JPH0160480B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規なヒトγ―インターフエロン関連
ペプチドに関する。 本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護
基、活性基、その他に関して略号で表示する場合
はIUPAC、IUBの規定或いは当該分野における
慣用記号に従うものとし、その例を次に挙げる。
またアミノ酸等に関して光学異性体がありうる場
合は、特に明記しなければＬ体を示すものとす
る。 Ser；セリン Leu；ロイシン Asn；アスパラギン Ala；アラニン Gln；グルタミン Glu；グルタミン酸 Arg；アルギニン Lys；リジン Tyr；チロシン Phe；フエニルアラニン Met；メチオニン Asp；アスパラギン酸 Gly；グリシン ONP；ｐ―ニトロフエノキシ基 Tos；ｐ―トルエンスルホニル基 Boc；第３級ブトキシカルボニル基 Bzl；ベンジル基 OBzl；ベンジルオキシ基 Cl₂―Bzl；２，６―ジクロルベンジル基 Cl―Ｚ；２―クロロベンジルオキシカルボニル
基 インターフエロンは、生体の細胞がウイルス感
染を受けた時に産生する抗ウイルス性糖蛋白質乃
至は蛋白質であり、その利用によればウイルス性
疾患の予防又は治療が可能であるとされ、近年注
目を集めつつある。現在解明されているヒトのイ
ンターフエロンは、β型インターフエロン
（Fibro blast interferon）、α型インターフエロ
ン（Leucocytes interferon，Lympho blastoid
interferon）及びγ型インターフエロン
（Immune interferon）に分類される。しかしな
がらこれらのインターフエロンを単一な糖蛋白質
乃至は蛋白質にまで精製する技術は未だ確立され
ていない。 本発明者等は、ヒトのγ型インターフエロンに
対して特異的に反応する抗体を利用すれば、抗原
―抗体反応によつてヒトγ型インターフエロンを
精製できると考え、この着想から感度よくヒトγ
型インターフエロンを選択し、該インターフエロ
ンに対して特異反応性を示す抗体を得るべく鋭意
研究を進めてきた。その過程において、ヒトγ型
インターフエロンのある特定部位のアミノ酸配列
を有するペプチドを合成し、これをハプテンとし
て抗原を合成するに成功し、該抗原からヒトγ型
インターフエロンに対して特異反応性を有する所
望の抗体が収得できることを見出した。本発明は
この新しい知見に基づき完成されたものである。 即ち本発明は一般式 Ｒ―Phe―Asn―Ser―Asn―Lys―Lys―Lys―
Arg―Asp―Asp―Phe―OH (1) 〔式中Ｒは水素原子又はＨ―Tyr基を示す。〕 で表わされるペプチド で表わされるペプチドからなる群より選ばれたヒ
トγ―インターフエロン関連ペプチドに係る。 本発明の上記一般式(1)で表わされるペプチド
は、入手容易な市販のアミノ酸を利用して、簡単
な操作で容易に合成することができる。しかも各
ペプチドは、特定のアミノ酸配列を有することに
基づいて、ハプテンとして用いることにより、認
識部位が明確な一定の抗原を大量に作成できる。
斯くして得られる抗原からは天然のγインターフ
エロンを抗原とする場合に比し、大量にしかも常
に安定して、ヒトγ型インターフエロンに対して
特異性の高い抗体を収得することができる。該抗
体はこれを例えばアフイニテイ―クロマトグラフ
イー用担体と結合させて、該クロマトグラフに利
用してヒトγ型インターフエロンの精製に用い得
る。 本発明の一般式(1)で表わされるペプチドは、通
常のペプチド合成法、具体的には「ザ ペプチド
（The Peptides）」第１巻（1966年）〔Schroder
and Luhke著、Academic press，New York，
USA〕或いは「ペプチド合成」〔泉屋ら著、丸善
株式会社（1975年）〕に記載されるごとき方法に
従つて、例えばアジド法、クロライド法、酸無水
物法、混酸無水物法、DCC法、活性エステル法
（ｐ―ニトロフエニルエステル法、Ｎ―ヒドロキ
シコハク酸イミドエステル法、シアノメチルエス
