JPH074239B2 - 耐熱性のロイシン脱水素酵素の製造法 - Google Patents
耐熱性のロイシン脱水素酵素の製造法Info
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- JPH074239B2 JPH074239B2 JP62042263A JP4226387A JPH074239B2 JP H074239 B2 JPH074239 B2 JP H074239B2 JP 62042263 A JP62042263 A JP 62042263A JP 4226387 A JP4226387 A JP 4226387A JP H074239 B2 JPH074239 B2 JP H074239B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
- C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は耐熱性のロイシン脱水素酵素の製造法に関する
ものである。
ものである。
（従来の技術） ロイシン脱水素酵素は，臨床検査用酵素として，非常に
重要な酵素である。このロイシン脱水素酵素を生産でき
る微生物としては，常温菌であるバチルス・スフェリカ
ス（Bacillus sphaericus）のようなバチルス属の細菌
が知られている。しかし，これらの菌より得られるロイ
シン脱水素酵素は，室温の水溶液中で１〜３週間のうち
に活性をほとんどを失うのが通例であり，熱安定性及び
長期の安定性に欠けるものであるという大きな欠点を有
している。
重要な酵素である。このロイシン脱水素酵素を生産でき
る微生物としては，常温菌であるバチルス・スフェリカ
ス（Bacillus sphaericus）のようなバチルス属の細菌
が知られている。しかし，これらの菌より得られるロイ
シン脱水素酵素は，室温の水溶液中で１〜３週間のうち
に活性をほとんどを失うのが通例であり，熱安定性及び
長期の安定性に欠けるものであるという大きな欠点を有
している。
それゆえ，ロイシン脱水素酵素を用いる臨床検査の分析
法の利点を最大限に発揮するうえで，熱に安定で，室温
で長時間活性を失わないロイシン脱水素酵素の出現が熱
望されていた。
法の利点を最大限に発揮するうえで，熱に安定で，室温
で長時間活性を失わないロイシン脱水素酵素の出現が熱
望されていた。
このため，先に本発明者らの一部がこのような観点か
ら，熱に安定で，長時間活性を失わない性質を有するロ
イシン脱水素酵素を求めて鋭意研究した結果，好熱性の
バチルス属に属する細菌に上記の性質を有するロイシン
脱水素酵素が存在することを見いだし，特許出願した
（特開昭59-348841号公報）。
ら，熱に安定で，長時間活性を失わない性質を有するロ
イシン脱水素酵素を求めて鋭意研究した結果，好熱性の
バチルス属に属する細菌に上記の性質を有するロイシン
脱水素酵素が存在することを見いだし，特許出願した
（特開昭59-348841号公報）。
しかし，この好熱性のバチルス属に属する細菌は，耐熱
性のロイシン脱水素酵素の生産性が低く，この酵素を効
率良く得るには，十分満足するものでなかった。
性のロイシン脱水素酵素の生産性が低く，この酵素を効
率良く得るには，十分満足するものでなかった。
一方，エシェリチア（Escherichia）属に属する細菌
は，本来ロイシン脱水素酵素生産能を全く有していな
い。
は，本来ロイシン脱水素酵素生産能を全く有していな
い。
また、組織DNA遺伝子工学に有用なプラスミド及びそれ
によって形質転換された微生物は良く知られている。例
えば，サイエンス（Science）198巻,1056頁（1978年）
には，プラスミドpBR322にラクトースプロモーターをつ
ないだプラスミドを導入した大腸菌内で動物タンパク質
が生産されることが記載されている。
によって形質転換された微生物は良く知られている。例
えば，サイエンス（Science）198巻,1056頁（1978年）
には，プラスミドpBR322にラクトースプロモーターをつ
ないだプラスミドを導入した大腸菌内で動物タンパク質
が生産されることが記載されている。
また，特開昭56−5093号公報には，サーマス属に属する
細菌の遺伝子を有するプラスミド（ベクターとしてプラ
スミドpBR322が用いられている。）を導入することによ
り形質転換されたエシェリチア（Escherichia）属に属
する細菌を用いて耐熱性の酵素を調製することが記載さ
れているが，耐熱性のロイシン脱水素酵素の遺伝子を有
するプラスミド及びそれによって形質転換された微生物
については，全く何も記載されていないし，またその創
製に成功したとの報告もなされていない。
細菌の遺伝子を有するプラスミド（ベクターとしてプラ
スミドpBR322が用いられている。）を導入することによ
り形質転換されたエシェリチア（Escherichia）属に属
する細菌を用いて耐熱性の酵素を調製することが記載さ
れているが，耐熱性のロイシン脱水素酵素の遺伝子を有
するプラスミド及びそれによって形質転換された微生物
については，全く何も記載されていないし，またその創
製に成功したとの報告もなされていない。
