JPH0361654B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、人IgGのＨ鎖（以下単にＨ鎖と記す
ことがある。）を主成分とする消化器潰瘍治療予
防剤に係る。 従来、IgGのＨ鎖の薬理作用及び医薬用途は知
られていなかつた。従つて、これを医薬として用
いることはなかつた。今回、本発明者らは、Ｈ鎖
が抗消化器潰瘍作用を有することを見当して本発
明を完成したものである。 IgGのＨ鎖は、公知のIgGの構成断片としてす
でに報告されており、例えば、フライシマンら
（Fleischman etal）の報告〔Arch.Biochem.
Biophys.，Supple.(1)，174，（1962）〕がある。本
発明において有効成分として特定されるＨ鎖は人
由来のIgGからIgGのジスルフイド結合を切断し
て得られる分子量50000±1500のポリペプチド鎖
であり、その回収法は、前記フライシマンらによ
つて確立されている。 なお、ジスルフイド結合の切断箇所は、分子間
結合だけでなく、分子内結合であつてもよい。 本発明に係るＨ鎖の代表的回収法の概要は次の
とおりである。 IgGを0.55Mのトリス−HCl緩衝液、PH8.2に約
２〜３％の濃度に溶かす。静かに窒素ガスを通じ
てから２−メルカプトエタノールを終濃度0.75〜
5.25Mになるように加え、室温に１時間放置して
還元を行なう。ついで、氷水浴で冷却し、これに
２−メルカプトエタノールと同量の0.75〜5.25M
モノヨードアセトアミドを加え、溶液のPHをトリ
メチルアミンなどの添加により8.0に保ちつつ１
時間程度反応させたのち冷食塩水に透析して余剰
の試薬を除く。この反応でＨ鎖中の遊離のSH基
が−CH₂CONH₂でブロツクされる。次に冷却し
た1Mプロピオン酸に透析してＨ鎖とＬ鎖を解離
させ、1Mプロピオン酸で平衡化したセフアデツ
クス（Sephadex）Ｇ−75のカラムを通過させる
とＨ鎖とＬ鎖が分離した二つのピークとして溶出
される。Ｈ鎖画分を回収後、透析、除菌過、加
熱処理、凍結乾燥等の医薬品として提供されうる
所望の公知の処理を施す。 なお、分子間及び分子内ジスルフイド結合を切
断するための試薬としては、２−メルカプトエタ
ノール（終濃度0.75〜5.25M）以外に、たとえば
ジチオスレイトール又は、ジチオエリスリトール
（終濃度0.01〜0.068M）等が用いられる。 本発明に用いられるＨ鎖は、勿論上記の回収法
により得られたものではなく、応用可能な他の方
法に従つて製造されたＨ鎖であつてもよい。 本発明で用いられるＨ鎖中のSH基は、ブロツ
クされていることが好ましく〔Biochemistry，
７(5)，1950〜1958（1968）、Method in
Enzymology xxv，185〕、このブロツクは容易
に分解されることのない基、たとえばＳ−Ｃ結合
が形成されるような基であることが好ましい。か
かる基としては、前記した基の外に、さらに、た
とえば次の様なものが例示される。 低級アルキル基：メチル、エチル、ｎ−プロ
ピルなど Ｎ，Ｎ−ジ低級アルキルカルバミド−低級ア
ルキル基：Ｎ，Ｎ−ジエチル−カルバミドメチ
ル 低級アルコキシカルボニル−低級アルキル
基：エトキシカルボニルメチル、エトキシカル
ボニルエチルなど カルボキシ−低級アルキル基：カルボキシメ
チル、カルボキシエチルなど シアノ−低級アルキル基：シアノメチルなど β−アミノ−低級アルキル基：−
