JPH0418840B2 - - Google Patents

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JPH0418840B2
JPH0418840B2 JP8249383A JP8249383A JPH0418840B2 JP H0418840 B2 JPH0418840 B2 JP H0418840B2 JP 8249383 A JP8249383 A JP 8249383A JP 8249383 A JP8249383 A JP 8249383A JP H0418840 B2 JPH0418840 B2 JP H0418840B2
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JP
Japan
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glutamyl
hydroxyanilide
leucyl
group
reaction
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JP8249383A
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JPS6047697A (ja
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Kunio Matsumoto
Hideo Misaki
Akira Ootsuka
Seiji Takahashi
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Toyo Jozo KK
Original Assignee
Toyo Jozo KK
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Publication date
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Description

【発明の詳现な説明】 本発明は、匏䞀般匏 匏䞭、R1は−ロむシル基たたはγ−−グ
ルタミル基を瀺し、R2、R3、R4、R5およびR6は
各々氎玠原子、ハロゲン原子、䜎玚アルキル基、
䜎玚アルコキシ基、アミノ基、眮換アミノ基、氎
酞基、カルボキシル基たたはスルホン酞基を瀺
すで衚わされるアミド化合物たたはその氎溶性
塩を合成基質ずする被隓䞭のペプチダヌれの新芏
な掻性枬定法に関する。
ペプチダヌれは䞀般的にはペプチドのペプチド
結合に䜜甚しおアミノ末端から切断しおアミノ酞
たたはより䜎玚のペプチドを遊離させる酵玠の総
称ずしお叀くから知られおいる。䟋えばロむシン
アミノペプチダヌれ臚床化孊においおTrue
LAPずもいうやアリルアミダヌれ臚床化孊
においおClinical LAPずもいう、以䞋時ずしお
AAず称するなどのアミノペプチダヌれ以䞋
True LAPずClinical LAPを䜵せお単にLAPず
称するシスチンアミノペプチダヌれ、プロリン
アミノペプチダヌれ、アルギニンアミノペプチダ
ヌれ、アラニンアミノペプチダヌれ、γ−グルタ
ミルトランスペプチダヌれγ−GTPなどが
知られおいる。
䞊蚘酵玠のうち、特にロむシンアミノペプチダ
ヌれLAPやγ−グルタミルトランスペプチ
ダヌれγ−GTPは、生䜓内のあらゆる組織
に広く分垃し、血枅䞭にも存圚しおおり、病的条
件によ぀お増加するこずが知られおおり、臚床怜
査䞊重芁な酵玠掻性枬定項目の察称ずな぀おいる
酵玠であり、そのLAP掻性枬定法、γ−GTP掻
性枬定法も皮々報告されおいる。
䟋えば、それらの倧郚分は合成基質よりLAP
によ぀お遊離されるアミン化合物を比色定量する
こずによりLAP掻性倀を求める方法であ぀お、
これに甚いる合成基質ずしお−ロむシル−−
ニトロアニリドを甚い、LAPの酵玠䜜甚により
生成する−ニトロアニリンの黄色を比色定量す
る方法が挙げられるが、この比色定量の際、その
合成基質の呈色波長がオヌバヌ・ラツプする欠点
があり、たた血枅成分、特にビリルビン圢色玠に
よる枬定の圱響も免れるこずが出来ない欠点があ
぀た。さらに、合成基質ずしお−ロむシル−β
−ナフチルアミドを甚いる方法が挙げられるが、
この方法では生成するβ−ナフチルアミンに−
ニトロ−−アミノメトキシベンれンアゟテヌト
などをカツプリングさせお色玠を圢成させるかあ
るいは生成するβ−ナフチルアミンを亜硝酞ナト
リりムでゞアゟ化し、−−ナフチル−゚チ
レンシアミンにカツプリングさせるか、もしくは
−ゞメチルアミノベンズアルデヒドたたは−
ゞメチルアミノシンナムアルデヒドを瞮合させお
色玠を圢成せしめ、次いでこれを比色定量する方
法であるが、反応過皋が耇雑で、か぀厳密な操䜜
を必芁ずするため、怜査法ずしお尚䞍䟿であるば
かりでなく、暙準物質たるβ−ナフチルアミンの
毒性が著しく、近幎膀胱の腫瘍や癌を発生するこ
ずが明らかずな぀たゝめ、発癌物質ずしお、その
䜿甚に特に厳密な泚意を甚いるなどの欠点があ぀
た。
又、−ロむシル−−アミノアニリド誘導䜓
あるいは、−ロむシル−−ヒドロキシアニド
誘導䜓を合成基質ずしお甚い、LAPによ぀お遊
離されるアミン化合物を、カプラヌを共存させ、
化孊的酞化剀を甚いお酞化瞮合しお生成する色玠
を比色定量しお枬定する方法特公昭54−32359
号公報も報告された又実甚化されおいるが、こ
れたでの方法はすべお二段反応である為、操䜜が
煩雑で枬定に長時間を芁するなどの点で自動分析
