JPH0360806B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、人IgGのＬ鎖（以下単にＬ鎖と記
す）を有効成分とする炎症治療予防剤に係る。 Ｌ鎖は、公知のIgGの構成断片としてすでに報
告されており、例えばFleischmanらの報告
〔Arch.Biochem.Biophys.，Supple.(1)，174，
（1962）〕がある。 ところで、本発明者らは当該Ｌ鎖が抗炎症作用
を有することを見出して本発明を完成した。 本発明における有効成分であるＬ鎖は人由来の
IgGから、IgGのジスルフイド結合を切断して得
られる分子量23000±1000のポリペプチド鎖であ
り、その回収法は、たとえば前記Fleischmanら
の報告等によつて確立されている。 既ち、Ｌ鎖の代表的回収法の概要は次のとおり
である。 IgGを0.55Mのトリス−塩酸緩衝液、PH8.2に約
２％の濃度に溶かす。静かに窒素ガスを通じてか
ら２ーメルカプトエタノールを終濃度0.75Mにな
るように加え、室温に１時間放置して還元を行
う。ついで、氷水浴で冷却し、これに２−メルカ
プトエタノールと同量の0.75Mモノヨードアセト
アミドを加え、溶液のPHをトリメチルアミン添加
により8.0に保ちつつ１時間反応させたのち、冷
食塩水に透析して余剰の試薬を除く。この反応で
遊離のSH基がアルキル化によりブロツクされる。
次に冷却したIMプロピオン酸に透析してＨ鎖と
Ｌ鎖を解離させ、IMプロピオン酸で平衡化した
SephadexG−75のカラムを通過させるとＨ鎖と
Ｌ鎖が分離した二つのピークとして溶接されるの
でこれを回収する。勿論Ｌ鎖の回収は上記の方法
に限定されるものではない。 Ｌ鎖画分を回収後、医薬としての使用に供すべ
く透析、除菌ろ過、加熱処理、凍結乾燥等の所望
の処理を施す。 また、Ｌ鎖にはそのSH基の安定性を向上させ
るためにSH基をモデイフイケーシヨン（アルキ
ル化、スルホ化など）した誘導体も包含される。 次にＬ鎖の抗炎症作用、臨床試験、急性毒性試
験、投与量及び投与方法を確認するために行つた
実験の方法ならびにその結果を示す。 （） 抗炎症作用 カラゲニン浮腫、カラゲニン肉芽腫をおこし、
Ｌ鎖の抗炎症作用とその強さを調べた。 カラゲニン浮腫に対するＬ鎖の抑制作用 体重200〜250gのS.D.系雄性ラツト各群12匹を
用いた。1.5％ラムダカラゲニン溶液（Sigma
type IV Iambda−Car−rageenan Lot 48C−
0.094）0.1mlを後肢足皮下に注射し、注射直後及
び１時間目より一定間隔で７時間目までの足容積
をUGO−BASIL製VoIume Differential Met−
erにて経時的に測定した。検体（生理食塩水、末
処理天燃IgG、参考例でヨード酢酸処理して得ら
れたＬ鎖、各100mg／Kg）は、カラゲニン注射30
分前に腹腔内投与した。注射直後に対する足容積
増加を浮腫率として求め、その結果を第１図に示
した。第１図における各点は平均±標準偏差を示
すものである。その結果から明らかなようにＬ鎖
100mg／Kg投与では、nativeな未処理IgGおよび
生食投与群に比し有意に浮腫増加率の抑制作用が
認められた。 カラゲニン肉芽腫抑制試験 体重100〜120gのWistar系ラツトを１群５匹と
して用いた。ラツトの背部の毛を刈り取つた後、
背部皮下に６mlの空気を注入し、空気包を形成し
た。約24時間後、同部位に起炎剤として２％ラム
ダカラゲニン溶液を４ml注入した。カラゲニン投
与後５日目に同程度の肉芽腫を形成したラツトを
スクリーニングし、被検薬物（表１に示す：Ｌ鎖
とは参考例でヨード酢酸処理されたもの）を７日
目までに連続３日間投与した。投与終了翌日にラ
ツトを殺し、肉芽腫重量を測定した。結果は表１
に示した。結論として生理食塩液投与群に比しＬ
鎖投与群で有意な抑制作用が認められた。100
mg／Kgおよび50mg／Kgで１％以下の危険率で、
又、10mg／Kgで５％以下の危険率で生食投与群と
の間にカラゲニン肉芽腫形成阻止作用がみとめら
れた。

【表】 （） 抗炎症作用機構 Ｌ鎖の抗炎症作用機構に関する検討をおこなつ
た。 Ｌ鎖の加熱溶血仰制作用の検討をGlennらの
方法（E.M.Glenn，B.J，BowmanandJ.C.
