JPH0364518B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は、成長ホルモン分泌制御因子であるソ
マトスタチン（Ala−Gly−Cys−Lys−Asn−
Phe−Phe−Trp−Lys−Thr−Phe−Thr−Ser−
Cysの14個のアミノ酸配列よりなるペプチド、以
下、GIFと略す。）を酵素のカルボキシ末端（以
下、Ｃ末端と略す。）側に有するジヒドロ葉酸還
元酵素（以下、DHFRと略す。）−ソマトスタチ
ン融合タンパク質（以下、DHFR−GIFと略す。）
およびその分離精製方法に関するものである。 本発明のDHFR−GIFは、第１図に示されるア
ミノ酸配列を有し、発酵工業、医薬品工業等の分
野に好適である。 従来の技術および問題点 GIFは、視床下部ペプチドの一種であり、成長
ホルモンなど下垂体前葉ホルモンおよびインシユ
リン、グルカゴンなどの消化管で生産される多く
のペプチドホルモンの分泌を抑制する。このよう
作用を有することから、GIFは、巨人症、糖尿病
等の治療薬としての利用が期待されている。 本発明のDHFR−GIFは、大腸菌の改変ジヒド
ロ葉酸還元酵素のＣ末端側にGIFが融合した構造
のタンパク質であり、これまで報告がなく新規な
物質である。 本発明のDHFR−GIFに類似した物質として
は、本発明者らが作成した枯草菌のDHFRのＣ
末端側にGIFが融合したタンパク質がある。（特
開昭63−258597号広報）。 本発明の技術的背景としては、いわゆる遺伝子
操作技術がある。 本発明のDHFR−GIFを暗号化する遺伝子を含
む組換えプラスミドpTPGIF2は、既に本発明者
らが構築している。また、pTPGIF2を含有する
大腸菌は、微工研にFERMBP−1577として寄託
されている。 しかしながら、pTPGIF2を含有する大腸菌か
らのDHFR−GIFの分離精製方法に関しては、全
く知られておらず未知であつた。 発明の目的 本発明の目的は、新規な物質であるDHFR−
GIFの分離精製法を確立し、DHFR−GIFの利用
をはかることにある。 また、本発明は、遺伝子操作の手法を用いて
GIFを大量に生産する方法の開発の一環として行
なわれたものである。 発明の構成 １ DHFR−GIFの構造。 本発明のDHFR−GIFは、第１図に示される
ように、175個のアミノ酸より構成される。
DHFR−GIFのアミノ末端側から数えて、１か
ら159番目までの配列が、大腸菌の野生型
DHFRに１箇所アミノ酸置換置換が起こつた
（Cys−152（wild type）→Glu−152）配列であ
り、162番目から175番目までがGIFの配列であ
る。GIFの配列の直前のアミノ酸はメチオニン
（Met）である。このことにより、DHFR−
GIFをブロムシアン処理することにより、GIF
を特異的に切り出すことができる構造である。
160番目のアミノ酸はイソロイシン（lle）であ
る。これは融合タンパク質遺伝子を作成する際
に、遺伝暗号の読み取り枠を合わせるために生
じた配列である。DHFR−GIFの分子量は、
19891である。 第１図には、DHFR−GIFを暗号化する
DNA配列を同時に記述している。このDNA配
列からアミノ酸配列を決定することができた。 DHFR−GIFは、大腸菌のDHFRのカルボキ
シ末端側が一部改変し、さらにGIFが融合した
構造をしている。通常、タンパク質の一次構造
を変化させた場合、その生理活性を失うことが
多いが、本発明のDHFR−GIFの場合、DHFR
酵素活性には影響が認められない。 ２ pTPGIF2を含有する大腸菌からのDHFR−
GIFの分離精製。 本発明のDHFR−GIFの分離精製は、菌体
の培養、菌体の破砕、DEAE−トヨパール
カラム処理、メソトリキセート結合アフイニ
テイクロマトグラフイー、およびDEAE−ト
ヨパールカラムクロマトグラフイーの過程より
成り立つている。 菌体の培養 pTPGIF2は、pTP70−１特開昭63−46193
号公報参照）のBamHI部位に、GIFを暗号
化する化学合成DNAを挿入して得られる組
換えプラスミドであり、既に本発明らが構築
