JPH0249713B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0249713B2 JPH0249713B2 JP58036307A JP3630783A JPH0249713B2 JP H0249713 B2 JPH0249713 B2 JP H0249713B2 JP 58036307 A JP58036307 A JP 58036307A JP 3630783 A JP3630783 A JP 3630783A JP H0249713 B2 JPH0249713 B2 JP H0249713B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmid
- dna
- leucine dehydrogenase
- picr1
- bacteria
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
- C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、耐熱性のロイシン脱水素酵素の遺伝
子を有する新規プラスミドに関するものである。 ロイシン脱水素酵素は、臨床検査用酵素とし
て、非常に重要な酵素である。このロイシン脱水
素酵素を生産できる微生物としては、常温菌であ
るバチルス・スフエリカス（Bacillus
sphaericus）のようなバチルス菌の細菌が知られ
ている。しかし、これらの菌より得られるロイシ
ン脱水素酵素は室温の水溶液中で１〜３週間のう
ちに活性をほとんどを失うのが通例であり、熱安
定性及び長期の安定性欠けるものであるという大
きな欠点を有している。 それゆえ、ロイシン脱水素酵素を用いる臨床検
査の分析法の利点を最大限に発揮するうえで、熱
に安定で、室温で長期間活性を失わないロイシン
脱水素酵素の出現が熱望されていた。 このため、先に本発明者らの一部が、このよう
な観点から、熱に安定で、長期間活性を失わない
性質を有するロイシン脱水素酵素を求めて鋭意研
究した結果、好熱性のバチルス属に属する細菌に
上記の性質を有するロイシン脱水素酵素が存在す
ることを見い出し、特許出願し、さらに生化学、
Vol.54.第634頁、（1982年）に発表した。 しかし、この好熱性のバチルス属に属する細菌
は、耐熱性のロイシン脱水素酵素の生産性が低
く、この酵素を効率良く得るには十分満足しうる
ものではなかつた。 一方、エシエリチア（Escherichia）属に属す
る細菌は、本来ロイシン脱水素酵素生産能を全く
有していない。 また、組換、DNA遺伝子工学に有用なプラス
ミドは良く知られている。例えば、サイエンス
（Science）198巻、1056頁（1978年）には、プラ
スミドpBR322にラクトースプロモータをつない
だプラスミドを導入した大腸菌内で動物のタンパ
ク質が生産されることが記載されている。 また、特開昭56−5093号公報には、サーマス属
に属する細菌の遺伝子を有するプラスミド（ベク
ターとしてプラスミドpBR322が用いられてい
る。）を導入することにより形質転換されたエン
シエリチア（Escherichia）属に属する細菌を用
いて耐熱性の酵素を調整することが記載されてい
るが、耐熱性のロイシン脱水素酵素の遺伝子を有
するプラスミドについては、全く何も記載されて
いなし、また、その創製に成功したとの報告もな
されていない。 そこで、本発明者らは、耐熱性のロイシン脱水
素酵素の生産性を向上させるために常温微生物内
で耐熱性のロイシン脱水素酵素が発現できるプラ
スミドを求めて鋭意研究した結果、好熱性の微生
物からロイシン脱水素酵素の遺伝子を分離し、こ
の遺伝子が公知のプラスミドDNAに導入しうる
こと及びこのようにして遺伝子を導入して得たプ
ラスミドが前記の性質を有することを見い出し、
本発明を完成した。 すなわち、本発明は、バチルス・ステアロサー
モフイルス（Bacillus stearothermophilus）の
染色体DNA由来で、かつ制限酵素SalIによる切
断で生じうる耐熱性のロイシン脱水素酵素の遺伝
子とベクタープラスミドとからなるプラスミドで
ある。 本発明のプラスミドを得るには、例えば、バイ
オケミカ・エト・バイオフイジカ・アクタ
（Biochem.Biophys acta）72，619〜629（1963）
に記載の方法に従い、耐熱性のロイシン脱水素酵
素の遺伝子とベクターとしての役割を有する
DNAとを制限酵素で消化し、次いでリガーゼを
用いて結合することにより調整することができ
る。 本発明に用いられる耐熱性のロイシン脱水素酵
素の遺伝子は、バチルス・ステアロサーモフイル
ス（Bacillus stearothermophilus）の染色体
DNA由来のものである。ステアロサーモフイル
スの具体例としては、IFO12550，ATCC7953，
7954，8005，10194，12980，NCA1503などがあ
る。 また、ベクターとしての役割を有するDNAと
しては、例えば、プラスミドDNAがあげられ、
特にプラスミドpBR322が好ましい。また、制限
酵素としては、SalIがあげられ、リガーゼとして
は、例えばT4DNAリガーゼがあげられる。 本発明のプラスミドとしては、例えば、前記し
た方法でプラスミドpBR322に、バチルス・ステ
アロサーモフイルスの染色体DNA由来のロイシ
ン脱水素酵素の遺伝子を導入したプラスミド
pICR1があげられる。このプラスミドpICR1を昭
和58年２月23日に通産省工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託の手続を行つたが、このプラスミ
ドは受託されなかつた。 次にこのプラスミドpICR1の理化学的性質を示
す。 (1) 常温微生物内で耐熱性のロイシン脱水素酵素
を発現させることができる。 (2) 下記制限酵素に対し、次の切断感受性を有す
る。 制限酵素 切断部位数EocR ２ Hind １ Pst ２ Sal ４ BamH ２ 制限酵素の名称は次の菌種から得られる制限
酵素の略称である。EcoR ；エシエリチア・コアHind ；ヘモフイラス・インフルエンザPst ；プロビデンシア・スチユアーテイーSal ；ストレプトマイセス・アルプス BamH；バチルス・アミロリクエフアシエ
ンス 制限酵素による切断部位数は、過剰の制限酵
素存在下でプラスミドpICR1を消化し、その消
化物をアガロースゲル電気泳動にかけ、分離可
能な断片の数から決定される。 (3) 分子量は約６メガダルトンである。 本発明のプラスミドは、例えば、常温で生育す
る細菌に導入することができ、このプラスミドを
導入することにより、形質転換された細菌を得る
ことができる。この常温で生育する細菌としては
例えば、エシエリチア（Escherichia）属に属す
る細菌があげられ、特にエシエリチア コリ
（Escherichia Coli）が好ましい。そのエシエリ
チア コリの具体例として、エシエリチア コリ
C600があげられる。 また、本発明のプラスミドを、例えば、上記常
温で生育する細菌に導入するには、例えば、ジヤ
ーナル・オブ・モレキユラ・バイオロジー（J.
