JPH0377200B2 - - Google Patents

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JPH0377200B2
JPH0377200B2 JP58170496A JP17049683A JPH0377200B2 JP H0377200 B2 JPH0377200 B2 JP H0377200B2 JP 58170496 A JP58170496 A JP 58170496A JP 17049683 A JP17049683 A JP 17049683A JP H0377200 B2 JPH0377200 B2 JP H0377200B2
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leu
peptide
ser
boc
acid
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Noboru Yanaihara
Hiroshi Okamoto
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Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
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  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
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【発明の詳細な説明】 本発明は、新規なペプチド（ヒトホルモン）、
更に詳しくはヒトPHI（PHM）に関する。
本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護
基、活性基、その他に関して略号で表示する場合
はIUPAC、IUBの規定或いは当該分野における
慣用記号に従うものとし、その例を次に挙げる。
またアミノ酸等に関して光学異性体がありうる場
合は、特に明記しなければＤ体、Ｌ体又はラセミ
体を示すものとする。
Ser；セリン Leu；ロイシン Thi；スレオニン Gly；グリシン Gln；グルタミン Glu；グルタミン酸 Lys；リジン Asp；アスパラギン酸 Val；バリン Tyr；チロシン Ala；アラニン Met；メチオニン Phe；フエニルアラニン Tos；ｐ−トルエンスルホニル基 Boc；第３級ブトキシカルボニル基 ONP；ｐ−ニトロフエノキシ基 Bzl；ベンジル基 OBzl；ベンジルオキシ基 Cl2−Bzl；２，６−ジクロルベンジル基 Cl−Ｚ；２−クロルベンジルオキシカルボニル基 最近のペプチドホルモンに関する研究の進歩に
より、消化管に存在するペプチドホルモンの多く
は、脳にも存在し、逆に脳で発見されたホルモン
の多数が消化管にも認められることが判り、これ
らのホルモンは脳一腸管ペプチド（Brain−
gutpeptide）と呼称され、これ等ホルモンに関す
る研究が神経内分泌学として脚光を浴びている。
本発明者らも、グルカゴン−セクレチンフアミ
リーに属するVIP（vasoactive intestinal
polypeptide）〔Mutt.V.＆ Said.S.I.，Eur.J.
Biochem.42、581−589（1974）〕及びPHI
〔Tatemoto.K.＆ Mutt.V.，Proc.Natl.Acad.
Sci.、USA.，Vol.78.No11，6603−6607（1981）〕
について、ことにヒト由来のそれにつき研究を重
ねてきたが、その過程において、V.I.P産生能を
有するヒト神経芽細胞腫株NB−OK−１
〔Yanaihara，N.et al，Biomedical Research，
２（６），728−734（1981）〕よりヒトVIPの前駆体
プレホルモン（prepro−VIP）〔Obata、K.etal，
FEBS Letters 136，123−126（1981）〕をコード
するｍ−RNAを単離することに成功し、これの
ｃ−DNAをクローニングし、その核酸の塩基配
列を決定した。その結果、上記prepro−VIPに
は、ヒトVIPの他に新規なアミノ酸配列が含まれ
ており、これがヒト消化管ペプチドホルモン（ヒ
トPHI）であることを発見すると共に上記ヒト
PHIの化学合成に成功し、ここに本発明を完成す
るに至つた。
