JPH0359382B2 - - Google Patents
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- JPH0359382B2 JPH0359382B2 JP21024182A JP21024182A JPH0359382B2 JP H0359382 B2 JPH0359382 B2 JP H0359382B2 JP 21024182 A JP21024182 A JP 21024182A JP 21024182 A JP21024182 A JP 21024182A JP H0359382 B2 JPH0359382 B2 JP H0359382B2
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- antigen
- hbc
- bacterial
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明は、抗体検出用試薬の水性溶媒に関する
ものである。 抗体検出用試薬としては血球凝集反応法、ラジ
オイムノアツセイ法又は酵素抗体法等が鋭敏な方
法として、臨床検査の分野で利用されている。 例えば血球凝集反応法について説明すれば、精
製した抗原（例えば、HBs抗原）を凝集試験用
担体としてヒツジ赤血球に感作せしめ、抗原感作
ヒツジ赤血球を得、このものと血液検体とを混合
させた時に、水性溶媒中で凝集反応がみられるか
否かによつて、検体中に当該抗原に対応する抗体
が存在しているか否かを判定できる。 また凝集反応がみられた場合は、その検体を更
に段階的に希釈して凝集反応が観察できなくなる
もでの希釈倍数を求めることなよりその検体中の
HBs抗体を定量的に測定することができる。ラ
ジオイムアツセイ法又は酵素抗体法ではポリスチ
レン球、瀘紙等に抗原を固定し、このものと検体
とを混合せしめ、更にラジオアイソトープ又はあ
る種の酵素を標識した抗原と反応せしめた後、ラ
ジオアイソトープ活性又は酵素活性を測定するこ
とにより検体中に当該抗原に対応する抗体が存在
していたか否かを知ることができる。 上記の反応試薬に用いられる抗原は従来、動物
血液又は組織から抽出精製されていた。例えば、
HBs抗原やHBc抗原はHBs抗原陽性者の血清か
ら、硫安分画法や超遠心分離法で精製され、
HBc抗原はＢ型肝炎患者の肝組織から抽出され
ているが、近年遺伝子組換え技術の発展にともな
い、これらの抗原を大腸菌や酵母などの菌に産生
せしめることが可能となつた。 ところが、本発明者らはかかる方法にて得られ
た抗原を用いた抗体検出用試薬にてヒト血清中の
抗体を試験した場合、精製抗原のロツトによつて
は、非特異反応を示すものがあることを見出し
た。従つて、遺伝子組み換え技術に基づいて細菌
より産生された抗原を使用する場合にも、前記非
特異反応による疑陽性を示さない抗体検出用試薬
を提供することが本発明によつて解決せんとする
新規な技術的課題である。 本発明者らは、かかる課題を解決するために更
に研究を重ねてきたところ、ヒト又は動物血清中
に、前記細菌に対する抗体が存在する場合のある
こと、この細菌に対する抗体が精製抗原中に微量
残存している細菌成分と反応して非特異反応が生
起することを見出した。また、この非特異反応
は、上記の抗原を産生することができない細菌
（即ち、遺伝子組み換え操作が行われていない宿
主細菌）によつて中和されることを見出した。 本発明はかかる新知見に基づいて完成されたも
のであり、口径0.8ミクロンのフイルターを通過
しうる細菌成分水抽出物（当該細菌は遺伝子組み
換え技術における宿主となりうる細菌である。）
を含むことを特徴とする免疫反応に基づく抗体検
出用試薬の水性溶媒である。 本発明において使用される遺伝子組み換え技術
における宿主となりうる細菌としては、大腸菌、
枯草病、酵母などが例示され、遺伝子組み換え操
作を行われていないもの（従つて、抗原産性能を
