JPH0387196A - 新規生理活性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は新規生理活性ポリペブポリペプチド、該ポリペ
プチドをコードするＤＮＡ領域を含む絹換えプラスミド
、該プラスミドによって形質転換された組換え微生物細
胞及び該微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチド
の製造方法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有す
る新規ポリペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチ
ドと略すこともある）、該ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ領域を含む絹換えプラスミド、該プラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物細胞及び該微生物細胞を
用いた新規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法に関する
。

本明細窩において、アミノ酸、ポリペプチドはＩＵＰＡ
（、−ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用された方法
により略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる
。

ＡＩａＬ−アラニン ＡｒｏＬ−アルギニン ＡＳｎＬ−アスパラギン ＡＳｐ　Ｌ−アスパラギン酸 Ｃｙｓ　　ｌ−−システィン Ｇｌｎ　　Ｌ−グルタミン ＧｌｕＬ−グルタミン酸 Ｇｌｌ／　　グリシン １−＋１ｓＬ−ヒスデシン ■１ｅｌ−−イソロイシン ＬＯＵＬ−ロイシン ＬＶＳＬ−リジン Ｍｅｔ　　Ｌ−メチオニン ＰｈｅＬ−フェニルアラニン ｐｒｏｌ−−プロリン ３ｅｒｌ−−セリン Ｔｈｒｌ−−スレオニン ＴｒｐＬ−ｔ−リプ１〜フアン Ｔｙｒ　Ｌ−ヂロシン Ｖａｔ　　Ｌ−バリン また、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオポリペプチドに含まれる［の種類で略記するもの
とし、たとえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。〉Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　アミノ　（デオキシチミ
ジル酸を示す。）さらに、（ｔ１２Ｎ）−及び−（ＣＯ
０１１）はそれぞれアミノ酸配列のアミノ末端側及びカ
ルボキシ末端側を示すものであり、（５′〉−及び（３
′）はそれぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び３′末端側
を示づものである。

〈発明の背景〉 ＣａｒＳＷｅｌｌ　らは、３ａＣｉｌｌｕＳ　　Ｃａｌ
ｍｅｔｔｅ　−Ｑｕｅｒ＋ｎ　　（ＢＣＧ）などで前も
って刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与した後
に採取した血清中に、移植したＭｅｔｈＡ肉腫による癌
を出血壊死させる物質が含まれていることを見出し、こ
の物質を腫瘍壊死因子（Ｔ　ｕｍｏｒ　　Ｎ　ｅｃｒｏ
ｓｉｓＦａｃｔｏｒ　、以下ＴＮＦと略記することもあ
る）と名づ（）た［Ｅ、　Ａ、　Ｃａｒｓｗｅｌｌ　ら
、　ｐ　ｒｏｃＪＪ　ａｔｌ。

八ｃａｄ、Ｓ　ｃｉ、、Ｕ　Ｓ　Ａ　、　７２．３６６
６　（１９７５）　］　、このＴＮＦはマウス、ウサギ
、ヒト等多くの動物中に見られ、腫瘍細胞に特異的に、
しかも種を越えて働くことから、制癌剤としての利用が
期待されてぎた。

最近になッテ、Ｐｅｎｎ１Ｃａらは、ヒｌ−Ｔ　Ｎ　Ｆ
のＣＤＮＡクローニングを行ない、ヒｌ−Ｔ　Ｎ　Ｆ蛋
白質の一次ＩＮ４造を明らかにすると共に、大腸菌にお
（ブるヒトＴＮＦ蛋白質の発現について報告した［　Ｄ
　、　　Ｐ　ｅｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　　、
　　３１２．　　７２４（１９８４）　］　。その後、
自封ら［Ｔ、　５ｈｉｒａｉら。

Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１３．　８０３（１９８５）　
］　、宗利ら［定判ら、癌と化学療法、　１２．　１６
０（１９８５）　］　、Ｗａｎ（１ら［Ａ、　Ｍ、　Ｗ
ａｎｃ＋ら、　３　ｃｉｃｎｃｅ、　　２２８．　１４
９（１９８５）　　］及びＭ　ａｒｍｅｎｏｕｔら［Ａ
　、　　Ｍ　ａｒｍｅｎｏｕｔら。

Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１５２．　５１
５（１９８５）　］が、ヒ１〜ＴＮＦｌ伝子の大腸菌に
お（プる発現について相ついで報告している。

このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトＴＮＦ蛋白質が多量に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの右する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引ぎ起こす原因の一つであるカケクヂ
ンがＴＮＦに非常に類似しており［１３、３ｅｕｌｔｅ
ｒら、　Ｎａｔｕｒｅ　。

３１６、　５５２　（１９８５）　］　、カケクヂンが
リボプロティン・リパーゼ阻害活性を有づることから、
ＴＮ「の投与により血中の１〜リグリセリド量が増大し
、その結果として高脂血症のような副作用を引き起こす
可能性のあることが示唆された。また、それ以外にも、
血管内皮細胞への影響［Ｊ、Ｒ。

Ｇａｍｂｌｅら、Ｊ、　　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　、　　
１６２．２１６３（１９８５）　］　、骨吸収作用ＦＤ
、　Ｒ，Ｂｅ１ｔｏｌｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ　、　　
３１９．　５１６（１９８６）　］等が報告されている
。

方、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意の
アミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、ま
たは欠失させることを可能にした。

このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数
多く威されている。

ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についてもいくつかの研究が成
されており、第１図記載のヒトＴＮＦ蛋白質のアミノ酸
配列において、Ｃｖｓｌｆ及びＣｙＳ／′／のいずれか
又は両方の他のアミノ酸残基への置換（ＰＣＴ出願公開
Ｗ　０８６／　０４６０６号、特願昭６１１０６７７２
）　、Ｇ　ＩＶ”’の他のアミノ酸残基への置換（特願
昭６１−１０６７７２号、特願昭６１−２３８０４８号
）。

Ａｌａ１８の他のアミノ酸残基への置換（特願昭６１２
３３３３７号）が報告されている。また、アミノ末端側
のアミノ酸残基の欠失についても、６アミノ酸欠失ＴＮ
Ｆが細胞障害活性を有していること（特開昭６１−５０
９２３号）、７アミノ酸欠失−「Ｎ１：が細胞障害活性
を有していること（特願昭６１−９００８７号）、１〜
１０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有しており、
その比活性は６〜８アミノ酸欠失ＴＮＦにおいて極大に
なること（Ｐ　ＣＴ出願公開ＷＯ３６／　０２３８１号
〉、１０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有してい
ること〈特願昭６１−１１４７５４号〉、及び１１アミ
ノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有していること（特願
昭６１−１７３８２２号〉が報告されている。

そこで、本発明者らは比活性の向上、安定性の向上９反
応スペクトルの広域化、副作用の低減化等を目的として
、ヒトＴＮＦ蛋白質の改変について鋭意研究を行ない、
本発明を完成するに至った。

〈発明の目的〉 本発明の目的は、新規抗１１１ｉ瘍活性ポリペブポリペ
プチドを提供づることにある。

本発明の他の目的は、新装抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを提供する
ことにある。

本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された相換え微うＬ物及びぞの組換え微生物
細胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方
法を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

〈発明の構成〉 本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、次の
アミノ酸配列 （Ｈ２Ｎ）　−Ｐｒｏ−８ｅｒ−ＡＳＩＩ−ＬｙｓＰ　
ｒｏ　−Ｖ　ａｌ　−Ａ　ｌａ−口１ｓ−Ｖ　ａｌ　−
Ｖ　ａｔ　−Ａ　ｌａＡ　ｓｎ　−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　Ｉｎ
　−Ａ　Ｉａ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ＩｎＬ
　ｅｕ−Ｇ　１ｎ−Ｔ　ｒｐ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　５ｎ−Ａ
　ｒＯ−Ａ　ｒ。