テル法等）、ウツドワード試薬Ｋを用いる方法、
カルボジイミダゾール法、酸化還元法、DCC／
アデイテイブ（HONB、HOBt、HOSu）法等に
より製造できる。上記方法においては、固相合成
法及び液相合成法のいずれをも適用できる。通常
本発明のペプチドは、上記した一般のポリペプチ
ドの合成法に従い、例えば末端アミノ酸に順次１
個づつアミノ酸を縮合させる所謂ステツプワイズ
法により、又は数個のフラグメントに分けてカツ
プリングさせていく方法により製造される。より
詳細には、例えば固相合成法を採用する場合、Ｃ
末端アミノ酸をそのカルボキシル基によつて、不
溶性担体に結合させる。不溶性担体としては、反
応性カルボキシル基と結合性を有するものであれ
ば特に限定はなく、例えばクロロメチル樹脂、ブ
ロモメチル樹脂等のハロゲノメチル樹脂やベンズ
ヒドリルアミン樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、フ
エノール樹脂、tert―アルキルオキシカルボニル
ヒドラジド化樹脂等を使用できる。 次いでアミノ保護基を除去した後、一般式(1)で
表わされるアミノ酸配列に従い順次アミノ基保護
アミノ酸を、その反応性アミノ基及び反応性カル
ボキシル基との縮合反応により結合させ、一段階
ずつ合成し、全配列を合成した後、ペプチドを不
溶性担体からはずすことにより製造される。 上記においてチロシン、グルタミン酸、アルギ
ニン、リジン、アスパラギン酸及びセリンの各ア
ミノ酸は、その側鎖官能基を保護しておくのが好
ましく、これは通常の保護基により保護され、反
応終了後該保護基は脱離される。また反応に関与
する官能基は、通常活性化される。これら各反応
方法は、公知であり、それらに用いられる試薬等
も公知のものから適宜選択される。 アミノ基の保護基としては、例えばベンジルオ
キシカルボニル、tert―ブチルオキシカルボニ
ル、tert―アミルオキシカルボニル、イソボルニ
ルオキシカルボニル、ｐ―メトキシベンジルオキ
シカルボニル、２―クロロ―ベンジルオキシカル
ボニル、アダマンチルオキシカルボニル、トリフ
ルオロアセチル、フタリル、ホルミル、ｏ―ニト
ロフエニルスルフエニル、ジフエニルホスフイノ
チオイル基等が挙げられる。 側鎖官能基の保護基としては、アスパラギン酸
及びグルタミン酸のカルボキシル基の保護基とし
て、例えばBzl、ｐ―メトキシベンジル、ｐ―ニ
トロベンジル、トリチル、メチル、エチル、tert
―ブチル基等が挙げられる。 セリンの水酸基の保護基としては、例えば
Bzl，tert―ブチル、アセチル、テトラヒドロピ
ラニル基等が挙げられる。 アルギニンのアミノ基の保護基としては、例え
ばニトロ、Tos、ベンジルオキシカルボニル基等
が挙げられる。 リジンのアミノ基の保護基としては、例えばベ
ンジルオキシカルボニル、Cl―Ｚ，Boc，Toc基
等が挙げられる。 チロシンの水酸基の保護基としては、例えば
Bzl，Cl₂―Bzl、ベンジルオキシカルボニル、ア
セチル、Tos基等が挙げられる。 カルボキシル基の活性化されたものとしては、
例えば対応する酸クロライド、酸無水物又は混合
酸無水物、アジド、活性エステル（ペンタクロロ
フエノール、ｐ―ニトロフエノール、Ｎ―ヒドロ
キシサクシンイミド、Ｎ―ヒドロキシベンズトリ
アゾール、Ｎ―ヒドロキシ―５―ノルボルネン―
２，３―ジカルボキシイミド等とのエステル）等
が挙げられる。尚ペプチド結合形成反応は、縮合
剤例えばジシクロヘキシルカルボジイミド、カル
ボジイミダゾール等のカルボジイミド試薬やテト
ラエチルピロホスフイン等の存在下に実施し得る
場合もある。 以下、本発明ペプチドの製造の一例につき反応
行程式を挙げて具体的に説明する。 （反応行程式 １〕 Ａ―Phe―OH (イ) ↓ Ａ―Phe―R¹ (ロ) ↓ Ｈ―Phe―R¹ (ハ) ↓Ａ―Asp―OH (ニ) Ａ―Asp―Phe―R¹ (ホ) ↓ ↓ ↓ Ｈ―Phe―Asn―Ser―Asn―Lys―Lys―Lys―
Arg―Asp―Asp―Phe―R¹ (ヘ) ↓Ａ―Tyr―OH (ト) Ａ―Tyr―Phe―Asn―Ser―Asn―Lys―Lys
―Lys―Arg―Asp―Asp―Phe―R¹ (チ) ↓ Ｈ―Tyr―Phe―Asn―Ser―Asn―Lys―Lys
