JPH0411537B2 - - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、式 （式中、ＲはＬ−ロイシル基、ＸおよびＹは同一
かまたは異なり、ハロゲン原子を示す）で表され
るアミド化合物またはその塩に関する。

〔従来の技術〕

ペプチターゼは一般的にはペプチドのペプチド
結合に作用してアミノ末端から切断しでアミノ酸
またはより低級のペプチドを遊離させる酵素の総
称として古くから知られている。例えば、ロイシ
ンアミノペプチターゼ（臨床化学においてTrue
LAPともいう）やアリルアミターゼ（臨床化学
においてClinical LAPともいう、以下時として
AAと称する）などのアミノペプチターゼ（以下
True LAPとClinical LAPを併せて単にLAPと
称する）、シスチンアミノペプチターゼ、プロリ
ンアミノペプチターゼ、アルギニンアミノペプチ
ダーゼ、アラニンアミノペプチザーゼ、γ−グル
タミルトランスペプチターゼ（γ−GTP）など
が知られている。

上記酵素のうち、特にロイシンアミノペプチダ
ーゼ（LAP）は、生体内のあらゆる組織に広く
分布し、血清中にも存在しており、病的条件によ
つて増加することが知られており、臨床検査上重
要な酵素活性測定項目と対象となつている酵素で
ある。

LAPはＬ−ペプチド、特にアミノ末端がＬ−
ロイシンまたはこれに関係あるアミノ酸であるＬ
−ペプチドを遊離アミノかをもつアミノ末端残基
を加水分解してＬ−ロイシンを遊離さえる酵素で
あつて、生体内の各組織に広く分布している。こ
の酵素の血清中にも存在していて、血清中の酵素
量は生体の状態により著しく変動することが知ら
れており、急性肝炎、肝癌、転移性肝癌、肝硬変
症、胆道症などではLAP活性が増加する。そこ
でLAP活性がかかる疾病の１つの指標となり、
この酵素活性を測定することは、これらの疾病の
診断に必要欠くべからざる検査法の１つになつて
いる。

従来から、LAP活性の測定法は多数報告され
ている。それらの大部分は合成基質からLAPに
よつて遊離されるアミン化合物を比色定量するこ
とによりLAP活性値を求める方法であつて、そ
れに用いる合成基質としてＬ−ロイシル−ｐ−ニ
トロアニリドを用い、LAPの酵素作用により生
成するＰ−ニトロアニリンの黄色を比色定量する
方法が挙げられる。しかし、この比色定量の波長
と合成基質の呈色波長がオーバ・ラツプする欠点
があり、、また血清成分、特にビリルビン系色素
による測定の影響も免れることが出来ないという
欠点があつた。さらに、合成基質としてＬ−ロイ
シル7β−ナフチルアミドを用いる方法であるが、
この方法では生成するβ−ナフチルアミンに５−
ニトロ−２−アミノトキシベンゼンジアゾテート
などをカツプリングさせて色素を形成させるか、
あるいは生成するβ−ナフチルアミンを亜硝酸ナ
トリウムでジアゾ化し、Ｎ−（１−ナフチル）−エ
チレンシアンにカツプリングさせるか、もしくは
ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドまたはｐ−
ジメチルアミノシンナムアルデヒドを縮合させて
色素を形成せしめ次いでこれを比色定量するとい
う方法がとられている。これらの方法は反応過程
が複雑で、かつ厳密な操作を必要とするため、検
査法として不便であるばかりでなく、標準物質た
るβ−ナフチルアミンの毒性が著しく、また、近
年膀胱の腫瘍が癌を発生させることが明らかとな
つたため、発癌物質として、その使用に特に厳密
な注意を要する、などの欠点があつた。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明者らは、かかる欠点を有する従来の
LAP活性測定法を改良すべく鋭意研究を続けた
結果、LAP活性測定に優れた性質を有する新規
な合成基質を乱し、本発明を完成した。