さらに，本発明者らの一部は，このような観点から，耐
熱性のロイシン脱水素酵素含量の高い微生物を求めて鋭
意研究した結果，エシェリチア属に属する耐熱性のロイ
シン脱水素酵素生産菌が耐熱性のロイシン脱水素酵素を
効率良く生産することを見い出し，特許出願した（特開
昭59-159778号公報）。
熱性のロイシン脱水素酵素含量の高い微生物を求めて鋭
意研究した結果，エシェリチア属に属する耐熱性のロイ
シン脱水素酵素生産菌が耐熱性のロイシン脱水素酵素を
効率良く生産することを見い出し，特許出願した（特開
昭59-159778号公報）。
（発明が解決しようとする問題点） 前記のエシェリチア属に属する耐熱性のロイシン脱水素
酵素生産菌では耐熱性のロイシン脱水素酵素の生産性が
いまだ充分ではなく，耐熱性のロイシン脱水素酵素を効
率良く得るには充分満足できるものではなかった。
酵素生産菌では耐熱性のロイシン脱水素酵素の生産性が
いまだ充分ではなく，耐熱性のロイシン脱水素酵素を効
率良く得るには充分満足できるものではなかった。
（問題点を解決するための手段） そこで，本発明者らは，耐熱性のロイシン脱水素酵素含
量の高い微生物を求めて鋭意研究した結果，嫌気性かつ
好熱性のクロストリジウム（Clostridium）属に属する
細菌由来のロイシン脱水素酵素遺伝子をベクタープラス
ミドに連結した組み換え体プラスミドで形質転換された
エシェリチア（Escherichia）属に属する細菌が耐熱性
のロイシン脱水素酵素を効率良く生産することを見い出
し，本発明を完成した。
量の高い微生物を求めて鋭意研究した結果，嫌気性かつ
好熱性のクロストリジウム（Clostridium）属に属する
細菌由来のロイシン脱水素酵素遺伝子をベクタープラス
ミドに連結した組み換え体プラスミドで形質転換された
エシェリチア（Escherichia）属に属する細菌が耐熱性
のロイシン脱水素酵素を効率良く生産することを見い出
し，本発明を完成した。
すなわち、本発明は嫌気性かつ好熱性のクロストリジウ
ム（Clostridium）属に属する細菌由来のロイシン脱水
素酵素遺伝子をベクタープラスミドに連結した組み換え
体プラスミドで形質転換されたエシェリチア（Escheric
hia）属に属する細菌を培養し，培養物から耐熱性のロ
イシン脱水素酵素を採取することを特徴とする耐熱性の
ロイシン脱水素酵素の製造法を要旨とするものである。
ム（Clostridium）属に属する細菌由来のロイシン脱水
素酵素遺伝子をベクタープラスミドに連結した組み換え
体プラスミドで形質転換されたエシェリチア（Escheric
hia）属に属する細菌を培養し，培養物から耐熱性のロ
イシン脱水素酵素を採取することを特徴とする耐熱性の
ロイシン脱水素酵素の製造法を要旨とするものである。
本発明に用いられる細菌は，嫌気性かつ好熱性のクロス
トリジウム（Clostridium）属に属する細菌由来のロイ
シン脱水素酵素遺伝子をベクタープラスミドに連結した
組み換え体プラスミドで形質転換されたエシェリチア
（Escherichia）属に属する細菌であり，そのような細
菌であれば，いかなるものでも使用できる。好ましい細
菌としては，例えば嫌気性かつ好熱性のクロストリジウ
ム（Clostridium）属に属する細菌由来とロイシン脱水
素酵素遺伝子をベクタープラスミドに連結した組み換え
体プラスミドpICD242で公知のエシェリチア・コリC600
を形質転換したエシェリチア・コリC600-pICD242があげ
られる。この菌株は，公知のエシェリチア・コリC600
〔ネイチャー（Nature）217 ,1110〜1114（1968）を参
照〕と，耐熱性のロイシン脱水素酵素生産能及びアンピ
シリン耐性を有する点以外は同じ菌学的性質を有してい
る。この菌株は，非伝達性を伝達性に変えることなく，
また非病原性を病原性に変えることなく安全性が保持さ
れている。特に，嫌気性かつ好熱性のクロストリジウム
（Closridium）属に属する細菌由来のロイシン脱水素酵
素遺伝子を組み込んだ耐熱性のロイシン脱水素酵素生産
能を有するエシェリチア・コリの報告はなかった。この
ことから，エシェリチア・コリC600-pICD242株は新菌株
であると考えられるので，昭和62年２月21日に通産省工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託した。その微生物
受託番号は第9213号である。
トリジウム（Clostridium）属に属する細菌由来のロイ
シン脱水素酵素遺伝子をベクタープラスミドに連結した
組み換え体プラスミドで形質転換されたエシェリチア
（Escherichia）属に属する細菌であり，そのような細
菌であれば，いかなるものでも使用できる。好ましい細
菌としては，例えば嫌気性かつ好熱性のクロストリジウ
ム（Clostridium）属に属する細菌由来とロイシン脱水
素酵素遺伝子をベクタープラスミドに連結した組み換え
体プラスミドpICD242で公知のエシェリチア・コリC600
を形質転換したエシェリチア・コリC600-pICD242があげ
られる。この菌株は，公知のエシェリチア・コリC600