―Lys―Arg―Asp―Asp―Phe―OH （1a） 〔式中Ａはアミノ基の保護基及びR¹は不溶性
担体を示す。〕 上記において、Ａの好ましいものとしては
Boc、ベンジルオキシカルボニル基、ｐ―メトキ
シベンジルオキシカルボニル基等を、またR¹の
好ましいものとしてはクロロメチル化ポリスチレ
ン等をそれぞれ例示することができる。 また、各反応において、使用するアミノ酸が反
応に関与しない側鎖官能基を有する場合は、常法
通り、前述した保護基により保護され、これは不
溶性担体R¹の脱離と同時に脱離される。 上記方法において、アミノ酸(イ)と不溶性担体
R¹との反応は、常法に従いアミノ酸(イ)の反応性
カルボキシル基を利用してこれをR¹と結合させ
ることによつて行なわれる。該反応は例えばクロ
ロメチル化ポリスチレンを使用する場合は適当な
溶媒中、例えばトリエチルアミン、カリウムtert
―ブトキシド、炭酸セシウム、水酸化セシウム等
の塩基性化合物の存在下に行なわれる。溶媒とし
ては例えばジメチルホルムアミド、ジメチルスル
ホキシド、ピリジン、クロロホルム、ジオキサ
ン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、Ｎ―
メチルピロリドン、ヘキサメチルリン酸トリアミ
ド等又はこれらの混合溶媒等を例示することがで
きる。上記反応は、通常０〜85℃、好ましくは25
〜80℃程度、数分〜24時間程度で終了する。アミ
ノ酸と不溶性担体との使用割合は通常後者１当量
に対して前者を過剰量、一般に１〜３倍当量とす
るのがよい。 かくして得られる一般式(ロ)の固相化アミノ酸の
保護基Ａの脱離反応は、常法により行なわれる。
該方法としては例えばパラジウム、パラジウム黒
等の触媒を用いる水素添加、液体アンモニア中金
属ナトリウムによる還元等の還元的方法、トリフ
ルオロ酢酸、塩化水素酸、弗化水素、メタンスル
ホン酸、臭化水素酸等の強酸によるアシドリシス
等を例示することができる。上記触媒を用いる水
素添加は、例えば水素圧１気圧、０〜40℃にて行
ない得る。触媒の使用量としては通常100mg〜１
ｇ程度とするのがよく、一般に１〜48時間程度で
反応は終了する。また上記アシドリシスは、無溶
媒下、通常０〜30℃程度、好ましくは０〜20℃程
度で約15分〜１時間程度を要して行なわれる。酸
の使用量は原料化合物に対し通常５〜10倍量程度
とするのがよい。該アシドリシスにおいて保護基
Ａのみを脱離する場合は、酸としてトリフルオロ
酢酸又は塩化水素酸を使用するのが好ましい。更
に上記液体アンモニア中金酸ナトリウムによる還
元は、反応液がパーマネントブルーに30秒〜10分
間程度呈色しているような量の金属ナトリウムを
用い、通常−40℃〜−70℃程度にて行ない得る。 次いで得られる一般式(ハ)の固相化アミノ酸とア
ミノ酸(ニ)（もしくはそのカルボキシル基の活性化
されたもの）との反応は、溶媒の存在下に行なわ
れる。該溶媒としては、ペプチド縮合反応に慣用
される公知の各種のもの、例えば無水ジメチルホ
ルムアミド、ジメチルスルホキシド（DMSO）、
ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、ジクロロ
メタン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、Ｎ―
メチルピロリドン、ヘキサメチルリン酸トリアミ
ド或いはこれらの混合溶媒等を例示することがで
きる。また該反応は、必要に応じて、通常のペプ
チド結合形成反応に用いられる試薬、例えばＮ，
Ｎ―ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、
Ｎ―エチル―N′―ジメチルアミノカルボジイミ
ド、１―エチル―３―ジイソプロピルアミノカル
ボジイミド、１―シクロヘキシル―３―（２―モ
ルホリニル―４―エチル）カルボジイミド等のカ
ルボジイミド類等の脱水縮合剤の存在下に行なう
ことができる。アミノ酸(ハ)とアミノ酸(ニ)との使用
割合としては、特に限定はないが、通常前者に対
して後者を等モル量〜10倍モル量、好ましくは等