Ａ　Ｉａ−Ａｓｎ　−Ａ　１ａ−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ
−Ａ　１ａ−ＡｓｎＧ　１ｙ−Ｖ　ａｌ　−Ｇ　Ｉｕ　
−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｒｏ　−Ａ　５ｎ−Ａ　５ｎＳｅｒ
・−Ｌ　ｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｔ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ｇｌ
ｕ　−Ｇ　ｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌ　ｅｕ　−Ｉ　　
１ｅ−Ｔｙｒ−３ｅｒＧ　１ｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈ
ｅ−Ｌ’／Ｓ−Ｇ　＋ｙ−Ｇ　ＩｎＧ　ｍｙ　−ＣＶｓ
　−Ｐ　ｒｏ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｔ　ｈｒ−口１ｓ−Ｖａ
Ｌｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｔｈｒ　−ｌ−１ｉｓ　−Ｔｈ
ｒ　−Ｉ　　ｌｅ　−５ｅｒＡ　ｒＱ−Ｉ　　Ｉｅ−Ａ
　ｌａ−Ｖａｌ−３ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇ　ＩｎＴ　ｈｒ−
Ｌ　ｖＳ−Ｖ　ａｌ−八５ｎ−ｌ−ｅｕ　−１−ｃｕ−
３ｃｒＡ　ｌａ−１１ｅ−１ｙｓ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃ
ＶＳ−Ｇ　ＩｎＡ　ｒｏ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｔ　ｈｒ　−
Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｙ−八１ａＧ　Ｉｕ−
Ａ　ｌａ−Ｌ　ｙｓ−Ｐ　ｒｏ−Ｔ　ｒｐ−Ｔ　ｙｒ−
Ｇ　ｌｕＰ　ｒｏ−Ｉ　　Ｉｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇ　
ｌｙ−Ｇ　ｌｙ−ＶａＰ　ｈｅ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ
−Ｇ　Ｉｕ　−Ｌ　Ｖｓ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　５ｐＡｒ
ｏ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ａ　１ａ−Ｇ　ｌｕ　−Ｉ　　１
ｅ−ＡｓｎＡ　ｒｑ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−’Ｔｙｒ−Ｌｅ
ｕ−Ａｓｐ−ＰｈｅＡ　Ｉａ−Ｇ　ＩＵ−５ｅｒ−Ｇ　
Ｉｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａｌ−ＴｙｒＰ　ｈｅ　−Ｇ　ｌｙ
　−Ｉ　Ｉｅ−Ｉ　ｌｅ−八１ａ−ｐｈｅ（Ｃｏ○１１
〉 で表わされる新規抗腫瘍活性ポリペプチドまたはそのア
ミノ末端にＭｅｔが結合したポリペプチドを包含リ−る
。また上記新規抗腫瘍活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合したポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ領域を含む組換えプラスミドを包含する。

組換えプラスミドとして下記の塩基配列（５’　）−Ｃ
ＣＧＡＧＴＧＡＣ ＡＡＧＣＣＴＧＴＡＧＣＣＣＡＴＧＴＴＧＴＡ　Ｇ　Ｃ
Ａ　Ａ　Ａ　ＣＣＣ−ｒ　ＣＡ　Ａ　Ｇ　ＣＴ　Ｇ　Ａ
　Ｇ　ＧＧ　Ｇ　ＣＡ　Ｇ　ＣＴ’　ＣＣＡ　Ｇ　Ｔ　
Ｇ　Ｇ　ＣＴ　ＧへＡＣＣＧ　ＣＣＧ　Ｇ　Ｇ　ＣＣＡ
　Ａ　”ｒ　Ｇ　ＣＣＣＴ　Ｇ　ＣＴＧＧＣＣ八ＡＴＧ
へＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＡＡＡＣＡＡＣＴＣＡＣＴ
ＧＧＴＧＧＴ八ＣＣへＡ　Ｔ　ＣＡ　Ｇ　Ａ　Ｇ　Ｇ　
Ｇ　ＣＣＴ　Ｇ　Ｔ’ΔＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＴＣＣＣ
ＡＧＧＴＣＣＴＣＴＴＣＡＡＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＴＧ
ＣＣＣＧＴＣＧＡＣＣＣＡＴＧＴＧＣＴＣＣＴＣＡＣＣ
ＣＡＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＧＣＡＴＣＧＣＣＧ　Ｔ　
ＣＴ　ＣＣＴ　Ａ　ＣＣへＧＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡＡＣ
ＣＴＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＡＴＣＡＡＧＡＧＣＣＣＣＴ
ＧＣＣＡＧＡＧＧＧＡＧＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＧＣ
ＴＧＡＧＧ　ＣＣＡ　Ａ　Ｇ　ＣＣＡ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ｔ
へＴＧＡＧＣＣＣＡ　Ｔ　ＣＴ　Ａ　Ｔ　ＣＴ　Ｇ　Ｇ
　ＧＡ　Ｇ　Ｇ　ＧＧ　Ｔ　ＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＧＡ
ＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＣＧＡＣＴＣＡＧＣＧＣＴＧ八Ａ
ＡＴＣＡＡＴＣＧＧＣＣＣＧＡＣＴＡＴＣＴＣＧＡＣＴ
Ｔ　Ｔ　Ｇ　へ　ＣＧ　Ａ　Ｇ　Ｔ　ＣＴ　Ｇ　Ｇ　Ｇ
　ＣＡ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　ＣＴＡＣＴＴＴＧＧＧＡＴＴＡＴ
ＴＧＣＣＴＴＣ−（３’） で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
Ａとから戒る二本鎖ＤＮＡを含むプラスミドが挙げられ
る。

あるいは次の塩基配列 （５’）−ＣへＴＣＡＴＡＡＣＧＧ ＴＴＣＴＧＧＣＡＡＡＴＡＴＴＣＴＧＡＡＡＴＧへＧＣ
ＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＡＡＣＴへＧ
ＴＴＡＡＣＴＡＧＴＡＣＧＣＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＡＡ
ＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＴＡＴＧＣＣＧＡＧＴＧＡＣ
へＡ　Ｇ　ＣＣＴ　Ｇ　Ｔ　Ａ　Ｇ　ＣＣＣＡ　Ｔ　Ｇ
　Ｔ　Ｔ　Ｇ　−ｒへＧＣＡＡＡＣＣＣＴＣＡＡＧＣＴ
ＧＡＧＧＧ　Ｇ　ＣＡ　Ｇ　ＣＴ　ＣＣＡ　Ｇ　Ｔ　Ｇ
　Ｇ　ＣＴ　Ｇ　Ａ　Ａ　ＣＣＧＣＣＧＧＧＣＣＡ八Ｔ
ＧＣＣＣＴＧＣＴへＧＣＣＡＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＣ
ＴＧＡＧＡＡＡＣＡＡＣＴＣＡＣＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣ
ＡＴＣＡＧＡＧＧＧＣＣＴＧＴＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣ
ＴＣＣＣＡＧＧＴＣＣＴＣＴＴＣＡＡＧＧＧＣＣＡＡＧ
ＧＣＴＧＣＣＣＧＴＣＧＡＣＣＣＡＴＧＴＧＣＴＣＣＴ
ＣＡＣＣＣＡＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＧＣＡＴＣＧＣＣ
ＧＴＣＴＣＣＴＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡＡＣＣ
ＴＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＡＴＣＡＡＧＡＧＣＣＣＣＴＧ
ＣＣＡＧへＧＧＧＡＧＡＣＣＣＣへＧＡＧＧＧＧＧＣＴ
ＧＡＧＧＣＣＡＡＧＣＣＡＴＧＧＴＡＴＧＡＧＣＣＣＡ
ＴＣＴＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＴＴＣＣＡＧＣＴ
ＧＧＡＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＣＧＡＣＴＣＡＧＣＧＣＴ
ＧＡＡＡＴＣＡ八ＴＣＧＧＣＣＣＧＡＣＴＡＴＣＴＣＧ
ＡＣＴＴＴＧＣＣＧＡＧＴＣＴＧＧＧＣＡＧＧＴＣＴＡ
ＣＴＴＴＧＧＧＡＴＴＡＴＴＧＣＣＴＴＣＴＧΔＴＡＡ
ＧＣＴＴ−（３’　　）で表わされる一本鎖ＤＮＡとそ
れに相補的な一本鎖ＤＮＡとから成る二本鎖ＤＮＡを含
むプラスミドが挙げられる。

更に具体的にはプラスミドｐＴＮＦ６４１が挙げられる
。

本発明は上記新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
れた組換え微生物細胞を包含する。ここで微生物細胞が
エシェリヒア・］す（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏ
ｌｉ）であることが好適である。

本発明は上記新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
れた組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理活
性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物から
新規生理活性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた
培養物から新規生理活性ポリペプチドの製造方法を包含
する。

本発明は抗腫瘍に有効な量の上記新規生理活性ポリペプ
チドまたはそのアミノ末端にＭｅｔが結合しているポリ
ペプチドを含有する医薬組成物を包含する。

以下本発明について更に詳細に説明する。

（Ａ）ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化；ヒトＴＮＦ３１
１子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノ酸［Ｄ　、
　Ｐ　ｅｎｎｉｃａら、前出１を指定するいくつかのコ
ドンの中から適当なものを選び、それを化学合成するこ
とによって取得できる。ヒトＴＮＦ遺伝子の設計に際し
ては、用いる宿主細胞に最も適したコドンを選択するこ
とが望ましく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に
行なえるように適当な位置に適当な制限ｖｆ素による切
断部位を設けることが望ましい。