Mol.Biol.）53，159〜162（1970）の方法に従つ
て、℃付近の温度で塩化カルシウム処理した上記
細菌と本発明のプラスミドとを接触させることに
より行えばよい。 以上のように形質転換された細菌の例として、
プラスミドpICR1が導入されたエシエリチア コ
リC600−pICR1株（微工研菌寄第6937号）があ
げられる。この菌株は、公知のエシエリチア・コ
リC600〔Nature217，1110〜1114（1968）を参照。〕
と、耐熱性のロイシン脱水素酵素生産能及びアン
ピシリン耐性を有する点以外は同じ菌学的性質を
有ている。この菌株は、非伝達性を伝達性に変え
ることなく、また非病原性を病原性に変えること
なく安全性が保持されている。 本発明のプラスミドは、上記したように有用な
微生物、例えば、常温で生育する細菌を形質転換
して耐熱性のロイシン脱水素酵生産能を賦与する
ことができ、形質転換された細菌から耐熱性のロ
イシン脱水素酵素を大量に、しかも容易に得るこ
とができるので、非常に有用である。 本発明によつて得られる耐熱性のロイシン脱水
素酵素は、生化学、Vol.54，第634頁，４（1982
年）に記載の耐熱性のロイシン脱水素酵素と同じ
理化学的性質を有する。 次に本発明を実施例により具体的に説明する。 なお、耐熱性のロイシン脱水素酵素の活性はア
ミノ酸、核酸〔Amino Acid and Nucleic Acid
27，84〜88（1973）〕に記載されているロイシン脱
水素酵素活性の測定法、すなわち、PH11.3の
100μmoleのグリシン−KCl−KOH緩衝液中で、
1.25μmoleのNADと、10μmoleのＬ−ロイシンを
含む混合液と調製し、その混合液に適当量の粗酵
素抽出液をかえて最終容量を0.8mlとし、25℃あ
るいは55℃における還元型NADの単位時間あた
りの増加を340nmの吸光度の増加として測定する
方法で行つた。 また、実施例及び参考例中の％は、容量％を示
す。 実施例 １ (i) バチルス・ステアロサーモフイルスの染色体
DNAの分離。 バチルス・ステアロサーモフイルス
IFO12250株から、バイオケミカ・エト・バイ
オフイジカ・アクタ（Biochem Biophys
acta）72，619−629（1963）に記載の方法に準
じ染色体DNAを分離した。 まず、バチルス・ステアロサーモフイルス
IFO12250株をグリセロール培地（ポリペプト
ン10ｇ／、酵母エキス2.5ｇ／、肉エキス
２ｇ／、グリセロール２ｇ／、塩化ナトリ
ウム５ｇ／、リン酸カリウム２ｇ／、リン
酸２カリウム２ｇ／、硫酸マグネシウム0.1
ｇ／、ビオチン4μｇ／、そしてPH7.2に調
製）２で、55℃で12時間振とう培養した後、
遠心分離にて集菌した。 次に、12mgのリゾチームを６mlサリン
（saline）−EDTA溶液（0.15MNaClと、
0.1MEDTAを含み、PH8.0に調製。）に溶かし、
この溶液に集菌した菌体を加え、よく撹拌し
た。これを37℃で約10分間加温し、菌体が溶菌
し始めたら、直ちに凍結した。 この凍結した菌体に50mlのトリス−SDS緩衝
液10mg／mlSDSと0.1M NaClを含むPH9.0に調
製された0.1Mトリス緩衝液。）を加えて撹拌
し、されに60℃に加温し、完全に溶菌させた。 この溶菌液に56mlの80％フエノールを加え
て、約20分間振とうさせ、フエノール抽出を行
い、夾雑蛋白質を除去した。この抽出された粗
DNA溶液に２倍容量の冷エタノールを加えて
ガラス棒で繊維状の沈澱を巻き取り、70，80，
90％のエタノール各10ml中に準じ、数分ずつ浸
漬した後、20mlの希サリン−サイトレート
（Saline―citrate）溶液（0.015M NaCl、
0.0015M Na3―リン酸に調製。）に溶かし、さ
らに濃Saline―citrate溶液（1.5M NaCl、
0.15M Na3―リン酸に調製。）を２ml加えて、
粗DNA液を調製した。 この粗DNA液を500μｇ／ml位にうすめてリ
ポヌクレアーゼ〔Ｒ Nase（シグマ社製）〕を
50μｇ／ml、Ｒ NaseA（シマダ社製）を30μ
ｇ／mlになるように加え、37℃で30分間加温し
た。冷却後、等量の80％エタノールを加え、フ
エノール抽出を行い、抽出DNAをエタノール
沈澱にて回収し、さらに上記の希Saline−
citrate溶液20mlに溶解させ、さらに上記の濃
Saline−citrate溶液を２ml加えることにより、