本発明は、ペプチダーゼと合成基質として使用
される新規なアミド化合物〔〕またはその塩で
ある。

〔問題点を解決するための手段〕

上記のような問題点を解決するため本発明によ
れば、式 （式中、ＲはＬ−ロイシル基、ＸおよびＹは同一
かまたは異なり、ハロゲン原子を示す）で表され
るアミド化合物またはその塩を提供するにある。

本発明においてペプチターゼの合成基質として
用いられるアミド化合物〔〕は、ペプチド合成
の常法によつて製造することができる。即ち、Ｌ
−ロイシンのカルボキシル基とアニリン誘導体 〔〕 （式中、ＸおよびＹは、前記と同じ意味を有す
る）との縮合反応により得られる。

上記の縮合反応に際しては、予め反応に関与し
てはならない官能基、即ちＬ−ロイシンのα−ア
ミノ基は保護するのがよい。α−アミノ基の保護
基としては通常ペプチド合成に用いられるα−ア
ミノ保護基が用いられる。例えばｔ−プチルオキ
シカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、ベ
ンジルオキシカルホニル、ｐ−ニトロベンジルオ
キシカルボニル、アダマンタチルオキシカルボニ
ル、ｐ−メトキシヘンジルオキシカルボニル、フ
タロイル、ｏ−ニトロフエニルチオ基などが挙げ
られる。

上記縮合反応に用いるアニリン誘導体〔〕の
例としては、３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシ
アニリン、３，５−ジクロロ−ビドロキシアニリ
ン、３−クロロ−５−ブロモ−４−ヒドロキシア
ニリンなどが挙げられる。

上記の縮合反応は、α−アミノ基が保護された
Ｌ−ロイシンのカルボキシル基を酸ハライド、酸
無水物、酸アジド、酸イミダゾリド、活性エステ
ル、例えばシアノメチルエステル、ｐ−ニトロフ
エルエステル、２，４−ジニトロフエルエステ
ル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ
−ヒドロキシフタルイミドエステルなどの活性化
アシル誘導体に変換してアニリン誘導体〔〕と
反応させるか、あるいはカルボジイミド、例えば
ウオーターソルプ・カルボジイミド塩酸塩〔１−
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド塩酸塩、Ｎ，N′−ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド、Ｎ，N′−カルボニルイミダ
ゾール、イソオキサゾリウム塩、例えばウツドワ
ード試薬などの縮合剤の存在下、上記の保護され
たＬ−ロイシンとアニリン誘導体〔〕を反応さ
せることにより行われる。

上記の縮合反応においては、通常不活性有機溶
媒、例えばジメチルホルムアミド、ジメチルアセ
トアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロ
フラン、ジオキサン、ベンゼン、クロロホルム、
ジクロロメタン、ジクロロエタンなどの溶媒中、
両者ほぼ等量を加え、室温またはそれ以下の温度
で反応させることにより行われる。上記の反応経
過はシリカゲルなどの薄層クロマトクラフイー
（TLC）、高速液体クロマトグラフイー（HPL）
などにより追跡できるので、出発物質にいずれか
の消失を持つて適宜反応を終了すればよい。

このようにして得られた反応生成物は、反応溶
媒を留去するかまたは留去することなく、非親水
性有機溶媒、例えはクロロホルム、ジクロロメタ
ン、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルイソブチル
ケトン、ベンゼン、ジエチルエーテルなどに溶か
し、酸性水およびアルカリ性水で洗浄した後、溶
媒を留去することにより採取できる。さらに精製
する必要がある場合には、適当な再結溶媒で再結
晶化するか、あるいはシリカゲル、活性アルミ
ナ、吸着樹脂などの吸着剤を用いるカラムクロマ
トグラフイーにより精製することができる。

次いで得られた反応生成物の保護基を脱離する
のであるが、この脱離化はペプチド化学における
保護基の脱離化法を用いて行われる。例えばα−
アミノ保護基がｔ−ブチルオキシカルボニル基で
ある場合には、2N塩化水素の酢酸溶液、トリフ
ルオロ酢酸、ギ酸などを用いる方法、ヘンジルオ
キシカルボニル基である場合には、パラジウム−
炭素触媒を用いる接触還元による方法、臭化水素
酸の酢酸溶液を用いる方法により行えばよい。

