JPH0364506B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（発明の技術分野） 本発明は、抗生物質RK−419及びその製造法
に関するものである。本発明のRK−419物質は、
キタサトスポリア（Kitasatosporia）属に属する
抗生物質RK−419生産菌を培養して、その培養
物中から分離採取される文献未載の新規抗生物質
である。 （発明の背景） 近年、抗生物質は、医療用のみならず農薬用と
しても利用しうるものが数多く見出されている。 本発明者らは、従来より上記の如き有用な抗生
物質の探索を目的として、多数の土壌中から微生
物を分離し、その産出する抗生物質について、精
製、同定及び用途の開発を行つてきた。 その結果、キタサトスポリア
（Kitasatosporia）属に属する微生物の培養物中
に文献未載の新規抗生物質が産出、蓄積されるこ
との知見を得、その単離・精製に成功した。 （発明の目的） 本発明の目的は、新規な抗生物質および該抗生
物質を放線菌キタサトスポリア属に属する微生物
から分離・採取する方法を提供することにある。 （発明の構成） ＜使用する微生物＞ まず、本発明において用いる微生物は、抗生物
質RK−419の生産能を有するものであり、キタ
サトスポリア属に属する菌種である。 その一例として、キタサトスポリア・エスピ
ー・RK−419（Kitasatosporia sp.RK−419）（以
下“RK−419株”という）と呼称される微生物
は上記の特性を有し、本発明の抗生物質RK−
419を有利に生産するものであり、本発明方法に
有効に利用し得るものである。 また、上記RK−419株の自然的及び人工的変
異株は勿論、キタサトスポリア属に属する菌種で
後述の抗生物質RK−419の生産能を有する微生
物はすべて本発明方法において使用することがで
きる。 上記RK−419株は、本発明者により山口県阿
武郡須佐町で採取された土壌中より発見された土
壌放線菌であり、工業技術院微生物工業技術研究
所に昭和59年12月14日付寄託され、その微生物受
託番号は、微工研菌寄第8006号（FERM Ｐ−
8006）である。 RK−419株は、次の菌学的性質を有する。 () 形態 オートミール・イーストエキス寒天培地上に
発育したRK−419株を電子顕微鏡により観察
した。これによると気中菌糸は柔性直状で分岐
は少なく、先端部分は３〜４回螺旋状となり末
端は開いており、いわゆるオープンスパイラル
を呈している。気菌糸のこの末端部分は胞子の
連らなつたもので、これは50個位である。胞子
表面は平滑でしわがみられ巾0.8〜1μで、胞子
間の境界ははつきりせず長さ１〜1.5μである。
本菌株には遊走子、胞子のう、菌核は観察され
なかつた。本菌株を菌体成分分析用液体培地で
液体培養し、菌体を分離し、これを６規定塩酸
と共に18時間加水分解した。この加水分解物を
ジアミノピメリン酸分析用のペーパークロマト
ブラフイーにかけて核成分の分析をしたとこ
ろ、メソ型ジアミノピメリン酸のみを検出し
た。また本菌株の全細胞の糖の検出ではガラク
トースを検出した。またアミノ酸のペーパーク
ロマトグラフイーではグリシンを検出した。本
菌株をイーストエキス麦芽寒天培地上に発育さ
せ、その気中菌糸部分を分離して上記同様加水
分解したものからは、多量のLL型ジアミノピ