染色体DNAの抽出液を調製した。 (ii) ベクタープラスミドpBR322の調製。 プラスミドpBR322（Betheada Research
Laboratories社製）を導入したエシエリチア・
コリC600株を、2lのＬ―培地（ポリペプトン10
ｇ／、酵母エキス５ｇ／、グリコース１
ｇ／、塩化ナトリウム５ｇ／でPH7.2に調
製。）で対数増殖期になるまで37℃で通気培養
した後、10mlのクロラムフエニコール溶液
（3.6mg／mlとなるようにエタノールで調製。）
を添加し、さらに37℃で15時間通気培養してプ
ラスミドpBR322を増殖させた。 次に遠心分離にて集菌した菌を80mlのTE−
シユクロース緩衝液200mg／mlシユクロース、
20mM EDTAを含み、PH8.0に調製された
0.05Mトリス緩衝液。）に懸濁し、さらに８ml
のリゾチーム溶液（５mg／mlとなるように上記
TE―シユクロース緩衝液にて調製。）を添加
し、さらに28mlの5M NaCl溶液と４mlの40
mg／mlSDS溶液を加えた。 この混合液を37℃で２時間反応させた後、遠
心分離にて粗プラスミドDNAを分離した。 次に、1/2容量の80％フエノールを加えてフ
エノール処理を行い、夾雑蛋白質を除去した。
この抽出した粗プラスミドを冷イソプロパノー
ルにて沈澱回収し、さらにTE緩衝液（0.14M
NaCl、1mM EDTAを含む、PH7.5に調製され
た20mMトリス緩衝液。）に溶解した。この混
合液に２mgのＲ Naseを添加し、37℃で２時
間反応させ、上記と同様の方法でフエノール処
理にて夾雑RNAを除去した。 この抽出した粗プラスミドを２倍容量のエタ
ノールを加え、エタノール沈澱にて回収した。
これを、さらに、10mlの上記のTE緩衝液に溶
解させ、アガロースゲルロ過にて夾雑RNAを
さらに除去し、得られた粗DNAをエタノール
にて再び回収した。 この沈澱を23.1mlの0.02Mトリス緩衝液（PH
8.0に調製。）に溶解し、さらに23.7ｇの塩化セ
シウムと0.6mlのエチジウムプロマイド溶液
（10mg／mlに調製。）を加え、約40時間超遠心す
ることにより、プラスミドDNAを分離し、次
にノルマルブタノールにより、エチジウムブロ
マイドを除去した。この分離したプラスミドを
0.01MのTE緩衝液（0.1mM EDTAを含む。PH
7.5に調製ささた0.01Mトリス緩衝液で透析す
ることにより、精製プラスミドpBR322得た。 (iii) プラスミドpICR1の創製。 (i)の方法で得られたバチルス・ステアロサー
モフイルスの染色体DNA5μｇと制限酵素Sal
（宝酒造社製）20ユニツトを、7mM Mg
Cl2、150mM NaCl 0.2mM EDTA 7mM2−
メルカプトエタノール、0.01％BSAを含むPH
7.5に調製した10mAトリス緩衝液100μに入
れ、37℃で2.5時間反応させて、DNAを消化さ
せた後、65℃で５分間加熱し、Salを不活性
化し、冷エタノールにて消化、DNA断片を沈
澱回収した。 次に、(ii)の方法で得られたプラスミド
pBR3221μｇに制限酵素Sal３ユニツトを加
え、上記と同様の緩衝液中で37℃で10時間反応
させ、上記と同様の方法で消化プラスミド
DNAを回収した。こうして得られた消化染色
体及びプラスミドのDNAを混合し、T4DNA
リガーゼ（宝酒造社製）を用い、6.6mA
MgCl2、10mM DTT、66μM ATPを含むPH
7.6に調製した66mMトリス緩衝液中で、13℃
で19時間反応させ、消化DNAと再結合するこ
とにより、プラスミドpICR1を得た。 参考例 １ 実施例１で得たプラスミドpICR1の発現性を調
べるため、次のトランスフオーメーシヨン処理を
行つた。 (iv) トランスフオーメーシヨン まず、宿主菌のエシエリチア・コリC600r−
ｍ−株を50mlの上記のＬ−培地にて培養し、遠
心分離に集菌後、50mlの0.1M MgCl2溶液に懸
濁し、さらに遠心分離を行つて最終的には2.5
mlの0.1M MgCl2溶液に懸濁させた。 このようにして得られたエシエリチア・コリ
C600r−ｍ−株の懸濁液0.2mlに(iii)の方法で得たプ
ラスミドpICR1を含む混合物を0.1ml加え、０℃
で30分間処理したのち、42℃で２分間処理した。
次にこれを３ml前記したＬ−培地を加え、37℃で
１時間培養し、さらにアンピシリン（15μｇ／ml
に調製。）の入つたＬ−寒天培地（Ｌ−培地１
当り、15ｇの寒天を加えたもの。）で37℃で培養
後、生じたコロニーを、さらにテトラサイクリン