〔ネイチャー（Nature）217 ,1110〜1114（1968）を参
照〕と，耐熱性のロイシン脱水素酵素生産能及びアンピ
シリン耐性を有する点以外は同じ菌学的性質を有してい
る。この菌株は，非伝達性を伝達性に変えることなく，
また非病原性を病原性に変えることなく安全性が保持さ
れている。特に，嫌気性かつ好熱性のクロストリジウム
（Closridium）属に属する細菌由来のロイシン脱水素酵
素遺伝子を組み込んだ耐熱性のロイシン脱水素酵素生産
能を有するエシェリチア・コリの報告はなかった。この
ことから，エシェリチア・コリC600-pICD242株は新菌株
であると考えられるので，昭和62年２月21日に通産省工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託した。その微生物
受託番号は第9213号である。
本発明に用いられるプラスミドを得るには，例えばバイ
オキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Biochimica
et Biophysica Acta）72,619〜629頁（1963年）に記載
の方法に従い，耐熱性のロイシン脱水素酵素の遺伝子と
ベクターとしての役割を有するDNAとを制限酵素で消化
し，次いでリガーゼを用いて結合することにより調製す
ることができる。
オキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Biochimica
et Biophysica Acta）72,619〜629頁（1963年）に記載
の方法に従い，耐熱性のロイシン脱水素酵素の遺伝子と
ベクターとしての役割を有するDNAとを制限酵素で消化
し，次いでリガーゼを用いて結合することにより調製す
ることができる。
本発明に用いられる耐熱性のロイシン脱水素酵素の遺伝
子としては，嫌気性かつ好熱性のクロストリジウム（Cl
ostridium）属に属する細菌由来のロイシン脱水素酵素
遺伝子であることが必要である。その中でもロイシン脱
水素酵素の活性が高いクロストリジウム・サーモアセチ
ィカム（Clostridium thermoaceticum）が好ましく，具
体的にはAN28−４株（昭和62年２月21日に通産省工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託した。その微生物受託
番号は第9214号である）がある。
子としては，嫌気性かつ好熱性のクロストリジウム（Cl
ostridium）属に属する細菌由来のロイシン脱水素酵素
遺伝子であることが必要である。その中でもロイシン脱
水素酵素の活性が高いクロストリジウム・サーモアセチ
ィカム（Clostridium thermoaceticum）が好ましく，具
体的にはAN28−４株（昭和62年２月21日に通産省工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託した。その微生物受託
番号は第9214号である）がある。
また，ベクターとしての役割を有するDNAとしては，例
えばプラスミドDNAがあげられ，特にプラスミドpBR232
が好ましい。また，制限酵素としては，例えばHind III
があげられ，リガーゼとしては，例えばT4DNAリガーゼ
があげられる。
えばプラスミドDNAがあげられ，特にプラスミドpBR232
が好ましい。また，制限酵素としては，例えばHind III
があげられ，リガーゼとしては，例えばT4DNAリガーゼ
があげられる。
この方法でプラスミドpBR322に，クロストリジウム・サ
ーモアセチィカムAN28−４株の染色体DNA由来のロイシ
ン脱水素酵素の遺伝子を導入したプラスミドpICD242が
得られる。このプラスミドpICD242を昭和62年２月21日
に通産省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託の手続
を行ったが，このプラスミドは受託されなかった。
ーモアセチィカムAN28−４株の染色体DNA由来のロイシ
ン脱水素酵素の遺伝子を導入したプラスミドpICD242が
得られる。このプラスミドpICD242を昭和62年２月21日
に通産省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託の手続
を行ったが，このプラスミドは受託されなかった。
次にこのプラスミドpICD242の理化学的性質を示す。
（１）常温微生物内で耐熱性のロイシン脱水素酵素を発
現させることができる。
現させることができる。
（２）第１図に示すごとく、下記制限酵素に対し，次の
切断感受性を有する。
切断感受性を有する。
制限酵素 切断部位数 EcoR Ｉ ３ Hind III ２ Pst Ｉ ３ Sal Ｉ ５ BamH Ｉ １ 制限酵素の名称は，次の菌種から得られる制限酵素の略
称である。EcoR I;エシェリチア・コリHind III;ヘモフィラス・インフルエンザPst I;プロビデンシア・フチュアーティーSal I;ストレプトマイセス・アルブスBamH I;バチルス・アミロリクエファシエンス 制限酵素による切断部位数は，過剰の制限酵素存在下で