有していないもの）が使用され、それは遺伝子組
み換え操作が施されて、試薬用の抗原の産生に利
用した細菌と同種細菌を使用することが好まし
い。 当該細菌は最大口径0.8ミクロンのフイルター
を通過しうる大きさの水抽出物として本発明に供
される。かかる大きさとした場合、細菌成分水抽
出物と検体血清中の当該細菌に対する抗体との凝
集反応物が微細であり、目的とする検査に何ら支
障をきたさない。かかる大きさの細菌成分水抽出
物は、たとえば細菌を水（たとえば、生理食塩水
など）に加え、これを超音波処理（たとえば、５
〜15KC、15分〜60分間の処理）に付すことによ
つて得られ、かくして得られたものを遠心分離
（たとえば、5000〜15000r.p.m.15分〜60分）に付
した上澄をさらに最大口径0.8ミクロンのフイル
ターを通過させることなどによつて分離される。 当該細菌成分水抽出物は0.001〜0.3％（ｗ／
ｖ）、好ましくは0.01〜0.1％（ｗ／ｖ）の割合で
水性溶媒中に含有される。水性溶媒としてはこの
分野にて公知のものが使用され、PH６〜８の低塩
濃度緩衝液であり、例えば水、生理食塩水、各種
緩衝液（リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン
緩衝液）、アルブミン溶液、デキストラン溶液、
正常ヒト及び動物血清溶液、合成高分子物質の溶
液、界面活性剤含有水溶液、およびこれらの組み
合せからなる溶液が例示される。当該水性溶媒の
PHは、約6.0〜8.5が好ましく、かかるPHへの調整
は緩衝液で行われることが好ましい。水性溶媒の
塩濃度は、比較的低濃度であることが好ましく、
より好ましくは、生理的等張な溶液である。 本発明の水性溶媒は、免疫反応に基づく抗体検
出用試薬（たとえば、凝集反応法、ラジオイムノ
アツセイ法、酵素抗体法などに基づく試薬）用の
溶媒として使用される。 本発明水性溶媒を用いることによつて、遺伝子
組み換え技術によつて産生された抗原を使用する
免疫反応に基づく抗体検出試験薬においても、非
特異反応により疑陽性がおこらないという特有の
効果が得られる。 以下本発明を実験例に基づきより詳細に説明す
る。 HBc抗原を産生する大腸菌より硫安分画法、
ゲル濾過法はイオン交換体吸着法等の一般的な方
法で精製HBc抗原を得た。 別途HBc抗原を産生しない大腸菌を培養し得
られた菌体に生理食塩溶液の５倍量を加え、冷温
下（２℃〜15℃）で10Kcの音波で30分間超音波
処理し、更にトミー精工社製遠心分離機（ロータ
ーNo.９）を用い、10000r.p.m.で30分間遠心を行
い、細菌成分水抽出物を得た。この抽出液を0.8μ
のメンブレンを用い清澄化した。生理食塩溶液
（PH7.0）に細菌成分抽出液中の蛋白が0.01％
（ｗ／ｖ）濃度になるように混合し、更にウシア
ルブミンを0.5％（ｗ／ｖ）、アジ化ナトリウムを
0.1％（ｗ／ｖ）濃度に加えHBc抗体検出用水性
溶媒を得た。 このようにして得た精製HBc抗原および細菌
成分水抽出物をグルタルアルデヒドで固定したヒ
ツジ赤血球に感作し、HBc抗原感作ヒツジ赤血
球および菌体成分感作ヒツジ赤血球を得た。この
両感作ヒツジ赤血球をそれぞれ0.5％濃度になる
ように、リン酸緩衝液（0.15M、PH7.2、0.5％ウ
シアルブミンおよびヒツジ赤血球ストローマ添
加、以下PBSと略す。）に浮遊せしめた同じリン
酸緩衝液に細菌成分水抽出物を0.1％（ｗ／ｖ）
濃度に加えた。（以下細菌水抽出物加PBSと略
す。）ヒト血清検体11検体につき前記の感作血球
に対する反応性をマイクロタイトレーシヨン法で
調べた。同時に別の方法でHBC抗体を検査した
処、11検体の内６検体はHBc抗体陽性であつた。
ものである。 抗体検出用試薬としては血球凝集反応法、ラジ
オイムノアツセイ法又は酵素抗体法等が鋭敏な方
法として、臨床検査の分野で利用されている。 例えば血球凝集反応法について説明すれば、精
製した抗原（例えば、HBs抗原）を凝集試験用