即ち本発明は一般式 Ｒ−Leu−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser−Ala
−Lys−Lys−Tyr−Leu−Glu−Ser−Leu−
Met−NH2 (1) 〔式中ＲはＨ−His−Ala−Asp−Gly−Val−
Phe−Thr−Ser−Asp−Phe−Ser−Lys基を示
す。〕 で表わされるペプチド及びその塩に係る。
本発明の上記の一般式(1)で表わされるペプチド
は、ヒト消化管ホルモン〔ヒトPHI（PHM）〕で
ある。一般式(1)で表わされる本発明のペプチド
は、該PHIとしてのホルモン作用（生理作用）に
基づき、例えば血流増加作用、インスリン及びプ
ロラクチンの分泌増加作用、平滑筋収縮作用等を
有し、例えば、血流改善剤、抗糖尿病薬、ホルモ
ン製剤、プロラクチノーマ診断薬等として有用で
あり、またヒトPHI抗体製造用の免疫抗原として
も有用である。
本発明の一般式(1)で表わされるペプチドは、入
手容易な市販のアミノ酸を利用して、簡単な操作
で容易に合成することができる。また該ペプチド
〔ヒトPHI（PHM）〕は、VIP及び／又はPHI産生
細胞株もしくは、ヒト腸等の組織より常法〔例え
ばProc.Natl.Acad.Sci.USA.，Vol.78，No.11，
6603−6607（1981）参照〕に従い、抽出単離する
こともできる。
以下本発明ペプチドの化学合成法につき詳述す
る。
本発明ペプチドは、通常のペプチド合成法、具
体的には「ザ ペプチド（The Peptides）」第１
巻（1966年）〔Schroder and Luhke著、
Academic press.New York.USA〕或いは「ペ
プチド合成」〔泉屋ら著、丸善株式会社（1975
年）〕に記載される如き方法に従い、例えばアジ
ド法、クロライド法、酸無水物法、混酸無水物
法、DCC法、活性エステル法（ｐ−ニトロフエ
ニルエステル法、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド
エステル法、シアノメチルエステル法等）、ウツ
ドワード試薬Ｋを用いる方法、カルボジイミダゾ
ール法、酸化還元法、DCC／アデイテイブ
（HONB、HOBt、HOSu）法等により製造でき
る。上記方法においては、固相合成法及び液相合
成法のいずれをも適用できる。通常本発明のペプ
チドは、上記した一般のポリペプチドの合成法に
従い、例えば末端アミノ酸に順次１個づつアミノ
酸を縮合させる所謂ステツプワイズ法により、又
は数個のフラグメントに分けてカツプリングさせ
ていく方法により製造される。
より詳細には、例えば固相合成法を採用する場
合、Ｃ末端アミノ酸をそのカルボキシル基によつ
て、不溶性担体に結合させ、次いでアミノ保護基
を除去した後、一般式(1)で表わされるアミノ酸配
列に従い順次アミノ基保護アミノ酸を、その反応
性アミノ基及び反応性カルボキシル基との縮合反
応により結合させ、一段階ずつ合成し、全配列を
合成した後、ペプチドを不溶性担体からはずすこ
とにより製造される。ここで用いられる不溶性担
体は、反応性カルボキシル基との結合性を有する
各種のもののいずれでもよいが、脱離によりアミ
ドを与える担体、例えばベンズヒドリルアミン系
樹脂を用いるのが好ましい。
またＮ末端アミノ酸をそのアミノ基によつて、
該アミノ基との結合性を有する通常の不溶性担体
に結合させ、同様にして合成することもできる。
この場合及び液相法を利用する場合は、Ｃ末端ア
ミノ酸即ちMetは、常法に従い例えばクイツト等
の方法〔P.Quitt et al.Helb.Chim.Acta.46．327
（1963）〕に準じてメチオニンアミドとして使用さ
れる。
上記いずれの方法においてもHis、Tyr、Glu、
Thr、Lys、Asp及びSerの各アミノ酸は、その側
鎖官能基を保護しておくのが好ましく、これは通
常の保護基により保護され、反応終了後該保護基
は脱離される。また反応に関与する官能基は、通
常活性化される。これら各反応方法は、公知であ
り、それらに用いられる試薬等も公知のものから
適宜選択される。
アミノ基の保護基としては、例えばベンジルオ
キシカルボニル、Boc、tert−アミルオキシカル
ボニル、イソボルニルオキシカルボニル、ｐ−メ
トキシベンジルオキシカルボニル、Cl−Ｚ、アダ
マンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチ
ル、フタリル、ホルミル、ｏ−ニトロフエニルス
ルフエニル、ジフエニルホスフイノチオイル基等
が挙げられる。