また、ヒトＴＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コドン（ＡＴＧ）を有することが好ましく、その下流方
向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コド
ン（ＴＧＡ。

Ｔ、ＡＧまたはＴＡＡ）を右することが好ましい。

上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。

さらに、このヒトＴＮＦＩ伝子は、その上流及び下流に
作用する制限酵素の切断部位を用いることにより、適当
なベクタへのクローン化が可能になる。このようなヒト
ＴＮＦ遺伝子の塩基配列の例を、第１図に示した。

上記のように設計したヒトＴＮＦ３１１伝子の取得は、
上側の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第２
図に示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて
、それらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連
結する方法をどろのが望ましい。各オリゴヌクレオチド
の合成法としてはジエステル法［１−１，Ｇ、　Ｋｈｏ
ｒａｎａ。

“Ｓｏｍｅ　　Ｒｅｃｅｎｔ　　［）　ｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔｓ　　ｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　　ｏｆ　　ｐ　
ｈｏｓｐｈａｔｅ　　Ｅ　５ｔｅｒｓ　　ｏｆ３　ｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ　　　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”、　Ｊｏｈｎ
　　Ｗｉｌｅｙａｎｄ　　３ｏｎｓ　、　　Ｉｎｃ、、
Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９６１）　］。

トリエステル法［Ｒ，Ｌ、　Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ
Ａ　ｍ、　　Ｃｈｅｍ、　　Ｓ　ｏｃ、、８９．４８０
１　（１９６７）　］及びホスファイト法［Ｍ、　Ｄ、
　Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔ、、　２１．　７
１９（１９８０）　］があるが、合成時間、収率、操作
の簡便さ等の点から、全自動ＤＮＡ合戊合金機いたホス
ファイト法による合成が好ましい。合成したオリゴヌク
レオチドの精製は、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル電気泳動、逆相カラムによる高速液体クロ
マトグラフィー等を、適宜単独もしくは組合せて用いる
ことができる。

こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水酸基を、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさ仕、たとえば
Ｔ４−ＤＮＡリガゼを用いて連結する。合成オリゴヌク
レオチドを連結してヒトＴＮＦ遺伝子を作成する方法と
しては、合成オリゴヌクレオチドをいくつかのブロック
に分けて連結し、たとえばｐＢＲ３２２［Ｆ　、　　Ｂ
　ｏｌｉｖａｒら、　　Ｑｅｎｅ　、　　２．　９５＜
１９７７）　］のＪ：うなベクターに−度クローン化し
た後、それらの各ブロックのＤＮＡ断片を連結する方法
が好ましい。このようなヒ１〜ＴＮＦ遺伝子を構成する
ブロックのＤＮＡ断片を含むプラスミドとして、好まし
くはｐＴＮＦＩＢＲ。

ｐＴＮＦ２ＮまたはｐＴＮＦ３が用いられる。

」−記のようにしてり］１−ン化したヒ１〜ＴＮＩ−遺
伝子を構成する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した後、
適当なブＤ　’Ｅ−ター、　ＳＤ　（シトイン・ダルガ
ーノ）配列の下流につなぐことにより、発現型遺伝子と
することができる。使用可能なプロモーターとして、１
−リプトファン・オペロン・プロモーター（ｔｒｐプロ
モーター）。

ラクトース・オペロン・プロモーター（ｌａｃプロモー
ター）　、　ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、
　ｌｐｐプロモーター等があげられるが、とりわけｔｒ
ｐプロモーターが好適である。ｔｒｐプロモーターを有
するプラスミドとして、好ましくはＩＩＹ　Ｓ　３１Ｎ
　、又はＩ）Ａ　Ａ　１１１が用いられる。

さらに、発現効率向上を目的として、ヒｌ−Ｔ　Ｎ「遺
伝子下流に大腸菌で効率良く機能するターミネータ−を
付与することができる。このようなターミネータ−とし
て、１ｐｐターミネータ−ｔｒｐ八タへミネータ−等が
あげられるが、とりわけｔｒｐ　Ａターミネータ−が好
適であり、ｔｒｐＡターミネータ−を右するプラスミド
としで、好ましくは１１Ａ　Ａ　４１が用いられる。こ
の発現型ヒトＴＮＦｍ転子を、たとえば１）ＢＲ３２２
由来のベクターにクローン化することにより、発現型プ
ラスミドが作成できる。ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラス
ミドとして、好ましくはｐＴＮＦ４０１ＮＮ又は１１Ｔ
ＮＦ　４０１Ａが用いられる。

（Ｂ）新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のクローン化
； こうして得られたヒトＴＮＦＷ信子発現型プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、ヒトＴＮＦ３ｉ伝子内の特定
な領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリ
ゴヌクレオポリペプチドを用いた遺伝子の修復を行なう
。かかる手法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中
の任意のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加し
たり、または欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチ
ドをコードする遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が
可能になる。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺
伝子発現型プラスミドとして、好ましくはｐ”ｒＮＦ　
４１６．　１）ＴＮ　Ｕ４１６八又は１）ＴＮ「４９５
が用いられる。

（Ｃ）発現確認及び活性評価； ヒ］〜ＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド道
伝子を発現さけるための微生物宿主どしては、大腸菌、
枯草菌、酵母等があげられるが、とりわけ大腸菌［エシ
ェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ
）　］が好ましい。前記ヒトＴＮＦＩ信子発現型プラス
ミド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラ
スミドは、たとえば公知の方法［Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒｇ
ａｒｄら。

Ｇｅｎｅ　、　３．　２７９（１９７８）　］を用いて
、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリＣ６００ｒ
−ｍａ　（ＡＴＣＣ３３５２５）に導入することができ
る。

このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地とじては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むＭ９培地［Ｔ　、　Ｍ　ａｎ
ｉａｔｉｓら編、　　”　ｌｙｌ　０１ｅｃｕｌａｒＣ
ｌｏｎｉｒ＋ｇ”　、　Ｐ　４４０．　Ｃｏ１ｄ　　５
ｐｒｉｎｑｌ−１ａｒｂｏｒ　　ＬａｂＯｒａｔＯｒＶ
　、　ＮｅＷ　　Ｙｏｒｋ　　（１９８２）参照］があ
げられ、必要に応じて、たとえばアンピシリン等を添加
するのが望ましい。１８養は目的の組換え微生物に適し
た条件、たとえば振とうによる通気、撹拌を加えながら
、３７℃で２〜３６時間行なう。また、培養開始時また
は培養中に、プロモーターを効率良く機能させる目的で
、３−β−インドールアクリル酸等の薬剤を加えること
もできる。

培養後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集
め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離に
より組換え微生物細胞のライゼートを得る。得られたラ
イゼート中の張白質を、ラウリル硫酸ナトリウム（以下
、ＳＯ３と略すこともある）を含むポリアクリルアミド
ゲルを用いた電気泳動にｊ：つて分離し、ゲル中の蛍白
質を適当な方法を用いて染色づる。

発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを比較づることにより、ヒトＴ
ＮＦＩ伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の
発現を確認する。

このようにして得られたヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの活性の評価は、マウスに移植した
ＭｅｔｈＡ肉腫を壊死さける効果を見るｉｎ　　ｖｉｖ
ｏ活性測定法（Ｃａｒｓｗｅｌｌ　ら。

前出）、マウスＬ細胞に対する細胞障害性を見るｉｎ　
　ｖｉｔｒｏ活性測定法［Ｒｕｆｆ　、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１２６．　２３５（１９８１）　
］等により行なえるが、測定時間、定量性、測定の簡便
さ等の点から、ｉｎ　　ＶｉｔｒＯ活性測定法による評
価が好ましい。

〈発明の効果〉 かくして本発明によれば、従来公知のヒ１〜ＴＮ「蛍白
質とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可
能になり、この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを用いるこ
とによって抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供す
ることが可能になった。

〈実施例〉 以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１（ヒトＴＮＦ遺伝子の設計） 第１図に示した塩基配列のヒトＴＮＦ遺伝子を設計した
、設計に際しては、ｐ　ｅｎｎｉｃａら［Ｄ。