担体としてヒツジ赤血球に感作せしめ、抗原感作
ヒツジ赤血球を得、このものと血液検体とを混合
させた時に、水性溶媒中で凝集反応がみられるか
否かによつて、検体中に当該抗原に対応する抗体
が存在しているか否かを判定できる。 また凝集反応がみられた場合は、その検体を更
に段階的に希釈して凝集反応が観察できなくなる
もでの希釈倍数を求めることなよりその検体中の
HBs抗体を定量的に測定することができる。ラ
ジオイムアツセイ法又は酵素抗体法ではポリスチ
レン球、瀘紙等に抗原を固定し、このものと検体
とを混合せしめ、更にラジオアイソトープ又はあ
る種の酵素を標識した抗原と反応せしめた後、ラ
ジオアイソトープ活性又は酵素活性を測定するこ
とにより検体中に当該抗原に対応する抗体が存在
していたか否かを知ることができる。 上記の反応試薬に用いられる抗原は従来、動物
血液又は組織から抽出精製されていた。例えば、
HBs抗原やHBc抗原はHBs抗原陽性者の血清か
ら、硫安分画法や超遠心分離法で精製され、
HBc抗原はＢ型肝炎患者の肝組織から抽出され
ているが、近年遺伝子組換え技術の発展にともな
い、これらの抗原を大腸菌や酵母などの菌に産生
せしめることが可能となつた。 ところが、本発明者らはかかる方法にて得られ
た抗原を用いた抗体検出用試薬にてヒト血清中の
抗体を試験した場合、精製抗原のロツトによつて
は、非特異反応を示すものがあることを見出し
た。従つて、遺伝子組み換え技術に基づいて細菌
より産生された抗原を使用する場合にも、前記非
特異反応による疑陽性を示さない抗体検出用試薬
を提供することが本発明によつて解決せんとする
新規な技術的課題である。 本発明者らは、かかる課題を解決するために更
に研究を重ねてきたところ、ヒト又は動物血清中
に、前記細菌に対する抗体が存在する場合のある
こと、この細菌に対する抗体が精製抗原中に微量
残存している細菌成分と反応して非特異反応が生
起することを見出した。また、この非特異反応
は、上記の抗原を産生することができない細菌
（即ち、遺伝子組み換え操作が行われていない宿
主細菌）によつて中和されることを見出した。 本発明はかかる新知見に基づいて完成されたも
のであり、口径0.8ミクロンのフイルターを通過
しうる細菌成分水抽出物（当該細菌は遺伝子組み
換え技術における宿主となりうる細菌である。）
を含むことを特徴とする免疫反応に基づく抗体検
出用試薬の水性溶媒である。 本発明において使用される遺伝子組み換え技術
における宿主となりうる細菌としては、大腸菌、
枯草病、酵母などが例示され、遺伝子組み換え操
作を行われていないもの（従つて、抗原産性能を
有していないもの）が使用され、それは遺伝子組
み換え操作が施されて、試薬用の抗原の産生に利
用した細菌と同種細菌を使用することが好まし
い。 当該細菌は最大口径0.8ミクロンのフイルター
を通過しうる大きさの水抽出物として本発明に供
される。かかる大きさとした場合、細菌成分水抽
出物と検体血清中の当該細菌に対する抗体との凝
集反応物が微細であり、目的とする検査に何ら支
障をきたさない。かかる大きさの細菌成分水抽出
物は、たとえば細菌を水（たとえば、生理食塩水
など）に加え、これを超音波処理（たとえば、５
〜15KC、15分〜60分間の処理）に付すことによ
つて得られ、かくして得られたものを遠心分離
（たとえば、5000〜15000r.p.m.15分〜60分）に付
した上澄をさらに最大口径0.8ミクロンのフイル
ターを通過させることなどによつて分離される。 当該細菌成分水抽出物は0.001〜0.3％（ｗ／
ｖ）、好ましくは0.01〜0.1％（ｗ／ｖ）の割合で
水性溶媒中に含有される。水性溶媒としてはこの
分野にて公知のものが使用され、PH６〜８の低塩
濃度緩衝液であり、例えば水、生理食塩水、各種
緩衝液（リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン
緩衝液）、アルブミン溶液、デキストラン溶液、