Hisのイミノ基の保護基としては、例えばTos、
Bzl、ベンジルオキシカルボニル、トリチル基等
が挙げられる。
Ser及びThrの水酸基の保護基としては、例え
ば、Bzl、tert−ブチル、アセチル、テトラヒド
ロピラニル基等が挙げられる。
Tyrの水酸基の保護基としては、例えばBzl、
Cl2−Bzl、ベンジルオキシカルボニル、アセチ
ル、Tos基等が挙げられる。
Lysのアミノ基の保護基としては、例えばベン
ジルオキシカルボニル、Cl−Ｚ、Cl2−Bzl、
Boc、Tos基等が挙げられる。
Glu及びAspのカルボキシル基の保護は、例え
ばベンジルアルコール、メタノール、エタノー
ル、tert−ブタノール等によるエステル化により
行なわれる。
カルボキシル基の活性化されたものとしては、
例えば対応する酸クロライド、酸無水物又は混合
酸無水物、アジド、活性エステル（ペンタクロロ
フエノール、ｐ−ニトロフエノール、Ｎ−ヒドロ
キシサクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンズトリ
アゾール、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−
２，３−ジカルボキシイミド等とのエステル）等
が挙げられる。尚ペプチド結合形成反応は、縮合
剤例えばジシクロヘキシルカルボジイミド、カル
ボジイミダゾール等のカルボジイミド試薬やテト
ラエチルピロホスフイン等の存在下に実施し得る
場合もある。
以下、本発明ペプチドの製造につき反応行程式
を挙げて具体的に説明すれば、該ペプチド(1)は一
般式(1)中Ｒが水素原子である下記ペプチド（1a）
をその合成中間体としてまず合成後、これを経由
して、該ペプチド（1a）の合成と同様にして製
造するこができる。
〔反応行程式−１〕 Ａ−Met−OH (イ) ↓ Ａ−Met−R1 (ロ) ↓ Ｈ−Met−R1 (ハ) ↓ Ａ−Leu−OH (ニ) Ａ−Leu−Met−R1 (ホ) ↓↓↓ Ａ−Leu−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser−Ala−
Lys−Lys−Tyr−Leu−Glu−Ser−Leu−Met−
R1 (ヘ) ↓ Ｈ−Leu−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser−Ala−
Lys−Lys−Tyr−Leu−Glu−Ser−Leu−Met−
NH2 （1a） 〔式中Ａはアミノ基の保護基及びR1は不溶性担
体を示す。〕 上記において、Ａの好ましいものとしては
Boc、ベンジルオキシカルボニル基、ｐ−メトキ
シベンジルオキシカルボニル基等を、またR1の
好ましいものとしてはベンズヒドリルアミン樹脂
をそれぞれ例示することができる。
また、各反応において、使用するアミノ酸が反
応に関与しない側鎖官能基を有する場合は、常法
通り、前述した保護基により、保護され、これは
不溶性担体R1の脱離と同時に脱離される。
上記方法において、アミノ酸(イ)（もしくはその
カルボキシル基の活性化されたもの）と不溶性担
体R1との反応は、常法に従いアミノ酸(イ)の反応
性カルボキシル基を利用して、これをR1と結合
させることによつて行なわれる。該反応は例えば
ベンズヒドリルアミン樹脂を使用する場合は、ペ
プチド縮合反応に慣用される公知の各種の溶媒、
例えば無水ジメチルホルムアミド、ジメチルスル
ホキシド、ピリジン、クロロホルム、ジオキサ
ン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、酢酸
エチル、Ｎ−メチルピロリドン、ヘキサメチルリ
ン酸トリアミド或いはこれらの混合溶媒等の存在
下に行なわれる。また該反応は、必要に応じて、
通常のペプチド結合形成反応に用いられる試薬、
例えばＮ，Ｎ−ジシクロヘキシカルボジイミド
（DCC）、Ｎ−エチル−N′−ジメチルアミノカル
ボジイミド、１−エチル−３−ジイソプロピルア
ミノカルボジイミド、１−シクロヘキシル−３−
（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミ
ド等のカルボジイミド類等の脱水縮合剤の存在下
に行なうこともできる。不溶性担体とアミノ酸(イ)
との使用割合は、特に限定はないが、通常前者に
対して後者を過剰量、一般に１〜３倍当量程度と
するのがよい。脱水縮合剤の使用量も特に限定は
なく、通常アミノ酸(イ)に対して、等モル量程度使
用されるのが好ましい。反応温度はペプチド結合