プラスミドpICD242を消化し，その消化物をアガロース
ゲル電気泳動にかけ，分離可能な断片の数から決定され
る。
称である。EcoR I;エシェリチア・コリHind III;ヘモフィラス・インフルエンザPst I;プロビデンシア・フチュアーティーSal I;ストレプトマイセス・アルブスBamH I;バチルス・アミロリクエファシエンス 制限酵素による切断部位数は，過剰の制限酵素存在下で
プラスミドpICD242を消化し，その消化物をアガロース
ゲル電気泳動にかけ，分離可能な断片の数から決定され
る。
（３）分子量は約5.8メガダルトンである。
本発明における細菌を培養するに際して用いられる栄養
培地の炭素源として，例えばグルコース，シュークロー
ス，フルクトース，澱粉加水分解物，糖蜜，亜硫酸パル
プ廃液の糖類，酢酸，乳酸などの有機酸類，さらには使
用する細菌が資化しうるアルコール類，脂肪酸及びグリ
セリンなどが使用でき，窒素源として，例えば硫酸アン
モニウム，塩化アンモニウム，リン酸アンモニウム，ア
ミノ酸，ペプトン，肉エキス，酵母エキスなどの無機又
は有機物が使用できる。さらに，無機塩類として，例え
ばカリウム，ナトリウム，リン酸，亜鉛，鉄，マグネシ
ウム，マンガン，銅，カルシウム，コバルトなどの各塩
類，必要に応じて微量金属塩，コーン・スティープ・リ
カー，ビタミン類，核酸などを使用してもよく，細菌の
一般的栄養培地が使用できる。
培地の炭素源として，例えばグルコース，シュークロー
ス，フルクトース，澱粉加水分解物，糖蜜，亜硫酸パル
プ廃液の糖類，酢酸，乳酸などの有機酸類，さらには使
用する細菌が資化しうるアルコール類，脂肪酸及びグリ
セリンなどが使用でき，窒素源として，例えば硫酸アン
モニウム，塩化アンモニウム，リン酸アンモニウム，ア
ミノ酸，ペプトン，肉エキス，酵母エキスなどの無機又
は有機物が使用できる。さらに，無機塩類として，例え
ばカリウム，ナトリウム，リン酸，亜鉛，鉄，マグネシ
ウム，マンガン，銅，カルシウム，コバルトなどの各塩
類，必要に応じて微量金属塩，コーン・スティープ・リ
カー，ビタミン類，核酸などを使用してもよく，細菌の
一般的栄養培地が使用できる。
これらの培地を用いて，本発明における細菌を20℃〜45
℃，好ましくは35℃〜40℃，最適には37℃で約10〜20時
間,pHを7.0〜7.4,最適には7.2で好気的に培養すればよ
い。
℃，好ましくは35℃〜40℃，最適には37℃で約10〜20時
間,pHを7.0〜7.4,最適には7.2で好気的に培養すればよ
い。
次に得られた培養物から本発明における耐熱性のロイシ
ン脱水素酵素が採取されるが，培養物，分離生菌体、分
離菌体の処理物，粗酵素抽出液，精製酵素などのあらゆ
る段階で採取できる。その際の精製法としては，通常の
酵素精製法を用いることができる。特に本発明では，耐
熱性のロイシン脱水素酵素を採取するに先立って，破砕
液を加熱処理すれば，耐熱性を有しない酵素や蛋白質が
熱変性することにより選択的に耐熱性のロイシン脱水素
酵素が得られるので有利である。この加熱処理の条件と
しては，例えば50〜80℃の温度で５〜30分間処理すれば
よい。このようにして処理した後，分離精製して耐熱性
のロイシン脱水素酵素を得てもよいが，そのまま酵素液
として利用できる。
ン脱水素酵素が採取されるが，培養物，分離生菌体、分
離菌体の処理物，粗酵素抽出液，精製酵素などのあらゆ
る段階で採取できる。その際の精製法としては，通常の
酵素精製法を用いることができる。特に本発明では，耐
熱性のロイシン脱水素酵素を採取するに先立って，破砕
液を加熱処理すれば，耐熱性を有しない酵素や蛋白質が
熱変性することにより選択的に耐熱性のロイシン脱水素
酵素が得られるので有利である。この加熱処理の条件と
しては，例えば50〜80℃の温度で５〜30分間処理すれば
よい。このようにして処理した後，分離精製して耐熱性
のロイシン脱水素酵素を得てもよいが，そのまま酵素液
として利用できる。
本発明によって得られる耐熱性のロイシン脱水素酵素
は，特開昭59-34884号公報や特開昭59-159778号公報に
記載の耐熱性のロイシン脱水素酵素と同じ理化学的性質
を有する。
は，特開昭59-34884号公報や特開昭59-159778号公報に
記載の耐熱性のロイシン脱水素酵素と同じ理化学的性質
を有する。
（実施例） 次に本発明を実施例により具体的に説明する。
なお，耐熱性のロイシン脱水素酵素の活性は，アミノ
酸，核酸〔Amino Acid and Nucleic Acid.27,84〜88（1
973）〕に記載されているロイシン脱水素酵素活性の測
定法に準じた。すなわちpH10.5の120μmoleのグリシン
−KCl−KOH緩衝液中で,2.5μmoleのNADと,20μmoleのＬ
−ロイシンを含む混合液を調製し，その混合液に適当量
の粗酵素抽出液を加えて，最終容量を0.8mlとし,25℃あ
るいは55℃における還元型のNADの単位時間あたりの増
加を340nmの吸光度の増加として測定する方法で行っ
た。
酸，核酸〔Amino Acid and Nucleic Acid.27,84〜88（1
973）〕に記載されているロイシン脱水素酵素活性の測