このようにして得られたアミド化合物〔〕を
反応液から採取するには、先ず保護基の脱離化が
酸分解による場合には、中和し、接触還元による
場合には触媒を除去した後、非親水性有機溶媒、
例えばクロロホルム、ジクロロメタン、ジクロロ
エタン、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルイソブ
チルケトン、ベンゼン、ジエチルエーテルなどの
溶媒中、酸性水およびアルカリ性水で洗浄した
後、溶媒を留去することにより採取できる。さら
に精製する必要がある場合には、適当な再結溶媒
で再結晶化するか、あるいシリカゲル、活性アル
ミナ、吸着樹脂などの吸着剤を用いるカラムクロ
マトグラフイーにより精製することができる。

本アミド化合物〔〕は必要に応じ、塩酸、硫
酸、酢酸、リン酸などの無機酸との塩、ギ酸、酢
酸、プロピオン酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石
酸、シユウ酸などの有機酸との塩を形成すること
ができる。

次に、参考として本アミド化合物〔〕を用い
るペプチターゼ活生測定法について述べる。この
測定法においては、上記アミド化合物〔〕また
はその塩の被験液に含有されてあるペプチター
ゼ、特にLAPの作用により遊離されるアニリン
誘導体〔〕を定量するに当たり、化学的発色法
を用いて発色化合物に導き、比色定量するもので
ある。

上記の化学的発色法としては、カプラー共存下
でアニリン誘導体〔〕と酸化縮合させて発色化
合物に導き比色定量するのが好ましい。使用する
カプラーとしては、アニリン誘導体〔〕と酸化
縮合して発色化合物を形成する芳香族化合物であ
れば、どのような化合物でもよいが、これらのう
ち代表的な芳香族化合物としてはフエノール系化
合物、アミノフエノール系化合物、アニリン系化
合物またはナフトール系化合物が挙げられる。フ
エノール系化合物の例としては、フエノール、サ
リチル酸、ｍ−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−ヒドロ
キシ安息香酸、２，６−ヒドロキシ安息香酸、サ
リチル酸メチル、ｏ−クレゾール、ｍ−クレゾー
ル、ｐ−クレゾール、ｏ−エチルフエノール、ｍ
−エチルフエノール、２，３−キシレノール、
２，４−キシレノール、２，５−キシレノール、
３，５−キシレノール、２，６−キシレノール、
ｏ−メトキシフエノール、ｍ−メトキシフエノー
ル、ｐ−メトキシフエノール、２，−ジメトキシ
フエノール、ｏ−クロロフエノール、ｍ−クロロ
フエノール、ｐ−クロロフエノール、２，４−ジ
クロロフエノール、２，６−ジクロロフエノー
ル、、ｏ−ブロモフエノール、ｍ−ブロモフエノ
ール、ｐ−ブロモフエノール、２，４−ジブロモ
フエノール、２，６−ジブロモフエノール、２−
メチル−６−クロロフエノール、２−クロロ−５
−メチルフエノール、ｏ−カルボキシメチルフエ
ノール、２−ヒドロキシ−４−アミノエチルフエ
ノールなどが挙げられる。アミノフエノール系化
合物の例としては、４−クロロ−２−アミノフエ
ノール、Ｎ，N′−ジメチル−ｍ−アミノフエノ
ール、４−メチル−２−アミノフエノール、５−
アミノ−２−ヒドロキシ安息香酸、２−アミノ−
３−ヒドロキシ安息香酸、ｏ−アミノフエノー
ル、ｍ−アミノフエノール、ｐ−アミノフエノー
ルなどが挙げられる。アニリン系化合物の例とし
ては、アニリン、ｏ−トルイジン、ｍ−トルイジ
ン、ｐ−トルイジン、Ｎ−メチルアニリン、Ｎ−
エチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、
Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−
ｏ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−トルイ
ジン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｏ−トルイジン、Ｎ，
Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジエチ
ル−ｐ−トルイジン、ｏ−クロロアニリン、ｍ−
クロロアニリン、ｍ−ブロモアニリン、アントラ
ニル酸、３−アミノ安息香酸、ｐ−ジメチルアミ
ノ安息香酸、ｐ−クロロ−ｏ−トルイジン、３−
アミノ−４−メチル安息香酸、ｍ−フエニルレン
ジアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−フエニレンジ
アミン、２−メチル−ｍ−フエニレンジアミン、
４−メチル−ｏ−フエニレンジアミン、４−メチ
ル−ｍ−フエニレンジアミン、２−クロロ−ｍ−
フエニレンジアミン、３−クロロ−ｏ−トルイジ
ン、２−メトキシ−５−クロロアリニン、ｏ−エ
チルアニリン、２，５−ジエトキシアニリン、Ｎ
−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアエリン、Ｎ−
エチルＮ−ヒドロキシエチル−ｍ−トルイジンな
どが挙げられる。ナフトール系化合物の例として
はα−ナフトール、β−ナフトール、２−カルボ
キシ−１−ナフトール、４−クロロ−１−ナフト
ール、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、１−ナ
フトール−２−スルホン酸、１−ナフトール−３
−スルホン酸、１−ナフトール−４−スルホン
酸、２−ナフトール−６−スルホン酸、２−ナフ
トール３，６−ジスルホン酸などが挙げられる。