モル量〜５倍モル量とするのがよい。脱水縮合剤
の使用量も特に限定はなく、通常アミノ酸(ニ)に対
して、好ましくは当モル量程度使用される。反応
温度はペプチド結合形成反応に使用される通常の
範囲、一般には約−40℃〜約60℃、好ましくは約
−20℃〜約40℃の範囲から適宜選択される。反応
時間は一般に数分〜30時間程度とされる。 かくして得られる一般式(ホ)のペプチドは、上記
と同様に保護基Ａの脱離後、一般式(1)で表わされ
るアミノ酸配列に従い、Ａ―Asp―OH，Ａ―
Arg―OH，Ａ―Lys―OH，Ａ―Lys―OH，Ａ
―Lys―OH，Ａ―Asn―OH，Ａ―Ser―OH，Ａ
―Asn―OH，Ａ―Phe―OH，Ａ―Tyr―OHの
各アミノ酸もしくはそのカルボキシ基の活性化さ
れたものと順次縮合反応させることにより行なわ
れ、斯くして一般式(チ)で表わされるペプチドに誘
導することができる。これら縮合反応及び保護基
Ａの脱離反応は、それぞれ前記した方法と同様に
して行なわれる。 また得られるペプチド(チ)は、同様にして保護基
Ａの脱離、アミノ酸の側鎖官能基の保護基の脱離
及び不溶性担体R¹の脱離により、一般式(1)中Ｒ
がＨ―Tyr基を表わすペプチド（1a）に誘導され
る。ここでアミノ酸の側鎖官能基の保護基及び不
溶性担体R¹の脱離反応は、保護基Ａの脱離反応
と同様に行ない得、この場合酸として弗化水素又
は臭化水素酸を用いるのが好ましい。 また、Ｒが水素原子を示す本発明のペプチド
は、上記反応において得られる一般式(ヘ)のペプチ
ドから、上記と同様にして、アミノ酸の側鎖官能
基の保護基及び不溶性担体R¹を脱離させること
により製造することができる。尚、上記方法にお
いて使用される各アミノ酸は、いずれも公知の市
販品でよい。 以上のようにして製造された一般式(1)の本発明
ペプチドは、反応混合物から通常のペプチドの分
離手段例えば抽出、分配、カラムクロマトグラフ
イー等により単離精製される。 かくして得られる本発明のペプチドは、これに
¹²⁵，¹³¹等の放射性物質やパーオキシダーゼ
（POX）、キモトリプシノーゲン、プロカルボキ
シペプチダーゼ、グリセロアルデヒド―３―リン
酸脱水素酵素、アミラーゼ、ホスホリラーゼ、Ｄ
―Nase、Ｐ―Nase、β―ガラクトシダーゼ、グ
ルコース―６―フオスフエートデハイドロゲナー
ゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等の各種酵素
試薬等を導入することにより、ラジオイムノアツ
セイ（RIA）法又はエンザイムイムノアツセイ
（EIA）法において用いられる標識抗原として利
用できる。上記放射性物質の導入は、通常の方法
により実施できる。例えば放射性ヨードは、クロ
ラミンＴを用いる酸化的ヨード化法〔W.M.
Hunter and F.C.Greenwood；Nature，194，
495（1962）、Biochem J.89，144，（1963）参照〕
等により行なわる。具体的には、適当な溶媒例え
ば0.2Mリン酸緩衝液（PH＝7.4）等の溶媒中、ク
ロラミンＴの存在下室温付近にて10〜30秒程度で
行なわれる。ペプチド、放射性ヨード及びクロラ
ミンＴの使用割合は、例えばチロシン当り放射性
ヨード１個を導入する場合には、ペプチド中に含
まれるチロシン分子１ナノモルに対して放射性ヨ
ードを１ミリキユーリー程度、クロラミンＴを10
〜100ナノモル程度用いるのがよく、またチロシ
ン当り放射性ヨード２個を導入する場合には、ペ
プチド中に含まれるチロシン分子１ナノモルに対
して放射性ヨードを２ミリキユーリー程度、クロ
ラミンＴを10〜100ナノモル程度用いるのがよい。
斯くして製造される放射性ヨードにより標識化さ
れたペプチドは、通常の分離手段、例えば抽出、
分配、カラムクロマトグラフイー、透析等により
単離精製される。このようにして得られるペプチ
ドは必要ならば凍結乾燥させて保存しておくこと
もできる。 酵素試薬の導入は、通常のカツプリング法例え
ばエルランガー（B.F.Erlanger）らの方法
〔Acta.Endocrinol.Suppl.，168，206（1972）〕及
びカロール（M.H.Karol）らの方法〔Proc.Natl.