（25μｇ／mlに調製。）の入つたＬ−寒天培地で培
養後、生えてこないコロニーを見出すことによ
り、プラスミドpICR1の導入されたエシエリチ
ア・コリC600−pICR1が得られた。 次にこうして得られたエシエリチア・コリ
C600−pICR1のコロニーより、アンピシリン
（15μｇ／mlに調製。）の入つた上記のグリセロー
ル培地100mlで37℃で16時間、振とう培養を行つ
た。これを遠心分離にて集菌、洗浄後、５mlの
0.01％２−メルカプトエタノールを含み、PH7.4
に調製した0.01Mにリン酸緩衝液に懸濁し、０℃
で５分間超音波処理にて菌体を破砕し、遠心分離
にて粗酵素抽出液を得た。 このようにして得た粗酵素抽出液の耐熱性のロ
イシン脱水素酵素の活性を測定したところ、
0.201ユニツト／mg・プロテインであつた。これ
はDNA供与菌であるバチルス・ステアロサーモ
フイルスIFO12250株のロイシン脱水素酵素の活
性（0.010ユニツト／mg・プロテイン）よりも10
培以上の活性があつた。 また、このロイシン脱水素酵素を含む粗酵素抽
出液は、２―メルカプトエタノールを0.01％含む
PH7.2の10mMリン酸緩衝液中、70℃で20分間加
熱処理したところ、80％以上の残存活性を有して
いた。 次にこの菌株から前記(iii)と同様の方法でプラス
ミドpICR1を分離して、水平型アガロースゲル電
気泳動でプラスミドpICR1の性質を調べた。 電気泳動を用いた緩衝液として、2.5mM
EDTA−Na、89mMのほう酸を含みPH8.3に調製
した89mMのトリス緩衝液を用い、ゲルとしてこ
の緩衝液に0.7％のアガロースと0.5mg／mlに調製
したエチジウムブロマイドを加えたものを用い、
これに、プラスミドpICR1とプラスミドpBR322、
さらに分子量マーカーとしてのラムダフアージ
DNAのHind（宝酒造社製）消化断片を各約1μ
ｇDNAを同一アガロースゲル上で同時に巾１cm
当り、7Vの定付加電圧で３〜４時間、泳動させ
た。次に紫外線ランプでバンドを判定し、プラス
ミドpICR1の大きさを調べた結果、分子量が約６
メガダルトンであつた。また、プラスミド
pBR322の分子量は、2.8メガダルトンであつた。 また、このプラスミドpICR1を制限酵素EcoR
，Hind，BamH，Pst，Salで各々の
制限酵素の適正条件で反応させ、プラスミド
pICR1を消化させた。 各制限酵素にて得られた消化試料は、上記と同
様の方法でアガロースゲル電気泳動を行い、各制
限酵素による切断部位数による切断部位数を調べ
た結果、プラスミドpICR1は以下の切断感受性部
位を有することが判明した。 制限酵素 切断部位数EcoR ２ Hind １ Pst ２ Sal ４ BamH ２ さらに、プラスミドpICR1は、Sal切断部位
にて、バチルス・ステアロサーモフイルス
IFO12250株のロイシン脱水素酵素の遺伝子を含
む染色体DNA断片とプラスミドpBR322DNAと
が結合していることが明らかである。
子を有する新規プラスミドに関するものである。 ロイシン脱水素酵素は、臨床検査用酵素とし
て、非常に重要な酵素である。このロイシン脱水
素酵素を生産できる微生物としては、常温菌であ
るバチルス・スフエリカス（Bacillus
sphaericus）のようなバチルス菌の細菌が知られ
ている。しかし、これらの菌より得られるロイシ
ン脱水素酵素は室温の水溶液中で１〜３週間のう
ちに活性をほとんどを失うのが通例であり、熱安
定性及び長期の安定性欠けるものであるという大
きな欠点を有している。 それゆえ、ロイシン脱水素酵素を用いる臨床検
査の分析法の利点を最大限に発揮するうえで、熱
に安定で、室温で長期間活性を失わないロイシン
脱水素酵素の出現が熱望されていた。 このため、先に本発明者らの一部が、このよう
な観点から、熱に安定で、長期間活性を失わない
性質を有するロイシン脱水素酵素を求めて鋭意研
究した結果、好熱性のバチルス属に属する細菌に
上記の性質を有するロイシン脱水素酵素が存在す
ることを見い出し、特許出願し、さらに生化学、
Vol.54.第634頁、（1982年）に発表した。 しかし、この好熱性のバチルス属に属する細菌
は、耐熱性のロイシン脱水素酵素の生産性が低
く、この酵素を効率良く得るには十分満足しうる
ものではなかつた。 一方、エシエリチア（Escherichia）属に属す
る細菌は、本来ロイシン脱水素酵素生産能を全く
有していない。 また、組換、DNA遺伝子工学に有用なプラス