形成反応に使用される通常の範囲、一般には約−
40℃〜約60℃、好ましくは約−20℃〜約40℃の範
囲から適宜選択される。反応時間は一般に数分〜
30時間程度とされる。
かくして得られる一般式(ロ)の固相化アミノ酸の
保護基Ａの脱離反応は、常法により行なわれる。
該方法としては例えばパラジウム、パラジウム黒
等の触媒を用いる水素添加、液体アンモニア中金
属ナトリウムによる還元等の還元的方法、トリフ
ルオロ酢酸、塩化水素酸、弗化水素、メタンスル
ホン酸、臭化水素酸等の強酸によるアシドリシス
等を例示することができる。上記触媒を用いる水
素添加は、例えば水素圧１気圧、０〜40℃にて行
ない得る。触媒の使用量としては通常100mg〜１
ｇ程度とするのがよく、一般に１〜48時間程度で
反応は終了する。また上記アシドリシスは、無溶
媒下、通常０〜30℃程度、好ましくは０〜20℃程
度で約15分〜１時間程度を要して行なわれる。酸
の使用量は原料化合物に対し通常５〜10倍量程度
とするのがよい。該アシドリシスにおいて保護基
Ａのみを脱離する場合は酸としてトリフルオロ酢
酸又は塩化水素酸を使用するのが好ましい。更に
上記液体アンモニア中金属ナトリウムによる還元
は、反応液がパーマネントブルーに30秒〜10分間
程度呈色しているような量の金属ナトリウムを用
い、通常−40℃〜−70℃程度にて行ない得る。
次いで得られる一般式(ハ)の固相化アミノ酸とア
ミノ酸(ニ)（もしくはそのカルボキシル基の活性化
されたもの）との反応は、通常前者に対して後者
を等モル量〜10倍モル量、好ましくは等モル量〜
５倍モル量とする割合で使用して、前記したアミ
ノ酸(イ)と不溶性担体との反応と同様にして行なわ
れる。
かくして得られる一般式(ホ)のペプチドは、上記
と同様に保護基Ａの脱離後、これに一般式(1)で表
わされるアミノ酸配列に従い、Ａ−Ser−OH、
Ａ−Glu−OH、Ａ−Leu−OH、Ａ−Thr−OH、
Ａ−Lys−OH、Ａ−Lys−OH、Ａ−Ala−OH、
Ａ−Ser−OH、Ａ−Leu−OH、Ａ−Gln−OH、
Ａ−Gly−OH、Ａ−Leu−OH、Ａ−Leu−OH
の各アミノ酸もしくは側鎖官能基を保護されたも
の乃至そのカルボキシ基を活性化されたものを順
次縮合反応させることにより一般式(ヘ)で表わされ
るペプチドに誘導することができる。これら縮合
反応及び保護基Ａの脱離反応は、それぞれ前記し
た方法と同様にして行なわれる。
また得られるペプチド(ヘ)は、同様にして保護基
Ａの脱離、アミノ酸の側鎖官能基の保護基の脱離
及び不溶性担体R1の脱離により、ペプチド（1a）
に誘導される。ここで側鎖官能基の保護基及び不
溶性担体R1の脱離反応は、保護基Ａの脱離反応
と同様に行ない得る。この場合は、酸として弗化
水素又は臭化水素酸を用いるのが好ましい。尚、
上記方法において使用される各アミノ酸は、いず
れも公知の市販品でよい。
以上のようにして製造された式（1a）のペプ
チドは、反応混合物からペプチドの分離手段例え
ば抽出、分配、カラムクロマトグラフイー等によ
り単離精製される。
本発明の一般式(1)で表わされるペプチドは、上
記ペプチド（1a）の製造と同様にして製造され
る。
本発明の上記の一般式(1)で表わされるペプチド
は、いずれも入手容易な市販のアミノ酸を利用し
て、簡単な操作で容易に合成することができ、ま
たこれを免疫抗原として又はそのハプテンとして
用いてヒトPHI（PHM）に特異反応性を有する抗
体を収得することができる。該抗体はこれを例え
ばアフイニテイークロマトグラフイー用担体と結
合させて、該クロマトグラフに利用する等により
ヒトPHIの精製に用いることができ、また該ヒト
PHIの各種免疫測定法における抗体として使用で
き、ヒトPHIの定量、これによる各種疾患の診断
等に使用できる。
上記免疫測定法、例えばラジオイムノアツセイ
（RIA）法又はエンザイムイムノアツセイ（EIA）
法においてはまた、本発明のペプチドは、これに
125I、 131I等の放射性物質、パーオキシターゼ
（POX）、キモトリプシノーゲン、プロカルボキ
シペプチダーゼ、グリセロアルデヒド−３−リン
酸脱水素酵素、アミラーゼ、ホスホリラーゼ、Ｄ
−Nase、Ｐ−Nase、β−ガラクトシダーゼ、グ
ルコース−６−フオスフエートデハイドロゲナー
ゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等の各種酵素
試薬等を導入して、標識抗原として利用できる。
上記放射性物質の導入は、通常の方法、例えばク
ロラミンＴを用いる酸化的ヨード化法〔W.M.