におけるレむトアツセむ法ずしおは実甚性に欠け
おいた。
たた、γ−GTP掻性の枬定法も倚数報告され
おいるが、それらの倧郚分は合成基質よりγ−
GTPによ぀お遊離されるアミン化合物を比色定
量するこずによりγ−GTP掻性倀を求める方法
であ぀お、それを甚いる合成基質ずしおγ−−
グルタミル−−ニトロアニリドを甚い、γ−
GTPの酵玠䜜甚により生成する−ニトロアニ
リンの黄色を410nで比色定量する方法が挙げ
られるが、血枅成分、特にビリルビン系色玠など
の圱響を避けるため、各怜䜓に察しお怜䜓ブラン
クを厳密に枬定しなければならず、正確な枬定倀
を埗るこずが困難であるずいう欠点があ぀た。た
た生成する−ニトロアニリンを−ゞメチルア
ミノシンナムアルデヒド、−ゞメチルアミノベ
ンズアルデヒドなどのアルデヒド化合物ず瞮合さ
せお長波長偎の赀色で枬定する方法も挙げられる
が、発色感床に察する枩床の圱響が倧きく、枬定
倀の再珟性に問題があ぀た。たた生成する−ニ
トロアニリンをゞアゟ化し、−キシレノヌ
ルず瞮合させお生ずる赀色を枬定する方法が提案
されたが反応操䜜段階で倚く簡䟿性に欠けるずい
う欠点があ぀た。さらに合成基質ずしおγ−−
グルタミル−β−ナフチルアミドを甚いれ方法が
挙げられるが、これらの方法ずしおγGTPにより
遊離したβ−ナフチルアミンをゞアゟニりム塩ず
しお比色定量する方法、−メチル−−ベンゟ
チアゟリノンヒドラゟンず酞化剀で発色させお比
色定量する方法、たたは前蚘アルデヒド化合物を
発色剀ずしお瞮合させお比色定量する方法がある
が、前蚘ず同様β−ナフチルアミンの発癌性が䞀
般に指摘されおいるずころであり、操䜜が煩雑で
枬定に長時間を芁するなどの点で実甚性に欠けお
いる。又、−γ−グルタミル−−アミノアニ
リド誘導䜓や−γ−グルタミル−−ヒドロキ
シアニリド誘導䜓を合成基質ずしお甚い、γ−
GTPによ぀お遊離されるアミン化合物を、カプ
ラヌを共存させ、化孊的酞化剀を甚いお酞化瞮合
しお生成する色玠を比色定量しお枬定する方法も
報告され実甚化されおいるが、これたでの方法は
すべお二段反応である為、操䜜が煩雑で枬定に長
時間を芁するなどの点で、自動分析におけるレむ
トアツセむ法ずしおは実甚性に欠けおいる。
本発明者らは、かゝる欠点を有する埓来の
LAPやγ−GTP掻性枬定法を改良すべく鋭意研
究を続けた結果、LAPやγ−GTP掻性枬定にお
いお、化孊的酞化剀の代りに、酞化瞮合を行なわ
せる酵玠、䟋えば、アスコルビン酞オキシダヌれ
やラツカヌれなどを甚いる方法を芋い出し、䞀段
階反応で簡䟿にLAPやγ−GTP掻性枬定が行な
える。すなわち、レむトアツセむ法をなし埗るこ
ずを完成した特願昭57−198862号。
曎に、本発明者らは、酞化瞮合反応を詳现に怜
蚎した結果、通垞、過ペり玠酞ナトリりム、次亜
塩玠酞ナトリりム、過マンガン酞カリりムなどの
化孊的酞化剀は酵玠掻性を倱なわせる䜜甚を有し
おいるが、党く意倖にも、化孊的酞化剀のうち、
プリシアン化カリりムのみがLAP、γ−GTP
を阻害しない事を芋い出した。しかも、プリシ
アン化カリりムずカプラヌ共存䞋で、段階で
LAP、γ−GTPが枬定できる、すなわち、レむ
トアツセむ法が行なえる事を芋い出し、本発明を
完成したものである。
プリシアン化カリりムの様な酞化剀は、通
垞、酵玠掻性を倱なわせる䜜甚を有しおいるの
で、プリシアン化カリりム存圚䞋での酵玠反応
は考えられない事であ぀た。
プリシアン化カリりムの濃床は、LAP掻性
枬定の堎合、0.1〜が良奜で、特に0.25〜
が奜適であるが、又、γ−GTP掻性枬定
の堎合、0.1〜が良奜で、特に、0.5〜
が奜適であるこずを芋い出した。
本発明はアミド化合物〔〕たたはその塩に、
被隓液に含有されおいるペプチダヌれを、 匏䞭、R1は−ロむシル基たたはγ−−グ
ルタミル基を瀺し、R2、R3、R4、R5およびR6は
各々氎玠原子、ハロゲン原子、䜎玚アルキル基、
䜎玚アルコキシ基、アミノ基、眮換アミノ基、氎
酞基カルボキシル基たたはスルホン酞基を瀺す
プリシアン化カリりムずカプラヌ共存䞋で、䞀
段反応を行い、生成する発色化合物を比色定量す
る事を特城ずする枬定法である。
本発明においおペプチダヌれの合成基質ずしお
甚いられるアミド化合物〔〕は、ペプチド合成
の垞法によ぀お補造するこずができる。即ち、
−ロむシンのα−カルボキシル基や−グルタミ
ン散のγ−カルボキシル基ずアニリン誘導䜓
〔〕ずの瞮合反応により埗られる。
䞊蚘の瞮合反応に際しおは、予め反応に関䞎し
おはならない官胜基、即ち−ロむシンのα−ア
ミノ基や−グルタミン酞のα−アミノ基および
α−カルボキシル基を保護するのがよい。α−ア
ミノ基の保護基ずしおは通垞ペプチド合成に甚い
られるα−アミノ保護基が甚いられる。䟋えば
−ブチルオキシカルボニル、−アミルオキシカ
ルボニル、ベンゞルオキシカルボニル、−ニト
ロベンゞルオキシカルボニル、アダマンタチルオ
キシカルボニル、−ニトロプニルチオ基など
が挙げられる。−グルタミン酞のα−カルボキ
シル基はメチル゚ステル、゚チル゚ステル、−
ブチル゚ステル、ベンゞル゚ステル、−ニトロ
ベンゞル゚ステル、−メトキシベンゞル゚ステ
ルなどで保護するのが奜たしいが、脱離の際α−
アミノ基の保護基ず共に䞀段階で脱離される条件
で脱離されるような保護基で保護するのが特に奜
たしい。䟋えばα−アミノ基をベンゞルオキシカ
ルボニル基、α−カルボキシル基をベンゞル゚ス
テルで保護するのがその䞀䟋である。
䞊蚘瞮合反応に甚いるアニリン誘導䜓〔〕の 匏䞭、R2、R3、R4、R5およびR6は前蚘ず同じ
意味を有する 䟋ずしおは、−ゞブロモ−−ヒドロキ