Ｐｅｎｎ＋ｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２．
　７２４（１９８４）　　］　の報告したヒトＴＮＦ前
駆体ｃＤ　Ｎ　Ａの構造遺伝子部分の塩基配列を基盤と
して、適当な制限酵素による切断部位を適当な位置に設
【プ、５′側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を、そして３
′側に２個の翻訳終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＡ’）を
それぞれ付与した。また、５′側翻訳開始コドン上流に
は制限酵素ＣｊａＩによる切断部位を設け、ＳＤ配列と
翻訳開始コドン間を適切な状態に保った形でのプロモー
ターとの連結を可能にした。更に、３′側翻訳終止コド
ン下流には制限酵素口ｉｎｄ　ｍによる切断部位を設け
、ベクター・プラスミドと容易に連結できるようにした
。

実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒトＴＮＦ遺伝子は、第２図に示したように１
７本のオリゴヌクレオチドに分Ｇ′Ｊで合成する１、オ
リゴヌクレオチドの合成は全自動ＤＮＡ合戒合成アプラ
イド・バイオシステムズ。

モデル３８０Ａ　）を用いて、ホスファイト法により行
なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライド
・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。

すなわち、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア水
溶液を５５℃で一晩保つことにより、ＤＮＡ塩基の保護
基をはずし、セファデックスＧ−５０フアイン・ゲルく
ファルマシア）を用いたゲル濾過によって、高分子量の
合成オリゴヌクレオポリペプチド画分を分取する。つい
で、７Ｍ尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（
ゲル濃１豆２０％〉の後、紫外線シー・ドウイング法に
より泳動パターンの観察を行なう。目的とする大きさの
バンド部分を切出して、そのポリアクリルアミドゲル断
片を細かく破砕した後、２〜５ｄの溶出用バッファ　　
［５００ｍＭ　　Ｎ＋１４０ＡＣ−１ｍＭＥＤＴＡ−０
，１％ＳＤＳ　（ｐｌ−１７，５＞　］を加え、３７℃
で一晩振とうした。遠心分離により、目的のＤＮＡを含
む水相の回収を行なった。最後に合成オリゴヌクレオチ
ドを含む溶液をゲル濾過カラム（セファデックスＧ−５
０）にかけることにより、合成オリゴヌクレオチドの精
製品を得た。なお、必要に応じて、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を繰り返し、合成オリゴヌクレオチドの純
度の向上をはかった。

実施例３（化学合成ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化〉 実施例２で作成した１７木の合成オリゴヌクレオチド（
ＴＮＦ−１〜ＴＮＦ−１７）を用いて、ヒトＴＮＦ遺伝
子を３つのブロックに分けてクローン化した。

０．１〜１．０μ９の合成オリゴヌクレオチドＴＮ「−
２〜ＴＮＦ−６の５′末端側を、５〜１５ユツトのＴ４
−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅ。

ｃｏｌｉ３タイプ、宝酒造〉を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０μ旦の５０ｍ
ＭＴｒｉＳ−口Ｃ９（ｐｌ−１９，５）　、　　１０　
ｍＭ　　Ｍ（Ｊ　ＣＢ　　。

５　ｍＭジチオスレイトール、１０ｍＭ　　ＡＴＰ水溶
液中で、３７℃で、３０分間行なった。反応終了後、す
べての合成オリゴヌクレオチド水溶液をすべて混合し、
フェノール抽出、ニーデル抽出にまりＴ４−ポリヌクレ
オチドキナーゼを失活、除去する。

この合成オリゴヌクレオポリペプチド混合液に、新たに
０．１〜１．０μ９の合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ１
及びＴ、ＮＦ−７を加え、９０℃で５分間加熱した後室
温まで徐冷して、アニーリングを行なう。

次に、これを減圧乾固した後に、３０μ旦の６６　ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ｌ−１（Ｊ　（ｐｌ−１７，６）　、　　６
．Ｇ　ＩＩＩＭ　　Ｍ（Ｉ　Ｃ９２１０ｍＭジチオスレ
イトール、　１　　ｍＭ　　Ａ−ｒＰ水溶液に溶解さぜ
、３００ユニツ１〜のＴ４〜ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）
を加えて、１１℃で１５時間連結反応を行なった。反応
終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃度５
％）を行ない、エチジウムブロマイド染色法により泳動
パターンの観察を行なう。目的とする大きさく約２２０
ｂｐ　）のバンド部分を切出して、実施例２の方法に従
ってポリアクリルアミドゲルよりＤＮＡを回収する。

方、３μｑの大腸菌用プラスミド１）ＢＲ３２２（約４
．４Ｋ　ｂｌｌ）を３０μ文の１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉ
ｓ−ＨＣ９（ｐｌ−１７，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎ
ａ　ＣＬ　７　ｍＭＭｇＣ９２水溶液に溶解させ、１０
ユニツトの制限酵素ＣｊａＩにューイングランド・バイ
オラブズ）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行な
った。

制限酵素ＣｊａＩによる切断の後、フェノール抽出。

エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。このＤＮＡを３０μ文の５Ｏｎ＋ＭＴｒｉｓ
−１−１ｆＪ　　（ｐ目　７．４）　　、　　１００　
ｍＭ　　　Ｎａ　（１，１０ｍＭ　　Ｍ（ｌｓＯ４水溶
液に溶解させ、１０ユニツトの制限酵素５ａｌＩ　（宝
酒造〉を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった
。反応終了後、アガロースゲル電気泳動（ゲルｓ１度０
．８％）を行ない、エチジウムブロマイド染色法により
切断パターンの観察を行なう。プラスミド１）ＢＲ３２
２の大部分を含む約３．７Ｋ　ｂｌｌのＤＮＡの部分に
相当するバンドを切出し、そのアガロースゲル断片を３
倍邑（ｖｏｌ　７ｗｔ）の８Ｍ　　ＮａＣｊＯ４水溶液
に溶解させた。Ｃｈｅｎらのグラスフィルター法［Ｃ，
Ｗ。

Ｃｈｅｎら、　Ａｎａｌ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　１
０１．　３３９（１９８０）　］により、約３，７Ｋ　
ｂｐのＤＮＡ断片（ＣｊａＩ←ト５ａｌＩ）をアガロー
スゲルより回収した。

先に得られたヒトＴＮＦ３ｍ信子の一部を含む約２２０
ｂｐのＤＮＡ断片について、前記の方法に準じて末端の
リン酸化反応を行なった後、プラスミドｐＢＲ３２２の
大部分を含む約３．７ＫｂｌｌのＤＮＡ水溶液と混合す
る。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じて両ＤＮＡ
断片の連結反応を行なった。

エシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ−株の形質転換は、
通常のＣａ（Ｊ２法（Ｍ　、　Ｖ　、　Ｎ　ｏｒｇａｒ
ｄらの方が１）の改良法で行なった。すなわち、５成の
Ｌ培地〈１％トリブ１〜ン、０．５％酵母エキス、０．
５％Ｎａ　ＣＲ，１ｌｌ−１７，２）にエシェリヒア−
］すＣ６００ｒ−ｍ−株の１８時間培養基を接種し、菌
体を含む培養液の６００ｎｍにおける濁度（ＯＤ６．、
）が０．３に達するまで生育させる。菌体を冷たいマグ
ネシウム・バッファ　　［０，ＩＭ　　Ｎａ　Ｃ９，５
ｍＭ　　Ｍ（ｌ　ＣＲｚ　。

５１１１Ｍ　　ＴｒｉＳ−１１ｃｆ　（１）ｌ−１７，
６，０℃）］中で２回洗い、２−の冷したカルシウム・
バッファー［１００ｍＭＣａ　Ｃ１２，２５０ｍＭ　　
ＫＣＲ，５ｍＭＭＣｌ　ＣＪｚ　　、　　５　　ｍＭ　
　”ｒｒｉｓ−口Ｃｌｒｌ口　７．６゜０℃）］中に再
懸濁させ、０℃で２５分間放置する。

次に菌体をこの容量の１／１０にカルシウム・バッファ
ーの中で濃縮し、連結後のＤＮＡ水溶液と２：１　（ｖ
ｏｌ、　：　ｖｏｌ、）混合する。この混合物を６０分
間。

０℃で保った後、１−のＬＢＧ培地（１％トリプトン、
０．５％酵母エキス、１％ＮａＣＪ、　　０．０８％グ
ル］−ス、ｐ口　７．２）を添加し、３７℃で１時間振
どう培養する。培養液を、選択培地［アンピシリン（シ
グマ）　３０μｇ／−を含むし培地プレート］に１００
μｍ／プレートの割合で接種する。プレトを３７℃で１
晩培養して、形質転換株を生育させる。得られたアンピ
シリン耐性のコロニーより、公知の方法を用いてＤＮＡ
を調製し、アガロースゲル電気泳動により、目的のプラ
スミドｐＴＮＦＩＢＲ（約４．ＯＫ　ｂｐ）の取得を確
認した。第３図に、プラスミドｐＴＮＦＩＢＲの作成方
法を示す。