定法に準じた。すなわちpH10.5の120μmoleのグリシン
−KCl−KOH緩衝液中で,2.5μmoleのNADと,20μmoleのＬ
−ロイシンを含む混合液を調製し，その混合液に適当量
の粗酵素抽出液を加えて，最終容量を0.8mlとし,25℃あ
るいは55℃における還元型のNADの単位時間あたりの増
加を340nmの吸光度の増加として測定する方法で行っ
た。
また，実施例及び参考例中の％は，容量％を示す。
参考例１ （ａ）クロストリジウム・サーモアセチィカムの染色体
DNAの分離。
DNAの分離。
クロストリジウム・サーモアセチィカムAN28−４株（微
工研菌寄第9214号）から，バイオキミカ・エト・バイオ
フィジカ・アクタ（Biochi-mica et Biophysica Acta）
72巻,619〜629頁（1963年）に記載の方法に準じ，染色
体DNAを分離した。
工研菌寄第9214号）から，バイオキミカ・エト・バイオ
フィジカ・アクタ（Biochi-mica et Biophysica Acta）
72巻,619〜629頁（1963年）に記載の方法に準じ，染色
体DNAを分離した。
まず，クロストリジウム・サーモアセチィカムAN28−４
株をトリプティコース17g/l,フィトン3g/l,グルコース6
g/l,塩化ナトリウム2.5g/l,チオグリコール酸ナトリウ
ム0.5g/l,L−システィン0.25g/l,亜硫酸ナトリウム0.1g
/l,そしてpH7.2に調製した培地２で,60℃で24時間静
置培養した後，遠心分離にて集菌した。
株をトリプティコース17g/l,フィトン3g/l,グルコース6
g/l,塩化ナトリウム2.5g/l,チオグリコール酸ナトリウ
ム0.5g/l,L−システィン0.25g/l,亜硫酸ナトリウム0.1g
/l,そしてpH7.2に調製した培地２で,60℃で24時間静
置培養した後，遠心分離にて集菌した。
次に12mgのリゾチームを6mlのサリン（Saline）−EDTA
溶液（0.15M Naclと0.1M EDTA）を含み,pH8.0に調
製。）に溶かし，この溶液に集菌した菌株を加え，よく
撹拌した。これを37℃で約10分間加温し，菌体が溶菌し
始めたら，直ちに凍結した。
溶液（0.15M Naclと0.1M EDTA）を含み,pH8.0に調
製。）に溶かし，この溶液に集菌した菌株を加え，よく
撹拌した。これを37℃で約10分間加温し，菌体が溶菌し
始めたら，直ちに凍結した。
この凍結した菌体に50mlのトリス−SDS緩衝液（10mg/ml
SDSと0.1M Naclを含むpH9.0に調製された0.1Mトリス緩
衝液。）を加えて撹拌し，らに60℃に加温し，完全に溶
菌させた。
SDSと0.1M Naclを含むpH9.0に調製された0.1Mトリス緩
衝液。）を加えて撹拌し，らに60℃に加温し，完全に溶
菌させた。
この溶菌液さに56mlの80％フェノールを加えて，約20分
間振とうさせ，フェノール抽出を行い，夾雑蛋白質を除
去した。この抽出された粗DNA溶液に２培容量の冷エタ
ノールを加えてガラス棒で繊維状の沈殿を巻き取り,70,
80,90％のエタノール各10ml中に順次，数分ずつ浸漬し
た後,20mlの希サリン−サイトレート（saline−citrat
e）溶液（0.015M NaCl,0.0015M Na3−クエン酸に調
製。）に溶かし，さらに濃saline−citrate溶液（1.5M
NaCl,0.15M Na3−クエン酸に調製。）を2ml加えて，粗D
NA液を調製した。
間振とうさせ，フェノール抽出を行い，夾雑蛋白質を除
去した。この抽出された粗DNA溶液に２培容量の冷エタ
ノールを加えてガラス棒で繊維状の沈殿を巻き取り,70,
80,90％のエタノール各10ml中に順次，数分ずつ浸漬し
た後,20mlの希サリン−サイトレート（saline−citrat
e）溶液（0.015M NaCl,0.0015M Na3−クエン酸に調
製。）に溶かし，さらに濃saline−citrate溶液（1.5M
NaCl,0.15M Na3−クエン酸に調製。）を2ml加えて，粗D
NA液を調製した。
この粗DNA液を500μg/ml位にうすめて，リボヌクレアー
ゼＡ〔R NaseA（シグマ社製）〕を50μg/ml,リボヌクレ
アーゼT1〔R NaseT1（シグマ社製）〕を30μg/mlになる
ように加え37℃で30分間加温した。冷却後，等量の80％
フェノールを加え，フェノール抽出を行い，抽出DNAを
エタノール沈殿にて回収し，さらに上記の希saline−ci
rate溶液20mlに溶解させ，さらに上記の濃saline−citr
ate溶液を2ml加えることにより，染色体DNAの抽出液を
調製した。
ゼＡ〔R NaseA（シグマ社製）〕を50μg/ml,リボヌクレ
アーゼT1〔R NaseT1（シグマ社製）〕を30μg/mlになる
ように加え37℃で30分間加温した。冷却後，等量の80％
フェノールを加え，フェノール抽出を行い，抽出DNAを
エタノール沈殿にて回収し，さらに上記の希saline−ci
rate溶液20mlに溶解させ，さらに上記の濃saline−citr
ate溶液を2ml加えることにより，染色体DNAの抽出液を
調製した。
（ｂ）ベクタ−プラスミドpBR322の調製。