CH₂CH₂NH₂など ベンゾイル−低級アルキル基：−
CH₂COC₆H₅など カルバモイル−低級アルキル基：−
CH₂CONH₂など これらブロツクされたものは、自体既知の手
段、又はこれに準ずる手段にて製造することがで
きる。 本発明の消化器潰瘍予防治療剤の有効成分はＨ
鎖であるが、IgGとしてＨ鎖を60〜100％モル比
率の割合で含有しておけばよく、残余の40％モル
比率としてＬ鎖を含有していてもよい。 次にＨ鎖の薬理作用と効果、臨床試験、急性毒
性試験、投与量及び投与方法等を確認するために
行つた実験の方法ならびにその結果を示す。 （） 薬理作用と効果 実動物物に(1)幽門結紮潰瘍及び、(2)フエニルブ
タゾン潰瘍をそれぞれおこし、Ｈ鎖の抗潰瘍作用
を調べた。 (1) シヤイ（Shay）らの方法
〔Gastroenterology，５，43，（1945）〕に準じ
て幽門結紮潰瘍を作成した。すなわち、ウイス
ター系雄性ラツト（体重200〜250ｇ）を24時間
絶食後、エーテル麻酔下に幽門部を結紮した。
絶食絶水下に16時間放置後、エーテルル麻酔下
に胃を摘出し、前胃部に発生した潰瘍をナルミ
（Narumi）らの方法〔J.Takeda Res.Lab.，
29，85，（1970）〕に従い、次のような潰瘍指数
により評価した。 ０：正常 １：エロジオンまたは出血斑 ２：10個以下の小潰瘍（直径１mm以下） ３：10個以上の小潰瘍または10個以下の中潰瘍
（直径２〜４mm） ４：10個以上の中潰瘍または大潰瘍（直径４mm以
上） ５：穿孔 なお検体としては参考例１で得たものを用い、
これを滅菌生理食塩水に溶解し、結紮直後および
８時間目に表１に示す量を２回、腹腔内投与し
た。 (2) 鈴木らの方法〔Japan J.Pharmaco.，26，
471（1976）〕によつてフエニルブタゾン潰瘍を
作成した。 ウイスター系雄性ラツト（体重150〜200ｇ）
を24時間絶食後、表２に示す量の参考例１で得
たＨ鎖を腹腔内投与し、その30分後にフエニル
ブタゾン（５％アラビアゴム懸濁）200mg／Kg
を経口投与した。絶食絶水に５時間放置後、エ
ーテル麻酔下に胃を摘出し、ホルマリン固定し
た。腺胃部に生じた潰瘍は、次のようなスコア
（score）を決めて合計した値を潰瘍指数として
表わした。 score1：潰瘍の長径１mm score2：１〜２mm score3：２〜３mm score4：３〜４mm score5：４〜５mm score10：＞５mm score25：穿孔しているもの (1)及び(2)の結果をそれぞれ表１及び表２に示
す。表１によれば、Ｈ鎖の幽門結紮潰瘍に対する
作用は、それぞれ50mg／Kg及び10mg／Kg各２回投
与では、対照の生理食塩水投与に比し潰瘍発生率
は乱90％に抑制される。さらに用量を下げた５
mg／Kg２回で71％抑制し、１mg／Kg２回投与でも
50％近い抑制活性が認められる。 【表】 表２によれば、Ｈ鎖のフエニルブタゾン潰瘍に
対する予防作用は、Ｈ鎖５mg／Kgの用量で83％の
有意な抑制活性が認められた。 【表】 （） 薬理作用 Ｈ鎖の抗潰瘍作用機構に関する検討をおこなつ
た。 (1) Ｈ鎖の胃液分泌抑制作用を検討した。投与
は、参考例１で得たものを生理食塩水に溶解し
て静脈内投与することによつて行つた。 胃液分泌抑制活性は、シヤイ（Shay）らの
方法〔Gastroenterology26，906.（1954）〕に準
じて測定した。すなわち、48時間絶食したウイ
