JPS6338200B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPS6338200B2 JPS6338200B2 JP57150701A JP15070182A JPS6338200B2 JP S6338200 B2 JPS6338200 B2 JP S6338200B2 JP 57150701 A JP57150701 A JP 57150701A JP 15070182 A JP15070182 A JP 15070182A JP S6338200 B2 JPS6338200 B2 JP S6338200B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hydroxyanilide
- glutamyl
- compound
- leucyl
- activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、被験液に含有されているＬ−ロイシ
ンアミノペプチダーゼおよびγ−グルタミルトラ
ンスペプチダーゼからなる群より選ばれるペプチ
ダーゼの活性測定において、式 （式中、ＲはＬ−ロイシンアミノペプチダーゼ活
性測定の場合にＬ−ロイシル基、γ−グルタミル
トランスペプチダーゼ活性測定の場合にγ−Ｌ−
グルタミル基を示し、ＸおよびＹは同一かまたは
異なりハロゲン原子を示す）で表わされるアミド
化合物を合成基質とする被験中のペプチダーゼの
新規な活性測定法に関する。
ンアミノペプチダーゼおよびγ−グルタミルトラ
ンスペプチダーゼからなる群より選ばれるペプチ
ダーゼの活性測定において、式 （式中、ＲはＬ−ロイシンアミノペプチダーゼ活
性測定の場合にＬ−ロイシル基、γ−グルタミル
トランスペプチダーゼ活性測定の場合にγ−Ｌ−
グルタミル基を示し、ＸおよびＹは同一かまたは
異なりハロゲン原子を示す）で表わされるアミド
化合物を合成基質とする被験中のペプチダーゼの
新規な活性測定法に関する。
ペプチダーゼは一般的にはペプチドのペプチド
結合に作用してアミノ末端から切断してアミノ酸
またはより低級のペプチドを遊離させる酵素の総
称として古くから知られている。例えばロイシン
アミノペプチダーゼ（臨床化学においてTrue
LAPともいう）やアリルアミダーゼ（臨床化学
においてClinical LAPともいう、以下時として
AAと称する）などのアミノペプチダーゼ（以下
True LAPとClinical LAPを併せて単にLAPと
称する）シスチンアミノペプチダーゼ、プロリン
アミノペプチダーゼ、アルギニンアミノペプチダ
ーゼ、アラニンアミノペプチダーゼ、γ−グルタ
ミルトランスペプチダーゼ（γ−GTP）などが
知られている。
結合に作用してアミノ末端から切断してアミノ酸
またはより低級のペプチドを遊離させる酵素の総
称として古くから知られている。例えばロイシン
アミノペプチダーゼ（臨床化学においてTrue
LAPともいう）やアリルアミダーゼ（臨床化学
においてClinical LAPともいう、以下時として
AAと称する）などのアミノペプチダーゼ（以下
True LAPとClinical LAPを併せて単にLAPと
称する）シスチンアミノペプチダーゼ、プロリン
アミノペプチダーゼ、アルギニンアミノペプチダ
ーゼ、アラニンアミノペプチダーゼ、γ−グルタ
ミルトランスペプチダーゼ（γ−GTP）などが
知られている。
上記酵素のうち、特にロイシンアミノペプチダ
ーゼ（LAP）やγ−グルタミルトランスペプチ
ダーゼ（γ−GTP）は、生体内のあらゆる組織
に広く分布し、血清中にも存在しており、病的条
件によつて増加することが知られており、臨床検
査上重要な酵素活性測定項目の対称となつている
酵素である。
ーゼ（LAP）やγ−グルタミルトランスペプチ
ダーゼ（γ−GTP）は、生体内のあらゆる組織
に広く分布し、血清中にも存在しており、病的条
件によつて増加することが知られており、臨床検
査上重要な酵素活性測定項目の対称となつている
酵素である。
LAPはＬ−ペプチド、特にアミノ末端がＬ−
ロイシンまたはこれに関係あるアミノ酸であるＬ
−ペプチドの遊離アミノ基をもつアミノ末端残基
を加水分解してＬ−ロイシンを遊離させる酵素で
あつて、生体内の各組織に広く分布し、血清中に
も存在していて、血清中の酵素量は生体の状態に