プラスミドpBR322（Bethesda.Research Laboratories社
製）を導入したエシェリチア・コリC600株を,2のＬ−
培地（ポリペプトン10g/l,酵母エキス5g/l,グルコース1
g/l,塩化ナトリウム5g/lでpH7.2に調製。）で対数増殖
前期になるまで37℃で通気培養した後,10mlのクロラム
フェニコール溶液（3.6mg/mlとなるようにエタノールで
調製。）を添加し，さらに37℃で15分間通気培養してプ
ラスミドpBR322を増殖させた。
製）を導入したエシェリチア・コリC600株を,2のＬ−
培地（ポリペプトン10g/l,酵母エキス5g/l,グルコース1
g/l,塩化ナトリウム5g/lでpH7.2に調製。）で対数増殖
前期になるまで37℃で通気培養した後,10mlのクロラム
フェニコール溶液（3.6mg/mlとなるようにエタノールで
調製。）を添加し，さらに37℃で15分間通気培養してプ
ラスミドpBR322を増殖させた。
次に遠心分離にて集菌した菌を80mlをTE−シュクロース
緩衝液（200mg/mlシュクロース,20mM EDTAを含み,pH8.0
に調製された0.05Mトリス緩衝液。）に懸濁し，さらに8
mlのリゾチーム溶液（5mg/mlとなるように上記TE−シュ
クロース緩衝液にて調製。）を添加し，さらに28mlの5M
NaCl溶液と4mlの40mg/mlSDS溶液を加えた。
緩衝液（200mg/mlシュクロース,20mM EDTAを含み,pH8.0
に調製された0.05Mトリス緩衝液。）に懸濁し，さらに8
mlのリゾチーム溶液（5mg/mlとなるように上記TE−シュ
クロース緩衝液にて調製。）を添加し，さらに28mlの5M
NaCl溶液と4mlの40mg/mlSDS溶液を加えた。
この混合液を37℃で２時間反応させた後，遠心分離にて
粗プラスミドDNAを分離した。
粗プラスミドDNAを分離した。
次に,1/2容量の80％フェノールを加えてフェノール処理
を行い，夾雑蛋白質を除去した。この抽出した粗プラス
ミドを冷イソプロパノールにて沈殿回収し，さらにTE緩
衝液（0.14M NaCl,1mM EDTAを含む,pH7.5に調製された2
0mMトリス緩衝液。）に溶解した。この混合液に2mgのR
NaseAを添加し,37℃で２時間反応させ，上記と同様の方
法でフェノール処理にて夾雑RNAを除去した。この抽出
された粗プラスミドを２倍容量のエタノール沈殿にて回
収した。これを，さらに10mlの上記のTE緩衝液に溶解さ
せ，アガロースゲル濾過にて夾雑RNAをさらに除去し，
得られた粗DNAをエタノール沈殿にて再び回収した。
を行い，夾雑蛋白質を除去した。この抽出した粗プラス
ミドを冷イソプロパノールにて沈殿回収し，さらにTE緩
衝液（0.14M NaCl,1mM EDTAを含む,pH7.5に調製された2
0mMトリス緩衝液。）に溶解した。この混合液に2mgのR
NaseAを添加し,37℃で２時間反応させ，上記と同様の方
法でフェノール処理にて夾雑RNAを除去した。この抽出
された粗プラスミドを２倍容量のエタノール沈殿にて回
収した。これを，さらに10mlの上記のTE緩衝液に溶解さ
せ，アガロースゲル濾過にて夾雑RNAをさらに除去し，
得られた粗DNAをエタノール沈殿にて再び回収した。
この沈殿を23.1mlの0.02Mトリス緩衝液（pH8.0に調
製。）に溶解し，さらに23.7gの塩化セシウムと0.6mlの
エチジウムブロマイド溶液（10mg/mlに調製。）を加
え，約40時間超遠心することにより，プラスミドDNAを
分離し，次にノルマルブタノールにより，エチジウムブ
ロマイドを除去した。この分離したプラスミドを0.01M
のTE緩衝液（0.1mM EDTAを含むpH7.5に調製された0.01M
トリス緩衝液。）で透析することにより，精製プラスミ
ドpBR322を得た。
製。）に溶解し，さらに23.7gの塩化セシウムと0.6mlの
エチジウムブロマイド溶液（10mg/mlに調製。）を加
え，約40時間超遠心することにより，プラスミドDNAを
分離し，次にノルマルブタノールにより，エチジウムブ
ロマイドを除去した。この分離したプラスミドを0.01M
のTE緩衝液（0.1mM EDTAを含むpH7.5に調製された0.01M
トリス緩衝液。）で透析することにより，精製プラスミ
ドpBR322を得た。
（ｃ）プラスミドpICD242の創製。
（ａ）の方法で得られたクロストリジウム・サーモアセ
チィカムの染色体DNA10μｇと制限酵素Hind III（宝酒
造社製）30ユニットを,7mM MgCl2,150mM NaCl,0.2mM ED
TA,7mM 2−メルカプトエタノール,0.01％BSAを含むpH7.
5に調製した10mMトリス緩衝液100μｌに入れ,37℃で30
分間反応させてDNAを消化させた後,65℃で５分間加熱
し，Hind IIIを不活性化し，冷エタノールにて消化DNA
断片を沈殿回収した。
チィカムの染色体DNA10μｇと制限酵素Hind III（宝酒
造社製）30ユニットを,7mM MgCl2,150mM NaCl,0.2mM ED
TA,7mM 2−メルカプトエタノール,0.01％BSAを含むpH7.