ミドは良く知られている。例えば、サイエンス
（Science）198巻、1056頁（1978年）には、プラ
スミドpBR322にラクトースプロモータをつない
だプラスミドを導入した大腸菌内で動物のタンパ
ク質が生産されることが記載されている。 また、特開昭56−5093号公報には、サーマス属
に属する細菌の遺伝子を有するプラスミド（ベク
ターとしてプラスミドpBR322が用いられてい
る。）を導入することにより形質転換されたエン
シエリチア（Escherichia）属に属する細菌を用
いて耐熱性の酵素を調整することが記載されてい
るが、耐熱性のロイシン脱水素酵素の遺伝子を有
するプラスミドについては、全く何も記載されて
いなし、また、その創製に成功したとの報告もな
されていない。 そこで、本発明者らは、耐熱性のロイシン脱水
素酵素の生産性を向上させるために常温微生物内
で耐熱性のロイシン脱水素酵素が発現できるプラ
スミドを求めて鋭意研究した結果、好熱性の微生
物からロイシン脱水素酵素の遺伝子を分離し、こ
の遺伝子が公知のプラスミドDNAに導入しうる
こと及びこのようにして遺伝子を導入して得たプ
ラスミドが前記の性質を有することを見い出し、
本発明を完成した。 すなわち、本発明は、バチルス・ステアロサー
モフイルス（Bacillus stearothermophilus）の
染色体DNA由来で、かつ制限酵素SalIによる切
断で生じうる耐熱性のロイシン脱水素酵素の遺伝
子とベクタープラスミドとからなるプラスミドで
ある。 本発明のプラスミドを得るには、例えば、バイ
オケミカ・エト・バイオフイジカ・アクタ
（Biochem.Biophys acta）72，619〜629（1963）
に記載の方法に従い、耐熱性のロイシン脱水素酵
素の遺伝子とベクターとしての役割を有する
DNAとを制限酵素で消化し、次いでリガーゼを
用いて結合することにより調整することができ
る。 本発明に用いられる耐熱性のロイシン脱水素酵
素の遺伝子は、バチルス・ステアロサーモフイル
ス（Bacillus stearothermophilus）の染色体
DNA由来のものである。ステアロサーモフイル
スの具体例としては、IFO12550，ATCC7953，
7954，8005，10194，12980，NCA1503などがあ
る。 また、ベクターとしての役割を有するDNAと
しては、例えば、プラスミドDNAがあげられ、
特にプラスミドpBR322が好ましい。また、制限
酵素としては、SalIがあげられ、リガーゼとして
は、例えばT4DNAリガーゼがあげられる。 本発明のプラスミドとしては、例えば、前記し
た方法でプラスミドpBR322に、バチルス・ステ
アロサーモフイルスの染色体DNA由来のロイシ
ン脱水素酵素の遺伝子を導入したプラスミド
pICR1があげられる。このプラスミドpICR1を昭
和58年２月23日に通産省工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託の手続を行つたが、このプラスミ
ドは受託されなかつた。 次にこのプラスミドpICR1の理化学的性質を示
す。 (1) 常温微生物内で耐熱性のロイシン脱水素酵素
を発現させることができる。 (2) 下記制限酵素に対し、次の切断感受性を有す
る。 制限酵素 切断部位数EocR ２ Hind １ Pst ２ Sal ４ BamH ２ 制限酵素の名称は次の菌種から得られる制限
酵素の略称である。EcoR ；エシエリチア・コアHind ；ヘモフイラス・インフルエンザPst ；プロビデンシア・スチユアーテイーSal ；ストレプトマイセス・アルプス BamH；バチルス・アミロリクエフアシエ
ンス 制限酵素による切断部位数は、過剰の制限酵
素存在下でプラスミドpICR1を消化し、その消
化物をアガロースゲル電気泳動にかけ、分離可
能な断片の数から決定される。 (3) 分子量は約６メガダルトンである。 本発明のプラスミドは、例えば、常温で生育す
る細菌に導入することができ、このプラスミドを
導入することにより、形質転換された細菌を得る
ことができる。この常温で生育する細菌としては
例えば、エシエリチア（Escherichia）属に属す
る細菌があげられ、特にエシエリチア コリ
（Escherichia Coli）が好ましい。そのエシエリ
チア コリの具体例として、エシエリチア コリ
C600があげられる。 また、本発明のプラスミドを、例えば、上記常
温で生育する細菌に導入するには、例えば、ジヤ
ーナル・オブ・モレキユラ・バイオロジー（J.