より著しく変動することが知られており、急性肝
炎、肝癌、転移性肝癌、肝硬変症、胆道症などで
はLAP活性が増加する。そこでLAP活性がかか
る疾病の１つの指標となり、この酵素活性を測定
することは、これら疾病の診断に必要欠くべから
ざる検査法の１つになつている。
ロイシンまたはこれに関係あるアミノ酸であるＬ
−ペプチドの遊離アミノ基をもつアミノ末端残基
を加水分解してＬ−ロイシンを遊離させる酵素で
あつて、生体内の各組織に広く分布し、血清中に
も存在していて、血清中の酵素量は生体の状態に
より著しく変動することが知られており、急性肝
炎、肝癌、転移性肝癌、肝硬変症、胆道症などで
はLAP活性が増加する。そこでLAP活性がかか
る疾病の１つの指標となり、この酵素活性を測定
することは、これら疾病の診断に必要欠くべから
ざる検査法の１つになつている。
γ−GTPは生体内でγ−グルタミルペプチド
の代謝に関与する酵素であり、γ−グルタミルペ
プチドを加水分解すると共に、γ−グルタミル基
を他のペプチドあるいはアミノ酸に転移させる酵
素であつて、生体内の各組織に広く分布し、血清
中にも存在する。γ−GTPは病的条件により著
しく変動することが知られており、血清γ−
GTPは肝汁うつ滞型肝炎、閉塞性黄疸、原発性
肝癌、転移性肝癌などでは、著しい高値を示し、
特に慢性肝炎の非活動型では低値を示すが、活動
型では高値を示すなど一般に慢性の肝疾患に特異
的であり、従来臨床的に用いられて来た種々の逸
脱酵素とは全く異なる診断学的意義を有し、かか
る血清γ−GTP活性の測定はこのような疾病の
診断および病態把握に必要欠くべからざる検査法
の１つになつている。
の代謝に関与する酵素であり、γ−グルタミルペ
プチドを加水分解すると共に、γ−グルタミル基
を他のペプチドあるいはアミノ酸に転移させる酵
素であつて、生体内の各組織に広く分布し、血清
中にも存在する。γ−GTPは病的条件により著
しく変動することが知られており、血清γ−
GTPは肝汁うつ滞型肝炎、閉塞性黄疸、原発性
肝癌、転移性肝癌などでは、著しい高値を示し、
特に慢性肝炎の非活動型では低値を示すが、活動
型では高値を示すなど一般に慢性の肝疾患に特異
的であり、従来臨床的に用いられて来た種々の逸
脱酵素とは全く異なる診断学的意義を有し、かか
る血清γ−GTP活性の測定はこのような疾病の
診断および病態把握に必要欠くべからざる検査法
の１つになつている。
従来、LAP活性の測定法は多数報告されてい
るが、それらの大部分は合成基質よりLAPによ
つて遊離されるアミン化合物を比色定量すること
によりLAP活性値を求める方法であつて、それ
に用いる合成基質としてＬ−ロイシル−ｐ−ニト
ロアニリドを用い、LAPの酵素作用により生成
するｐ−ニトロアニリンの黄色を比色定量する方
法が挙げられるが、この比色定量の際、その合成
基質の呈色波長がオーバー・ラツプする欠点があ
り、また血清成分、特にビリルビン系色素による
測定の影響も免れることが出来ない欠点があつ
た。さらに、合成基質としてＬ−ロイシル−β−
ナフチルアミドを用いる方法が挙げられるが、こ
の方法では生成するβ−ナフチルアミンに５−ニ
トロ−２−アミノメトキシベンゼンジアゾテート
などをカツプリングさせて色素を形成させるかあ
るいは生成するβ−ナフチルアミンを亜硝酸ナト
リウムでジアゾ化し、Ｎ−（１−ナフチル）−エチ
レンジアミンにカツプリングさせるか、もしくは
ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドまたはｐ−
ジメチルアミノシンナムアルデヒドを縮合させて
色素を形成せしめ、次いでこれを比色定量する方
法であるが、反応過程が複雑で、かつ厳密な操作
を必要とするため、検査法として尚不便であるば
かりでなく、標準物質たるβ−ナフチルアミンの
毒性が著しく、近年膀胱の腫瘍や癌を発生するこ
とが明らかとなつたため、発癌物質として、その
使用に特に厳密な注意を用するなどの欠点があつ
た。
るが、それらの大部分は合成基質よりLAPによ
つて遊離されるアミン化合物を比色定量すること
によりLAP活性値を求める方法であつて、それ
に用いる合成基質としてＬ−ロイシル−ｐ−ニト
ロアニリドを用い、LAPの酵素作用により生成
するｐ−ニトロアニリンの黄色を比色定量する方
法が挙げられるが、この比色定量の際、その合成