正常ヒト及び動物血清溶液、合成高分子物質の溶
液、界面活性剤含有水溶液、およびこれらの組み
合せからなる溶液が例示される。当該水性溶媒の
PHは、約6.0〜8.5が好ましく、かかるPHへの調整
は緩衝液で行われることが好ましい。水性溶媒の
塩濃度は、比較的低濃度であることが好ましく、
より好ましくは、生理的等張な溶液である。 本発明の水性溶媒は、免疫反応に基づく抗体検
出用試薬（たとえば、凝集反応法、ラジオイムノ
アツセイ法、酵素抗体法などに基づく試薬）用の
溶媒として使用される。 本発明水性溶媒を用いることによつて、遺伝子
組み換え技術によつて産生された抗原を使用する
免疫反応に基づく抗体検出試験薬においても、非
特異反応により疑陽性がおこらないという特有の
効果が得られる。 以下本発明を実験例に基づきより詳細に説明す
る。 HBc抗原を産生する大腸菌より硫安分画法、
ゲル濾過法はイオン交換体吸着法等の一般的な方
法で精製HBc抗原を得た。 別途HBc抗原を産生しない大腸菌を培養し得
られた菌体に生理食塩溶液の５倍量を加え、冷温
下（２℃〜15℃）で10Kcの音波で30分間超音波
処理し、更にトミー精工社製遠心分離機（ロータ
ーNo.９）を用い、10000r.p.m.で30分間遠心を行
い、細菌成分水抽出物を得た。この抽出液を0.8μ
のメンブレンを用い清澄化した。生理食塩溶液
（PH7.0）に細菌成分抽出液中の蛋白が0.01％
（ｗ／ｖ）濃度になるように混合し、更にウシア
ルブミンを0.5％（ｗ／ｖ）、アジ化ナトリウムを
0.1％（ｗ／ｖ）濃度に加えHBc抗体検出用水性
溶媒を得た。 このようにして得た精製HBc抗原および細菌
成分水抽出物をグルタルアルデヒドで固定したヒ
ツジ赤血球に感作し、HBc抗原感作ヒツジ赤血
球および菌体成分感作ヒツジ赤血球を得た。この
両感作ヒツジ赤血球をそれぞれ0.5％濃度になる
ように、リン酸緩衝液（0.15M、PH7.2、0.5％ウ
シアルブミンおよびヒツジ赤血球ストローマ添
加、以下PBSと略す。）に浮遊せしめた同じリン
酸緩衝液に細菌成分水抽出物を0.1％（ｗ／ｖ）
濃度に加えた。（以下細菌水抽出物加PBSと略
す。）ヒト血清検体11検体につき前記の感作血球
に対する反応性をマイクロタイトレーシヨン法で
調べた。同時に別の方法でHBC抗体を検査した
処、11検体の内６検体はHBc抗体陽性であつた。
【表】
【表】
表１に示した如く検体No.１〜６はHBc抗体陽
性、No.７〜11は陰性であつた。No.１、３、４、
５、７、８および９は菌体成分感作血球と強い反
応を示したが、この反応はHBc抗原を含まない
細菌水抽出物加PBSで測定した場合、その凝集
価はPBS測定した価の1/16又はそれ以下に抑制
された。 HBc抗体陰性のNo.７〜11の検体の内７、８お
よび９はHBc抗原感作血球とも反応した。しか
し、この反応は細菌水抽出物加PBSで測定する
ことにより、１：８〜１：４にまで抑制された。 HBc抗体陽性のNo.１〜６の検体はHBc抗原感
作血球と強い反応を示し、この反応はPBS又は
細菌水抽出物加PBSの両溶媒で測定して誤差範
囲で一致した。 以上の如くヒト血清中には大腸菌菌体成分に対
する抗体が存在する場合があること、この抗体
は、大腸菌より抽出精製したHBc抗原を感作し
た血球と反応すること、この反応は大腸菌菌体成
分抽出液を加えた溶媒を用いることにより抑制さ
れること、更にこの菌体成分抽出液は目的とする
HBc抗体の測定には影響しないことが明らかと
なつた。 従つて、この細菌成分水抽出物を加てた溶媒を
用いることにより、より特異的にHBc抗体が検
査できることが判つた。 また、この溶媒はHBc抗体を試験する際にも、
非特異抗体の反応を抑制するのに有効であつた。 実施例 １ HBc抗原を産生しない大腸菌を培養し得られ
た菌体に生理食塩溶液の５倍量を加え、冷温下
（２℃〜15℃）で10kcの音波で30分間超音波処理
し、更にトミー精工社製遠心分離機（ローターNo.