メリン酸と少量のメソ型ジアミノピメリン酸が
検出された。 () 各種培地上における生育状態（27℃３週間
培養） 色調の記載ほデイスクリプテイブ・カラー・
ネイムズ・デイクシヨナリー（Descriptive
color names dictionary）第４版の色名記号
による。 １ シユクロース・硝酸塩寒天培地 生育：生育せず ２ グルコース・アスパラギン寒天培地 生育：不良 気中菌糸の着生：なし ３ グリセロール・アスパラギン寒天培地 生育：普通 気中菌糸の着生：普通 気中菌糸の色：10cb オーチドミスト 裏面の色：3cb サンド 可溶性色素：なし ４ スターチ無機塩寒天培地 生育：普通 気中菌糸の着生：普通 気中菌糸の色：Ｇ グレー 裏面の色：1fe シトロングレー 可溶性色素：なし ５ チロシン寒天培地 生育：普通 気中菌糸の着生：普通 気中菌糸の色：5ge ローズウツド 裏面の色：3ie メイプルシユガー 可溶性色素：なし ６ 栄養寒天培地 生育：普通 気中菌糸の着生：普通 気中菌糸の色：ａ ホワイト 裏面の色：2nc ブライトゴールド 可溶性色素：なし ７ イーストエキス・麦芽寒天培地 生育：良好 気中菌糸の着生：豊富 気中菌糸の色：ｆ グレー 裏面の色：3ie メイプルシユガー 可溶性色素：なし ８ オートミール寒天培地 生育：良好 気中菌糸の着生：豊富 気中菌糸の色：ｈ グレー 裏面の色：2fe コバートグレー 可溶性色素：なし ９ ペプトン・イースト・鉄寒天培地 生育：生育せず 10 スターチ・イースト寒天培地 生育：良好 気中菌糸の着生：豊富 気中菌糸の色：5fe アツシユ 裏面の色：3ie ベイジユグレー 可溶性色素：なし () 炭素源の資化性（プリドハム・ゴツトリー
ブ寒天培地）（27℃培養） １ Ｌ−アラビノース − ２ Ｄ−キシロース − ３ Ｄ−グルコース ＋＋＋ ４ Ｄ−フルクトース − ５ シユクロース ＋＋ ６ イソシトール − ７ Ｌ−ラムノース − ８ ラフイノース ＋＋ ９ Ｄ−マンニトール − 10 ラクトース − 11 メリビオース ＋ ＋＋＋非常によく生育する、＋＋よく生育す
る、＋生育する、−生育しない () その他の生理的性質（27℃培養） １ ゼラチンの液化（グルコース・ペプトン・
ゼラチン培地） 表面に発育するが液化しない。 ２ スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒
天培地） 加水分解するが弱い。 ３ 脱脂牛乳の凝固のペプトン化凝固し、ペプ
トン化する。 ４ メラニン様色素の形成 チロシン寒天培地、ペプトン・イースト・
鉄寒天培他で色素の生成は認められない。 ５ 生育温度 20℃〜35℃ 上記のような諸特徴、特に栄養菌糸中にメソ・
ジアミノピメリン酸を有し、気中菌糸中にＬ，Ｌ
−ジアミノピメリン酸を有すること、および糖と
してガラクトースが、またアミノ酸としてグリシ
ンが検出され、かつストレプトミセスイに酷似し
た気中菌糸および胞子を形成する放線菌はキタサ
トスポリアである（S.mura etal J.
Antibiot.35、1013（1982）；Y.Takahashi etal J.
Gen.Appl.Microbiol.30、223（1984）参照）。本菌
属はキタサトスポリア・セタルバ
（Kitasatosporia setalba）、K.メラノゲナ（K.