基質の呈色波長がオーバー・ラツプする欠点があ
り、また血清成分、特にビリルビン系色素による
測定の影響も免れることが出来ない欠点があつ
た。さらに、合成基質としてＬ−ロイシル−β−
ナフチルアミドを用いる方法が挙げられるが、こ
の方法では生成するβ−ナフチルアミンに５−ニ
トロ−２−アミノメトキシベンゼンジアゾテート
などをカツプリングさせて色素を形成させるかあ
るいは生成するβ−ナフチルアミンを亜硝酸ナト
リウムでジアゾ化し、Ｎ−（１−ナフチル）−エチ
レンジアミンにカツプリングさせるか、もしくは
ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドまたはｐ−
ジメチルアミノシンナムアルデヒドを縮合させて
色素を形成せしめ、次いでこれを比色定量する方
法であるが、反応過程が複雑で、かつ厳密な操作
を必要とするため、検査法として尚不便であるば
かりでなく、標準物質たるβ−ナフチルアミンの
毒性が著しく、近年膀胱の腫瘍や癌を発生するこ
とが明らかとなつたため、発癌物質として、その
使用に特に厳密な注意を用するなどの欠点があつ
た。
一方、γ−GTP活性の測定法も多数報告され
ているが、それらの大部分は合成基質よりγ−
GTPによつて遊離されるアミン化合物を比色定
量することによりγ−GTP活性値を求める方法
であつて、それを用いる合成基質としてγ−Ｌ−
グルタミル−ｐ−ニトロアニリドを用い、γ−
GTPの酵素作用により生成するｐ−ニトロアニ
リンの黄色を410nｍで比色定量する方法が挙げ
られるが、血清成分、特にビリルビン系色素など
の影響を避けるため、各検体に対して検体ブラン
クを厳密に測定しなければならず、正確な測定値
を得ることが困難であるという欠点があつた。ま
た生成するｐ−ニトロアニリンをｐ−ジメチルア
ミノシンナムアルデヒド、ｐ−ジメチルアミノベ
ンズアルデヒドなどのアルデヒド化合物と縮合さ
せて長波長測の赤色で測定する方法も挙げられる
が、発色感度に対する温度の影響が大きく、測定
値の再現性に問題があつた。また生成するｐ−ニ
トロアニリンをジアゾ化し、３，５−キシレノー
ルと縮合させて生ずる赤色を測定する方法が提案
されたが反応操作段階が多く簡便性に欠けるとい
う欠点があつた。さらに合成基質としてγ−Ｌ−
グルタミル−β−ナフチルアミドを用いる方法が
挙げられるが、これらの方法としてγ−GTPに
より遊離したβ−ナフチルアミンをジアゾニウム
塩として比色定量する方法、３−メチル−２−ベ
ンゾチアゾリノンヒドラゾンと酸化剤で発色させ
て比色定量する方法、または前記アルデヒド化合
物を発色剤として縮合させて比色定量する方法が
あるが、前記と同様β−ナフチルアミンの発癌性
が一般に指摘されているところであり、操作が煩
雑で測定に長時間を要するなどの点で実用性に欠
けている。
ているが、それらの大部分は合成基質よりγ−
GTPによつて遊離されるアミン化合物を比色定
量することによりγ−GTP活性値を求める方法
であつて、それを用いる合成基質としてγ−Ｌ−
グルタミル−ｐ−ニトロアニリドを用い、γ−
GTPの酵素作用により生成するｐ−ニトロアニ
リンの黄色を410nｍで比色定量する方法が挙げ
られるが、血清成分、特にビリルビン系色素など
の影響を避けるため、各検体に対して検体ブラン
クを厳密に測定しなければならず、正確な測定値
を得ることが困難であるという欠点があつた。ま
た生成するｐ−ニトロアニリンをｐ−ジメチルア
ミノシンナムアルデヒド、ｐ−ジメチルアミノベ
ンズアルデヒドなどのアルデヒド化合物と縮合さ
せて長波長測の赤色で測定する方法も挙げられる
が、発色感度に対する温度の影響が大きく、測定
値の再現性に問題があつた。また生成するｐ−ニ
トロアニリンをジアゾ化し、３，５−キシレノー
ルと縮合させて生ずる赤色を測定する方法が提案
されたが反応操作段階が多く簡便性に欠けるとい
う欠点があつた。さらに合成基質としてγ−Ｌ−
グルタミル−β−ナフチルアミドを用いる方法が
挙げられるが、これらの方法としてγ−GTPに
より遊離したβ−ナフチルアミンをジアゾニウム
塩として比色定量する方法、３−メチル−２−ベ
ンゾチアゾリノンヒドラゾンと酸化剤で発色させ
て比色定量する方法、または前記アルデヒド化合
物を発色剤として縮合させて比色定量する方法が
あるが、前記と同様β−ナフチルアミンの発癌性