Hunter and F.C.Greenwood； Nature，194，
495（1962）、BiochemJ.89，144.（1963）参照〕等
により行なわれ、酵素試薬の導入は、通常のカツ
プリング法例えばエルランガー（B.F.Erlanger）
らの方法〔Acta.Endocrinol.Suppl.，167，206
（1972）〕及びカロール（M.H.Karol）らの方法
〔Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，57，713（1967）〕
等の公知の方法によつて行なうことができる。
また本発明ペプチドは、これをポリビニルピロ
リドンなどのポリマーまたは炭末などに吸着させ
ることにより免疫抗原として用いることができ
る。また本発明ペプチドをハプテンとして用いる
場合、これはハプテン−担体結合試薬の存在下
に、適当な担体との反応により免疫抗原とされ
る。上記担体としては、通常抗原の作成に当り慣
用される高分子の天然もしくは合成の蛋白質を広
く使用できる。該担体としては例えば馬血清アル
ブミン、牛血清アルブミン、ウサギ血清アルブミ
ン、人血清アルブミン、ヒツジ血清アルブミン等
の動物の血清アルブミン類；馬血清グロブリン、
牛血清グロブリン、ウサギ血清グロブリン、人血
清グロブリン、ヒツジ血清グロブリン等の動物の
血清グロブリン類；馬チログロブリン、牛チログ
ロブリン、ウサギチログロブリン、人チログロブ
リン、ヒツジチログロブリン等の動物のチログロ
ブリン類；馬ヘモグロブリン、牛ヘモグロブリ
ン、ウサギヘモグロブリン、人ヘモグロブリン、
ヒツジヘモグロブリン等の動物のヘモグロブリン
類；キーホールリンペツトヘモシアニン（KLH）
等の動物のヘモシアニン類；回虫より抽出された
蛋白質（アスカーリス抽出物、特開昭56−16414
号公報、J.Immun.，111，260〜268（1973）、J.
Immun.，122，302〜308（1979）、J.Immun.，98，
893〜900（1967）及びAm.J.Physiol.，199，575〜
578（1960）に記載されたもの又はこれらを更に精
製したもの）；ポリリジン、ポリグルタミン酸、
リジン−グルタミン酸共重合体、リジン又はオル
ニチンを含む共重合体等を挙げることができる。
ハプテン−担体結合試薬としては、通常抗原の
作成に当り慣用されているものを広く使用でき
る。具体的にはチロシン、ヒスチジン、トリプト
フアンを架橋結合させる、例えばビスジアゾタイ
ズドベンジン（BDB）、ビスジアゾタイズド−
３，3′−ジアニシジン（BDD）等のジアゾニウ
ム化合物；アミノ基とアミノ基とを架橋結合させ
る、例えばグリオキサール、マロンジアルデヒ
ド、グルタールアルデヒド、スクシンアルデヒ
ド、アジポアルデヒド等の脂肪族アルデヒド類；
チオール基とチオール基とを架橋結合させる、例
えばＮ，N′−０−フエニレンジマレイミド、Ｎ，
N′−ｍ−フエニレンジマレイミド等のジマレイ
ミド化合物；アミノ基とチオール基とを架橋結合
させる、例えばメタマレイミドベンゾイル−Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−（マレ
イミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキ
シル−N′−ヒドロキシスクシンイミドエステル
等のマレイミドカルボキシル−Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミドエステル類；アミノ基とカルボキシ
基とをアミノ結合させる通常のペプチド結合形成
反応に用いられる試薬、例えばＮ，Ｎ−ジシクロ
ヘキシカルボジイミド、Ｎ−エチル−N′−ジメ
チルアミノカルボジイミド、１−エチル−３−ジ
イソプロピルアミノカルボジイミド、１−シクロ
ヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）
カルボジイミド等のカルボジイミド類等の脱水縮
合剤を挙げることができる。また上記ハプテン−