melanogena）が知られているが、これらの胞子
形成は直状でスパイラルではない。またメラノゲ
ナはメラノイド色素を形成し、気中菌糸は黄椿な
いし褐色である。セタルバの気中菌糸は白ないし
灰色で本菌と類似するが、上記の様に菌糸はスパ
イラルにならず、また糖利用性も一致しない。以
上のことから本菌RK−419株ひキタサトスポリ
アに属する新種の菌株とすることが妥当と結論さ
れた。 ＜培養及び単離・精製＞ 次に、本発明方法を実施するに当つては、キタ
サトスポリア属に属する抗生物質RK−419生産
菌を、抗生物質を生産する通常の方法で培養する
ことができる。培養の形態は、液体培養でも固体
培養でもよく、工業的に有利に培養するために
は、上記生産菌の胞子懸濁液又は培養液を培地に
接種し、通気撹拌培養を行えばよい。 培地の栄養源としては特に限定されることな
く、微生物の培養に通常用いられる炭素源、窒素
源その他を培地中に含有させることができる。 炭素源としては、澱粉、デキストリン、グリセ
リン、グルコース、シユクロース、ガラクトース
などが、また窒素源としては、ペプトン、大豆
粉、肉エキス、米ぬか、麩、尿素、コーンステイ
ープリカー、アンモニウム塩、硝酸塩、その他の
有機または無機の窒素含有物が用いられる。その
他、無機塩類、たとえば食塩、リン酸塩類、カル
シウム、亜鉛、マンガン、鉄等の金属塩類等を適
宜に添加してもよく、必要に応じて消泡剤として
の動、植、鉱物油等を添加してもよい。 培養温度、培養時間等の培養条件は使用菌の発
育に適し、しかもRK−419物質の生産が最高と
なるような条件が選ばれる。たとえば、培地のPH
は5.5〜6.5がよく、培養の適温は25℃〜30℃程度
が望ましい。また培養時間は通常48〜96時間程度
がよい。 しかし、これらの培養組成物、培地の液性、培
養温度、撹拌条件などの培養条件は使用する菌株
の種類や外部の条件などに応じて好ましい結果が
得られるような適宜調節選択されるべきであるこ
とはいうまでもない。このようにして得られる培
養物から、抗生物質RK−419を得るには、代謝
産物を採取するのに通常用いられる手段が適宜に
利用される。たとえば、RK−419物質と不純物
との溶解度差を利用する手段、吸着親和力の差を
利用する手段、イオン結合力の差を利用する手
段、有機溶剤との間の分配の差を利用する手段の
いずれも、それぞれ単独で、または組合わせて、
あるいは反復して利用される。 具体的には、RK−419物質は、培養慮液及び
培養菌体に存在するが、菌体中に存在するRK−
419物質の活性区分は、含水アセトンで抽出され
る。 該抽出液及び上記培養濾液を合わせ、吸着クロ
マトグラフイー、液体クロマトグラフイー、ゲル
濾過クロマトグラフイー等を組み合わせ精製する
ことにより精製RK−419物質が得られる。吸着
クロマトグラフイーの担体としては、ダイヤイオ
ン（登録商標）HP−10が、液体クロマトグラフ
イーの担体としては、MCI GEL 2OPが、ゲル
濾過クロマトグラフイーの担体としては、セフア
デツクス（登録商標）LH−20等が有利に使用し
得る。又、更に高度の精製には、高速液体クロマ
トグラフイーがくり返し用いられるが、使用カラ
ムは逆相分配型のものが有利である。得られた活
性画分を分取し、減圧濃縮、凍結乾燥することに
より、純粋なRK−419物質が得られる。 かくして得られたRK−419物質の理化学的性
質及び生物学的物質は、次のとおりである。 〔理化学的性質及び生物学的性質〕 (1) 形状：白色粉末 (2) 融点：260℃以上（分解） (3) 元素分析：炭素47.21％、水素4.87％ 窒素17.02％、硫黄12.17％ (4) 比旋光度：〔α〕²²℃_D：＋14.5°（Ｃ＝0.475、5
0
％エタノール） (5) 紫外部吸収スペクトル：（第１図参照） エタノール中、次の波長に極大吸収を示す。 （ｎｍ） （Ｅ１％ １cm） 220 397.5 272 194.5 301 146 318 120 (6) 赤外部吸収スペクトル：（第２図参照） 臭化カリ中、次の波数に特徴的な吸収帯を有