が一般に指摘されているところであり、操作が煩
雑で測定に長時間を要するなどの点で実用性に欠
けている。
本発明者らは、かかる欠点を有する従来の
LAPやγ−GTP活性測定法を改良すべく鋭意研
究を続けた結果、LAPやγ−GTP活性測定に優
れた性質を有する新規な合成基質を見い出し、本
発明を完成したものである。
LAPやγ−GTP活性測定法を改良すべく鋭意研
究を続けた結果、LAPやγ−GTP活性測定に優
れた性質を有する新規な合成基質を見い出し、本
発明を完成したものである。
本発明は、被験液に含有されているLAPおよ
びγ−GTPからなる群より選ばれるペプチダー
ゼの活性測定において、式 （式中、Ｒ、ＸおよびＹは前記と同じ意味を有す
る）で表わされるアミド化合物またはその塩に、
被験液中に含有されているペプチダーゼを作用さ
せて、式 （式中、ＸおよびＹは前記と同じ意味を有する）
で表わされるアニリン誘導体を遊離せしめ、次い
で該アニリン誘導体を化学的手段により発色させ
て生成する発色化合物を比色定量することを特徴
とする新規な合成基質を用いるLAPおよびγ−
GTPからなる群より選ばれるペプチダーゼの活
性測定法である。
びγ−GTPからなる群より選ばれるペプチダー
ゼの活性測定において、式 （式中、Ｒ、ＸおよびＹは前記と同じ意味を有す
る）で表わされるアミド化合物またはその塩に、
被験液中に含有されているペプチダーゼを作用さ
せて、式 （式中、ＸおよびＹは前記と同じ意味を有する）
で表わされるアニリン誘導体を遊離せしめ、次い
で該アニリン誘導体を化学的手段により発色させ
て生成する発色化合物を比色定量することを特徴
とする新規な合成基質を用いるLAPおよびγ−
GTPからなる群より選ばれるペプチダーゼの活
性測定法である。
本発明においてペプチダーゼの合成基質として
用いられるアミド化合物〔〕は、ペプチド合成
の常法によつて製造することができる。即ち、Ｌ
−ロイシンのカルボキシル基やＬ−グルタミル酸
のγ−カルボキシル基とアニリン誘導体〔〕と
の縮合反応により得られる。
用いられるアミド化合物〔〕は、ペプチド合成
の常法によつて製造することができる。即ち、Ｌ
−ロイシンのカルボキシル基やＬ−グルタミル酸
のγ−カルボキシル基とアニリン誘導体〔〕と
の縮合反応により得られる。
上記の縮合反応に際しては、予め反応に関与し
てはならない官能基、即ちＬ−ロイシンのα−ア
ミノ基やＬ−グルタミン酸のα−アミノ基および
α−カルボキシル基を保護するのがよい。α−ア
ミノ基の保護基としては通常ペプチド合成に用い
られるα−アミノ保護基が用いられる。例えばｔ
−ブチルオキシカルボニル、ｔ−アミノオキシカ
ルボニル、ベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニト
ロベンジルオキシカルボニル、アダマンタチルオ
キシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカ
ルボニル、フタロイル、ｏ−ニトロフエニルチオ
基などが挙げられる。Ｌ−グルタミン酸のα−カ
ルボキシル基はメチルエステル、エチルエステ
ル、ｔ−ブチルエステル、ベンジルエステル、ｐ
−ニトロベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジ
ルエステルなどで保護するのが好ましいが、脱離
の際α−アミノ基の保護基と共に一段階で脱離さ
れる条件で脱離されるような保護基で保護するの
が特に好ましい。例えばα−アミノ基をベンジル
オキシカルボニル基、α−カルボキシル基をベン
ジルエステルで保護するのがその一例である。
てはならない官能基、即ちＬ−ロイシンのα−ア
ミノ基やＬ−グルタミン酸のα−アミノ基および
α−カルボキシル基を保護するのがよい。α−ア
ミノ基の保護基としては通常ペプチド合成に用い
られるα−アミノ保護基が用いられる。例えばｔ
−ブチルオキシカルボニル、ｔ−アミノオキシカ
ルボニル、ベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニト
ロベンジルオキシカルボニル、アダマンタチルオ
キシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカ
ルボニル、フタロイル、ｏ−ニトロフエニルチオ