シアニリン、−ゞクロロ−−ヒドロキシ
アニリン、−クロロ−−ブロモ−−ヒドロ
キシアニリン、−ゞ゚チル−−プニレ
ンゞアミレ、−メチル−−ゞ゚チルアミノア
ニリン、−ゞメチル−−プニレンゞア
ミン、−ゞ−−プロピル−−プニレ
ンゞアミン、−アミノサリチル酞、−スルホ
−−ヒドロキシアニリンなどが挙げられる。
䞊蚘の瞮合反応は、α−アミノ基が保護された
−ロむシンのα−カルボキシル基たたはα−ア
ミノ基およびα−カルボキシル基が保護された
−グルタミン酞のγ−カルボキシル基を酞ハラむ
ド、酞無氎物、酞アゞド、酞むミダゟリド、掻性
゚ステル、䟋えばシアノメチル゚ステル、−ニ
トロプニル゚ステル、−ゞニトロプニ
ル゚ステル、−ヒドロキシスクシンむミド゚ス
テル、−ヒドロキシフタルむミド゚ステルなど
の掻性化アシル誘導䜓に倉換しおアニリン誘導䜓
〔〕ず反応させるか、あるいはカルボゞむミド、
䟋えばN′−ゞシクロヘキシルカルボゞむミ
ド、N′−カルボニルむミダゟヌル、む゜オ
キサゟリりム塩、䟋えばりツドワヌド詊薬などの
瞮合剀の存圚䞋䞊蚘の保護された−ロむシンた
たは−グルタミン酞ずアチリン誘導䜓〔〕を
反応させるこずにより行われる。
䞊蚘の瞮合反応においおは、通垞䞍掻性有機溶
媒、䟋えばゞメチルホルムアミド、ゞメチルアセ
トむアミド、ゞメチルスルホキシド、テトラヒド
ロフラン、ゞオキサン、ベンれン、クロロホル
ム、ゞクロロメタン、ゞクロロ゚タンなどの溶媒
䞭、䞡者ほが等量を加え、宀枩たたはそれ以䞋の
枩床で反応させるこずにより行われる。䞊蚘の反
応経過はシリカゲルなどの薄局クロマトグラフむ
ヌTLC、高速液䜓クロマトグラフむヌ
HPLCなどにより远跡できるので、出発物質
のいずれかの消倱を埅぀お適宜反応を終了すれば
よい。
このようにしお埗られた反応生成物は、反応溶
媒を留去するかたたは留去するこずなく、非芪氎
性有機溶媒、䟋えばクロロホルム、ゞクロロメタ
ン、酢酞゚チル、酢酞ブチル、メチルむ゜ブチル
ケトン、ベンれン、ゞ゚チル゚ヌテルなどに溶か
し、酞性氎およびアルカリ性氎で掗浄した埌、溶
媒を留去するこずにより採取できる。さらに粟補
する必芁がある堎合には、適圓な再結溶媒で再結
晶化するか、あるいはシリカゲル、掻性アルミ
ナ、吞着暹脂などの吞着剀を甚いるカラムクロマ
トグラフむヌにより粟補するこずができる。
次いで埗られた反応生成物の保護基を脱離する
のであるが、この脱離化はペプチド化孊における
保護基の脱離法を甚いお行われる。䟋えばα−ア
ミノ保護基が−ブチルオキシカルボニル基であ
る堎合には、2N塩化氎玠の酢酞溶液、トリフル
オロ酢酞、ギ酞などを甚いる方法、ベンゞルオキ
シカルボニル基である堎合には、パラゞりム−炭
玠觊媒を甚いる接觊還元により方法、臭化氎玠酞
の酢酞溶液を甚いる方法により行えばよい。−
グルタミン酞のα−カルボキシル基の保護基がベ
ンゞル゚ステルである堎合には、パラゞりム−炭
玠觊媒を甚いる接觊還元による方法で行えばよ
い。
このようにしお埗られたアミド化合物〔〕を
反応液から採取するには、先ず保護基の脱離化が
酞分解による堎合には、䞭和し、接觊還元による
堎合には觊媒を陀去した埌、非芪氎性有機溶媒、
䟋えばクロロホルム、ゞクロロメタン、ゞクロロ
゚タン、酢酞゚チル、酢酞ブチル、メチルむ゜ブ
チルケトン、ベンれン、ゞ゚チル゚ヌテルなどの
溶媒䞭、酞性氎およびアルカリ性氎で掗浄した
埌、溶媒を留去するこずにより採取できる。さら
に粟補する必芁がある堎合には、適圓な再結溶媒
で再結晶化するか、あるいはシリカゲル、掻性ア
ルミナ、吞着暹脂などの吞着剀を甚いるカラムク
ロマトグラフむヌにより粟補するこずができる。
このようにしお埗られたアミド化合物〔〕の
奜たしい化合物を䟋瀺すれば、−ロむシル−
−ゞハロゲノ−−ヒドロキシアニリド、
䟋えば−ロむシル−−ゞブロモ−−ヒ
ドロキシアニリド、−ロむシル−−ゞク
ロロ−−ヒドコキシアニリドなどが挙げられ、
たた䞋蚘䞀般匏 匏䞭R7、R8は䜎玚アルキル基を瀺し、R9は氎
玠原子たたは䜎玚アルキル基を瀺すで衚わされ
る−ロむシル−−アミノアニリド誘導䜓、䟋
えば−ロむシル−−−ゞ゚チルアミノ
アニリド、−ロむシル−−メチル−−
−ゞ゚チルアミノアニリド、−ロむシル−
−−ゞメチルアミノアニリド、−ロむシ
ル−−ゞ−−プロピルアミノアニリドなどが
挙げられ、さらに䞋蚘䞀般匏 匏䞭、R10はカルボキシル基たたはスルホン酞
基を瀺すで衚わされる−ロむシル−−ヒド
ロキシアニリド誘導䜓、䟋えば−ロむシル−
−カルボキシ−−ヒドロキシアニリド、−ロ
むシル−−スルホ−−ヒドロキシアニリドな
どが挙げられ、たた、γ−−グルタミル−
−ゞハロゲノ−−ヒドロキシアニリド、䟋え
ばγ−−グルタミル−−ゞブロモ−−
ヒドロキシアニリド、γ−−グルタミル−
−ゞクロロ−−ヒドロキシアニリドなどが挙
げられ、さらに䞋蚘䞀般匏 匏䞭、R11、R12は氎酞基を有しおもよい䜎玚
アルキル基を瀺し、R13は氎玠原子、䜎玚アルキ
ル基、カルボキシル基たたはスルホン酞基を瀺
すで衚されるγ−−グルタミル−−アミノ
アニリド誘導䜓、䟋えばγ−−グルタミル−
−−ゞメチルアミノアニリド、γ−−グ
ルタミル−−−ゞ゚チルアミノアニリ
ド、γ−−グルタミル−−−ゞ−−
プロピルアミノアニリド、γ−−グルタミル−
−メチル−−−ゞ゚チルアミノアニリ
ド、γ−−グルタミル−−−゚チル−−
ヒドロキシ゚チルアミノアニリドなどが挙げら
れ、たたγ−−グルタミル−−ヒドロキシア
ニリド誘導䜓、䟋えばγ−−グルタミル−−
カルボキシ−−ヒドロキシアニリドが挙げられ
る。
本アミド化合物〔〕は必芁に応じ、塩酞、硫