Mol.Biol.）53，159〜162（1970）の方法に従つ
て、℃付近の温度で塩化カルシウム処理した上記
細菌と本発明のプラスミドとを接触させることに
より行えばよい。 以上のように形質転換された細菌の例として、
プラスミドpICR1が導入されたエシエリチア コ
リC600−pICR1株（微工研菌寄第6937号）があ
げられる。この菌株は、公知のエシエリチア・コ
リC600〔Nature217，1110〜1114（1968）を参照。〕
と、耐熱性のロイシン脱水素酵素生産能及びアン
ピシリン耐性を有する点以外は同じ菌学的性質を
有ている。この菌株は、非伝達性を伝達性に変え
ることなく、また非病原性を病原性に変えること
なく安全性が保持されている。 本発明のプラスミドは、上記したように有用な
微生物、例えば、常温で生育する細菌を形質転換
して耐熱性のロイシン脱水素酵生産能を賦与する
ことができ、形質転換された細菌から耐熱性のロ
イシン脱水素酵素を大量に、しかも容易に得るこ
とができるので、非常に有用である。 本発明によつて得られる耐熱性のロイシン脱水
素酵素は、生化学、Vol.54，第634頁，４（1982
年）に記載の耐熱性のロイシン脱水素酵素と同じ
理化学的性質を有する。 次に本発明を実施例により具体的に説明する。 なお、耐熱性のロイシン脱水素酵素の活性はア
ミノ酸、核酸〔Amino Acid and Nucleic Acid
27，84〜88（1973）〕に記載されているロイシン脱
水素酵素活性の測定法、すなわち、PH11.3の
100μmoleのグリシン−KCl−KOH緩衝液中で、
1.25μmoleのNADと、10μmoleのＬ−ロイシンを
含む混合液と調製し、その混合液に適当量の粗酵
素抽出液をかえて最終容量を0.8mlとし、25℃あ
るいは55℃における還元型NADの単位時間あた
りの増加を340nmの吸光度の増加として測定する
方法で行つた。 また、実施例及び参考例中の％は、容量％を示
す。 実施例 １ (i) バチルス・ステアロサーモフイルスの染色体
DNAの分離。 バチルス・ステアロサーモフイルス
IFO12250株から、バイオケミカ・エト・バイ
オフイジカ・アクタ（Biochem Biophys
acta）72，619−629（1963）に記載の方法に準
じ染色体DNAを分離した。 まず、バチルス・ステアロサーモフイルス
IFO12250株をグリセロール培地（ポリペプト
ン10ｇ／、酵母エキス2.5ｇ／、肉エキス
２ｇ／、グリセロール２ｇ／、塩化ナトリ
ウム５ｇ／、リン酸カリウム２ｇ／、リン
酸２カリウム２ｇ／、硫酸マグネシウム0.1
ｇ／、ビオチン4μｇ／、そしてPH7.2に調
製）２で、55℃で12時間振とう培養した後、
遠心分離にて集菌した。 次に、12mgのリゾチームを６mlサリン
（saline）−EDTA溶液（0.15MNaClと、
0.1MEDTAを含み、PH8.0に調製。）に溶かし、
この溶液に集菌した菌体を加え、よく撹拌し
た。これを37℃で約10分間加温し、菌体が溶菌
し始めたら、直ちに凍結した。 この凍結した菌体に50mlのトリス−SDS緩衝
液10mg／mlSDSと0.1M NaClを含むPH9.0に調
製された0.1Mトリス緩衝液。）を加えて撹拌
し、されに60℃に加温し、完全に溶菌させた。 この溶菌液に56mlの80％フエノールを加え
て、約20分間振とうさせ、フエノール抽出を行
い、夾雑蛋白質を除去した。この抽出された粗
DNA溶液に２倍容量の冷エタノールを加えて
ガラス棒で繊維状の沈澱を巻き取り、70，80，
90％のエタノール各10ml中に準じ、数分ずつ浸
漬した後、20mlの希サリン−サイトレート
（Saline―citrate）溶液（0.015M NaCl、
0.0015M Na3―リン酸に調製。）に溶かし、さ
らに濃Saline―citrate溶液（1.5M NaCl、
0.15M Na3―リン酸に調製。）を２ml加えて、
粗DNA液を調製した。 この粗DNA液を500μｇ／ml位にうすめてリ
ポヌクレアーゼ〔Ｒ Nase（シグマ社製）〕を
50μｇ／ml、Ｒ NaseA（シマダ社製）を30μ
ｇ／mlになるように加え、37℃で30分間加温し
た。冷却後、等量の80％エタノールを加え、フ
エノール抽出を行い、抽出DNAをエタノール
沈澱にて回収し、さらに上記の希Saline−
citrate溶液20mlに溶解させ、さらに上記の濃
Saline−citrate溶液を２ml加えることにより、
染色体DNAの抽出液を調製した。 (ii) ベクタープラスミドpBR322の調製。 プラスミドpBR322（Betheada Research
Laboratories社製）を導入したエシエリチア・
コリC600株を、2lのＬ―培地（ポリペプトン10
ｇ／、酵母エキス５ｇ／、グリコース１
ｇ／、塩化ナトリウム５ｇ／でPH7.2に調
製。）で対数増殖期になるまで37℃で通気培養
した後、10mlのクロラムフエニコール溶液
（3.6mg／mlとなるようにエタノールで調製。）
を添加し、さらに37℃で15時間通気培養してプ
ラスミドpBR322を増殖させた。 次に遠心分離にて集菌した菌を80mlのTE−
シユクロース緩衝液200mg／mlシユクロース、
20mM EDTAを含み、PH8.0に調製された
0.05Mトリス緩衝液。）に懸濁し、さらに８ml
のリゾチーム溶液（５mg／mlとなるように上記
TE―シユクロース緩衝液にて調製。）を添加
し、さらに28mlの5M NaCl溶液と４mlの40
mg／mlSDS溶液を加えた。 この混合液を37℃で２時間反応させた後、遠
心分離にて粗プラスミドDNAを分離した。 次に、1/2容量の80％フエノールを加えてフ
エノール処理を行い、夾雑蛋白質を除去した。