する。 3350、2930、1660、1515、1285、1070、1045
cm^-1 (7) 溶解性：メタノール、エタノールに可溶。 水、アセトン、ブタノールに僅溶。 クロロホルム、酢酸エチル、ベンゼン、エー
テルに不溶。 (8) 分子量：滴定当量による分子量は約1000〜
2000である。 (9) Rf値：シリカゲル薄層クロマトグラフイに
おけるRf値は次のとおりである。 Rf値 ｎ−プロパノール−1N NH₄OH（７：３） 0.3 ｎ−ブタノール−メタノール−水（４：１：
２） 0.35 クロロホルム−エタノール−0.1N NH₄OH
（４：７：0.5） 0.02 (10) 呈色反応：過マンガン酸カリウム溶液を脱色
する。 ライドン−スミス（Rydon−Smith） 試薬 ：陽性 ニンヒドリン反応 ：陰性 アニスアルデヒド−硫酸反応 ：陰性 坂口反応 ：擬陽性 (11) 塩基性、酸性、中性の区別：酸性物質（電
気泳動による） (12) 抗菌スペクトル（寒天希釈法による）： 以下に示すように、広範囲の糸状菌に強い生
育阻害活性を示す。

【表】 ＜RK−419物質と既知物質との比較＞ RK−419物質の理化学的、生物学的物質を既
知の抗生物質と比較すると、紫外部吸収スペクト
ルがサラマイセチン（saramycetin）（Julius
Breger et al Antimicrob Agents and
Chemth，1961、436）によく類似しているが、
サラマイセチンは分子中にアミノ酸成分としてア
スパラギン酸、スレオニン、グリシン、プロリン
を含んでいることが判つている。RK−419物質
を6N・HCl、110℃で16時間加水分解しアミノ酸
成分をアミノ酸分析器によつて分析したところ、
アスパラギン酸、グリシン、プロピン、アルギニ
オンが１：１：１：１の比率で検出されたが、ス
レオニンは痕跡しか検出されなかつた。またRK
−419物質を過ギ酸で酸化し、ついで塩酸で加水
分解したのち、アミノ酸分析を行つたところ、上
記アスパラギン酸１に対して2.5の比率でシステ
イン酸が検出された。更に両者は、薄層クロマト
グラフイーで明らかに異なるRf値を示し、又、
高速液体クロマトグラフイーにおいても明らかに
異る保持時間を示した。この結果は、明らかに本
物質がサラマイセチンとは異なる物質であること
を示すものである。これ以外に類似物質のないこ
とから、RK−419物質を新規抗生物質であると
結論した。 RK−419物質は、植物病原菌に対して抗菌活
性を示すことから、農業用殺菌剤として利用が期
待できる。 以下、本発明方法を実施例によつて詳述する。 実施例 30の容積のジヤーフアーメンターに、グルコ
ース２％、可溶性デンプン１％、肉エキス0.1％、
酵母0.4％、大豆粉2.5％、食塩0.2％、第二ラカ酸
0.005％の組成よりなる培地18を入れ殺菌後、
あらかじめ同一培地に前記RK−419株（微工研
菌寄第8006号、FERM Ｐ−8006）を接種して48
〜72時間、27℃でフラスコ振盪培養した培養液
150mlを接種する。ジヤーフアーメンターは28℃、
48〜72時間通気撹拌培養を行なう（18／分、
350rpm）。最終PHは5.5〜6.5である。かくして得
られた４基分の培養液60を濾過助剤セライトを
加えて遠心濾過し菌体と濾液とに分離する。菌体
は70％アセトン水30中に一夜浸漬した後、濾過
して抽出液を得る。これを減圧濃縮してアセトン
を溜去し、８の水溶液を得た。これを培養濾液
と合わせて、ダイヤイオンHP−10カラム（６
）を通過させる。カラムを水15、30％メタノ
ール水30を用いて洗浄後、50％アセトン水24
を用いて溶出を行なう。活性区分を集めて減集濃
縮しアセトンを溜去し、水溶液12を得る。これ