Acad.Sci.，USA.，57，713（1967）〕等の公知の
方法によつて行なうことができる。すなわち、ペ
プチドと酵素をNaIO₄等の酸化剤の存在下、PH４
〜６の緩衝液、例えば1mM酢酸緩衝液（PH4.4）
中で、室温付近で２〜５時間反応させ、次いで
NaBH₄等で還元することによつて行なわれる。
酵素はペプチド１モルに対して１〜３倍モル量程
度用いられる。酸化剤はペプチドの100〜300倍モ
ル程度、還元剤は酸化剤の１〜２倍モル程度用い
られるのが好ましい。斯くして製造される酵素に
より標識化されたペプチドは、上記放射性ヨード
標識ペプチドと同様に単離精製され、保存するこ
とができる。 以下、本発明のペプチドをハプテンとして利用
した抗原の製造方法につき詳述する。 上記抗原は本発明ペプチドをハプテンとし、こ
れをハプテン―担体結合試薬の存在下に、適当な
担体と反応させることにより製造される。上記に
おいてハプテンに結合される担体としては、通常
抗原の作成に当り慣用される高分子の天然もしく
は合成の蛋白質を広く使用できる。該担体として
は例えば馬血清アルブミン、牛血清アルブミン、
ウサギ血清アルブミン、人血清アルブミン、ヒツ
ジ血清アルブミン等の動物の血清アルブミン類；
馬血清グロブリン、牛血清グロブリン、ウサギ血
清グロブリン、人血清グロブリン、ヒツジ血清グ
ロブリン等の動物の血清グロブリン類；馬チログ
ロブリン、牛チログロブリン、ウサギチログロブ
リン、人チログロブリン、ヒツジチログロブリン
等の動物のチログロブリン類；馬ヘモグロブリ
ン、牛ヘモグロブリン、ウサギヘモグロブリン、
人ヘモグロブリン、ヒツジヘモグロブリン等の動
物のヘモグロブリン類；キーホール リンペツト
ヘモシアニン（KLH）等の動物のヘモシアニ
ン類；回虫より抽出された蛋白質（アスカーリス
抽出物、特開昭56―16414号公報、J.Immun.，
111，260〜268（1973）、J.Immun.，122，302〜
308（1979）、J.Immun.，98，893〜900（1967）及
びAm.J.Physol.，199，575〜578（1960）に記載
されたもの又はこれらを更に精製したもの）；ポ
リリジン、ポリグルタミン酸、リジン―グルタミ
ン酸共重合体、リジン又はオルニチンを含む共重
合体等を挙げることができる。 ハプテン―担体結合試薬としては、通常抗原の
作成に当り慣用されているものを広く使用でき
る。具体的にはアミノ基とアミノ基とを架橋結合
させる、例えばグリオキサール、ビスジアゾタイ
ズドベンジジン（BDB）、マロンジアルデヒド、
グルタールアルデヒド、スクシンアルデヒド、ア
ジポアルデヒド等の脂肪族ジアルデヒド類；チオ
ール基とチオール基とを架橋結合させる、例えば
Ｎ，N′―ｏ―フエニレンジマレイミド、Ｎ，
N′―ｍ―フエニレンジマレイミド等のジマレイ
ミド化合物；アミノ基とチオール基とを架橋結合
させる、例えばメタマレイミドベンゾイル―Ｎ―
ヒドロキシスクシンイミドエステル、４―（マレ
イミドメチル）―シクロヘキサン―１―カルボキ
シル―N′―ヒドロキシスクシンイミドエステル
等のマレイミドカルボキシル―Ｎ―ヒドロキシス
クシンイミドエステル類；アミノ基とカルボキシ
ル基とをアミド結合させる通常のペプチド結合形
成反応に用いられる試薬、例えばＮ，N′―ジシ
クロヘキシルカルボジイミド、Ｎ―エチル―
N′―ジメチルアミノカルボジイミド、１―エチ
ル―３―ジイソプロピルアミノカルボジイミド、
１―シクロヘキシル―３―（２―モルホリニル―
４―エチル）カルボジイミド等のカルボジイミド
類等の脱水縮合剤等を挙げることができる。また
上記ハプテン―担体結合試薬としては、ｐ―ジア
ゾニウムフエニル酢酸等のジアゾニウムアリール
カルボン酸類と通常のペプチド結合形成反応試
薬、例えば上記脱水縮合剤とを組合せたものも使
用可能である。 上記抗原の製造反応は、例えば水溶液もしくは
PH７〜10の通常の緩衝液中、好ましくはPH８〜９