以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてアラスミ１０丁ＮＦ２Ｎ
　（約３．ＩＫ　ｂｐ）を、合成オリゴヌクレオチドＴ
ＮＦ−１４〜ＴＮＩ−１７を用いてプラスミドｐＴＮＦ
３（約２，４Ｋ　ｂｐ）を、ぞれぞれ作成した。第４図
及び第５図に、プラスミドｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３
の作成方法を、それぞれ示す。

こうして得られたヒト−「Ｎ１：遺伝子の−８（（を含
むプラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ，ｐＲＮＦ２Ｎ及び１］Ｔ
ＮＦ３の、合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列
が設計通りであることは、マギザム・ギルバート法［Ａ
、　Ｍ、　Ｍａｘａｍら、　ＭｅｔｈｏｄｓＥ　ＩＩＺ
ＶＩＩＩＯ＋、、６５．　４９９　（７９８０）　］に
よって確認した。

実施例４（ヒトＴ　Ｎ　Ｆ　遺伝子発現型プラスミドの
作成〉 実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦＩＢＲ１０μｇ
を、実施例３と同様にして制限酵素ＣＲａ■及び３ａｌ
Ｉで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃
度５％）の後、実施例２の方法に準じＣ１ヒトＴＮ　Ｆ
３１ｔ伝子の一部を含む約２２０ｂｐのＤＮＡ断片＜Ｃ
Ｒａ　Ｉイ→５ａｌＩ　）をポリアクリルアミドゲルよ
り回収した。

次に、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ２　１０
μ９を１０（Ｉ　ｕの１０　ｍＭＴｒ＋ｓ−口ＣＪ（Ｄ
トｌ　　　７．５）　　　、　　　６０ｍ　　Ｍ　　　
　Ｎａ　　ＣＲ，７ｍＭＭＯＣｊ２Ｍ溶液に溶解させ、
４０ユニツトの制限酵素ＰＶＬＩＩ［（宝酒造）を添加
し、３７℃で１時間切断反応を行なった。そして、実施
例３の方法に準じて制限酵素５ａｌＩによる切断、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ゲルｍ度５％）の後、実
施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む
約ｉ　７０ｂｐのＤＮＡ断片（ＳａｌＩＨＰｖｕｌｌ）
をポリアクリルアミドゲルより回収した。

また、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ３　１０
、ｃｚｇも１００μＪ２の１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−
ｌ−１（Ｊ（ｐ目　７．５）、６０　ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ
９，７ｍＭＭＯＣＪ２Ｍ溶液に溶解させ、４０ユニツト
の制限酵素ｐｖｕ［及び４０．：ｌニットの制限酵素Ｈ
ｉｎｄ　［１（宝酒造）を添加し、３７℃で１時間切断
反応を行なった。そして、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２の方法に準じて、
ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１１０ｂＤのＤＮＡ断
片（ＰｖｕＩＩ（へ）口１ｎｄＩ［ｌ）をポリアクリル
アミドゲルより回収した。

一方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを右するプラスミドｌ
］Ｙｓ３１Ｎ（約４．７Ｋｂｌ）＞　５μグを、上記と
同様に制限酵素ｃｎａｌ及び口ｉｎｄ　ｍで切断し、ア
ガロースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％〉の後、実施
例３の方法に準じて、プラスミドｔｌＹｓ３１Ｎの大部
分を含む約４．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（ＣｆａＩ４−
１１−１ｉｎｄ■）をアガロースゲルより回収した。

こうして得られた、ヒトＴＮＦｌ信子の一部を含む約２
２０ｂｐ、約１７０ｂｐ及び約１１０ｂ１１の３つのＤ
ＮＡ断片とプラスミド１）ＹＳ３ＩＮの大部分を含む約
４，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エタノール沈
澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガー
ゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の
方法に準じてエシェリヒア・コリＣ６Ｃ６００ｒ−株に
導入し、形質転換株の中より目的のヒトＴＮＦＭ信子発
現型プラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮ＜約５．２Ｋｂ＋１
）を有するクローンを選択した。第６図に、そのプラス
ミド１ｌＴＮＦ４０１ＮＮの作成方法を示した。

また、上記プラスミドｐＹｓ３１Ｎ５μ３を、上記の方
法に準じて制限酵素ｐｖｕ［で部分分解した後、さらに
制限酵素）−１ｉｎｄｌｌｌで切断し、アガロースゲル
電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例３の方法に
準じて、ｔｒｐプロモーターを含む約２．７Ｋ　ｂｐの
ＤＮＡ断片［ＰｖｕＩＩ（２］”口１ｎｄＩ［［］をア
ガロースゲルより回収した。

次に第７図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を、実施例２の方法に準じて、合成・精製した。得られ
た２本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μ９に
ついて、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アニーリングの後、先に得られた約２．７Ｋ　ｂ
ｐのＤＮＡ断片［ＰｖｕＩＩ　（２）　←）ｌ−１ｉ　
ｎｄ　ｌｌ［］と混合し、エタ／−ル沈ｍ（Ｄ後、実施
例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結
反応を行なった。反応終了後、実施例３の方法に準じて
ニジ−［リヒア・コリＣ６ｏｏｒ−ｍ株に導入し、形質
転換株の中より目的のプラスミドｐΔＡ４１（約２．７
Ｋ　ｂｐ）を有するクローンを選択した。このようなプ
ラスミドは、プラスミドｐＹＳ３１Ｎからコピー数制御
領域除去し、ｔｒｐプロモーター下流に存在するクロー
ニング・サイトの下流に大腸菌ｔｒｐ　Ａターミネータ
−を付与した形の、多コピー・高効率発現ベクターであ
り、第７図にその作成方法を示した。

このプラスミドｐＡＡ４１　２μグを、上記と同様に制
限酵素ＣｊａＩ及びＨｉｎｄｌ［で切断し、アガロース
ゲル電気泳動くゲル濃度０．８％〉の後、実施例３の方
法に準じて、プラスミドルへＡ４１の大部分を含む約２
．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（ｃｐａ工、−）ｌ−ｌ　ｉ
ｎｄ　■）をアガロースゲルより回収した。

また、先に得られたヒトＴＮＦＪ信子発現型プラスミド
ｐＴＮＦ　４０１ＮＮ５μｑを、上記と同様に制限酵素
ＣＲａ■及び目ｉｎｄ　ｍで切断し、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動くゲル濃度５％）の後、実施例２の方法
に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０ｂｌ）
のＤＮＡ断片（（Ｊａ　工”Ｈｉｎｄ　１１　）をポリ
アクリルアミドゲルより回収した。

こうして得られた、プラスミドｐΔＡ４１の大部分を含
む約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とヒトＴＮＦ遺伝子全
域を含む約４９０ｂｐのＤＮＡ断片どを混合し、エタノ
ール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡ
リガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、実施例３の方法に準じて、エシェリヒア・
コリ６０Ｑｒ’−旧株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミドＩＩＴＮ　Ｆ　４０１Ａ　（約３．２Ｋ
ｂｌ’））を右するクローンを選択した。このプラスミ
ドは、ヒトＴＮＦ遺伝子をより効率良く発現させる能力
を有しており、第８図にその作成方法を示した。

実施例５（新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成） 実施例４で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
ｔｌＴ　Ｎ　Ｆ　４０１Ａ　２０μグを、１００μ文の
１０ｍＭ　　　Ｔ　ｒｉｓ　　　−ト１（Ｊ　　（ｐｌ
−１７，４）　　　、　　　１０　　ｍＭ　　　　Ｍ（
１３０４、１１１１Ｍジチオスレイト−ル水溶液に溶解
させ、４０ユニツトの制限酵素Ｋｐｎｌ（宝酒造）を添
加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。さらに実
施例３の方法に準じて制限酵素ＣＲａＩによる切断を行
ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃度５％
）及びアガロースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％〉の
後、それぞれ実施例２及び３の方法に準じて、生成する
２つのＤＮＡ断片（約１６０ｂｐ及び約３．０Ｋ　ｂｐ
、両方共ＣｊａＩＨＫｉｌｎ■）をゲルより回収した。