酞、硝酞、リン酞などの無機酞ずの塩、ギ酞、酢
酞、プロピオン酞、リンゎ酞、ク゚ン酞、酒石
酞、シナり酞などの有機酞ずの塩を圢成するこず
ができる。
次に、本アミド化合物〔〕を甚いるペプチダ
ヌれ掻性枬定法に぀いお述べる。本枬定法におい
おは、䞊蚘アミド化合物〔〕たたはその塩に被
隓液に含有されおいるペプチザヌれ、特にLAP
たたはγ−GTPを、プリシアン化カリりムず
カプラヌ共存䞋で、䞀段反応を行い、生成する発
色化合物を比色定量するものである。䜿甚するカ
プラヌずしおは、アニリン誘導䜓〔〕ず酞化瞮
合しお発色化合物を圢成する芳銙族化合物であれ
ば、どのような化合物でもよいが、これらのうち
代衚的な芳銙族化合物ずしおはプノヌル系化合
物、アミノプノヌル系化合物、アニリン系化合
物たたはナフトヌル系化合物が挙げられる。プ
ノヌル系化合物の䟋ずしおは、プノヌル、サリ
チル酞、−ヒドロキシ安息銙酞、−ヒドロキ
シ安息銙酞、−ゞヒドロキシ安息銙酞、サ
リチル酞メチル、−クレゟヌル、−クレゟヌ
ル、−クレゟヌル、−゚チルプノヌル、
−゚チルプノヌル、−キシレノヌル、
−キシレノヌル、−キシレノヌル、
−キシレノヌル、−キシレノヌル、
−メトキシプノヌル、−メトキシプノヌ
ル、−メトキシプノヌル、−ゞメトキ
シプノヌル、−クロロプノヌル、−クロ
ロプノヌル、−クロロプノヌル、−
ゞクロロプノヌル、−ゞクロロプノヌ
ル、−ブロモプノヌル、−ブロモプノヌ
ル、−グロモプノヌル、−ゞブロモフ
゚ノヌル、−ゞブロモプノヌル、−メ
チル−−クロロプノヌル、−クロロ−−
メチルプノヌル、−カルボキシメチルプノ
ヌル、−ヒドロキシ−−アミノ゚チルプノ
ヌルなどが挙げられ、アミノプノヌル系化合物
の䟋ずしおは、−クロロ−−アミノプノヌ
ル、−ゞ゚チル−−アミノプノヌル、
−メチル−−アミノプノヌル、−アミノ
−−ヒドロキシ安息銙酞、−アミノ−−ヒ
ドロキシ安息銙酞、−アミノプノヌル、−
アミノプノヌル、−アミノプノヌルなどが
挙げられ、アニリン系化合物の䟋ずしおは、アニ
リン、−トルむゞン、−トルむゞン、−ト
ルむゞン、−メチルアニリン、−゚チルアニ
リン、−ゞメチルアニリン、−ゞ゚
チルアニリン、−ゞメチル−−トルむゞ
ン、−ゞメチル−−トルむゞン、
−ゞ゚チル−−トルむゞン、−ゞ゚チル
−−トルむゞン、−ゞ゚チル−−トル
むゞン、−クロロアニリン、−クロロアニリ
ン、−ブロモアニリン、アントラニン酞、−
アミノ安息銙酞、−ゞメチルアミノ安息銙酞、
−クロロ−−トルむゞン、−アミノ−−
メチル安息銙酞、−プニレンゞアミン、
−ゞメチル−−プニレンゞアミン、−メ
チル−−プニレンゞアミン、−メチル−
−プニレンゞアミン、−メチル−−プニ
レンゞアミン、−クロロ−−プニレンゞア
ミン、−クロロ−−トルむゞン、−メトキ
シ−−クロロアニリン、−゚チルアニリン、
−ゞ゚トキシアニリン、−゚チル−−
ヒドロキシ゚チルアニリン、−゚チル−−ヒ
ドロキシ゚チル−−トルむゞンなどが挙げら
れ、ナフトヌル系化合物の䟋ずしおはα−ナフト
ヌル、β−ナフトヌル、−カルボキシ−−ナ
フトヌル、−クロロ−−ナフトヌル、−ヒ
ドロキシ−−ナフト゚酞、−ナフトヌル−
−スルホン酞、−ナフトヌル−−スルホン
酞、−ナフトヌル−−スルホン酞、−ナフ
トヌル−−スルホン酞、−ナフトヌル−
−ゞスルホン酞などが挙げられる。
䞊蚘の酵玠反応及び酞化瞮合反応は、この反応
の至適PHは6.5〜8.0の範囲にあるから、この範囲
内で適宜PHを蚭定すればよい。PHを保持するため
の緩衝液ずしおは、リン酞塩、バルビタヌル、ホ
り酞塩、トリスヒドロキシメチルアミノメタンな
どの緩衝液が甚いられる。
アニリン誘導䜓〔〕ず䞊蚘カプラヌずの酞化
瞮合により生成する発色化合物は、カプラヌの皮
類により極倧吞収波長が玄550−770nに巟広く
分垃するが、通垞は殆んど570〜680nに極倧吞
収を有する有色系色玠であり、呈色も極めお高感
床で安定性も良く、しかも枩床による倉動も殆ん
どなく、生䜓詊料䞭のビリルビンなどの借雑物に
よる圱響も受けにくいため、正の誀差も殆んど受
けるこずがないので、LAPやγ−GTPなどのペ
プチダヌれ掻性枬定に極めお奜結果を䞎える。
次に、LAPの掻性枬定に぀いお曎に詳しく説
明する。LAPの掻性枬定を行うに圓぀おは、先
ずLAPの合成基質である−ロむシル−
−ゞハロゲノ−−ヒドロキシアニリドに被隓液
䞭のLAPを、プリシアン化カリりムずカプラ
ヌ共存䞋で䞀段反応酵玠反応を行い、生成す
る発色化合物を比色定量すればよい。被隓液ずし
おは血枅を0.01〜mlの範囲内で甚いられる。䞊
蚘酵玠反応は通垞37℃付近で分以䞊反応させれ
ばよい。この反応の至適PHは6.5〜8.0の範囲にあ
るから、この範囲内で適宜PHを蚭定すればよい。
PHを保持するための緩衝液ずしおは、リン酞塩、
バルビタヌル、ホり酞塩、トリスヒドロキシメチ
ルアミノメタンなどの緩衝液が甚いられる。カプ
ラヌずしおは、䟋えば、−キシレノヌルや−
ナフトヌル−−スルホン酞などが甚いられる。
又、プリシアン化カリりムの濃床は、通垞
0.1〜の範囲、奜適量ずしおは0.25〜
であり、歀の範囲で䜿甚すれば充分であ
る。
次にγ−GTPの掻性枬定に぀いお曎に詳しく
説明する。γ−GTPの掻性枬定を行うに圓぀お
は、先ずγ−GTPの合成基質であるγ−−グ
ルタミル−−ゞハロゲノ−−ヒドロキシ
アニリドに被怜液䞭のγ−GTPを、プリシア
ン化カリりムずカプラヌ共存䞋で、䞀段反応酵
玠反応を行い、生成する発色化合物を比色定量
すればよい。被隓液ずしおは血枅を0.01〜mlの
範囲内で甚いられる。䞊蚘酵玠反応は通垞37℃付