の緩衝液中、０〜40℃、好ましくは室温付近で行
なわれる。該反応は通常約１〜24時間、好ましく
は３〜５時間で完結する。上記において用いられ
る代表的緩衝液としては、次のものを例示でき
る。 0.2N水酸化ナトリウム―0.2Mホウ酸―0.2M塩
化カリウム緩衝液、 0.2M炭酸ナトリウム―0.2Mホウ酸―0.2M塩化
カリウム緩衝液、 0.05M四ホウ酸ナトリウム―0.2Mホウ酸―
0.05M塩化ナトリウム緩衝液、 0.1Mリン酸二水素カリウム―0.05M四ホウ酸
ナトリウム緩衝液 上記においてハプテン、ハプテン―担体結合試
薬及び担体の使用割合は、適宜に決定できるが、
通常ハプテンに対して担体を２〜６倍重量程度、
好ましくは３〜５倍重量程度、及びハプテン―担
体結合試薬を５〜10倍モル程度用いるのがよい。
上記反応によりハプテン―担体結合試薬を仲介さ
せて担体とハプテンとが結合したペプチド―担体
複合体からなるヒトγ型インターフエロン抗原が
収得される。 反応終了後得られる抗原は常法に従い、例えば
透析法、ゲル過法、分別沈澱法等により容易に
単離精製できる。 斯くして得られる抗原は、通常蛋白質１モルに
対してペプチドが平均５〜20モル結合したもので
あり、いずれも引き続き該抗原に対して特異性の
高い抗体の製造を可能とするものである。 該抗原による抗体の製造は、上記抗原を哺乳動
物に投与し、生体内に所望抗体を産生させ、これ
を採取することにより実施される。 抗体の製造に供せられる哺乳動物としては、特
に制限はないが、通常ウサギやモルモツトを用い
るのが好ましい。抗体の産生に当つては、上記に
より得られる抗原の所定量を生理食塩水で適当濃
度に希釈し、フロインドの補助液（Complete
Freund′s Ajuvant）と混合して懸濁液を調整し、
これを哺乳動物体に投与すればよい。例えばウサ
ギに上記懸濁液を皮内注射（抗原の量として0.5
〜５mg／回）し、以後２週間毎に２〜10ケ月、好
ましくは４〜６ケ月間投与し免疫化させればよ
い。抗体の採取は、上記懸濁液の最終投与の１〜
２週間経過後、免疫化された動物から採血し、こ
れを遠心分離後、血清を分離することにより行な
われる。上記によれば、用いる抗原に対して優れ
た特異性を有する抗体を収得でき、これはRIA
法、EIA法等に利用してヒトγ型インターフエロ
ンの定量に用い得る。 以下本発明を更に詳しく説明するため、一般式
(1)で表わされる本発明ペプチドの製造例及びこれ
により得られるペプチドからの抗原及び抗体の製
造例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。 尚、各製造例におけるRf値はシリカゲル上の
薄層クロマトグラフイーにて下記混合溶媒を用い
て測定したものである。 Rf¹…ｎ―ブタノール―酢酸―水（４：１：
５） Rf²…ｎ―ブタノール―酢酸―ピリジン―水 （15：３：10：12） ＜ペプチドの製造＞ 製造例 １ カリウムtert―ブトキシド12.4ミリ当量の
DMSO溶液35mlにBoc―Phe―OH3.65ｇを溶
解し、クロロメチル化ポリスチレン樹脂（1.32
ミリ当量／ｇ樹脂、財団法人蛋白質研究奨励
会）５ｇを加えて、80℃で30分反応させる。樹
脂をDMSO、50％酢酸／クロロホルム、塩化
メチレンの順に、充分に洗浄し、減圧乾燥して
Boc―Phe―樹脂6.04ｇを得る。一部を加水分
解後アミノ酸分析を行なつた結果、アミノ酸
0.17ミリモル／ｇ樹脂であつた。 上記で得たBoc―Phe―樹脂5.88ｇをクロ
ロホルム30mlで３回洗浄後、50％トリフルオロ
酢酸（TFA）のクロロホルム溶液30mlに加え、
室温で20分間反応させる。樹脂をクロロホルム
30mlで１回、塩化メチレン30mlで５回、10％ト
リエチルアミンの塩化メチレン溶液30mlで３
回、次いで塩化メチレン30mlで６回それぞれ洗
浄してＨ―Phe―樹脂を得る。 Boc―Asp（OBzl）―OHの0.81ｇを塩化メチ
レンに溶かした溶液25mlに上記Ｈ―Phe―樹脂
