグルタミンを、Ｇｌｕはグ
ルタミン酸を、ｃｔｙはグリシンを、Ｈｉｓはヒスチジ
ンを、Ｉｌｅはイソロイシンを、Ｐｒｏはプロリンを、
Ｓｅｒはセリンを。 Ｔｈｒはトレオニンを、Ｔｒｐはトリプトファンを、Ｔ
ｙｒはチロシンを、Ｖａｌはバリンを示している。図中
番号は、１番目のアミノ酸であるメチオニンを暗号化す
るＡＴＧコドンの”Ａ”を１番として数えた番号を示し
ている。 第３図は、トリプシン処理したＤ　ＨＦ　Ｒ−ＭＥＫ試
料の高速液体クロマトグラムを示している。 横軸は、試料注入後の時間を分単位で、縦軸は。 ２２０　ｎｍの吸光度を任意単位で表現し・ている。 矢印で示したピークがＭＥＫの溶出ピークである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、大腸菌において安定に複製され、宿主である大腸菌
   にトリメトプリム耐性およびアンピシリン耐性を与える
   ことができ、４６４０塩基対の大きさを有し、第１図に
   おいて示されるＤＮＡ配列を有する新規組換えプラスミ
   ドｐＭＥＫ２。 ２、ｐＭＥＫ２を含有する大腸菌。 ３、ｐＭＥＫ２を含有する大腸菌が生産し、第２図によ
   って示されるアミノ酸配列を有するジヒドロ葉酸還元酵
   素−メチオニンエンケフアリン融合タンパク質。 ４、ｐＭＥＫ２を含有する大腸菌を培養し、ジヒドロ葉
   酸還元酵素活性を目安に、ジヒドロ葉酸還元酵素−メチ
   オニンエンケフアリン融合タンパク質を、培養菌体の無
   細胞抽出液から、イオン交換カラム処理、メソトリキセ
   ート結合アフィニティカラムクロマトグラフィー、およ
   び陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いて精製
   することを特徴とするジヒドロ葉酸還元酵素−メチオニ
   ンエンケフアリン融合タンパク質の分離精製方法。 ５、ｐＭＥＫ２を含有する大腸菌の生産するジヒドロ葉
   酸還元酵素−メチオニンエンケフアリン融合タンパク質
   をトリプシンを用いて分解した後、メチオニンエンケフ
   アリンを分離精製することを特徴とするメチオニンエン
   ケフアリンの製造方法。