近で分以䞊反応させればよい。この反応の至適
PHは7.5〜9.0の範囲にあるから、この範囲内で適
宜PHを蚭定すればよい。反応に際しおは受容䜓ず
しおアミノ酞やペプチド、䟋えばグリシルグリシ
ンの適圓量を含むPH7.5〜9.0の緩衝液䞭で反応さ
せればよい。PHを保持するための緩衝液ずしお
は、リン酞塩、バルビタヌル、ホり酞塩、炭酞
塩、トリ゚タノヌルアミン、グリシン、トリスヒ
ドロキシメチルアミノメタンなどの緩衝液が甚い
られる。カプラヌずしおは、䟋えば、−キシレ
ノヌルや−ナフトヌル−−スルホン酞などが
甚いられる。
又、プリシアン化カリりムの濃床は、通垞
0.1〜の範囲、奜適量ずしおは、0.5〜
であり、歀の範囲で䜿甚すれば充分であ
る。
前蚘したように本発明の合成基質を甚いる枬定
法は、各反応工皋が簡䟿なため、速やかに䞔぀正
確なLAP、γ−GTPなどのペプチダヌデ掻性倀
を枬定するこずができるばかりでなく、生成する
発色化合物が通垞550〜750n附近に極倧吞収を
有するため、生䜓詊料䞭の借雑物による圱響を受
けにくく、ペプチダヌれ掻性枬定が粟床の高い方
法である。
又、プリシアン化カリりムの様な酞化剀は、
通垞酵玠掻性を倱なわせる䜜甚を有しおいる。そ
こで、プリシアン化カリりム存圚䞋での酵玠反
応は考えられない事であ぀た。
本発明方法は、酞化瞮合剀ずしお甚いるプリ
シアン化カリりムが、以倖にも、LAPやγ−
GTPを阻害しないこずを芋い出しお完成したも
のであり、しかも䞀段反応で簡䟿にLAPやγ−
GTPの酵玠掻性枬定がなし埗るものである䞊に、
枬定の自動化が容易になし埗るものであ぀お、埓
来の化孊的発色法の二段反応では䞍可胜であ぀た
レむト・アツセりを可胜にしたものである。
次に参考䟋および実斜䟋を挙げお本発明を具䜓
的に説明するが、これにより本発明を限定するも
のではなく、たた参考䟋は特願昭57−150701号に
蚘茉されおいるものである。
尚、参考䟋䞭に蚘茉の略蚘号は次の意味を有す
る。
Leu−ロむシル −Vluγ−−グルタミル BOC−ブチルオキシカルボニル OSu−ヒドロキシスクシンむミド゚ステル AcOH酢酞 参考䟋  −ロむシル−−ゞクロロ−−ヒドロ
キシアニリド・塩酞塩 −ゞクロロ−−アミノプノヌル1.78
10ミリモルおよび炭酞氎玠ナトリりム1.26
15ミリモルを氎25mlに溶かし、これに〜
℃に冷华し぀ゝBOC−Leu−OSu3.2810ミ
リモルのゞオキサン25ml溶液を攪拌䞋滎䞋
した。宀枩で䞀倜攪拌した埌、30℃以䞋でゞオキ
サンを枛圧䞋留去した。残枣を酢酞゚チル200ml
に溶かし、飜和炭酞氎玠ナトリりム氎溶液、氎、
1N塩酞、飜和食塩氎の順で各50mlで回づ぀掗
浄した。酢酞゚チル局を無氎硫酞マグネシりムで
也燥した埌、枛圧濃瞮しおBOC−−ロむシル
−−ゞクロロ−−ヒドロキシアニリド
2.96を埗た。次いで、これを2N−HCl
AcOH1 mlに溶かし、宀枩で時間攪拌した
埌、也燥ゞ゚チル゚ヌテル100mlを加えお結晶化
し、也燥゚ヌテルで回デカンテヌシペンした。
埗られた結晶を枛圧也燥しお−ロむシル−
−ゞクロロ−−ヒドロキシアニリド・塩酞塩
を埗た。
収量 1.89収率57.7 分子匏 C12H16N2O2Cl2・HCl 融点127〜133℃分解 シリカゲル薄局クロマトグラフむTLCRf
0.63〔−ブタノヌル−酢酞−氎
〕 参考䟋  −ロむシル−−ゞブロモ−−ヒドロ
キシアニリド・塩酞塩 −ゞブロモ−−アミノプノヌル4.90
13.3ミリモルおよび炭酞氎玠ナトリりム
1.6820ミリモルを氎70mlに溶かし、これに
〜℃に冷华し぀぀BOC−Leu−OSu6.01
18.3ミリモルのゞオキサン70ml溶液を攪
拌䞋滎䞋した。宀枩で䞀倜攪拌した埌、30℃以䞋
でゞオキサンを枛圧䞋留去した。残枣を酢酞゚チ
ル400mlに溶かし、飜和炭酞氎玠ナトリりム氎溶
液、氎、1N塩酞、飜和食塩氎の順で各100mlで
回づ぀掗浄した。酢酞゚チル局を無氎硫酞マグネ
シりムで也燥した埌、枛圧濃瞮しおBOC−−
ロむシル−−ゞブロモ−−ヒドロキシア
ニリド5.8を埗た。次いでこれを2N−HCl
AcOH30mlに溶かし、宀枩で時間攪拌した埌、
也燥゚ヌテルを加えお結晶化させお−ロむシル
−−ゞブロモ−−ヒドロキシアニリド・
塩酞塩を埗た。
収量 2.50収率32.8 分子匏 C12H16N2O2Br2・HCl416.54 シリカゲル薄局クロマトグラフむTLCRf
0.65〔−ブタノヌル酢酞氎〕 融点131〜134℃分解 参考䟋  γ−−グルタミル−−ゞクロロ−−
ヒドロキシアニリド −フタロむル−−グルタミン酞無氎物
5.1620ミリモルおよび−アミノ−
−ゞクロロプノヌル3.5620ミリモルをゞ
オキサン50mlに溶かし、60℃で時間攪拌した。
ゞオキサンを枛圧䞋留去し、残枣にヒドラゞン・
ヒドラヌト1.5mlのメタノヌル50ml溶液を加
え、宀枩で日間攟眮した。メタノヌルを枛圧䞋
留去し、残枣に氎を加えた埌、0.5N−HClでPH
に調節しお析出したγ−−グルタミル−
−ゞクロロ−−ヒドロキシアニリド3.96を
埗た。
収量 3.96収率64.5 分子匏 C11H12O4Cl2 融点214〜217℃分解 シリカゲルTLCRf0.49−ブタノヌル酢
酞氎 参考䟋  γ−−グルタミル−−ゞブロモ−−
ヒドロキシアニリド −フタロむル−−グルタミン酞無氎物
2.188.4ミリモルおよび−アミノ−
−ゞブロモプノヌル2.268.4ミリモル
をゞオキサン20mlに溶かし、60℃で1.5時間攪拌
した。ゞオキサンを枛圧䞋留去し、残枣にヒドラ
ゞン・ヒドラヌト0.7mlのメタノヌル20ml溶