基などが挙げられる。Ｌ−グルタミン酸のα−カ
ルボキシル基はメチルエステル、エチルエステ
ル、ｔ−ブチルエステル、ベンジルエステル、ｐ
−ニトロベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジ
ルエステルなどで保護するのが好ましいが、脱離
の際α−アミノ基の保護基と共に一段階で脱離さ
れる条件で脱離されるような保護基で保護するの
が特に好ましい。例えばα−アミノ基をベンジル
オキシカルボニル基、α−カルボキシル基をベン
ジルエステルで保護するのがその一例である。
上記縮合反応に用いるアニリン誘導体〔〕の
例としては、３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシ
アニリン、３，６−ジクロロ−４−ヒドロキシア
ニリン、３−クロロ−５−ブロモ−４−ヒドロキ
シアニリンなどが挙げられる。
例としては、３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシ
アニリン、３，６−ジクロロ−４−ヒドロキシア
ニリン、３−クロロ−５−ブロモ−４−ヒドロキ
シアニリンなどが挙げられる。
上記の縮合反応は、α−アミノ基が保護された
Ｌ−ロイシンのカルボキシル基またはα−アミノ
基およびα−カルボキシル基が保護されたＬ−グ
ルタミン酸のγ−カルボキシル基を酸ハライド、
酸無水物、酸アジド、酸イミダゾリド、活性エス
テル、例えばシアノメチルエステル、ｐ−ニトロ
フエニルエステル、２，４−ジニトロフエニルエ
ステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル、Ｎ−ヒドロキシフタルイミドエステルなどの
活性化アシル誘導体に変換してアニリン誘導体
〔〕と反応させるか、あるいはカルボジイミド、
例えばウオーターソルブ・カルボジイミド塩酸塩
〔１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド塩酸塩、Ｎ，N′−ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド、Ｎ，N′−カルボニル
イミダゾール、イソオキサゾリウム塩、例えばウ
ツドワード試薬などの縮合剤の存在下上記の保護
されたＬ−ロイシンまたはＬ−グルタミン酸とア
ニリン誘導体〔〕を反応させることにより行わ
れる。
Ｌ−ロイシンのカルボキシル基またはα−アミノ
基およびα−カルボキシル基が保護されたＬ−グ
ルタミン酸のγ−カルボキシル基を酸ハライド、
酸無水物、酸アジド、酸イミダゾリド、活性エス
テル、例えばシアノメチルエステル、ｐ−ニトロ
フエニルエステル、２，４−ジニトロフエニルエ
ステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル、Ｎ−ヒドロキシフタルイミドエステルなどの
活性化アシル誘導体に変換してアニリン誘導体
〔〕と反応させるか、あるいはカルボジイミド、
例えばウオーターソルブ・カルボジイミド塩酸塩
〔１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド塩酸塩、Ｎ，N′−ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド、Ｎ，N′−カルボニル
イミダゾール、イソオキサゾリウム塩、例えばウ
ツドワード試薬などの縮合剤の存在下上記の保護
されたＬ−ロイシンまたはＬ−グルタミン酸とア
ニリン誘導体〔〕を反応させることにより行わ
れる。
上記の縮合反応においては、通常不活性有機溶
媒、例えばジメチルホルムアミド、ジメチルアセ
トアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロ
フラン、ジオキサン、ベンゼン、クロロホルム、
ジクロロメタン、ジクロロエタンなどの溶媒中、
両者ほぼ等量を加え、室温またはそれ以下の温度
で反応させることにより行われる。上記の反応経
過はシリカゲルなどの薄層クロマトグラフイー
（TLC）、高速液体クロマトグラフイー（HPLC）
などにより追跡できるので、出発物質のいずれか
の消失を持つて適宜反応を終了すればよい。
媒、例えばジメチルホルムアミド、ジメチルアセ
トアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロ
フラン、ジオキサン、ベンゼン、クロロホルム、
ジクロロメタン、ジクロロエタンなどの溶媒中、
両者ほぼ等量を加え、室温またはそれ以下の温度
で反応させることにより行われる。上記の反応経
過はシリカゲルなどの薄層クロマトグラフイー
（TLC）、高速液体クロマトグラフイー（HPLC）
などにより追跡できるので、出発物質のいずれか
の消失を持つて適宜反応を終了すればよい。
このようにして得られた反応生成物は、反応溶
媒を留去するかまたは留去することなく、非親水
性有機溶媒、例えばクロロホルム、ジクロロメタ
ン、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルイソブチル
ケトン、ベンゼン、ジエチルエーテルなどに溶か
し、酸性水およびアルカリ性水で洗浄した後、溶
媒を留去することにより採取できる。さらに精製
する必要がある場合には、適当な再結溶媒で再結
晶化するか、あるいはシリカゲル、活性アルミ
ナ、吸着樹脂などの吸着剤を用いるカラムクロマ
トグラフイーにより精製することができる。
媒を留去するかまたは留去することなく、非親水
性有機溶媒、例えばクロロホルム、ジクロロメタ
ン、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルイソブチル
ケトン、ベンゼン、ジエチルエーテルなどに溶か
し、酸性水およびアルカリ性水で洗浄した後、溶
媒を留去することにより採取できる。さらに精製
する必要がある場合には、適当な再結溶媒で再結
晶化するか、あるいはシリカゲル、活性アルミ
ナ、吸着樹脂などの吸着剤を用いるカラムクロマ
トグラフイーにより精製することができる。
次いで得られた反応生成物の保護基を脱離する
のであるが、この脱離化はペプチド化学における
保護基の脱離化法を用いて行われる。例えばα−
アミノ保護基がｔ−ブチルオキシカルボニル基で
ある場合には、2N塩化水素の酢酸溶液、トリフ
ルオロ酢酸、ギ酸などを用いる方法、ベンジルオ
キシカルボニル基である場合には、パラジウム−
炭素触媒を用いる接触還元による方法、臭化水素
酸の酢酸溶液を用いる方法により行えばよい。Ｌ
−グルタミン酸のα−カルボキシル基の保護基が
ベンジルエステルである場合には、パラジウム−
炭素触媒を用いる触媒還元による方法で行えばよ
い。
のであるが、この脱離化はペプチド化学における
保護基の脱離化法を用いて行われる。例えばα−
アミノ保護基がｔ−ブチルオキシカルボニル基で
ある場合には、2N塩化水素の酢酸溶液、トリフ
ルオロ酢酸、ギ酸などを用いる方法、ベンジルオ
キシカルボニル基である場合には、パラジウム−
炭素触媒を用いる接触還元による方法、臭化水素
酸の酢酸溶液を用いる方法により行えばよい。Ｌ
−グルタミン酸のα−カルボキシル基の保護基が
ベンジルエステルである場合には、パラジウム−
炭素触媒を用いる触媒還元による方法で行えばよ
い。
このようにして得られたアミド化合物〔〕を
反応液から採取するには、先ず保護基の脱離化が
酸分解による場合には、中和し、接触還元による
場合には触媒を除去した後、非親水性有機溶媒、
例えばクロロホルム、ジクロロメタン、ジクロロ
エタン、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルイソブ
チルケトン、ベンゼン、ジエチルエーテルなどの
溶媒中、酸性水およびアルカリ性水で洗浄した
後、溶媒を留去することにより採取できる。さら
に精製する必要がある場合には、適当な再結溶媒
で再結晶化するか、あるいはシリカゲル、活性ア
ルミナ、吸着樹脂などの吸着剤を用いるカラムク
ロマトグラフイーにより精製することができる。
反応液から採取するには、先ず保護基の脱離化が
酸分解による場合には、中和し、接触還元による
場合には触媒を除去した後、非親水性有機溶媒、
例えばクロロホルム、ジクロロメタン、ジクロロ
エタン、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルイソブ
チルケトン、ベンゼン、ジエチルエーテルなどの
溶媒中、酸性水およびアルカリ性水で洗浄した
後、溶媒を留去することにより採取できる。さら
に精製する必要がある場合には、適当な再結溶媒
で再結晶化するか、あるいはシリカゲル、活性ア