を加え、次いでDCCの0.51ｇを塩化メチレンに
溶かした溶液５mlを加え、室温で２時間反応さ
せる。樹脂を塩化メチレン30mlで６回洗浄後、
Boc―Asp（OBzl）―OHの0.81ｇ及び１―ヒド
ロキシベンゾトリアゾール（HOBt）0.34ｇの
塩化メチレン溶液25mlに加え、次いでDCCの
0.51ｇを塩化メチレンに溶かした溶液５mlを加
えて再度同様に反応させる（二重カツプリング
法）。樹脂を塩化メチレンで充分に洗浄して
Boc―Asp（OBzl）―Phe―樹脂を得る。 上記と同様にして、Boc―Asp（OBzl）―
Phe―樹脂の脱Boc化を行ない、次いで下記ア
ミノ酸を順次縮合及び脱Boc反応に付す。 Boc―Asp（OBzl）―OH 0.81ｇ Boc―Arg（Tos）―OH 1.11ｇ Boc―Lys（Cl―Ｚ）―OH 1.04ｇを３回繰返す Boc―Asn―ONP 0.88ｇ及び HOBt 0.34ｇ Boc―Ser（Bzl）―OH 0.74ｇ Boc―Asn―ONP 0.88ｇ及び HOBt 0.34ｇ Boc―Phe―OH 0.66ｇ 斯くしてＨ―Phe―Asn―Ser（Bzl）―Asn―
Lys（Cl―Ｚ）―Lys（Cl―Ｚ）―Lys（Cl―Ｚ）―
Arg（Tos）―Asp（OBzl）―Asp（OBzl）―Phe
―樹脂の7.79ｇを得る。このうち3.75ｇをアニソ
ール４ml及び弗化水素40mlに溶かし、−20℃で30
分、次いで０℃で30分反応させた後、弗化水素を
留去し、残渣を乾燥後、10％酢酸にて抽出し、エ
ーテルにて洗浄後、凍結乾燥する。次いでセフア
デツクスＧ―10（フアルマシア社、溶出液10％酢
酸）によるゲル過、次いでLH―20（フアルマ
シア社、溶出液、１／1000N―HCl）にて精製し
て、Ｈ―Phe―Asn―Ser―Asn―Lys―Lys―Lys
―Arg―Asp―Asp―Phe―OHの350mgを得る。
以下このペプチドを「ペプチドＡ」と呼ぶ。 Rf値： Rf¹＝0.01 Rf²＝0.35 元素分析値： （C₈₁H₉₃N₁₉O₁₈・8H₂O・5CH₃COOHとして） Ｃ(%) Ｈ(%) Ｎ(%) 理論値 46.73 7.13 14.58 分析値 46.48 7.40 14.46 製造例 ２ 前記製造例１で得たＨ―Phe―Asn―Ser（Bzl）
―Asn―Lys（Cl―Ｚ）―Lys（Cl―Ｚ）―Lys（Cl
―Ｚ）―Arg（Tos）―Asp（OBzl）―Asp（OBzl）
―Phe―樹脂4.04ｇにBoc―Tyr（Cl₂―Bzl）―
OH1.06ｇを前記製造例１―と同様にして反応
させ、次いで１―と同様にして脱保護基及び脱
樹脂反応を行ない、同様に精製して、Ｈ―Tyr―
Phe―Asn―Ser―Asn―Lys―Lys―Lys―Arg―
Asp―Asp―Phe―OH〔以下「ペプチドＢ」と呼
ぶ〕258mgを得る。 Rf値： Rf¹＝0.01 Rf²＝0.36 元素分析値： （C₇₀H₁₀₂N₂₀O₂₀・10H₂O・5CH₃COOHとし
て） Ｃ(%) Ｈ(%) Ｎ(%) 理論値 47.47 7.07 13.84 分析値 47.20 7.30 13.92 ＜抗原の製造＞ 製造例 １ ペプチドの製造例２で得たペプチドＢの5.55mg
及び牛血清アルブミン（BSA）の10.23mgを
0.16M ホウ酸塩緩衝液（0.13M NaCl、PH＝
9.0）２mlに溶かす。この溶液に、BDBの1.64mg
の同緩衝液3.0mlを加え、４℃にて５時間撹拌す
る。その後反応混合物を水１で透析し、透析中
水を５回交換する。その後ペプチド―蛋白複合体
を含む溶液を凍結乾燥してヒトγ型―インターフ
エロン抗原17.27mgを得る。以下この抗原を「抗
原」と言う。 抗原はBSA1モルに対してペプチドＢが平均
８モル結合したものである。尚このペプチドＢと
BSAとの結合率は、得られる抗原を更にセフ
アデツクスＧ―50（溶出液：生理食塩水、検出：
OD 280nm、流出速度：３ml／時間、分取量：１