９）を用い、10000r.p.m.で30分間遠心を行い、
細菌成分水抽出物を得た。この抽出液を0.8μのメ
ンブレンを用い清澄化した。生理食塩溶液（PH
7.0）に菌体成分抽出液の蛋白が0.01％（ｗ／ｖ）
濃度になるように混合し、更にウシアルブミンを
0.5％（ｗ／ｖ）、アジ化ナトリウムを0.1％
（ｗ／ｖ）濃度に加えHBc抗体検出用水性溶媒を
得た。 実施例 ２ 実施例１で得られた菌体成分抽出液をリン酸緩
衝液（0.15M、PH7.2）に0.3％濃度になるように
加え、ヒツジ赤血球ストローマを0.1％（ｗ／
ｖ）、ポリエチレングリコール4000を0.2％（ｗ／
ｖ）およびウジアルブミンを0.2％（ｗ／ｖ）濃
度になるように追加した。
性、No.７〜11は陰性であつた。No.１、３、４、
５、７、８および９は菌体成分感作血球と強い反
応を示したが、この反応はHBc抗原を含まない
細菌水抽出物加PBSで測定した場合、その凝集
価はPBS測定した価の1/16又はそれ以下に抑制
された。 HBc抗体陰性のNo.７〜11の検体の内７、８お
よび９はHBc抗原感作血球とも反応した。しか
し、この反応は細菌水抽出物加PBSで測定する
ことにより、１：８〜１：４にまで抑制された。 HBc抗体陽性のNo.１〜６の検体はHBc抗原感
作血球と強い反応を示し、この反応はPBS又は
細菌水抽出物加PBSの両溶媒で測定して誤差範
囲で一致した。 以上の如くヒト血清中には大腸菌菌体成分に対
する抗体が存在する場合があること、この抗体
は、大腸菌より抽出精製したHBc抗原を感作し
た血球と反応すること、この反応は大腸菌菌体成
分抽出液を加えた溶媒を用いることにより抑制さ
れること、更にこの菌体成分抽出液は目的とする
HBc抗体の測定には影響しないことが明らかと
なつた。 従つて、この細菌成分水抽出物を加てた溶媒を
用いることにより、より特異的にHBc抗体が検
査できることが判つた。 また、この溶媒はHBc抗体を試験する際にも、
非特異抗体の反応を抑制するのに有効であつた。 実施例 １ HBc抗原を産生しない大腸菌を培養し得られ
た菌体に生理食塩溶液の５倍量を加え、冷温下
（２℃〜15℃）で10kcの音波で30分間超音波処理
し、更にトミー精工社製遠心分離機（ローターNo.
９）を用い、10000r.p.m.で30分間遠心を行い、
細菌成分水抽出物を得た。この抽出液を0.8μのメ
ンブレンを用い清澄化した。生理食塩溶液（PH
7.0）に菌体成分抽出液の蛋白が0.01％（ｗ／ｖ）
濃度になるように混合し、更にウシアルブミンを
0.5％（ｗ／ｖ）、アジ化ナトリウムを0.1％
（ｗ／ｖ）濃度に加えHBc抗体検出用水性溶媒を
得た。 実施例 ２ 実施例１で得られた菌体成分抽出液をリン酸緩
衝液（0.15M、PH7.2）に0.3％濃度になるように
加え、ヒツジ赤血球ストローマを0.1％（ｗ／
ｖ）、ポリエチレングリコール4000を0.2％（ｗ／
ｖ）およびウジアルブミンを0.2％（ｗ／ｖ）濃
度になるように追加した。
Claims (1)
- １ 遺伝子組み換え技術によつて産生された抗原
に反応する抗体の検出において、遺伝子組み換え
技術における宿主となり得、かつ上記抗原の産生
に利用した細菌と同種細菌の口径0.8ミクロンの
フイルターを通過しうる細菌成分水抽出物を含む
ことを特徴とする免疫反応に基づく抗体検出用試
薬の水性溶媒。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21024182A JPS5999257A (ja) | 1982-11-29 | 1982-11-29 | 抗体検出用試薬の水性溶媒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21024182A JPS5999257A (ja) | 1982-11-29 | 1982-11-29 | 抗体検出用試薬の水性溶媒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5999257A JPS5999257A (ja) | 1984-06-07 |
| JPH0359382B2 true JPH0359382B2 (ja) | 1991-09-10 |
Family
ID=16586116
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21024182A Granted JPS5999257A (ja) | 1982-11-29 | 1982-11-29 | 抗体検出用試薬の水性溶媒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5999257A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010101157A1 (ja) | 2009-03-02 | 2010-09-10 | 日本たばこ産業株式会社 | 生物学的試料中の物質を検出する方法 |
| RU2011143787A (ru) | 2009-03-31 | 2013-05-10 | Джапан Тобакко Инк. | Способ детектирования вещества в биологическом образце |
| CN102449483A (zh) | 2009-03-31 | 2012-05-09 | 日本烟草产业株式会社 | 对生物学样品中的sith-1抗体进行检测的方法 |
-
1982
- 1982-11-29 JP JP21024182A patent/JPS5999257A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5999257A (ja) | 1984-06-07 |
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