ルミナ、吸着樹脂などの吸着剤を用いるカラムク
ロマトグラフイーにより精製することができる。
本アミド化合物〔〕は必要に応じ、塩酸、硫
酸、硝酸、リン酸などの無機酸との塩、ギ酸、酢
酸、プロピオン酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石
酸、シユウ酸などの有機酸との塩を形成すること
ができる。
酸、硝酸、リン酸などの無機酸との塩、ギ酸、酢
酸、プロピオン酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石
酸、シユウ酸などの有機酸との塩を形成すること
ができる。
次に、本アミド化合物〔〕を用いるペプチダ
ーゼ活性測定法について述べる。本測定法におい
ては、上記アミド化合物〔〕またはその塩に被
験液に含有されているLAP−およびγ−GTPか
らなる群より選ばれるペプチダーゼの作用により
遊離されるアニリン誘導体〔〕を定量するに当
り、化学的発色法を用いて発色化合物に導き、比
色定量するものである。
ーゼ活性測定法について述べる。本測定法におい
ては、上記アミド化合物〔〕またはその塩に被
験液に含有されているLAP−およびγ−GTPか
らなる群より選ばれるペプチダーゼの作用により
遊離されるアニリン誘導体〔〕を定量するに当
り、化学的発色法を用いて発色化合物に導き、比
色定量するものである。
上記の化学的発色法としては、カプラー共存下
でアニリン誘導体〔〕と酸化縮合させて発色化
合物に導き比色定量するのが好ましい。使用する
カプラーとしては、アニリン誘導体〔〕と酸化
縮合して発色化合物を形成する芳香族化合物であ
れば、どのような化合物でもよいが、これらのう
ち代表的な芳香族化合物としてはフエノール系化
合物、アミノフエノール系化合物、アニリン系化
合物またはナフトール系化合物が挙げられる。フ
エノール系化合物の例としては、フエノール、サ
リチル酸、ｍ−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−ヒドロ
キシ安息香酸、２，６−ジヒドロキシ安息香酸、
サリチル酸メチル、ｏ−クレゾール、ｍ−クレゾ
ール、ｐ−クレゾール、ｏ−エチルフエノール、
ｍ−エチルフエノール、２，３−キシレノール、
２，４−キシレノール、２，５−キシレノール
３，５−キシレノール、２，６−キシレノール、
ｏ−メトキシフエノール、ｍ−メトキシフエノー
ル、ｐ−メトキシフエノール、２，６−ジメトキ
シフエノール、ｏ−クロロフエノール、ｍ−クロ
ロフエノール、ｐ−クロロフエノール、２，４−
ジクロロフエノール、２，６−ジクロロフエノー
ル、ｏ−ブロモフエノール、ｍ−ブロモフエノー
ル、ｐ−ブロモフエノール、２，４−ジブロモフ
エノール、２，６−ジブロモフエノール、２−メ
チル−６−クロロフエノール、２−クロロ−５−
メチルフエノール、ｏ−カルボキシメチルフエノ
ール、２−ヒドロキシ−４−アミノエチルフエノ
ールなどが挙げられ、アミノフエノール系化合物
の例としては、４−クロロ−２−アミノフエノー
ル、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−アミノフエノール、
４−メチル−２−アミノフエノール、５−アミノ
−２−ヒドロキシ安息香酸、２−アミノ−３−ヒ
ドロキシ安息香酸、ｏ−アミノフエノール、ｍ−
アミノフエノール、ｐ−アミノフエノールなどが
挙げられ、アニリン系化合物の例としては、アニ
リン、ｏ−トルイジン、ｍ−トルイジン、ｐ−ト
ルイジン、Ｎ−メチルアニリン、Ｎ−エチルアニ
リン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエ
チルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｏ−トルイジ
ン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−トルイジン、Ｎ，Ｎ
−ジエチル−ｏ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジメチル
−ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−トル
イジン、ｏ−クロロアニリン、ｍ−クロロアニリ