液を加え、宀枩で日間攟眮した。メタノヌルを
枛圧䞋留去し、残枣に氎を加おた埌、0.5N−
HClでPHに調節しお析出したγ−−グルタミ
ル−−ゞブロモ−−ヒドロキシアニリド
2.13を埗た。
収量 2.13収率64.0 分子匏 C11H12N2O4Br2 融点191〜194℃分離〔日本薬局方䞀般詊隓
法融点枬定の項に準じお枬定した結果は199〜
200℃に分解であ぀た。〕 シリカゲルTLCRf0.53−ブタノヌル酢
酞氎 実斜䟋  −ロむシル−−ゞブロモ−−ヒドロ
キシアニリド・塩酞塩、−キシレノヌル、フ
゚リシアン化カリりムを甚いるLAP掻性枬定
法 −ロむシル−−ゞブロモ−−ヒドロ
キシアニリド・塩酞塩、−キシレノヌル
およびプリシアン化カリりム0.5を
含有する0.1Mリン酞緩衝液PH7.0を調補しお
基質溶液ずした。歀の基質溶液mlに、LAPを
含有する患者血枅515G−単䜍20Όを加え
お37℃で反応させた。又、歀の反応時間ごずに反
応によ぀お発色する色玠を585nの波長にお吞
光床を枬定した。
その結果を第図に瀺した。
又、比范の為、プリシアン化カリりムの代り
に、化孊的方法で通垞䜿甚されおいる酞化剀、過
ペり玠酞カリりム0.5を䜿甚する以倖は同様
な反応を行な぀たが、第図に瀺した様に、過ペ
り玠酞カリりムがLAP反応を阻害する為、LAP
掻性枬定が枬定䞍可胜であ぀た。
すなわち、本発明に䜿甚した酞化剀、プリシ
アン化カリりムは、LAP反応を阻害せず、LAP
反応が始たるず同時に呈色が起る為、レむトアツ
セむが行なえる特色を有するものであ぀た。
実斜䟋  −ロむシル−−ゞブロモ−−ヒドロ
キシアニリド・塩酞塩、−ナフトヌル−−
スルホン酞、プリシアン化カリりムを甚いる
LAP掻性枬定法 −ロむシル−−ゞブロモ−−ヒドロ
キシアニリド・塩酞塩、−ナフトヌル−
−スルホン酞0.5、プリシアン化カリり
ム0.5を含有する0.1Mリン酞緩衝液PH7.0
を調補しお基質溶液ずした。歀の基質溶液ml
に、LAPを含有する患者血枅515G−単䜍
20Όを加えお37℃で反応させた。又、歀の反応
時間ごずに反応によ぀お発色する色玠を630n
の波長にお吞光床を枬定した。その結果を、第
図に瀺した。歀の第図に瀺す通り、本発明の枬
定法は、LAP掻性を良奜に枬定する事が出来、
しかも、埓来の化孊発色法ず異なり、反応液の呈
色がLAPの反応が始たるず同時に生ずる為、レ
むトアツセむが行なえる特色を有するものであ぀
た。
実斜䟋  −ロむシル−−ゞクロロ−−ヒドロ
キシアニリド・塩酞塩、−キシレノヌル、フ
゚リシアン化カリりムを甚いるLAP掻性枬定
法 実斜䟋の−ロむシル−−ゞブロモ−
−ヒドロキシアニリド・塩酞塩の代りに−ロ
むシン−−ゞクロロ−−ヒドロキシアニ
リド・塩酞塩を甚いる以倖は同様な方法で実斜し
た。その結果を第図に瀺した。歀の第図に瀺
す通り、本発明の枬定法は、LAP掻性を良奜に
枬定する事が出来、しかも、埓来の化孊発色法ず
異なり、反応液の呈色がLAPの反応が始たるず
同時に生ずる為、レむトアツセむが行なえる特色
を有するものであ぀た。
実斜䟋  −ロむシル−−ゞクロロ−−ヒドロ
キシアニリド・塩酞塩、−ナフトヌル−−
スルホン酞、プリシアン化カリりムを甚いる
LAP掻性枬定法 実斜䟋の−ロむシル−−ゞブロモ−
−ヒドロキシアニリド・塩酞塩の代りに、−
ロむシル−−ゞクロロ−−ヒドロキシア
ニリド塩酞塩を甚いる以倖は、同様な方法で実斜
した。
その結果を第図に瀺した。歀の第図に瀺す
通り、本発明の枬定法は、LAP掻性を良奜に枬
定する事が出来、しかも、埓来の化孊発色法ず異
なり、反応液の呈色がLAPの反応が始たるず同
時に生ずる為、レむトアツセむが行なえる特色を
有するものであ぀た。
実斜䟋  γ−−グルタミル−−ゞブロモ−−
ヒドロキシアニリド、−キシレノヌル、プ
リシアン化カリりムを甚いるγ−GTP掻性枬
定法。
γ−−グルタミル−−ゞブロモ−−
ヒドロキシアニリド7.5、グリシルグリシン
100、−キシレノヌル、および、フ
゚リシアン化カリりムを含有する50ト
リスヌ塩酞緩衝液PH7.9を調補しお基質溶液
ずした。歀の基質溶液mlにγ−GTPを含有す
る患者血枅278ml20Όを加えお37℃
で反応させた。又、歀の反応時願こずに反応によ
぀お発色する色玠を585nの波長にお吞光床を
枬定した。
その結果を第図に瀺した。
又、比范の為、プリシアン化カリりムの代り
に、化孊的方法で通垞䜿甚されおいる酞化剀、過
ペり玠酞カリりムを䜿甚する以倖は同様な
反応を行な぀たが、第図に瀺した様に、過ペり
玠カリりムがγ−GTP反応を阻害する為、γ−
GTP掻性偎が枬定䞍可胜であ぀た。
すなわち、本発明に䜿甚した酞化剀、プリシ
アン化カリりム、γ−GTP反応を阻害せず、γ
−GTP反応が始たるず同時に呈色が起る為、レ
むトアツセむが行なえる特色を有するものであ぀
た。
実斜䟋  γ−−グルタミル−−ゞブロモ−−
ヒドロキシアニリド、−ナフトヌル−−ス
ルホン酞、プリシアン化カリりムを甚いるγ
−GTP掻性枬定法。
γ−−グルタミル−−ゞブロモ−−
ヒドロキシアニリド7.5、グリシルグリシン
10、−ナフトヌル−−スルホン酞0.5
、およびプリシアン化カリりムを含有
する50MTris−HCl緩衝液PH7.9を調敎し
お基質溶液ずした。歀の基質溶液mlにγ−
GTPを含有する患者血枅275ml20ÎŒ
を加えお37℃で反応させた。又、歀の反応時間ご
ずに反応によ぀お発色する色玠を630nの波長
にお吞光床を枬定した。
その結果を、第図に瀺した。歀の第図に瀺
す通り、本発明の枬定法は、γ−GTP掻性を良