ここで得られたヒトＴＮＦｍ転子前半部分を含む約１６
０ｂｐのＤＮＡ断片を５０μ文の１０　ｍ１ｙｌＴ　ｒ
ｉｓ−口ＣＢ　（ｐｌ−１７，４）　、　　１０１１１
Ｍ　　Ｍ（Ｉ　ＳＯ４゜１　　ｍＭジヂオスレイトール
水溶液に溶解させ、１０ユニツ１−の制限酵素１−１ａ
ｐＩＩ（宝酒造）を添加して、３７℃で１時間切断反応
を行なった。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動くゲル濃度５％）を行ない、実施例２の方法に準じ
て、ヒトＴＮＦ遺伝子の前半部分を含む約１００ｂｐの
ＤＮＡ断片（ＣβａＪ＋→口ａｐ■）をポリアクリルア
ミドゲルり回収した。

また、第９図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた２本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μグについて、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニルリングを行なった。

反応終了後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチドを、先
に得られた約３，ＯＫ　ｂｐのＤＮＡ断片＜ＣＪａ　Ｉ
’−’Ｋ１１ｎＩ　）及びヒトＴＮＦ遺伝子の前半部分
を含む約１００ｂｐのＤＮＡ断片（ＣｊａＩ”Ｈａｔ）
■〉と混合し、エタノール沈澱の後、実施例３の方法に
準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なっ
た。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリヒア
・コリＣ６００ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株の中よ
り目的のプラスミドｐＴＮＦ４８９＜約３．２Ｋｂｐ）
を右づ−るクローンを選択した。

このプラスミド（よ、次のアミノ酸配列（ｆｉ２Ｎ　）
　−Ｖａｌ−八ｒｇ−３ｅｒ　−３ｅｒＳ　ｅｒ−Ａ　
ｒＧ−Ｔ　ｈｒ−Ｐ　ｒｏ　−３ｅｒ　−Ａ　Ｓｐ　−
Ｌ　ＶＳＰ　ｒｏ−Ｖａｌ　　−Ａ　　ｌａ　−Ｈｉｓ
　−Ｖａｌ　−Ｖａｌ−Ａ　　ＩａＡ　ｓｎ　−ｐ　ｒ
ｏ−Ｑ　Ｉｎ−八ｌａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ＩＶ−Ｇ　
Ｉｎ１−ｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ　−１−ｃｕ−Ａｓｎ−
Ａｒ（１−ＡｒｔｌＡｌａ−八ｓｎ　−Ａ　ｌａ−Ｌ　
ｅｕ−ｌ−ｅｕ　−Ａ　１ａ−Ａ　ｓｎＧ　ｌｙ−Ｖ　
ａｌ−Ｇ　１ｕ−ｌ−ｃｕ−へｒｇ−へｓｎ−へ５ｎＳ
ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｔ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ｇ　
ｕＧｌｙ−ヒｅｕ−Ｔ　ｙｒ　−Ｌ　ｃｕ　−１ｌｅ　
−Ｔｙｒ　−３ｅｒＧ　Ｉｎ　−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈ
ｅ−Ｌｙｓ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　ＩｎＧ１’／　　Ｃｙｓ　
　Ｐｒｏ　　５ｅｒ−−Ｔｈｒ　　１ｌｌｓ　　７ａし
ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ−Ｔｈｒ　−１−１１ｓ−Ｔｈｒ　−
Ｉ　ｌｅ　−３ｅｒＡ　ｒａ−１１ｅ−Ａ　ｌａ　−Ｖ
ａｌ−３ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇ　ＩｎＴｈｒ　−Ｌｙｓ　−
Ｖａｔ　−Ａｓｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−５ｅｒ
Ａ　ｌａ　−１１ｅ　−１−ｙｓ　−Ｓａｒ　−ｐ　ｒ
ｏ　−Ｃｙｓ　−Ｇ　ＩｎＡ　ｒ（Ｊ−Ｇ　ｌｕ−Ｔ　
ｈｒ−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　ｌｕ−Ｇ　ＩＶ−Ａ　ｌａＧ　
１ｕ−Ａ　１ａ−ＬＶＳ　−Ｐｒｏ−Ｔｒｌ）−ｒｙｒ
−ＱｌｕＰｒｏ−１ｌｅ−’ｒｙｒ　−Ｌｅｕ−ＧＩＶ
−ＧＩＶ−ＶａｌＰ　ｈｅ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　
ｌｕ　−Ｌ　ｙｓ−Ｇ　ｌｙ−Ａ　５ｐ−Ａｒａ−Ｌｅ
ｕ−８ｅｒ−Ａ　１ａ−Ｇ　ｌｕ　−１１ｅ−ＡｓｎＡ
　ｒｇ−Ｐ　ｒｏ−Ａ　ｓｐ−Ｔ　ｙｒ−Ｌ　ｅｕ−Ａ
　ｓｐ−Ｐ　ｈｅＡ　１ａ−Ｇ　ｌｕ−Ｓ　ｅｒ−Ｇ　
Ｉｙ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖ　ａｌ−Ｔ　ｙｒＰｈｅ−Ｇ　ｌ
ｙ　−（ｌｅ　−１１ｅ　−Ａ　１ａ−Ｌｅｕ（ＣＯＯ
口） で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
る新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド
であり、第９図にその作成方法を示した。

次に、ここで得られたプラスミド１）ＴＮＦ４８９５μ
９を、５０μ文の１０　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　−１−１（
Ｊ　（Ｄ目７．５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ　ＣＲ，
７１１１Ｍ　　ＭＣＩ　ＣＲ２水溶液に溶解させ、２０
ユニツトの制限酵素Ｃ１ａＩ及び２０ユニツ１〜の制限
酵素ＡｖａＩ（宝酒造）を添加し、３７℃で１時間切断
反応を行なった。そして、アガロースゲル電気泳動（ゲ
ル濃度０．７％）の後、実施例３の方法に準じて、プラ
スミド１ｌｌＴＮＦ４８８の大部分を含む約３．２Ｋ　
ｂｐのＤＮＡ断片（ＣＲａＩＨＡｖａＩ）をアガロース
ゲルより回収した。

一方、第１０図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドを、実施例２の方法に準じて、合成・精製した。得
られた４本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μ
牙を、第１０図記載の組合せで混合し、アニーリングを
行なった後、先に得られた約３，２Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断
片（ＣＲａ　ＩＨＡｖａＩ　）と混合する。エタノール
沈殿の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガ
ーゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実施例３
の方法に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ−株
に導入し、形質転換株の中より目的のプラスミド１ｌＴ
ＮＦ４９７Ａ又はＩ）ＴＮ　Ｆ　４９７Ｂ　（いずれも
約３．２Ｋ　ｂｐ＞を有するクローンを選択した。これ
らのプラスミドは、次のアミノ酸配列 （＋−（２Ｎ）　−Ｐｒｏ−３ｅｐ−ＡＳＤ−１１ｓＰ
　ｒｏ−Ｖ　ａｌ　−Ａ　Ｉａ−目ｉｓ　−Ｖ　ａｌ　
−Ｖ　ａｌ　−Ａ　ＩａＡ　Ｓｎ　−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　Ｉ
ｎ−八ｌａ　−Ｇ　ｌｕ−’Ｇ　ＩＶ　−Ｇ　ＩｎＬ　
ｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌ　ｅｕ−Ａｓｎ−ＡｒＯ−Ａ
ｒ（１−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−ｌ−ｅｕ−１−ｅｕ
−Ａｌａ−Ａｓｎ　−Ｑ　ｌｙ　−Ｖ　ａｌ　−Ｇ　Ｉ
ｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｒｇ　−Ａ　５ｎ−Ａ　５ｎＳ
ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｔ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−８ｃｒ−Ｇｌ
ｕＧ　ｌｖ　−１−ｅｕ　−Ｔｙｒ　−Ｌｅｕ−１ｌｅ
　−Ｔｖｒ　−５ｅｒＧ　Ｉｎ　−Ｖ、ａｔ　−Ｌｅｕ
　−Ｐｈｅ−ＬｙＳ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｇｌｙ−
Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−３ｅｔ−Ｔｈｒ−１−１ｉｓ−ｖａｌ
−−Ｌｅｕ−Ｌ　ｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ　−Ｉ
　１ｅ−８ｅｒＡｒｏ　−１１ｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−８
ｅｒ−Ｔｙｒ−ＧｉｎＴｈｒ　−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓ
ｎ　−Ｌｅｕ−Ｌ　ｅｕ−８ｅｒＡ　１ａ−Ｉ　Ｉｅ−
Ｌｙｓ　−５ａｒ−Ｐ、ｒｏ−ＣｙＳ−Ｇ　１ｎ−Ａ　
ｒｏ　−Ｇ　ｌｕ−Ｔ　ｈｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　ｌｕ
−Ｇ　１ｙ−Ａ　ｌａ　−〇　ＩＵ−Ａ　１ａ−Ｌ　ｌ
／Ｓ−Ｐ　ｒＯ−Ｔ　ｒＬ−Ｔ　Ｖｒ　−Ｇ　１１Ｐｒ
ｏ　−Ｉ　１ｅ−Ｔｙｒ　−Ｌ　ｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
−ＶａＰ　ｈｅ　−Ｇ　Ｉｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　１ｕ−Ｌ
　ｌ／Ｓ−Ｇ　ＩＶ−Ａ　Ｓｔ）Ａｒｇ−１ｅｕ−３ｅ
ｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−１１ｅ−八ｓｎ　−Ａ　ｒａ−Ｐ
　ｒｏ　−Ａ　３ｐ−Ｔ　ｙｒ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｓｐ　
−Ｐ　ｈｅＡ　Ｉａ−Ｇ　ｌｕ−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　ｌｙ
−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖ　ａｌ−Ｔ　ｙｒ−Ｐｈｅ−Ｃｔｌｙ
−１１ｅ　−１１ｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（ＣＯＯ口） で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
る新規抗腫瘍活性ポリペプチド道伝子介現型プラスミド
であり、第１０図にその作成方法を示した。