上記の酸化縮合においては、PHを約４〜12の範
囲内で反応を行わせることにより発色反応が定量
的に完成する。上記PHの維持のための緩衝液また
はアルカリ水溶液としては、炭酸塩緩衝液、リン
酸塩緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、水酸化アルカリ水
溶液などが有効に使用できる。

上記の酸化縮合は、アニリン誘導体〔〕とカ
プラーを酸化縮合することのできる酸化剤の存在
下で行われる。このような酸化剤としては、通常
過ヨウ素酸塩、クロラミンＴ、次亜鉛素酸塩など
のハロゲン系酸化剤もしくは過硫酸塩などの過酸
化合物系酸化剤、過酸化水素などが挙げられる
が、メタ過ヨウ素酸ナトリウムは好適な一例であ
る。

アニリン誘導体〔〕と上記カプラーとの酸化
縮合により生ずる発色化合物は、カプラーの種類
により極大吸収波長が約550〜770nｍに幅広く分
布するが、通常はほとんど570〜680nｍに極大吸
収を有す有色系色素であり、呈色も極めて高感度
で安定性もよく、しかも温度によ変動もほとんど
なく生体試料中のビリルビンなどの夾雑物による
影響も受けにくいため、正の誤差もほとんど受け
ることがないので、LAPなどのペプチターゼ活
性測定に極めて好結果を与える。

上記のアニリン誘導体〔〕を呈色定量する他
の方法としてはペンタシアノ鉄錯塩を過酸化物で
処理して呈色液を調整して発生させる方法があ
る。上記の過酸化物としては過ヨウ素酸ナノリウ
ム塩、過ヨウ素酸カリウム塩、過マンガン酸カリ
ウム、過酸化水素などが挙げられるが、過酸化水
素は最も好適な一例である。上記鉄錯塩は重炭酸
塩、例えば重炭酸ナトリム、重炭酸リチウム、重
炭酸カリウムなどと低分子デキストランを配合す
るとさらに安定な鉄錯塩試薬が得られる。また、
これらの配合試薬は凍結乾燥により、鉄錯が非常
に安定化されるので、呈色用反応試薬としてキツ
ト化する場合は連結乾燥式試薬とすることが望ま
しい。