奜に枬定する事が出来、しかも、埓来の化孊発色
法ず異なり、反応液の呈色が、γ−GTPの反応
が始たるず同時に生ずる為、レむトアツセむが行
なえる特色を有するものであ぀た。
実斜䟋  γ−−グルタミル−−ゞクロロ−−
ヒドロキシアニリド、−キシレノヌル、プ
リシアン化カリりムを甚いるγ−GTP掻性枬
定法。
実斜䟋のγ−−グルタミル−−ゞブ
ロモ−−ヒドロキシアニリドの代りにγ−−
グルタミル−−ゞクロロ−−ヒドロキシ
アニリドを甚いる以倖は同様な方法で実斜した。
その結果を第図に瀺した。歀の第図に瀺す通
り、本発明の枬定方法は、γ−GTP掻性を良奜
に枬定する事が出来、しかも、埓来の化孊発色法
ず異なり、反応液の呈色がγ−GTPの反応が始
たるず同時に生ずる為、レむトアツセむが行なえ
る特色を有するものであ぀た。
実斜䟋  γ−−グルタミル−−ゞクロロ−−
ヒドロキシアニリド、−ナフトヌル−−ス
ルホン酞、プリシアン化カリりムを甚いるγ
−GTP掻性枬定法 実斜䟋のγ−−グルタミル−−ゞブ
ロモ−−ヒドロキシアニリドの代りに、γ−
−グルタミル−−ゞクロロ−−ヒドロキ
シアニリドを甚いる以倖は同様な方法で実斜し
た。その結果を第図に瀺した。歀の第図に瀺
す通り、本発明の枬定方法は、γ−GTP掻性を
良奜に枬定する事が出来、しかも、埓来の化孊発
色法ず異なり、反応液の呈色がγ−GTPの反応
が始たるず同時に生ずる為、レむトアツセむが行
なえる特色を有するものであ぀た。
実斜䟋  −ロむシル−−−ゞ゚チルアミノア
ニリド二塩酞塩、−ナフトヌル−−スルホ
ン酞、プリシアン化カリりムを甚いるLAP
掻性枬定法 −ロむシル−−−ゞ゚チルアミノア
ニリド二塩酞塩、−ナフトヌル−−ス
ルホン酞塩0.5、プリシアン化カリりム塩
0.5を含有する0.1Mリン酞緩衝液PH7.0を
調補しお基質溶液ずした。歀の基質溶液mlに、
LAPを含有する患者血枅515G−単䜍20ÎŒ
を加えお37℃で反応させた。又、歀の反応時間ご
ずに反応によ぀お発色する色玠を655nの波長
にお吞光床を枬定した。
その結果を第図に瀺した。歀の第図に瀺す
通り、本発明の枬定方法は、LAP掻性を良奜に
枬定する事が出来、しかも、埓来の化孊発色法ず
異なり、反応液の呈色がLAPの反応が始たるず
同時に生ずる為、レむトアツセむが行なえる特色
を有するものであ぀た。
実斜䟋 10 −ロむシル−−カルボキシ−−ヒドロキ
シアニリド、−キシレノヌル、プリシアン
化カリりムを甚いるLAP掻性枬定法 −ロむシル−−カルボキシ−−ヒドロキ
シアニリド、−キシレノヌル、フ
゚リシアン化カリりム0.5を含有する0.1Mリ
ン酞緩衝液PH7.0を調補しお基質溶液ずした。
歀の基質溶液mlに、LAPを含有する患者血枅
515G−単䜍20Όを加えお37℃で反応させ
た。又、歀の反応時間ごずに反応によ぀お発色す
る色玠を575nの波長にお吞光床を枬定した。
その結果を第図に瀺した。歀の第図に
瀺す通り本発明の枬定方法は、LAP掻性を良奜
に枬定する事が出来、しかも、埓来の化孊発色法
ず異なり、反応液の呈色がLAPの反応が始たる
ず同時に生ずる為、レむトアツセむが行なえる特
色を有するものであ぀た。
実斜䟋 11 γ−−グルタミル−−−゚チル−−ヒ
ドロキシ゚チルアミノアニリド、−ナフトヌ
ル−−スルホン酞、プリシアン化カリりム
を甚いるγ−GTP掻性枬定法 γ−−グルタミル−−−゚チル−−ヒ
ドロキシ゚チルアミノアニリド7.5、グリシ
ルグリシン100、−ナフトヌル−−スル
ホン酞0.5およびプリシアン化カリりム
を含有する50 Tris−HCl緩衝液PH
7.9を調補しお基質溶液ずした。歀の基質溶液
mlにγ−GTPを含有する患者血枅275
ml20Όを加えお37℃で反応させた。又、歀の
反応時間ごずに反応によ぀お発色する色玠を
670nの波長にお吞光床を枬定した。その結果
を第図に瀺した。歀の第図に瀺す通り、
本発明の枬定法は、γ−GTP掻性を良奜に枬定
する事が出来、しかも、埓来の化孊発色法ず異な
り反応液の呈色が、γ−GTPの反応が始たるず
同時に生ずる為に、レむトアツセむが行なえる特
色を有するものであ぀た。
実斜䟋 12 γ−−グルタミル−−カルボキシ−−ヒ
ドロキシアニリド、−キシレノヌル、プリ
シアン化カリりムを甚いるγ−GTP掻性枬定
法 γ−−グルタミル−−カルボキシ−−ヒ
ドロキシアニリド7.5、グリシルグリシン100
、−キシレノヌル0.5およびプリシ
ア化カリりムを含有する50 Tris−
HCl緩衝液PH7.9を調補しお基質溶液ずした。
歀の基質溶液mlにγ−GTPを含有する患者血
枅275ml20Όを加えお37℃で反応さ
せた。又、歀の反応時間ごずに反応によ぀お発色
する色玠を615nの波長にお吞光床を枬定した。
その結果を第図に瀺した。歀の第図に瀺
す通り、本発明の枬定法は、γ−GTP掻性を良
奜に枬定する事が出来、しかも、埓来の化孊発色
法ず異なり、反応液の呈色が、γ−GTPの反応
が始たるず同時に生ずる為に、レむトアツセむが
行なれる特色を有するものであ぀た。
【図面の簡単な説明】
第図は−ロむシル−、−ゞブロモ−
−ヒドロキシアニリド、−キシレノヌル、プ
リシアン化カリりムを甚いるLAP枬定法ず埓来
法による酞化剀を甚いた堎合の比范、第図は
−ロむシル−、−ゞブロモ−−ヒドロキシ
アニリド、−ナフトヌル−−スルホン酞、フ
゚リシアン化カリりムを甚いるLAP掻性枬定法、
第図は−ロむシル−、−ゞクロロ−−
ヒドロキシアニリド、−キシレノヌル、プリ
シアン化カリりムを甚いるLAP掻性枬定法、第
図は−ロむシル−、−ゞクロロ−−ヒ