をｎ−ブタノールで２度に分けて抽出し、８の
ブタノール抽出液を得る。これを水を加えながら
減圧濃縮し５とする。この抽出液500mlをとり、
更に水を加えて減圧濃縮し、最終的にはエタノー
ルを加えて濃縮して乾燥残渣とする。これを150
mlのメタノールに溶かして、MCIゲル・CHP20
−Ｐのカラム（500ml、30×770mm）を通過させる
と活性物質は吸着されるので、これを段階的に20
％、40％、60％アセトン水にて溶出する。活性物
質は60％アセトンにて溶出される。活性区分を集
めて減圧濃縮し、乾燥残渣を20mlのメタノールの
溶解し、セフアデツクスLH20のカラム（400ml、
25×820mm）にのせる。メタノールにて展開して
分画する。活性区分を集めて減圧濃縮し、乾燥す
ると、粗物質860mgが得られる。粗物質を更に精
製するために、逆相系担体ヌクレオジル5C₁₈
（Nucleosil5C₁₈）を用いた高速液体クロマトグラ
フイーを行なう。逆相カラム（10×300mm）を用
い、溶媒系として80％メタノールにて分離する。
約15分の保持時間で溶出される活性区分を分取す
る。分取を繰返し行ない、溶出液を集めて、減圧
濃縮してメタノールを溜去し、得られる懸濁液を
凍結乾燥すると、50mgの白色粉末を得る。更にこ
の粉末を逆相カラム（６×250mm）を用いて、80
％メタノールの溶媒系を用いた高速液体クロマト
ブラフイーによつて精製する。活性ピーク（約15
分の保持時間）を分取し、減圧濃縮し、凍結乾燥
するこによつて純粋はRK−419物質の白色粉末
が20mg得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、RK−419物質の紫外線吸収スペク
トルを示す図面であり、第２図は、RK−419の
赤外線吸収スペクトルを示す図面である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性質及び生物学的性質を有す
   る抗生物質RK−419。 (1) 形状：白色粉末 (2) 融点：260℃以上（分解） (3) 元素分析：炭素47.21％、水素4.87％ 窒素17.02％、硫黄12.17％ (4) 比旋光度：〔α〕²²℃_D14.5°（Ｃ＝0.475、50％
   エ
   タノール） (5) 紫外部吸収スペクトル： エタノール中、次の波長に極大吸収を示す。 （ｎｍ） （Ｅ１％ １cm） 220 397.5 272 194.5 301 146 318 120 (6) 赤外部吸収スペクトル： 臭化カリ中、次の波長に特徴的な吸収帯を有
   する。 3350、2930、1660、1515、1285、1070、1045
   cm^-1 (7) 溶解性：メタノール、エタノールに可溶。 水、アセトン、ブタノールに僅溶。 クロロホルム、酢酸エチル、ベンゼン、エー
   テルに不溶。 (8) 分子量：滴定当量による分子量は約1000〜
   2000である。 (9) 呈色反応：過マンガン酸カリウム溶液を脱色
   する。 ライドン−スミス（Rydon−Smith） 試薬 ：陽性 ニンヒドリン反応 ：陰性 アニスアルデヒド−硫酸反応 ：陰性 坂口反応 ：擬陽性 (10) 塩基性、酸性、中性の区別：酸性物質（電気
   泳電による） (11) 抗菌スペクトル（寒天希釈法による）： 広範囲の糸状菌に強い生育阻害活性を示す。 ２ キタサトスポリア（Kitasatosporia）属に属
   する抗生物質RK−419生産菌を培養し、その培
   養物から抗生物質RK−419を分離・採取するこ
   とを特徴とする抗生物質RK−419の製造法。 ３ キタサトスポリア属に属する抗生物質RK−
   419生産菌かキタサトスポリア・エスピー・No.
   RK−419（Kitasatosporia sp.RK−419）（FERM
   Ｐ−8006）である特許請求の範囲第２項記載の方
   法。