していたものである。pTPGIF2は、大腸菌
に導入され安定に存在し、pTPGIF2を含有
する大腸菌は、微工研にFERMBP−1577と
して寄託されている。 pTPGIF2を含有する大腸菌の培養は、
YT＋Ap倍地（倍地１中に、５ｇのNaCl、
８ｇのトリプトン、５ｇのイーストエキスお
よび50mgのアンビシリンナトリウムを含む液
体培地。）で培養することができる。 培地としては、この外にST＋Ap培地（培
地１中に、２ｇのグルコース、１ｇのリン
酸２カリウム、５ｇのポリペプトン、５ｇの
イーストエキスおよび50mgのアンビシリンナ
トリウムを含む液体培地。）など、菌体が成
長する培地であれば、どの様な培地でも用い
ることができるが、調べた限りでは、
DHFRの生産にはYT＋Ap培地が最適であ
つた。 pTPGIF2を含有する大腸菌を、培地に接
種し、37℃で対数成長期の後期もしくは定常
期まで培養する。培養温度により菌体中の
DHFR−GIFの蓄積量が変動し、調べた限り
では、培養温度が高いほど蓄積量が大であつ
た。培養した菌体は、5000回転／分の遠心分
離により集める。培地１より湿重量２から
５ｇの菌体が得られる。 集菌およびこれ以後の操作は、特に断わら
ない限り定温（０から10℃の間、４℃が望ま
しい）で行う。 菌体の破砕 培養して得られた菌体を、湿重量の３倍の
緩衝液１（0.1ｍＭ エチレンジアミン４酢
酸ナトリウムを含む10ｍＭリン酸カリウム緩
衝液、PH7.0）に懸濁し、フレンチプレスを
用いて菌体を破砕する。菌体破砕液を20000
回転、１時間遠心分離し、上清を得る（無細
胞抽出液）。 DEAE−トヨパールカラム処理 この操作は、次の精製過程の前処理の目的
で行なう。 無細胞抽出液に、これと同容の0.6Mの
KClを含む緩衝液１を加える。この酵素液
を、あかじめ0.3MのKClを含む緩衝液１で
平衡化したDEAEトヨパールカラムにかけ、
0.3MのKClを含む緩衝液１で酵素を溶出さ
せる。溶出液を一定量ずつフラクシヨンコレ
クターを用いて分画する。分画した溶出液に
ついてDHFR活性を測定し、酵素活性が含
まれる画分を集める。 メソトリキセート結合アフイニテイクロマ
トグラフイー 上記の操作により得られた酵素液を、あら
かじめ緩衝液１で平衡化したメソトリキセー
ト結合Sepgaroseアフイニテイカラムに吸着
させる。吸着後、1MのKClを含む緩衝液１
で洗う。洗いは、カラムからの溶出液の
280nｍの吸光度を測定し、吸光度が0.1以下
になるまで同緩衝液を流し続ける。酵素の溶
出は、1MのKClと３ｍＭを含む10ｍＭリン
酸カリウム緩衝液、PH9.0を用いて行い、溶
出液を一定量ずつフラクシヨンコレクターを
用いて分画する。分画した溶出液について
DHFR活性を測定し、酵素活性が含まれる
画分を集める。得られた酵素液を、緩衝液１
に対して、３回透析する。 DEAE−トヨパールカラムクロマトグラフ
イー 透析した酵素液を、あらかじめ緩衝液１で
平衡化したDEAE−トヨパールカラムに吸着
させる。吸着後、50ｍMKClを含む緩衝液１
で洗う。洗いは、カラムからの抽出液の
280nｍの吸光度を測定し、吸光度が0.01以下
になるまで同緩衝液を流し続ける。酵素の溶
出は、緩衝液１を用いて50ｍＭから0.4Mの
KClの直線濃度勾配を用いて行い、溶出液を
一定量ずつフラクシヨンコレクターを用いて
分画する。分画した溶出液について280nｍ
の吸光度とDHFR活性を測定する。酵素活
性／280nｍの吸光度の値が、一定な画分を
集める。 以上の操作により、再現性に良く、DHFR−
GIFを電気泳動的に完全に均一まで精製すること
ができる。 本発明に従うと、DHFR−GIFの精製は、培養
を含めて一週間以内に行うことができる。 次に本発明の実施例を示す。 実施例 DHFR−GIFの精製 Ａ 用いた菌体量：湿重量12ｇ Ｂ 酵素精製表（表における精製過程は無細胞
抽出液、DEAE−トヨパールカラム処理、
メソトリキセート結合アフイテイニクロマトグ
ラフイー、およびDEAE−トヨパールカラム
クロマトグラフイーを表す。

【表】 得られた酵素タンパク質をSDS電気泳動法に