スター系雄性ラツト（体重150〜200ｇ）の幽門
部を結紮後４時間の貯留胃液について、その液
量、総酸度、総ペプシン活性を測定した。総酸
度は、フエノールフタレインを指示薬として、
１／50N、NaOHで滴定して求め、また、総ペ
プシン活性は、カゼインを基質としてアンソン
（Anson）法〔Brit.J.Pharmacol.，13，54，
（1958）〕に準じて求める。検体（参考例１で得
たＨ鎖）は滅菌生理食塩水に溶解し、結紮直後
に腹腔内投与あるいは股静脈内投与した。 結果は、表３に示される。対照群の胃液量に
対し、Ｈ鎖５mg／Kgを腹腔内投与した場合、83
％抑制し、さらに１mg／Kgでも有意に抑制し
た。この傾向は、総酸度及び総ペプシン活性と
も同様に抑制が認められた。静脈内投与した場
合も、５mg／Kg、１mg／Kg投与ともそれぞれ用
量に応じた強い胃液分泌抑制活性を認めた。 【表】 【表】 （） 毒性 本発明からなるＨ鎖を含有する製剤は、人IgG
を原料とするものであるから、その毒性の点にお
いても人IgGと同様の安全性が保障される。ちな
みにIgGと参考例１で得たＨ鎖につきLD₅₀値を求
めた結果は表４のとおりであつた。 【表】 （） 投与量及び投与方法 Ｈ鎖は、前記試験の結果から成人１日当り１〜
100mg／Kgを投与することが好ましい。 本薬剤は注射剤および経口剤のいずれの形態で
でも投与可能である。注射剤として使用する時
は、例えば用時に於いて注射用蒸留水等に溶解し
て使用される。投与の方法は、静脈内及び筋肉内
投与である。経口剤として使用する時はカプセル
剤、錠剤、散剤、リポソーム製剤あるいは経口用
液体製剤等として投与される。これらは、例えば
日本薬局方に記載された当業者に周知方法に従つ
て製造される。 本発明のＨ鎖を主成分とする消化器潰瘍治療予
防剤は、毒性がきわめて低く又その薬理効果は著
効を示すもので、潰瘍の治療予防用医薬品として
極めて有用である。 次に本発明の参考例及び実施例を説明する。 参考例 １ IgGを0.05Mのトリス−HCl緩衝液（PH8.2）に
約２％の濃度に溶かし、２−メルカプトエタノー
ルを終濃度0.75〜5.25Mにまで添加し、ジスルフ
イド結合を切断した。次いで0.75〜5.25Mヨード
酢酸を加え、PHを8.0に保ち１時間反応させた後、
セフアデツクスＧ−25カラムで余剰の試薬を除去
した。次に、SDS（sodium dodecyl sulfate）存
在下セフアデツクス（Sephadex）G200カラム
（4.0×120cm）〔溶媒：0.04M SDS−0.05Mリン酸
緩衝液（PH8.0）〕にかけて、O.D.280mmで測定し
Ｈ鎖画分を回収した。Ｈ鎖画分からSDSを除去
し、生理食塩水に対して透析し、さらに除菌過
をおこなつた後、凍結乾燥品とした。 参考例 ２ IgGを2mMEDTAを含む0.5Mトリス−HCl緩
衝液（PH8.2）に約２％の濃度に溶かす。窒素ガ
スを約20分間通じてから、ジチオスレイトールを
終濃度0.01〜0.068Mまで添加し、室温で２時間
反応させた。次いでヨードアセトアミドを終濃度
0.04〜0.272Mまで加え、氷冷下、１時間反応さ
せた後、0.1M酢酸、緩衝液（PH5.5）、および蒸
留水の順で４℃で透析を行つた。なお、これまで
の操作はすべて遮光下で行つた。次に、液にプロ
ピオン酸を終濃度で1Mとなる様に加え、直ちに
1Mプロピオン酸で平衡化したセフアデツクスＧ
−100カラムでゲル過を行つた。O.D.280nmで