担体結合試薬としては、ｐ−ジアゾニウムフエニ
ル酢酸等のジアゾニウムアリールカルボン酸類と
通常のペプチド結合形成反応試薬、例えば上記脱
水縮合剤とを組合せたものも使用可能である。
上記抗原の製造反応は、例えば水溶液もしくは
PH７〜10の通常の緩衝液中、０〜40℃、好ましく
は室温付近で通常約１〜24時間で行なわれる。上
記によりハプテン−担体結合試薬を仲介させて担
体とハプテンとが結合したペプチド−担体複合体
からなる所望の抗原が収得される。反応終了後得
られる抗原は常法に従い、例えば透析法、ゲル
過法、分別沈澱法等により容易に単離精製でき
る。
上記のごとくして得られる抗原又は本発明ペプ
チドを免疫抗原としてヒトPHＩに反応性を有する
抗体を製造する方法は、例えば矢内原らの文献
〔Gastroenterology.72，803〜810（1977）〕に示さ
れる方法を準じることが出来る。例えば上記抗体
は、抗原を哺乳動物に投与し、生体内に所望抗体
を産生させ、これを採取することにより製造され
る。抗体の製造に供せられる哺乳動物としては、
特に制限はないが、通常ウサギ、ヤギ、モルモツ
ト等を用いるのが好ましい。抗体の産生に当つて
は、抗原の所定量を生理食塩水で適当濃度に希釈
し、フロインドの補助液（Complete Freund′s
Adjuvant）と混合して懸濁液を調整し、これを
哺乳動物体に投与し免疫化させればよい。抗体の
採取は、免疫化された動物から採血し、これを遠
心分離後、血清を分離することにより行なわれ
る。
かくして得られる本発明のペプチドは、薬理的
に許容される酸性化合物又は塩基性化合物と塩を
形成させることができる。かかる酸性化合物とし
ては、例えば塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素酸等
の無機酸、フマール酸、マレイン酸、酢酸、シユ
ウ酸、リンゴ酸、クエン酸等の有機酸をまた塩基
性化合物としては、例えば水酸化ナトリウム、水
酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウ
ム、炭酸水素カリウム等を挙げることができる。
本発明ペプチド及びその塩は、例えばこれを血
流改善剤として用いるに当り、通常製剤的担体と
共に製剤粗成の形態に加工させるが、中でも注射
剤の形態に加工され使用されるのが好ましい。
注射剤として調整される場合、得られる製剤は
殺菌され且つ血液と等張であるのが好ましい。注
射剤の形態に形成するのに際しては、希釈剤とし
てこの分野に於いて慣用されているものをすべて
使用できる。例えば、水、生理食塩水等を挙げる
ことができる。なおこの場合等張性の溶液を調整
するに充分な量の食塩、あるいはグリセリンを注
射剤の形態の製剤中に含有せしめてもよい。また
上記製剤には通常の緩衝剤、無痛化剤、保存剤
等、更に必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風
味剤、甘味剤等や他の医薬品をも含有せしめ得る
ものである。また上記有効成分は使用時に注射用
蒸溜水に溶解し、溶時溶解剤としても使用でき
る。
上記の如くして調整される製剤は、その形態に
応じた方法で投与され得る。注射剤の場合には単
独であるいはアミノ酸等の通常の補液と混合して
静脈内投与される。
有効成分の投与量は使用目的、症状等により適
宜決定されるが、通常１人１日当り1nｇ〜１
mg／Kg程度の範囲で用いるのが好ましく、また１
日に２〜４回分割投与するのが好ましい。
以下本発明を更に詳しく説明するため、式
（1a）で表わされるペプチドの参考製造例、一般
式(1)で表わされる本発明ペプチドの製造例及び試
験例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。
尚、各製造例において、各アミノ酸はＬ体を示
す。またRf値はシリカゲル上の薄層クロマトグ
ラフイーにて下記混合溶媒を用いて測定したもの
である。
Rf1……ｎ−ブタノール−酢酸−水
（４：１：５） Rf2……ｎ−ブタノール−酢酸−ピリジン−水