上記の鉄錯塩を用いて呈色反応を行う場合に
は、酸性側で反応を進行する方が好ましい。使用
し得るPHとしては３〜７が好ましく、４〜5.5が
最も好ましい。上記のPHを維持するために通常弱
酸性の緩衝液が用いられるが、特に乳酸塩、クエ
ン酸塩、シユウ酸塩などの緩衝液が好ましい。緩
衝液の濃度は0.01〜10Mの範囲内で使用し得る
が、0.05〜0.4の範囲内の濃度が特に好ましい。
上記の鉄錯塩とアニリン誘導体〔〕との反応に
よつて形成される発色化合物は極大吸収波長が
700nｍ付近に分布し、色長が安定なためLAPな
どのペプチターゼ活性測定に適している。

さらに、ナトリウムペンタシアノアコフエリア
ートNa₂〔Fe（CN）₅・H₂O〕を、遊離したアニリ
ン誘導体〔〕と反応させて発色化合物を形成せ
しめ、その発色化合物の量を比色定量してLAP
などのペプチターゼ活性測定を行つてもよい。

さらにまた、芳香族アミンを発色定量する方
法、例えばジアゾカツプリング法、アルデヒド系
化合物を反応させて生成するシツフ塩基を定量す
る方法など公知の種々の化学的発色法を適用して
アニリン誘導体〔〕を発色定量することにより
LAPなどのペプチターゼ活性測定を行つてもよ
い。

次に、LAP活性測定について更に詳しく説明
する。LAPの活性測定を行うに当たつては、先
ずLAPの合成基質であるＬ−ロイシル−３，５
−ジハロゲノ−４−ヒドロキシアニリドに被験液
中のLAPを酵素反応させてアニリン誘導体〔〕
を遊離させる。被験液として血清が0.01〜５mlの
範囲内で用いられる。上記酵素反応は通常37℃付
近で５分以上反応させればよい。この反応の至適
PHは6.5〜8.0の範囲にあるから、この範囲内で適
宜PHを設定すればよい。PHを保持するための緩衝
液としては、リン酸塩、バルビタール、ホウ酸
塩、トリスヒドロキシメチルアミノメタンなどの
緩衝液が用いられる。

生成したアニリン誘導体〔〕を定量するに当
たつては、ｐ−キシレノールなどのカプラー共存
下でアルカリの条件下メタ過ヨウ素酸ナトリウム
などの酸化剤で酸化縮させて発色化合物を形成し
て比色定量してもよく、また過酸化水素などの酸
化剤でペンタシアノアミノフエロエートを酸化し
て得た呈色試薬を用いて発色させ、比色定量して
もよい。

前記したように本発明の合成基質を用いる測定
法は、各反応工程が簡便なため、速やかにかつ正
確なLAPなどのペプチターゼ活性値を測定する
ことができるばかりでなく、生成する発色化合物
が通常550〜750nｍ付近に極大吸収を有するた
め、生体試料中の夾雑物による影響を受けにく
く、ペプチダーゼ活性測定において精度の高い方
法である。

次に実施例および参考例を挙げて本発明を具体
的に説明するが、これによりなんら本発明を限定
するものではない。

なお、実施例および参考例中に記載の略記号は
次の意味を有する。

Leu；Ｌ−ロイシル BOC；ｔ−ブチルオキシカルボニル OSu；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル AcOH；酢酸、 実施例 １ Ｌ−ロイシル−３，５−ジクロロ−４−ビドロ
キシアニリド・塩酸塩 ２，６−ジクロロ−４−アミノフエノール1.78
ｇ（10ミリモル）および炭酸水素ナトリウム1.26
ｇ（15ミリモル）を水25mlに溶かし、これを０〜
５℃に冷却しつつ、BOC−Leu−OSu3.28ｇ（10
ミリモル）のジオキサン（25ml）溶液を撹拌滴下
した。室温で一夜撹拌した後、30℃以下でジオキ
サンを減圧下留去した。残渣を酢酸エチル200ml
に溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、
1N塩酸、飽和食塩水の順で各50mlで３回づつい
洗浄した。酢酸エチル層を無水硫酸マグネシウム
で乾燥した後、減圧濃縮してBOC−Ｌ−ロイシ
ル−３，５−ジクロロ−４−ヒドロキシアニリド
2.96ｇを得た。次いで３これを2N−Hcl／AcOH
15mlに溶かし、室温で２時間撹拌した後、乾燥ジ
エチルエーテル100mlを加えで結晶下し、乾燥エ
ーテルで２回デカンテーシヨンした。得られた結
晶を減圧乾燥してＬ−ロイシル−３，５−ジクロ
ロ−４−ヒドロキシアニリド・塩酸塩を得た。