5に調製した10mMトリス緩衝液100μｌに入れ,37℃で30
分間反応させてDNAを消化させた後,65℃で５分間加熱
し，Hind IIIを不活性化し，冷エタノールにて消化DNA
断片を沈殿回収した。
次に，（ｂ）の方法で得られたプラスミドpBR3223μｇ
に制限酵素Hind III 3ユニットを加え，上記と同様の緩
衝液中で37℃で10時間反応させ，上記と同様の方法で消
化プラスミドDNAを回収した。こうして得られた消化染
色体及びプラスミドとDNAを混合し,T4DNAリガーゼ（宝
酒造社製）を用い,6.6mM MgCl2,10mMDTT,66μM ATPを含
むpH7.6に調製した66mMトリス緩衝液中で,13℃で16時間
反応させ，消化DNAを再結合することにより，プラスミ
ドpICD242を得た。
に制限酵素Hind III 3ユニットを加え，上記と同様の緩
衝液中で37℃で10時間反応させ，上記と同様の方法で消
化プラスミドDNAを回収した。こうして得られた消化染
色体及びプラスミドとDNAを混合し,T4DNAリガーゼ（宝
酒造社製）を用い,6.6mM MgCl2,10mMDTT,66μM ATPを含
むpH7.6に調製した66mMトリス緩衝液中で,13℃で16時間
反応させ，消化DNAを再結合することにより，プラスミ
ドpICD242を得た。
（ｄ）トランスフォーメーション。
まず，宿主菌のエシェリチア・コリC600r-m-株を50mlの
上記のＬ−培地にて培養し，遠心分離にて集菌後,50ml
の0.1M MgCl2溶液に懸濁し，さらに遠心分離を行って最
終的には2.5mlの0.1M MgCl2溶液に懸濁させた。
上記のＬ−培地にて培養し，遠心分離にて集菌後,50ml
の0.1M MgCl2溶液に懸濁し，さらに遠心分離を行って最
終的には2.5mlの0.1M MgCl2溶液に懸濁させた。
このようにして得られたエシェリチア・コリC600r-m-株
の懸濁液0.2mlに（ｃ）の方法で得られたプラスミドpIC
D242を含む混合物を0.1ml加え,0℃で30分間処理したの
ち,42℃で２分間処理した。
の懸濁液0.2mlに（ｃ）の方法で得られたプラスミドpIC
D242を含む混合物を0.1ml加え,0℃で30分間処理したの
ち,42℃で２分間処理した。
次にこれに3mlの前記したＬ−培地を加え,37℃で１時間
培養し，さらにアンピシリン（15μg/mlに調製。）の入
ったＬ−寒天培地（Ｌ−培地１当り,15gの寒天を加え
たもの。）で37℃で培養後，生じたコロニーを，さらに
テトラサイクリン（25μg/mlに調製。）の入ったＬ−寒
天培地で培養後，生えてこないコロニーを見出すことに
より，プラスミドpICD242の導入されたエシエリチア・
コリC600−pICD242が得られた。
培養し，さらにアンピシリン（15μg/mlに調製。）の入
ったＬ−寒天培地（Ｌ−培地１当り,15gの寒天を加え
たもの。）で37℃で培養後，生じたコロニーを，さらに
テトラサイクリン（25μg/mlに調製。）の入ったＬ−寒
天培地で培養後，生えてこないコロニーを見出すことに
より，プラスミドpICD242の導入されたエシエリチア・
コリC600−pICD242が得られた。
次にこうして得られたエシェリチア・コリC600−pICD24
2のコロニーより，アンピシリン（15μg/mlに調製。）
の入った上記のグリセロール培地（ポリペプトン10g/l,
酵母エキス2.5g/l,肉エキス2g/l,グリセロール2g/l,塩
化ナトリウム5g/l,リン酸１カリウム2g/l,リン酸２カリ
ウム2g/l,硫酸マグネシウム0.1g/l,ビオチン４μg/l,そ
してpH7.2に調製）100mlで37℃で16時間、振とう培養を
行った。これを遠心分離にて集菌，洗浄後,5mlの0.01％
２−メルカプトエタノールを含み,pH7.4に調製した0.01
Mのリン酸緩衝液に懸濁し,0℃で５分間の超音波処理に
て菌体を破砕し，遠心分離にて粗酵素抽出液を得た。
2のコロニーより，アンピシリン（15μg/mlに調製。）
の入った上記のグリセロール培地（ポリペプトン10g/l,
酵母エキス2.5g/l,肉エキス2g/l,グリセロール2g/l,塩
化ナトリウム5g/l,リン酸１カリウム2g/l,リン酸２カリ
ウム2g/l,硫酸マグネシウム0.1g/l,ビオチン４μg/l,そ
してpH7.2に調製）100mlで37℃で16時間、振とう培養を
行った。これを遠心分離にて集菌，洗浄後,5mlの0.01％
２−メルカプトエタノールを含み,pH7.4に調製した0.01
Mのリン酸緩衝液に懸濁し,0℃で５分間の超音波処理に
て菌体を破砕し，遠心分離にて粗酵素抽出液を得た。
このようにして得た粗酵素抽出液の耐熱性のロイシン脱
水素酵素の活性を測定したところ,8.9ユニット/mg・プ
ロティンであった。これはDNA供与菌であるクロストリ
ジウム・サーモアセチィカムAN28−４株のロイシン脱水
素酵素の活性（0.010ユニット/mg.プロティン）よりも8
00倍以上の活性があった。
水素酵素の活性を測定したところ,8.9ユニット/mg・プ
ロティンであった。これはDNA供与菌であるクロストリ
ジウム・サーモアセチィカムAN28−４株のロイシン脱水
素酵素の活性（0.010ユニット/mg.プロティン）よりも8
00倍以上の活性があった。
また，このロイシン脱水素酵素を含む粗酵素抽出液は,2
−メルカプトエタノールを0.01％含むpH7.2の10mMリン
酸緩衝液中,70℃で20分間加熱処理しとところ,80％以上
の残存活性を有していた。
−メルカプトエタノールを0.01％含むpH7.2の10mMリン
酸緩衝液中,70℃で20分間加熱処理しとところ,80％以上
の残存活性を有していた。
実施例1,比較例１ 参考例１で得たエシェリチア・コリC600-pICD242株（微
工研菌寄第9213号）をアンピシリン（15μg/mlに調
製。）を含む前記グリセロール培地100mlにて37℃で16
時間振とう培養した。培養後，遠心分離にて集菌し,0.0
1％の２−メルカプトエタノールを含むpH7.4に調製した
0.01Mリン酸緩衝液5mlに懸濁し，約５分間の超音波処理
で菌体を破砕した。その菌体破砕液の酵素活性を測定し
たところ，培地１当たりのロイシン脱水素酵素活性は
9500ユニットであることが判り，これは以下の比較例１