測定し、Ｈ鎖画分を回収し、限外過で濃縮した
後、蒸留水に対して透析し、更に除菌過を行つ
た後、凍結乾燥を行つた。以上の操作を行つたと
きの収率は表５の通りであつた。 【表】 実施例１ （経口用製剤） (1) 人IgG由来カルバモイルメチル化Ｈ鎖 5.0mg (2) 直打用微粒No.209（富士化学製） 46.6mg 〓メタケイ酸アルミン酸マグネシウム 20％ トウモロコシデンプン 30％ 乳 糖 50％ (3) 結晶セルロース 24.0mg (4) カルボキシメチルセルロース・カルシウム
4.0mg (5) ステアリン酸マグネシウム 0.4mg (1)，(3)および(4)はいずれも予め100メツシユの
ふるいに通す。この(1)，(3)，(4)と(2)をそれぞれ乾
燥して一定含水率にまで下げた後、上記の重量割
合で混合機を用いて混合する。全質均等にした混
合末に(5)を添加して短時間（30秒間）混合し、混
合末を打錠（杵：6.3mmφ、6.0mmＲ）して、１錠
80mgの錠剤とした。 この錠剤は必要に応じて通常用いられる胃溶性
フイルムコーテイング剤（例、ポリビニルアセタ
ールジエチルアミノアセテート）や食用性着色剤
でコーテイングしてもよい。 実施例２ （静脈内注射剤） (1) 人IgG由来カルボキシメチル化Ｈ鎖 30mg 人IgG由来カルボキシメチル化Ｌ鎖 20mg (2) ブドウ糖 100mg (3) 生理食塩水 10ml (3)に(1)と(2)を上記の重合割合で加えて撹拌し、
完全に溶解させる。この溶解液を孔径0.45μのメ
ンブランフイルターを用いて滅過した後、再び孔
径0.20μのメンブランフイルターを用いて除菌
過を行なう。過液を10mlずつ無菌的にバイアル
に分注し、窒素ガスを充填した後密封して静脈内
注射剤とする。 実施例３（カプセル剤） (1) 人IgG由来カルボキシメチルＨ鎖 50ｇ (2) 乳 糖 935ｇ (3) ステアリン酸マグネシウム 15ｇ 上記成分をそれぞれ秤量して合計1000ｇを均一
に混合し、混合粉体をハードゼラチンカプセルに
200mgずつ充填する。 実施例４（リボゾーム製剤） 人IgG由来カルバモイルメチル化Ｈ鎖を、
0.125MNaClを含む0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2）
に約0.5％の濃度に溶かす。他方、０，５，10，
20％（ｗ／ｗ）のフオスフアチジン酸を含む卵黄
リン脂質100mgを10mlのクロロホルムにそれぞれ
溶解、回転エバポレーターを用いて、リン脂質の
フイルムを形成させた。これに上記のＨ鎖溶液１
mlを加え、振盪することによつて閉鎖脂肪小体を
形成し、Ｈ鎖を取り込ませてリポゾーム製剤を得
た。この脂肪小体を遠心分離（10000rpm，30分）
によつて分別し、その中に取り込まれたタンパク
質を測定した。その結果を表６に示す。 【表】 【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 人IgGのＨ鎖を有効成分とする消化器潰瘍治
   療予防剤。 ２ Ｈ鎖がアルキル化Ｈ鎖である特許請求の範囲
   第１項記載の消化器潰瘍治療予防剤。 ３ 形態が経口投与用の散剤、錠剤、カプセル剤
   又はリポソーム製剤である特許請求の範囲第１項
   記載の消化器潰瘍治療予防剤。 ４ 形態が、静脈内、筋肉内又は経口投与用の液
   状である特許請求の範囲第１項記載の消化器潰瘍
   治療予防剤。