Koslowske，Biochem.Pharmacol.Supple−
ment，27，1968）。に準じて行つた。 Wistar系雄性ラツトより採血し、ガラス棒に
て線維素を除去した後に0.15Mリン酸緩衝液（PH
7.4）を加えて1500rpm、15分遠心して沈渣とし
て赤血球を得た。上清にヘモグロビンが認められ
なくなるまで同緩衝液で洗浄した。この赤血球懸
濁液（ery−throcyte suspension）3.8mlに
400mMドデシル硫酸ナトリウム（SDS）0.2mlを
加えて全溶血時の上清の吸光度540nmが0.4−0.5
になるように濃度を調整した。赤血球懸濁液の
3.8mlに検体（第２図に示すようにＬ鎖の添加量
を10〜200μｇ／mlとした：Ｌ鎖とは、参考例で
ヨードアセトアミド処理されたもの）を0.2ml添
加し、53℃で20分間インキユベートした。その後
急冷・遠沈（3000rpm×15分）して懸濁液を吸光
度540nmで測定した。溶血量を計算し、第２図に
加熱溶血抑制率として示した。 結論としてＬ鎖100mg以上の添加で62％の溶血
阻止効果が認められた。これはＬ鎖が赤血球膜の
安定性をますためと考えられる。従つてＬ鎖によ
る一連の抗炎症効果の原因がこのもののもつ生体
膜安定性によるものと推察される。 （） 毒性 本発明に係るＬ鎖を含有する製剤は、人IgGを
原料とするものであるから、その毒性の点におい
ても人IgGと同様の安全性が保障される。 （） 投与対象、投与量及び投与方法 Ｌ鎖は哺乳動物（たとえばヒト、イヌ、マウ
ス、ラツト、ウマ、ウシ）に対する抗炎症の予
防、治療剤として用いられ、その投与量は通常１
日当り100mg／Kgである。 Ｌ鎖は通常注射剤、経口剤等の形態で投与され
る。注射剤としては、例えば用時に於いて注射用
蒸留水等に溶解して使用する形態などがあげられ
る。その投与の方法は、静脈内、筋肉内投与であ
る。経口剤としてはカプセル剤、錠剤、散剤ある
いは経口用液体製剤等が列挙される。これら製剤
はたとえば日本薬局方等に記載された方法等の公
知方法に従つて作られる。 本発明のＬ鎖を主成分とする抗炎症治療予防剤
は、毒性がきわめて低く又その薬理効果は著効を
示すもので、炎症の治療予防用医薬品として極め
て有用である。 次に本発明の参考例、製剤例を説明する。 参考例 IgGを0.05Mのトリス−塩酸緩衝液、PH8.2に約
２％の濃度に溶かし、２−メルカプトエタノール
を終濃度0.75Mにまで添加し、ジスルイド結合を
切断した。次いで0.75Mヨード酢酸又は0.2ヨー
ドアセトアミドを加え、PHを8.0に保ち１時間反
応させた後、SephadexG−25カラムで余剰の試
薬を除去した。次に、SDS存在下SephadexG200
カラム（4.0×120cm）〔溶媒：0.04MSDS−0.05M
リン酸緩衝液（PH8.0）〕にかけて吸光度280nmで
測定しＬ鎖画分を回収した。Ｌ鎖画分からSDSを
除去し、生理食塩水に対して透析し、さらに除菌
ろ過をおこなつた後、凍結乾燥品とした。 製剤例１ （経口用製剤） (1) カルボキシメチル化Ｌ鎖 5.0mg (2) 直打用微粒No.209（富士化学製） 46.6mg メタケイ酸アルミン酸マグネシウム 20％ トウモロコシデンプン 30％ 乳糖 50％ (3) 結晶セルロース 24.0mg (4) カルボキシルメチルセルロース・カルシウム
4.0mg (5) ステアリン酸マグネシウム 0.4mg (1)，(3)および(4)はいずれも予め100メツシユの
ふるいに通す。この(1)，(3)，(4)と(2)をそれぞれ乾
燥して一定含水率にまで下げた後、上記の重量割
合で混合機を用いて混合する。全質均等にした混
合末に(5)を添加して短時間（30秒間）混合し、混
合末を打錠（杵：6.3mmφ、6.0mmＲ）して、１錠
80mgの錠剤とした。 この錠剤は必要に応じて通常用いられる胃溶液
性フイルムコーテイング剤（例、ポリビニルアセ
タールジエチルアミノアセテート）や食用性着色
剤でコーテイングしてもよい。 製剤例２ （静脈内注射剤） (1) カルバモイルメチル化Ｌ鎖 50mg (2) ブドウ糖 10mg (3) 生理食塩水 10mg (3)に(1)と(2)を上記の重量割合で加えて攬拌し、
完全に溶解させる。この溶解液を孔径0.45μのメ
ンブランフイルターを用いてろ過した後、再び孔
径0.20μのメンブランフイルターを用いて除菌ろ
過を行う。ろ過液を10mlずつ無菌的にバイアルに
分注し、窒素ガスを充填した後密封して静脈内注
射剤とする。 製剤例３ （カプセル剤） (1) カルボキシメチル化Ｌ鎖 50ｇ (2) 乳糖 935ｇ (3) ステアリン酸マグネシウム 15ｇ 上記成分をそれぞれ秤量して合ほ1000ｇを均一
に混合し、混合粉体をハードゼラチンカプセルに
200mgずつ充填する。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図はそれぞれ本発明製剤の作用
効果を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 人IgGのＬ鎖を有効成分とする炎症治療予防
   剤。 ２ Ｌ鎖がアルキル化Ｌ鎖である特許請求の範囲
   第１項記載の炎症治療予防剤。 ３ 固形製剤形態にある特許請求の範囲第１項記
   載の炎症治療予防剤。 ４ 液状製剤形態にある特許請求の範囲第１項記
   載の炎症治療予防剤。