（15：３：10：12） 参考製造例 １ 塩化メチレン25mlにBoc−Met−OHの897mg
を溶解し、ベンズヒドリルアミン樹脂（0.4ミ
リモルNH2／ｇ樹脂：財団法人蛋白質研究奨
励会）6.00ｇを加えて室温で120分間反応させ
る。樹脂を塩化メチレン25mlで、1.5分間、６
回繰り返し洗浄し、減圧乾燥してBoc−Met−
樹脂を得る。
上記で得たBoc−Met−樹脂を１％エタン
ジオール、25％トリフルオロ酢酸（TFA）の
塩化メチレン溶液25mlに加え、室温で30分間反
応させる。樹脂を塩化メチレン25mlで６回、10
％トリエチルアミンの塩化メチレン溶液25mlで
1.5分間、３回、次いで塩化メチレン25mlで1.5
分間、６回それぞれ洗浄してＨ−Met−樹脂を
得る。
Boc−Leu−OHの900mgを塩化メチレンに溶
かした溶液25mlに上記Ｈ−Met−樹脂に加え、
次いでDCCの743mgを塩化メチレンに溶かした
溶液7.2mgを加え室温で２時間反応させる。樹
脂を塩化メチレン25mlで1.5分間、６回洗浄後、
Boc−Leu−OHの900mg及び１−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾール486mgをジメチルホルムアミ
ド10ml及び塩化メチレン15mlに溶解した溶液に
加え、次いでDCCの743mgを塩化メチレンに溶
かした溶液7.2mlを加えて再度同様に反応させ
る（二重カツプリング法）。樹脂を塩化メチレ
ンで充分に洗浄してBoc−Leu−Met−樹脂を
得る。
上記と同様にして、Boc−Leu−Met−樹
脂の脱Boc化を行ない、次いで下記アミノ酸を
順次縮合及び脱Boc反応に付す。
Boc−Ser（Bzl）−OH 1062mg Boc−Glu（Bzl）−OH 1214mg Boc−Leu−OH 900mg Boc−Ter（Cl2−Bzl）−OH 1649mg Boc−Lys（Cl−Ｚ）−OH・（tert−ブチルアン
モニウム塩；TBA） 1754mg Boc−Lys（Cl−Ｚ）−OH・TBA 1754mg Boc−Ala−OH 681mg Boc−Ser（Bzl）−OH 1062mg Boc−Leu−OH 900mg Boc−Gln−OH 886mg Boc−Gly−OH 630mg Boc−Leu−OH 900mg Boc−Leu−OH 900mg 斯くしてＨ−Leu−Leu−Gly−Gln−Leu−
Ser（Bzl）−Ala−Lys（Cl−Ｚ）−Lys（Cl−Ｚ）−
Tyr（Cl2−Bzl）−Leu−Glu（Bzl）−Ser（Bzl）−
Leu−Met−樹脂を得る。このうち3.27ｇをアニ
ソール４ml及びメチルエチルスルフイド0.75mlを
含む弗化水素40mlに溶かし、０℃で60分間インキ
ユベーシヨンさせた後、過剰の弗化水素を減圧留
去し、残渣を酢酸エチルで３回洗浄後、3M酢酸
100mlにて抽出し、凍結乾燥して粗製品950mgを得
る。この500mgをセフアデツクスＧ−25（フアルマ
シア社、カラム2.4×145cm、溶出液1M酢酸）に
よるゲル過、さらに液滴向流分配（φ3×400mm
tube×100，分配系；ｎ−ブタノール：酢酸：水
＝４：１：５，３ｇフラクシヨン分取）にて精製
（フランクシヨンNo.43〜64）して、Ｈ−Leu−Leu
−Gly−Gln−Leu−Ser−Ala−Lys−Lys−Tyr
−Leu−Glu−Ser−Leu−Met−NH2の137mgを
得る。以下このペプチドを「ペプチドＡ」と呼
ぶ。
Rf値： Rf1＝0.22 Rf2＝0.62 HPLC：ODS−120T（0.46×25cm；東洋曹達社），
0.01N HCl／CH3 CN＝75／25〜55／45グラ
ジエント、流速；１ml／min保持時間；12分 アミノ酸分析値；6N HCl、110℃ 24時間加水
分解、アミノ酸自動分析計835型（日立製作所）
にて分析 Ser 1.82(2) Glu 1.93(2) Gly 0.97(1) Ala 0.96(1) Met 1.04(1) Leu 5.08(5) Tyr 1.07(1) Lys 2.15(2) 製造例 １ 前記参考製造例１で得たＨ−Leu−Leu−Gly