ドロキシアニリド、−ナトヌル−−スルホン
酞、プリシアン化カリりムを甚いるLAP掻性
枬定法、第図はγ−−グルタミル−、−
ゞブロモ−−ヒドロキシアニリド、−キシノ
レヌル、プリシアン化カリりムを甚いるγ−
GTP掻性枬定法ず埓来法による酞化剀を甚いた
堎合の比范、第図はγ−−グルタミル−、
−ゞブロモ−−ヒドロキシアニリド、−ナ
フトヌル−−スルホン酞、プリシアン化カリ
りムを甚いるγ−GTP掻性枬定法、第図はγ
−−グルタミル−、−ゞクロロ−−ヒド
ロキシアニリド、−キシレノヌル、プリシア
ン化カリりムを甚いるγ−GTP掻性枬定法、第
図はγ−−グルタミル−、−ゞクロロ−
−ヒドロキシアニリド、−ナフトヌル−−
スルホン酞、プリシアン化カリりムを甚いるγ
−GTP掻性枬定法、第図は−ロむシル−
−−ゞ゚チルアミノアニリド、−ナフト
ヌル−−スルホン酞、プリシアン化カリりム
を甚いるLAP掻性枬定法、第図は−ロむ
シル−−カルボキシ−−ヒドロキシアニリ
ド、−キシレノヌル、プリシアン化カリりム
を甚いるLAP掻性枬定法、第図はγ−−
グルタミル−−−゚チル−−ヒドロキシ゚
チルアミノアニリド、−ナフトヌル−−スル
ホン酞、プリシアン化カリりムを甚いるγ−
GTP掻性枬定法、第図はγ−−グルタミ
ル−−カルボキシ−−ヒドロキシアニリド、
−キシレノヌル、プリシアン化カリりムを甚
いるγ−GTP掻性枬定法である。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  ロむシンアミノペプチダヌれたたはγ−グル
    タミルトランスペプチダヌれを含有する被怜液䞭
    のロむシンアミノペプチダヌれたたはγ−グルタ
    ミルトランスペプチダヌれの酵玠掻性の枬定にお
    いお、䞀般匏 匏䞭、R1は−ロむシル基たたはγ−−グ
    ルタミル基を瀺し、R2、R3、R4、R5およびR6は
    各々氎玠原子、ハロゲン原子、䜎玚アルキル基、
    䜎玚アルコキシ基、アミノ基、眮換アミノ基、氎
    酞基カルボキシル基たたはスルホン酞基を瀺す
    で衚わされるアミド化合物たたはその氎溶性塩に
    該被怜液、プリシアン化カリりム、およびカプ
    ラヌを共存させお酞化瞮合を䞀段で行い、生成す
    る発色化合物を比色定量するこずを特城ずする酵
    玠掻性の枬定法。  アミド化合物が−ロむシル−−ゞハ
    ロゲノ−−ヒドロキシアニリドである特蚱請求
    の範囲第項蚘茉の枬定法。  −ロむシル−−ゞハロゲノ−−ヒ
    ドロキシアニリドが−ロむシル−−ゞブ
    ロモ−−ヒドロキシアニリドたたは−ロむシ
    ル−−ゞクロロ−−ヒドロキシアニリド
    である特蚱請求の範囲第項蚘茉の枬定法。  アミド化合物が䞀般匏 匏䞭R7、R8は䜎玚アルキル基を瀺し、R9は氎
    玠原子たたは又は䜎玚アルキル基を瀺すで衚わ
    される−ロむシル−−アミノアニリド誘導䜓
    である特蚱請求の範囲第項蚘茉の枬定法。  −ロむシル−−アミノアニリド誘導䜓
    が、−ロむシル−−−ゞ゚チルアミノ
    アニリド、−ロむシル−−メチル−−
    −ゞ゚チルアミノアニリド、−ロむシル−
    −−ゞメチルアミノアニリドたたは−ロ
    むシル−−ゞ−−プロピルアミノアニリドで
    ある特蚱請求の範囲第項蚘茉の枬定法。  アミド化合物が䞀般匏 匏䞭、R10はカルボキシル基たたはスルホン酞
    基を瀺すで衚わされる−ロむシル−−ヒド
    ロキシアニリド誘導䜓である特蚱請求の範囲第
    項蚘茉の枬定法。  −ロむシル−−ヒドロキシアニリド誘導
    䜓が、−ロむシル−−カルボキシ−−ヒド
    ロキシアニリドたたは、−ロむシル−−スル
    ホ−−ヒドロキシアニリドである特蚱請求の範
    囲第項蚘茉の枬定法。  アミド化合物がγ−−グルタミル−
    −ゞハロゲノ−−ヒドロキシアニリドである特
    蚱請求の範囲第項蚘茉の枬定法。  γ−−グルタミル−−ゞハロゲノ−
    −ヒドロキシアニリドがγ−−グルタミル−
    −ゞブロモ−−ヒドロキシアニリドたた
    はγ−−グルタミル−−ゞクロロ−−
    ヒドロキシアニリドである特蚱請求の範囲第項
    蚘茉の枬定法。  アミド化合物が䞀般匏 匏䞭、R11、R12は氎酞基を有しおもよい䜎玚
    アルキル基を瀺し、R13は氎玠原子、䜎玚アルキ
    ル基、カルボキシル基たたはスルホン酞基を瀺
    すで衚されるγ−−グルタミル−−アミノ
    アニリド誘導䜓である特蚱請求の範囲第項蚘茉
    の枬定法。  γ−−グルタミル−−アミノアニリド
    誘導䜓がγ−−グルタミル−−−ゞメ
    チルアミノアニリド、γ−−グルタミル−−
    −ゞ゚チルアミノアニリド、γ−−グル
    タミル−−−ゞ−−プロピルアミノア
    ニリド、γ−−グルタミル−−メチル−−
    −ゞ゚チルアミノアニリドたたは、γ−
    −グルタミル−−−゚チル−−ヒドロキシ
    ゞ゚チルアミノアニリドである特蚱請求の範囲第
    項蚘茉の枬定法。  アミド化合物が、γ−−グルタミル−
    −ヒドロキシアニリド誘導䜓である特蚱請求の範
    囲第項蚘茉の枬定法。  γ−−グルタル−−ヒドロキシアニリ
    ド誘導䜓が、γ−−グルタミル−−カルボキ
    シ−−ヒドロキシアニリドである特蚱請求の範
    囲第項蚘茉の枬定法。
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