次に、上記で得られたヒトＴＮＦｌ転子発現型プラスミ
ドｐＴＮＦ　４９７１３　２０μＵを、実施例４の方法
に準じて制限酵素ＨｉｎｄＩ［［で切断した後、５０　
　ｍＭ　　　Ｔ　ｒｉｓ　　　−Ｆｌｃｆ（Ｄ口　　７
．４）　　　、　　　１００　　ｍ　　ＭＮａ　（Ｊ、
１０　ｍＭ　　ＭＣ＋　３０４水溶液中で制限酵素ＮＣ
０Ｉ（宝酒造）による切断反応を３７℃で１時間行なう
。反応終了後、アガロースゲル電気泳動くゲル濃度０．
７％〉及びポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃度
５％）を行ない、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ
遺伝子の一部を含む約１４０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｎ　ｃ
ｏＩ　＜−＋　ＩＩ　ｉｎｄ　Ｉ［［）をポリアクリル
アミドゲルより、そして実施例３の方法に準じて、ｐＴ
ＮＦ　４９７Ｂの大部分を含む約３．０ＫｂＤのＤＮＡ
断片（ＮｃｏＴ←＋１−ｆｉｎｄ　Ｉ［［）をアガロー
スゲルより、それぞれ回収した。

さらに、上で得られた約１４ｏｂｐのＤＮＡ断片（Ｎｃ
ｏＩ＋ｌ−１ｉｎｄ　Ｉ［［）を５０μ文の１０１＋１
Ｍ　　Ｔｒｉｓｌ−１ｃｆＣｐ口　７．４）、１０　ｍ
Ｍ　　ＭＣＩ　　ＳＯ４，１ｍＭジヂオスレイトール水
溶液に溶解させ、１０ユニツトの制限酵素ＡｃｃＩ（宝
酒造）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった
。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル を行ない、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子
の一部を含む約１１０ｂｐのＤＮＡ断片（　Ｎ　Ｃ。

ＩＷＡＣＣＩ）をポリアクリルアミドゲルより回収した
。

また、第１１図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドを、実施例２の方法に準じて、台底。

精製した。得られた２本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μｑについて、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングを行なった。

アニーリングの後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチド
を、先に得られた約３，ＯＫ　ｂｐのＤＮＡ断片（Ｎｃ
ｏＩ＋Ｈ　ｉｎｄ　ｍ　）及びヒトＴＮＦ遺伝子の部含
む約ｉｉｏｂｐのＤＮＡ断片（ＮｃｏＩ＋ＡｃｃＩ）と
混合し、エタノール沈殿の後、実施例３の方法に準じて
、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。反
応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリヒア・コリ
Ｃ　６００ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミドｐＴＮ「６４１（約３．２Ｋ　ｂｐ）を
有するクローンを選択した。このプラスミドは、次のア
ミノ酸配列 （１１２　Ｎ　）　−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−ＡＳＩ）　−　
ＬｙｓＰ　ｒｏ−Ｖ　ａｌ　−　Ａ　ｌａ−目ｉｓ　−
　Ｖ　ａｌ　−　Ｖ　ａｌ　−　Ａ　ｌａΔｓｎ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌｎ　−　Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ　−
Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ　−　Ｌｅｕ−Ａｓｎ−ＡｒＯ
−ＡｒｇＡ　ｌａ　−　Ａ　ｓｎ　−　Ａ　Ｉａ　−　
Ｌ　ｅｕ　−　Ｌ　ｅｕ−Δｌａ−ＡｓｎＧ　ＩＶ−Ｖ
　ａｌ−　Ｇ　ｌｕ−　Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｒＬ−　Ａ　Ｓ
Ｄ−　Ａ　ＳｎＧｌｎ　−　Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−
Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−ＧｌｕＧ　ｌｙ−ｔ　ｅｕ−Ｔｙｒ−
Ｌｅｕ　−　１　ｔｅ−　Ｔｙｒ　−　ＳｅｒＧ　Ｉｎ
　−　Ｖａｌ　−　Ｌｅｕ　−　Ｐｈｅ　−　Ｌｙｓ　
−　Ｇ　ｌｙ　−　Ｇ　ＩｎＧ　ＩＶ　−　Ｃｙｓ　−
　Ｐｒｏ　−　３ｅｒ　−　Ｔｈｒ　−　Ｈ　ｉｓ　−
　Ｖａしｅｕ　−　Ｌ　ｅｕ−Ｔｈｒ　−　１−ｌ　ｉ
ｓ−Ｔｈｒ−Ｉ　ｌｅ−３ｅｒＡ　ｒｏ　−　１　１ｅ
　−　Ａ　ｌａ　−　Ｖａｌ　−　Ｓｅｒ　−　Ｔｙｒ
−Ｇ　ＩｎＴｈｒ　−　Ｌｙｓ　−　Ｖａｌ−Ａｓｎ　
−　Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ　−　ＳｅｒＡｌａ　−　１　１
ｅ　−　Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＧｌｎＡ　
ｒｏ　−　Ｇ　Ｉｕ−　Ｔ　ｈｒ　−　Ｐ　ｒｏ−　Ｇ
　ｌｕ−　Ｇ　ｌｙ−　Ａ　ｌａＧ　ｌｕ　−　Ａ　Ｉ
ａ　−　Ｌ　ｙｓ　−　Ｐ　ｒｏ　−　Ｔ　ｒｐ　−　
Ｔ　ｙｒ　−　Ｇ　ｌｕ　−Ｐ　ｒｏ−Ｉｌｅ　−　Ｔ
ｙｒ　−　Ｌｅｕ　−　Ｇ　ｌｙ　−　Ｇ　ｌｙ−　Ｖ
ａＰｈｅ−Ｇｌｎ−Ｌ　ｅｕ−ＧＩＬＩ−ＬＶＳ−ＧＩ
Ｖ−ＡＳＦＩＡｒＱ　−　Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ａ　ｌａ−
Ｇｌｕ　−　１　１（！−Ａ３ｎＡ　ｒｑ　−　Ｐ　ｒ
ｏ　−　Ａ　ｓｐ−Ｔｙｒ−ｌ−ｅｕ　−　Ａ　ｓｐ　
−　Ｐｈｅ八ｌへ−Ｇ　ｌｕ　−　Ｓ　ｅｒ−　Ｇ　ｌ
ｙ　−　Ｇ　ｌｎ−　Ｖ　ａｌ　−　Ｔ　ｙｒ　−Ｐｈ
ｅ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｐｈｅ（ＣＯＯ
口） で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にｌｙｌｅｔが結合しているポリペプチドをコー
ドする新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラス
ミドであり、第１１図にその作成方法を示した。

実施例６（発現の確認〉 前記実施例４で得られた発現ベクター１）ＡＡ４１。

ｐＴＮＦ　４０１ＮＮ又はｐＴＮＦ４０１Ａ又は前記実
施例５で祷られた、新規抗１１ｉ１ｉ瘍活性ポリペプチ
ド遺伝子発現型プラスミドＩ）ＴＮＦ６４１を有する工
シエリヒア・］すＣＣ６００ｒ−ｍ−株を、３０〜５０
μ３／ｍｅのアンピシリン、０．２％のグルコース及び
／１　ｍｙ／−のカザミノ酸を含むＭ９培地［０，６％
Ｎａｚ＋−Ｉ　ＰＯ４−０，３％Ｋ　２　ｈｌ　Ｐ　Ｏ
４−０，０５％ＮａｃＲＯ１１％Ｎ目４Ｃ９水溶液（ｐ
ｌ−１７，４）をオー１へクレープ減菌した後に、別途
にオー１〜クレープ滅菌したＭ（］　ＳＯ４水溶液及び
ＣａＣＲｚ水溶液をそれぞれ最終濃度２　ｍＭ及び０．
１　ｍＭになるように加える。］２５０−に接種し、Ｏ
Ｄｌ、、が０．７に達するまで、３７℃で振とう培養を
行なった。次いで、最終濃度５０μｇ／−の３−β−イ
ンドールアクリル酸を培養液中に添加し、さらに３７℃
で１２時間振とう培養を続けた。

遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、ＰＢＳバッファ
　　（１５０ｍＭ　　ＮａＣ９を含む２０　ｍＭリン酸
バッファー、　　ＤＩ−１７，４）を用いて菌体の洗浄
を行なった。洗浄後の菌体を１０−のＰＢＳバッファに
１濁させ、超音波発生装置（久保田、　　２００Ｍ型）
を用いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体残渣の
除去を行なった。

１９られた大腸菌ライゼー１〜の一部に対して、Ｔｒｉ
ｓ−ｌ−ＩＣｊバッファ（ｐｌ−１６，８）　、　ＳＤ
Ｓ、　２メルカプトエタノール、グリセロールを、それ
ぞれ最終濃度６０ｍＭ、２％、４％、１０％になるよう
に加え、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動「銘
木、遺伝、　３１．４３（１９７７）　］を行なった。

分離用ゲルは１２．５％とし、泳動バッファーばＳＤ３
、Ｔｒｉｓ−グリシン系［Ｕ、　Ｋ、　ｌ−ａｅｍｍＮ
ａｔｕｒｅ　、　　２２７．　６８０（１９７０）　］
を用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーマシ
ープルーＲ−２５０（バイオ・ラッド〉で染色し、新規
抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の発現の確認を行なった
。結果の一部を第１２図に示した。

なお、染色後のゲルをクロマ１〜・スキャナー（島津、
　Ｃ８−９３０型〉にかけて、産生されたヒトＴＮＦ蛋
白質又は新規抗腫瘍活性ポリペプチドの大腸菌細胞質蛋
白質中にしめる割合の算出を行なった。その結果、ヒト
ＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ　４０１Ａを有
する大腸菌においては全細胞質蛋白質の約１７％のヒト
ＴＮＦ蛋白質、新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現
型プラスミド１）ＴＮＦ６４１を右する大腸菌において
は同じく約１０％の新規抗腫瘍活性ポリペプチドの産生
がそれぞれ認められた。また、ヒトＴＮＦ遺伝子発現型
プラスミドｐＴＮＦ　４０１ＮＮを有する大腸菌におけ
るヒトＴＮＦ蛋白質の産生量は、上記ｐＴＮＦ　４０１
Ａの場合の約４０％にすぎず、発現ベクター＋１Ａ　Ａ
　４１の有用性が示された。

実施例７（活性の評価） 新規抗腫瘍活性ポリペプチドの活性測定は、前記Ｒｕｆ
ｆの方法に準じて行なった。すなわち、実施例６で得ら
れた新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼー
トを順次培地で希釈した試別１００μ旦と、４ｘ１０５
個／−の濃度のマウスＬ９２９繊維芽細胞（ＡＴＣＣＣ
Ｃし−９２９）懸濁液１００μ文を、９６穴のＩＩ培養
用マイクロプレート（コースタ−）内で混合した。なお
この際に、最終濃度１μｇ／−のアクチノマイシンＤ（
］スメゲアン萬有製薬）を添加しておく。培地とじては
、５％（ｖｏｌ　／ｖｏｌ　）のウシ胎児血清を含むイ
ーグルのミニマム・エツヒンシャル培地（日永製薬）を
用いた。上記マイクロプレートを、５％炭酸ガスを含む
空気中、３７℃で１８時間培養した後、クリスタル・バ
イオレット溶液［５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ　）メタノール
水溶液に、０．５％（ｖｔ／ｖｏｌ　）のクリスタル・
バイオレットを溶解させたもの］を用いて生細胞を染色
した。余分なりリスタル・バイオレットを洗い流し乾燥
した後、残ったクリスタル・バイオレットを１００μ旦
の０．５％ＳＤＳ水溶液で抽出し、その５９５ｎｍにお
ける吸光度をＥＬＩＳＡアナライザー（東洋測器、ＥＴ
Ｙ−９６型）で測定する。この吸光度は、生き残った細
胞数に比例する。そこで、新規抗ＩＩ！ｒ！瘍活性ポリ
ペブポリペプチドを含む大腸菌ライゼートの希釈溶液を
加えない対照の吸光度の５０％の値に相当する大腸菌ラ
イゼートの希釈倍率をグラフ（たとえば第１３図）によ
って求め、その希釈倍率をユニットと定義する。第１３
図より、発現型プラスミドｌ’１ＴＮＦ　４０１Ａにコ
ードされるヒトＴＮＦ蛋白質を含む大腸菌ライゼ−１〜
　１００μ夏は１．３Ｘ　１０’ユニット程度の活性を
、そして発現型プラスミドＤＴＮＦ６４１にコードされ
る新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼー１
〜１００μ旦は約１．２Ｘ　１０’コニッｌ〜程度の活
性を、それぞれ有していることが明らかになった。

実施例６で得られた発現型プラスミドｐＴＮＦ４０１Ａ
にコードされるヒトＴＮＦ蛋白質又は発現型プラスミド
Ｉ）ＴＮＦ６４１にコードされる新規抗腫瘍活性ポリペ
プチドを含む大腸菌ライビー１〜中に含まれ総蛋白質量
は、プロティン・アッセイ・キラ１〜（バイオ・ラッド
）を用いて定量し、ウシ血清アルブミンを用いた検量線
より請算した。上記で得られた発現量、活性の値及び蛋
白質定品結果よりヒｈ　Ｔ　Ｎ　Ｆ蛋白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの比活性を計算したところ、表１の
ような値が得られた。表１より、新規抗腫瘍活性ポリペ
プチドはヒトＴＮＦ蛋白質の約１．７倍の比活性を右し
ていることがわかる。

表１ ヒトＴＮＦ蛋白質と本発明の新規抗腫瘍活性ポリペプチ
ドの比較

【図面の簡単な説明】

第１図は設計したヒトＴＮＦＩ伝子の塩基配列を、第２
図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を
、それぞれ示したものである。第３図、第４図及び第５
図は、ヒトＴＮＦ遺伝子の部を有するプラスミドｐＴＮ
ＦＩＢＲ，ｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作成方法を、
それぞれ示したものである。第６図はヒトＴＮＦ遺伝子
発現型プラスミドｐＴＮＦ　４０１ＮＮの作成方法を、
第７図は発現ベクターｒｌＡ　Ａ　４１の作成方法を、
そして第８図はヒトＴＮＦｍ信子発現型プラスミド＋１
ＴＮＦ４０１への作成方法を、それぞれ示したものであ
る。第９図は新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドｐＴＮＦ４８９の作成方法を、そして第１０
図は新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミ
ドｐＴＮＦ　４９７Ｂ及びＩＩＴＮＦ４９７Ａの作成方
法を、それぞれ示したものである。第１１図は新規抗腫
瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドｔ）ＴＮＦ
６４１の作成方法を示したものである。第１２図は新規
抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の発現結果を示したもの
である。第１３図は新規抗腫瘍活性ポリペプチドの活性
測定結果を示したものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）次のアミノ酸配列 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】 で表わされる、新規生理活性ポリペプチド。 （２）アミノ末端にＭｅｔが結合していることを特徴と
   する請求項１記載のポリペプチド。 （３）次のアミノ酸配列 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
   るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド。 （４）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
   Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする請求
   項３記載のプラスミド。 （５）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
   Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする請求
   項３記載のプラスミド。 （６）該プラスミドがプラスミドｐＴＮＦ６４１である
   請求項３記載のプラスミド。 （７）次のアミノ酸配列 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
   るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
   れた組換え微生物細胞。 （８）該微生物細胞がエシエリヒア・コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）であることを特徴
   とする請求項７記載微生物細胞。（９）次のアミノ酸配
   列 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
   るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
   れた組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理活
   性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物から
   新規生理活性ポリペプチドを分離することを特徴とする
   、新規生理活性ポリペプチドの製造方法。 （１０）抗腫瘍に有効な量の次のアミノ酸配列【遺伝子
   配列があります。】 【遺伝子配列があります。】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドを含有する
   医薬組成物。