この抽出した粗プラスミドを冷イソプロパノー
ルにて沈澱回収し、さらにTE緩衝液（0.14M
NaCl、1mM EDTAを含む、PH7.5に調製され
た20mMトリス緩衝液。）に溶解した。この混
合液に２mgのＲ Naseを添加し、37℃で２時
間反応させ、上記と同様の方法でフエノール処
理にて夾雑RNAを除去した。 この抽出した粗プラスミドを２倍容量のエタ
ノールを加え、エタノール沈澱にて回収した。
これを、さらに、10mlの上記のTE緩衝液に溶
解させ、アガロースゲルロ過にて夾雑RNAを
さらに除去し、得られた粗DNAをエタノール
にて再び回収した。 この沈澱を23.1mlの0.02Mトリス緩衝液（PH
8.0に調製。）に溶解し、さらに23.7ｇの塩化セ
シウムと0.6mlのエチジウムプロマイド溶液
（10mg／mlに調製。）を加え、約40時間超遠心す
ることにより、プラスミドDNAを分離し、次
にノルマルブタノールにより、エチジウムブロ
マイドを除去した。この分離したプラスミドを
0.01MのTE緩衝液（0.1mM EDTAを含む。PH
7.5に調製ささた0.01Mトリス緩衝液で透析す
ることにより、精製プラスミドpBR322得た。 (iii) プラスミドpICR1の創製。 (i)の方法で得られたバチルス・ステアロサー
モフイルスの染色体DNA5μｇと制限酵素Sal
（宝酒造社製）20ユニツトを、7mM Mg
Cl2、150mM NaCl 0.2mM EDTA 7mM2−
メルカプトエタノール、0.01％BSAを含むPH
7.5に調製した10mAトリス緩衝液100μに入
れ、37℃で2.5時間反応させて、DNAを消化さ
せた後、65℃で５分間加熱し、Salを不活性
化し、冷エタノールにて消化、DNA断片を沈
澱回収した。 次に、(ii)の方法で得られたプラスミド
pBR3221μｇに制限酵素Sal３ユニツトを加
え、上記と同様の緩衝液中で37℃で10時間反応
させ、上記と同様の方法で消化プラスミド
DNAを回収した。こうして得られた消化染色
体及びプラスミドのDNAを混合し、T4DNA
リガーゼ（宝酒造社製）を用い、6.6mA
MgCl2、10mM DTT、66μM ATPを含むPH
7.6に調製した66mMトリス緩衝液中で、13℃
で19時間反応させ、消化DNAと再結合するこ
とにより、プラスミドpICR1を得た。 参考例 １ 実施例１で得たプラスミドpICR1の発現性を調
べるため、次のトランスフオーメーシヨン処理を
行つた。 (iv) トランスフオーメーシヨン まず、宿主菌のエシエリチア・コリC600r−
ｍ−株を50mlの上記のＬ−培地にて培養し、遠
心分離に集菌後、50mlの0.1M MgCl2溶液に懸
濁し、さらに遠心分離を行つて最終的には2.5
mlの0.1M MgCl2溶液に懸濁させた。 このようにして得られたエシエリチア・コリ
C600r−ｍ−株の懸濁液0.2mlに(iii)の方法で得たプ
ラスミドpICR1を含む混合物を0.1ml加え、０℃
で30分間処理したのち、42℃で２分間処理した。
次にこれを３ml前記したＬ−培地を加え、37℃で
１時間培養し、さらにアンピシリン（15μｇ／ml
に調製。）の入つたＬ−寒天培地（Ｌ−培地１
当り、15ｇの寒天を加えたもの。）で37℃で培養
後、生じたコロニーを、さらにテトラサイクリン
（25μｇ／mlに調製。）の入つたＬ−寒天培地で培
養後、生えてこないコロニーを見出すことによ
り、プラスミドpICR1の導入されたエシエリチ
ア・コリC600−pICR1が得られた。 次にこうして得られたエシエリチア・コリ
C600−pICR1のコロニーより、アンピシリン
（15μｇ／mlに調製。）の入つた上記のグリセロー
ル培地100mlで37℃で16時間、振とう培養を行つ
た。これを遠心分離にて集菌、洗浄後、５mlの
0.01％２−メルカプトエタノールを含み、PH7.4
に調製した0.01Mにリン酸緩衝液に懸濁し、０℃
で５分間超音波処理にて菌体を破砕し、遠心分離
にて粗酵素抽出液を得た。 このようにして得た粗酵素抽出液の耐熱性のロ
イシン脱水素酵素の活性を測定したところ、
0.201ユニツト／mg・プロテインであつた。これ
はDNA供与菌であるバチルス・ステアロサーモ
フイルスIFO12250株のロイシン脱水素酵素の活
性（0.010ユニツト／mg・プロテイン）よりも10
培以上の活性があつた。 また、このロイシン脱水素酵素を含む粗酵素抽
出液は、２―メルカプトエタノールを0.01％含む
PH7.2の10mMリン酸緩衝液中、70℃で20分間加
熱処理したところ、80％以上の残存活性を有して
いた。 次にこの菌株から前記(iii)と同様の方法でプラス
ミドpICR1を分離して、水平型アガロースゲル電
気泳動でプラスミドpICR1の性質を調べた。 電気泳動を用いた緩衝液として、2.5mM
EDTA−Na、89mMのほう酸を含みPH8.3に調製
した89mMのトリス緩衝液を用い、ゲルとしてこ
の緩衝液に0.7％のアガロースと0.5mg／mlに調製
したエチジウムブロマイドを加えたものを用い、
これに、プラスミドpICR1とプラスミドpBR322、
さらに分子量マーカーとしてのラムダフアージ
DNAのHind（宝酒造社製）消化断片を各約1μ
ｇDNAを同一アガロースゲル上で同時に巾１cm
当り、7Vの定付加電圧で３〜４時間、泳動させ
た。次に紫外線ランプでバンドを判定し、プラス
ミドpICR1の大きさを調べた結果、分子量が約６
メガダルトンであつた。また、プラスミド
pBR322の分子量は、2.8メガダルトンであつた。 また、このプラスミドpICR1を制限酵素EcoR
，Hind，BamH，Pst，Salで各々の
制限酵素の適正条件で反応させ、プラスミド
pICR1を消化させた。 各制限酵素にて得られた消化試料は、上記と同