mlづつ）でゲル過した際、未反応のBSA及び
ペプチドＢの存在は認められないことより、該ゲ
ル過によつてBSAに結合したペプチドＢのフ
ラクシヨンと他の生成体（ペプチドＢの２量体）
のフラクシヨンとを分離し、ペプチド２量体の標
準濃度の検量線を作成して、上記２量体の量を求
め、これを出発原料として用いたペプチドＢの量
から差し引いた値がすべてBSAに結合している
として求めたものである。以下の抗原の製造例に
おいても同様とする。 製造例 ４ 前記抗原の製造例１において、ペプチドＢの代
りにペプチドＡを用いて、同様にして目的抗原を
得る。 ＜抗体の製造＞ 製造例 １ 抗原の製造例１で得た抗原の30μｇを1.5mlの
生理食塩水に溶解後、これにフロインドの補助液
1.5mlを加えて調整した懸濁液を、それぞれ７羽
のウサギ（New―Zealand white rabbits）（2.5
〜3.0Kg）に皮下投与し、２週間毎に６回同量を
投与する。更にその後１ケ月毎に３回、最初に投
与した量と同量を投与する。最終投与後７日経過
してのち試験動物から採血し、遠心分離して抗血
清をそれぞれ採取して、ヒトγ型インターフエロ
ン抗体（以下「抗体〜」と夫々呼ぶ）を得
る。 製造例 ２ 上記製造例１に於いて、10羽のウサギに抗原
のそれぞれ60μｇを使用する以外は同様の操作に
より、ヒトγ型インターフエロン抗体（抗体〜
）を夫々得る。 ＜標識ペプチドの製造＞ ペプチドの製造例２で得たペプチドＢをクロラ
ミンＴを用いる方法で以下の通り標識化する。 即ち上記ペプチド5μｇの0.5モルリン酸塩緩衝
液（PH7.5）10μにNa〔¹²⁵〕（carrier free N.
E.N.）１ミリキユーリーの0.5モルリン酸塩緩衝
液20μを加え、つぎにクロラミンT60μの0.5
モルリン酸塩緩衝液20μを加える。室温で25秒
間撹拌して150μｇのメタ重亜硫酸ナトリウム
（Na₂S₂O₅）の0.5Mリン酸塩緩衝液20μを加え
ることで反応を終わらせる。次いで反応液に１％
の冷沃化ナトリウム水溶液100μを加え、反応
混合物を高速液体クロマトグラフイー〔10〜40％
エタノール gradient／0.1MトリスHcl緩衝液
（PH8.0）1.0ml／min、逆相クロマト〕にて精製し
て、¹²⁵で標識されたペプチドＢを得る。該標識
ペプチドの放射活性は1128μCi／μｇであつた。 Γ 力価の測定 上記で得られる抗体の力価を次の通り測定す
る。即ち抗体をそれぞれ生理食塩水で10，10²，
10³，10⁴，10⁵……倍に希釈（イニシヤル）し、
これらのそれぞれ100μに、¹²⁵標識ペプチド
（上記で得られる標識ペプチドを約9500cpmにな
るように希釈したもの）0.1ml及び0.05モルリン
酸塩緩衝液（PH＝7.4）〔0.25％BSA、10m
MEDTA及び0.02％NaN₃を含む〕0.2mlを加え、
４℃で24時間インキユベートし、生成した抗体と
¹²⁵標識抗原との結合体を、デキストラン―活
性炭法及び遠心分離法（４℃、30分間、
3000rpm）により未反応（結合しない）¹²⁵標
識ペプチドから分離し、その放射線をカウント
し、各希釈濃度における抗体の¹²⁵標識ペプチ
ドとの結合率（％）を測定する。縦軸に抗体の
¹²⁵標識ペプチドとの結合率（％）及び横軸に抗
体の希釈倍率（イニシヤル濃度）をとり、各々の
濃度において結合率をプロツトする。結合率が50
％となる抗体の希釈倍率即ち抗体の力価を求め
る。抗体〜について得られた結果を下記第
１表に示す。 【表】 【表】 本発明に従い得られた抗体は、いずれもヒトγ
型インターフエロンに対して特異性よく反応す
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式 Ｒ―Phe―Asn―Ser―Asn―Lys―Lys―Lys―
   Arg―Asp―Asp―Phe―OH 〔式中Ｒは水素原子又はＨ―Thr基を示す。〕 で表されるヒトγ―インターフエロン関連ペプチ
   ド。