収 量；1.89（収率57.7％） 分子式；C₁₂H₁₆O₂Cl₂.HCl 融 点；127〜133℃（分解） シリカゲル薄層クロマトクラフイー（TLC）；Rf
＝0.63〔ｎ−ブタノール−酢酸−水（４：１：
１）〕 IRチヤート（KBr法）；第１図に示す通り 実施例 ２ Ｌ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロ
キシアニリド・塩酸塩 ２，６−ジクロロ−４−アミノフエノール4.90
ｇ（18.3ミリモル）および炭酸水素ナトリウム
1.68ｇ（20ミリモル）を水70mlに溶かし、これを
０〜５℃に冷却しつつ、BOC−Leu−OSu6.01ｇ
（18.3ミリモル）のジオキサン（70ml）溶液を撹
拌滴下した。室温で一夜撹拌した後、30℃以下で
ジオキサンを減圧下留去した。残渣を酢酸エチル
400mlに溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、
水、1N塩酸、飽和食塩水の順で各100mlで３回づ
つ洗浄した。酢酸エチル層を無水硫酸マグネシウ
ムで乾燥した後、減圧濃縮してBOC−Ｌ−ロイ
シル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリ
ド5.8ｇを得た。次いで、これを2N−Hcl／
ACOH 30mlに溶かし、室温で２時間撹拌した
後、乾燥エーテルを加えて結晶化させてＬ−ロイ
シル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリ
ド・塩酸塩を得た。

収 量；2.50g（収率32.8％） 分子式；C₁₂H₁₆O₂Br₂.HCl（416.54）シリカゲル
薄層クロマトクラフイー（TLC）；Rf＝0.65
〔ｎ−ブタノール−酢酸−水＝４：１：１）〕 融 点；131〜134℃（分解） IRチヤート（KBr法）；第２図に示す通り 参考例 １ Ｌ−ロイシル−３，５−ジクロロ−４−ヒドロ
キシアニリド、メタ過ヨウ素酸ナトリウム、ｐ
−キシレノールを用いるLAP活性測定 Ｌ−ロイシル−３，５−ジクロロ−４−ヒドロ
キシアニリド・塩酸塩を0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.0）に溶解して基質溶液とした（５ｍＭ）。この
基質溶液１mlに、患者血清（236G−Ｒ単位の
LAP）20μlを加えてよく混合し、37℃にて20分
間反応させた。反応後、２ｍＭメタ過ヨウ素酸ナ
トリウ、10ｍMp−キシレノールを含有する0.2N
−KOH溶液からなる酸化試薬液３mlを加え反応
せしめて発色させた。

次いで、これを波長585nｍにおいて発色液の
吸光度を測定したところO.D₅₈₅＝0.18を得た。

すなわち、本発明の合成基質は、臨床上、重要
とされているLAPに対してよく作用することが
示された。

参考例 ２ Ｌ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロ
キ シアニリド、メタ過ヨウ素酸ナトリウム、ｐ−
キシレノールを用いるLAP活性測定Ｌ−ロイシ
ル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリ
ド・塩酸塩を0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解
して基質溶液とした（５ｍＭ）。この基質溶液１
mlに．患者血清（250G−Ｒ単位のLAP）20μlを
加えてよく混合し、37℃にて20分間反応させた。
反応後、２ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム、10ｍ
Mp−キシレノールを含有する0.2N−KOH溶液
からなる酸化試薬液３mlを加え反応せしめて発色
させた。