様の方法でアガロースゲル電気泳動を行い、各制
限酵素による切断部位数による切断部位数を調べ
た結果、プラスミドpICR1は以下の切断感受性部
位を有することが判明した。 制限酵素 切断部位数EcoR ２ Hind １ Pst ２ Sal ４ BamH ２ さらに、プラスミドpICR1は、Sal切断部位
にて、バチルス・ステアロサーモフイルス
IFO12250株のロイシン脱水素酵素の遺伝子を含
む染色体DNA断片とプラスミドpBR322DNAと
が結合していることが明らかである。
Claims (1)
- １ バチルス・ステアロサーモフイルス
（Bacillus stearothermophilus）の染色体DNA
由来で、かつ制限酵素SalIによる切断で生じうる
耐熱性のロイシン脱水素酵素の遺伝子とベクター
プラスミドとからなるプラスミド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58036307A JPS59162882A (ja) | 1983-03-04 | 1983-03-04 | プラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58036307A JPS59162882A (ja) | 1983-03-04 | 1983-03-04 | プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59162882A JPS59162882A (ja) | 1984-09-13 |
| JPH0249713B2 true JPH0249713B2 (ja) | 1990-10-31 |
Family
ID=12466180
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58036307A Granted JPS59162882A (ja) | 1983-03-04 | 1983-03-04 | プラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59162882A (ja) |
-
1983
- 1983-03-04 JP JP58036307A patent/JPS59162882A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS59162882A (ja) | 1984-09-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2023524066A (ja) | 非カノニカルｔｔｔｔプロトスペーサー隣接モチーフにて増強された切断活性を備えるラクノスピラセｓｐ．のｃａｓ１２ａ変異体 | |
| KR20030052242A (ko) | 로도콕쿠스 클로닝 및 발현 벡터 | |
| US4374200A (en) | Broad host range small plasmid rings as cloning vehicles | |
| EP0537553B1 (en) | Farnesyl pyrophosphate synthetase and DNA sequence encoding the same | |
| JPH0249713B2 (ja) | ||
| JPH0142672B2 (ja) | ||
| US4376164A (en) | Process for preparing broad host range small plasmid rings as cloning vehicles | |
| JPH0258914B2 (ja) | ||
| EP0067071B1 (en) | Plasmid and production thereof | |
| US4418194A (en) | DNA Fragments for forming plasmids | |
| JPH0679556B2 (ja) | プラスミド | |
| JP2615090B2 (ja) | プラスミド及びそれで形質転換されたエシェリチア・コリ | |
| JP2602840B2 (ja) | プラスミド及びそれで形質転換されたエシェリチア・コリ | |
| JP2833793B2 (ja) | ヘパリナーゼをコードするプラスミド、このプラスミドを保持するヘパリナーゼ生産株及びヘパリナーゼの製造法 | |
| JPH0357746B2 (ja) | ||
| JPS61181374A (ja) | 中性プロテア−ゼの産生法 | |
| JP2003144144A (ja) | 菌体または菌体処理物を含有する液体の保存方法 | |
| JPS59159778A (ja) | 耐熱性のロイシン脱水素酵素の製造法 | |
| JPH0532024B2 (ja) | ||
| JP3092817B2 (ja) | 制限酵素の製造方法 | |
| JP2904436B2 (ja) | 新規な組み換え体ｄｎａ及びシュークロース・ホスホリラーゼの製造法 | |
| JP2788070B2 (ja) | ２―ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子 | |
| JP5130480B2 (ja) | キレート剤耐性が向上したクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体 | |
| JPS63207388A (ja) | プラスミド及びそれで形質転換されたエシエリチア・コリ | |
| JP5130479B2 (ja) | クレアチニンアミドヒドロラーゼの比活性を向上させる方法 |