−Gln−Leu−Ser（Bzl）−Ala−Lys（Cl−Ｚ）−
Lys（Cl−Ｚ）−Lys（Cl2−Bzl）−Leu−Glu（Bzl）
−Ser（Bzl）−Leu−Met−樹脂に参考製造例１と
同様にして、以下のアミノ酸を順次縮合及び脱
Boc化反応させる。
Boc−Lys（Cl−Ｚ）−OH・TBA 1754mg Boc−Ser（Bzl）−OH 1062mg Boc−Phe−OH 954mg Boc−Asp（Bzl）−OH 1163mg Boc−Ser（Bzl）−OH 1062mg Boc−Thr（Bzl）−OH 1113mg Boc−Phe−OH 954mg Boc−Val−OH 782mg Boc−Gly−OH 630mg Boc−Asp（Bzl）OH 1163mg Boc−Ala−OH 681mg Boc−His（Tos）−OH 1473mg 斯くして、Ｈ−His（Tos）−Ala−Asp（Bzl）−
Gly−Val−Phe−Thr（Bzl）−Ser（Bzl）−Asp
（Bzl）−Phe−Ser（Bzl）−Lys（Cl−Ｚ）−Leu−
Leu−Gly−Gln−Leu−Ser（Bzl）−Ala−Lys（Cl
−Ｚ）−Lys（Cl−Ｚ）−Tyr（Cl2−Bzl）−Leu−
Glu（Bzl）−Ser（Bzl）−Leu−Met−樹脂10.7ｇを
得る。このうち5.26ｇを用い前記参考製造例１と
同様にして、保護基及び樹脂の脱離ついで精製し
て530mgのＨ−His−Ala−Asp−Gly−Val−Phe
−Thr−Ser−Asp−Phe−Ser−Lys−Leu−Leu
−Gly−Gln−Leu−Ser−Ala−Lys−Lys−Tyr
−Leu−Glu−Ser−Leu−Met−NH2を得る。以
下これを「ペプチドＢ」と呼ぶ。
Rf値： Rf1＝0.28 Rf2＝0.65 HPLC；0.01N HCl／CH3CN＝70／30〜50／50、
グラジエント（他は前記に同じ） 保持時間；12分 アミノ酸分析（前記に同じ） Phe 1.86(2) Tyr 0.99(1) Leu 5.30(5) Met 0.96(1) Val 0.97(1) Ala 1.99(2) Gly 2.00(2) Glu 2.01(2) Ser 3.57(4) Thr 0.88(1) Asp 2.08(2) His 0.92(1) Lys 3.19(3) ＜試験例＞ ペプチドＢの血流増加作用を試験した
〔Gastroenterology，72，803〜810（1977）〕。す
なわち、雑種成犬を麻酔下に開腹し、上腸間膜動
脈の根部を周囲結合機から剥離露出し、電磁流量
計のプローブを装着する。分時流量が安定した
後、ペプチドＢの生理食塩水溶液を10-10モル／
Kg静注し、血流量の変化を測定した。その結果強
い血流量の増加が認められた。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式 Ｒ−Leu−Leu−Gly−Gln−Leu−Ser−Ala−
    Lys−Lys−Tyr−Leu−Glu−Ser−Leu−Met−
    NH2 〔式中ＲはＨ−His−Ala−Asp−Gly−Val−
    Phe−Thr−Ser−Asp−Phe−Ser−Lys基を示
    す。〕 で表わされるペプチド及びその塩。
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Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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PEPT:SYNTH.STRUCT FUNCT.PROC AM.PEPT.SYMP.7TH=1981 *
PROC.NATL.ACAD.SCI U.S.A=1981 *

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