次いで、これを波長585nｍにおいて発色液の
吸光度を測定したところO.D₅₈₅＝0.22を得た。

すなわち、本発明の合成基質は、臨床上、重要
とされているLAPに対してよく作用することが
示された。

参考例 ３ Ｌ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロ
キシアニリド、メタ過ヨウ素酸ナトリウム、２
−クロロ−５−メチルフエノールを用いる
LAP活性測定 Ｌ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロ
キシアニリド・塩酸塩を0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.0）に溶解して基質溶液とした（５ｍＭ）。この
基質溶液１mlに、患者血清（250G−Ｒ単位の
LAP）20μlを加えてよく混合し、37℃にて20分
間反応させた。反応後、２ｍＭメタ過ヨウ素酸ナ
トリウム、5mM2−クロロ−５−メチルフエノー
ルを含有する0.2N−KOH溶液からなる酸化試薬
液３mlを加え反応せしめて発色させた。

次いで、これを635nｍにおいて発色液の吸光
度を測定したところO.D₆₃₅＝0.33を得た。

すなわち、本発明の合成基質は、臨床上、重要
とされているLAPに対してよく作用することが
示された。

参考例 ４ Ｌ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロ
キシアニリド、ナトリウムペタシアノアミノフ
エロートを用いるLAP活性測定 ナトリウムペンタシアノアミノフエロート２ｇ
を水20mlに溶解し、0.3％過酸化水素60mlを加え、
更に10％重炭酸ナトリウム液20mlを加えた。次に
デキストランT10（フアルマシア社製）４ｇを加
え、呈色原液を調整した。反応停止・呈色原液１
mlに１％食塩および0.5％Tween80を含有する
0.2Mのクエン酸緩衝液（PH4.5）50mlを加えて調
整した。

0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解した５ｍＭ
Ｌ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロ
キシアニリド・塩酸塩１mlに患者血清（250G−
Ｒ単位のLAP）20μlを加えよく混合し、37℃に
て20分間反応させた。反応後、反応停止・呈色液
５mlを加え、室温に20分間放置し、呈色させた
700nｍにて吸光度を測定した。その結果、O.D₇₀₀
＝0.12であつた。

参考例 ５ Ｌ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロ
キシアニリド、ナトリウムペンタシアノアコフ
エリアートを用いるLAP活性測定 Ｌ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロ
キシアニリド・塩酸塩を0.1Mリン賛緩衝液（PH
7.0）に溶解して基質溶液（５ｍＭ）とした。こ
の基質溶液１mlに患者血清（250G−Ｒ単位の
LAP）20μlを加えよく混合し、37℃にて15分間
反応させた。反応後、１％−ナトリウムペンタシ
アノアコフエリアート30mlに0.2M EDTA・2Na
（PH11）溶液90mlを加えて調整した溶液４mlを加
え、37℃にて15分間反応させた。反応呈色後、
730nｍにで吸光度を測定した。その結果、O.D₇₃₀
＝0.232であつた。

１％−ナトリウムペンタシアノアコフエリアー
トは、１％−ニトロプルシツドナトリウムNa
〔Fe（CH）₅ND〕−１％炭酸ナトリウム液を15分
間、紫外線照射して作製した。

【図面の簡単な説明】

第１図はＬ−ロイシル−３，５−ジクロロ−４
−ヒドロキシアニリド・塩酸塩のIRチヤート、
第２図はBOC−Ｌ−ロイシル−３，５−ジブロ
モ−４−ヒドロキシアニリドのIRチヤートを示
す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式 （式中、ＲはＬ−ロイシル基、ＸおよびＹは同一
   かまたは異なり、ハロゲン原子を示す）で表され
   るアミド化合物またはその塩。 ２ ＲがＬ−ロイシル基であり、ハロゲン原子が
   臭素原子または塩素原子である特許請求の範囲第
   １項記載のアミド化合物またはその塩。 ３ Ｌ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４−ヒド
   ロキシアニリドまたはＬ−ロイシル３，５−ジク
   ロロ−４−ヒドロキシアニリドである特許請求の
   範囲第２項記載のアミド化合物またはその塩。