より分析したところ、約23000の単一なタンパ
ク質バンドが示され、得られた酵素標品が均一
であることが示された。 精製したDHFRGIFをエンザイムイムノアツ
セイにより検討したところ、GIFに対する抗体
と反応することが示された。即ち、精製して得
られたタンパク質は免疫学的にGIFと同等の構
造を有することが明らかとなつた。 精製して得られたタンパク質のカルボキシ末
端側のアミノ酸配列を明らかにするために、カ
ルボキシペプチターゼＹを、精製タンパク質に
時間を変化させて作用させ、遊離してくるアミ
ノ酸を定量した（カルボキシペプチダーゼ法に
よるカルボキシ末端側のアミノ酸配列の決定
法）。その結果、−−Trp−Lys−Thr−Phe−
Thr−Ser−（カルボキシ末端）であることが予
想された。DHFR−GIFのカルボキシ末端のア
ミノ酸はCys（システイン）であるが、このア
ミノ酸は上記方法では検出できない。Ellman
の方法を用いて、５，5′−ジチオビス２−ニト
ロ安息香酸（DTNB）を用いて、精製タンパ
ク質中のチオール（SH基）の含料を測定した
ところ、2.6〜2.9残基／酵素分子という値が得
られた。pTP70−1DHFRについて同様に測定
したところ、0.8〜1.0残基／酵素分子という値
であつた。 以上の結果は、pTPGIF2を有する大腸菌から
精製して得られたDHFR活性を有するタンパク
質が、DHFR−GIFであることを示している。 発明の効果 上記のように、pTPGIF2を有する大腸菌から、
DHFR活性を指標に精製を容易に行うことがで
きる。得られたDHFR−GIFは、DHFR活性を有
するだけでなく、GIFの免疫学的な性質を有す
る。また、DHFR−GIFは、DHFR部分とGIF部
分がメチオニン残基を介して結合していることか
ら、DHFR−GIFをプロムシアンで処理すること
により、GIFを切り出せる構造である。このこと
から、DHFR−GIFは、GIFの構造の原料として
用いることができ、それを利用したGIFの生産に
有益である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、DHFR−GIFを暗号化する部分の塩
基配列およびタンパク質のアミノ酸配列を示す図
である。図中符号は、核酸塩基およびアミノ酸を
表し、Ａはアデニンを、Ｃはシトシンを、Ｇはグ
アニンを、Ｔはチミンを、Alaはアラニンを、
Argはアルギニンを、Asnはアスパラギンを、
Aspはアスパラギン酸を、Cysはシステインを、
Glnはグルタミンを、Gluはグルタミン酸を、Gly
はグリシンを、Hisはヒスチジンを、leはイソ
ロイシンを、Leuはロイシンを、Lysはリジンを、
Metはメチオニンを、Pheはフエニルアラニン
を、Proはプロリンを、Serはセリンを、Thrは
トレオニンを、Trpはトリプトフアンを、Tyrは
チロシンを、Valはバリンを示している。図中番
号は、１番目のアミノ酸であるメチオニンを暗号
化するATGコドンの“Ａ”を１番として数えた
番号を示している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の式に示すDNA配列を有するプラス
   ミドpTPGIF2を含有する大腸菌が生産し、下記
   の式に示すアミノ酸配列を有するジヒドロ葉酸
   還元酵素−ソマトスタチン融合タンパク質。 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 ２ 下記に示すDNA配列を有するプラスミド
   pTPGIF2を含有する大腸菌を培養し、培養菌体
   を破砕して得られる遠心分離上清から、ジヒドロ
   葉酸還元酵素活性を目安にして、ジヒドロ葉酸還
   元酵素−ソマトスタチン融合タンパク質を培養菌
   体の無細胞抽出液から、イオン交換カラム処理、
   メソトリキセート結合アフイニテイカラムクロマ
   トグラフイー、および陰イオン交換カラムクロマ
   トグラフイーを用いて精製することを特徴とする
   ジヒドロ葉酸還元酵素−ソマトスタチン融合タン
   パク質の分離精製方法。 【表】 【表】 【表】 【表】