に比べて約10培近くも活性があり，生産性が著しく向上
していることが明らかである。
工研菌寄第9213号）をアンピシリン（15μg/mlに調
製。）を含む前記グリセロール培地100mlにて37℃で16
時間振とう培養した。培養後，遠心分離にて集菌し,0.0
1％の２−メルカプトエタノールを含むpH7.4に調製した
0.01Mリン酸緩衝液5mlに懸濁し，約５分間の超音波処理
で菌体を破砕した。その菌体破砕液の酵素活性を測定し
たところ，培地１当たりのロイシン脱水素酵素活性は
9500ユニットであることが判り，これは以下の比較例１
に比べて約10培近くも活性があり，生産性が著しく向上
していることが明らかである。
その後，遠心分離にて粗酵素抽出液を得，その粗酵素抽
出液を70℃で30分間熱処理した後，遠心分離し，その上
澄液のロイシン脱水素酵素活性を測定したところ,46ニ
ット/mg・プロティンの活性があり，粗酵素抽出液を70
℃で30分間熱処理することにより，熱処理前に比べて比
活性が約５倍向上した。
出液を70℃で30分間熱処理した後，遠心分離し，その上
澄液のロイシン脱水素酵素活性を測定したところ,46ニ
ット/mg・プロティンの活性があり，粗酵素抽出液を70
℃で30分間熱処理することにより，熱処理前に比べて比
活性が約５倍向上した。
次に,7.5％濃度のアクリルアミドを用いた調製用電気泳
動，スーパーローズ12ゲルクロマトカラム（フアルマシ
ア製,2本を直列に連結）による高速液体クロマトグラフ
ィーで精製して比活性116ユニット/mg・プロティンの耐
熱性のロイシン脱水素酵素を得た。
動，スーパーローズ12ゲルクロマトカラム（フアルマシ
ア製,2本を直列に連結）による高速液体クロマトグラフ
ィーで精製して比活性116ユニット/mg・プロティンの耐
熱性のロイシン脱水素酵素を得た。
この酵素は,pH9.4の7.5％アクリルアミド電気泳動法に
より単一なバンドを与え，従来のバチルス・ステアロサ
ーモフイルス由来のロイシン脱水素酵素の性質と同じで
あった。
より単一なバンドを与え，従来のバチルス・ステアロサ
ーモフイルス由来のロイシン脱水素酵素の性質と同じで
あった。
比較のため，バチルス・ステアロサーモフイルス由来の
遺伝子を組み込んだエシェリチア・コリC600-pICR1（微
工研菌寄第6937号）を公知文献（特開昭59-159778号公
報）に従い，前記グリセロール培地100mlにて37℃で16
時間振盪培養し，遠心分離にて集菌した後,0.01％の２
−メルカプトエタノールを含むpH7.4に調製した0.01Mリ
ン酸緩衝液5mlに懸濁し，約５分間の超音波処理で菌体
を破砕して破砕液を得た。この破砕液についてロイシン
脱水素酵素の活性を測定したところ，培地１当たり10
00ユニットであった（比較例１）。
遺伝子を組み込んだエシェリチア・コリC600-pICR1（微
工研菌寄第6937号）を公知文献（特開昭59-159778号公
報）に従い，前記グリセロール培地100mlにて37℃で16
時間振盪培養し，遠心分離にて集菌した後,0.01％の２
−メルカプトエタノールを含むpH7.4に調製した0.01Mリ
ン酸緩衝液5mlに懸濁し，約５分間の超音波処理で菌体
を破砕して破砕液を得た。この破砕液についてロイシン
脱水素酵素の活性を測定したところ，培地１当たり10
00ユニットであった（比較例１）。
（発明の効果） 本発明によれば，耐熱性のロイシン脱水素酵素が多量
に，しかも容量に得ることができるため，臨床検査用試
薬等の分野に極めて有用である。
に，しかも容量に得ることができるため，臨床検査用試
薬等の分野に極めて有用である。
第１図は本発明に用いられるプラスミドpICD242の制限
酵素地図である。 S:Sal I,E: EcoR I,P: Pst I, B:BamH I,H:Hind III
酵素地図である。 S:Sal I,E: EcoR I,P: Pst I, B:BamH I,H:Hind III
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:145）
Claims (1)
- 【請求項１】嫌気性かつ好熱性のクロストリジウム（Cl
ostridium）属に属する細菌由来のロイシン脱水素酵素
遺伝子をベクタープラスミドに連結した組み換え体プラ
スミドで形質転換されたエシェリチア（Escherichia）
属に属する細菌を培養し，培養物から耐熱性のロイシン
脱水素酵素を採取することを特徴とする耐熱性のロイシ
ン脱水素酵素の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62042263A JPH074239B2 (ja) | 1987-02-24 | 1987-02-24 | 耐熱性のロイシン脱水素酵素の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62042263A JPH074239B2 (ja) | 1987-02-24 | 1987-02-24 | 耐熱性のロイシン脱水素酵素の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63207383A JPS63207383A (ja) | 1988-08-26 |
| JPH074239B2 true JPH074239B2 (ja) | 1995-01-25 |
Family
ID=12631145
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62042263A Expired - Lifetime JPH074239B2 (ja) | 1987-02-24 | 1987-02-24 | 耐熱性のロイシン脱水素酵素の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH074239B2 (ja) |
-
1987
- 1987-02-24 JP JP62042263A patent/JPH074239B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63207383A (ja) | 1988-08-26 |
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