ン、ｍ−ブロモアニリン、アントラニル酸、３−
アミノ安息香酸、ｐ−ジメチルアミノ安息香酸、
ｐ−クロロ−ｏ−トルイジン、３−アミノ−４−
メチル安息香酸、ｍ−フエニレンジアミン、Ｎ，
Ｎ−ジメチル−ｍ−フエニレンジアミン、２−メ
チル−ｍ−フエニレンジアミン、４−メチル−ｏ
−フエニレンジアミン、４−メチル−ｍ−フエニ
レンジアミン、２−クロロ−ｍ−フエニレンジア
ミン、３−クロロ−ｏ−トルイジン、２−メトキ
シ−５−クロロアニリン、ｏ−エチルアニリン、
２，５−ジエトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−
ヒドロキシエチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−ヒ
ドロキシエチル−ｍ−トルイジンなどが挙げら
れ、ナフトール系化合物の例としてはα−ナフト
ール、β−ナフトール、２−カルボキシ−１−ナ
フトール、４−クロロ−１−ナフトール、１−ヒ
ドロキシ−２−ナフトエ酸、１−ナフトール−２
−スルホン酸、１−ナフトール−３−スルホン
酸、１−ナフトール−４−スルホン酸、２−ナフ
トール−６−スルホン酸、２−ナフトール−３，
６−ジスルホン酸などが挙げられる。
でアニリン誘導体〔〕と酸化縮合させて発色化
合物に導き比色定量するのが好ましい。使用する
カプラーとしては、アニリン誘導体〔〕と酸化
縮合して発色化合物を形成する芳香族化合物であ
れば、どのような化合物でもよいが、これらのう
ち代表的な芳香族化合物としてはフエノール系化
合物、アミノフエノール系化合物、アニリン系化
合物またはナフトール系化合物が挙げられる。フ
エノール系化合物の例としては、フエノール、サ
リチル酸、ｍ−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−ヒドロ
キシ安息香酸、２，６−ジヒドロキシ安息香酸、
サリチル酸メチル、ｏ−クレゾール、ｍ−クレゾ
ール、ｐ−クレゾール、ｏ−エチルフエノール、
ｍ−エチルフエノール、２，３−キシレノール、
２，４−キシレノール、２，５−キシレノール
３，５−キシレノール、２，６−キシレノール、
ｏ−メトキシフエノール、ｍ−メトキシフエノー
ル、ｐ−メトキシフエノール、２，６−ジメトキ
シフエノール、ｏ−クロロフエノール、ｍ−クロ
ロフエノール、ｐ−クロロフエノール、２，４−
ジクロロフエノール、２，６−ジクロロフエノー
ル、ｏ−ブロモフエノール、ｍ−ブロモフエノー
ル、ｐ−ブロモフエノール、２，４−ジブロモフ
エノール、２，６−ジブロモフエノール、２−メ
チル−６−クロロフエノール、２−クロロ−５−
メチルフエノール、ｏ−カルボキシメチルフエノ
ール、２−ヒドロキシ−４−アミノエチルフエノ
ールなどが挙げられ、アミノフエノール系化合物
の例としては、４−クロロ−２−アミノフエノー
ル、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−アミノフエノール、
４−メチル−２−アミノフエノール、５−アミノ
−２−ヒドロキシ安息香酸、２−アミノ−３−ヒ
ドロキシ安息香酸、ｏ−アミノフエノール、ｍ−
アミノフエノール、ｐ−アミノフエノールなどが
挙げられ、アニリン系化合物の例としては、アニ
リン、ｏ−トルイジン、ｍ−トルイジン、ｐ−ト
ルイジン、Ｎ−メチルアニリン、Ｎ−エチルアニ
リン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエ
チルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｏ−トルイジ
ン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−トルイジン、Ｎ，Ｎ
−ジエチル−ｏ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジメチル
−ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−トル
イジン、ｏ−クロロアニリン、ｍ−クロロアニリ
ン、ｍ−ブロモアニリン、アントラニル酸、３−
アミノ安息香酸、ｐ−ジメチルアミノ安息香酸、
ｐ−クロロ−ｏ−トルイジン、３−アミノ−４−
メチル安息香酸、ｍ−フエニレンジアミン、Ｎ，
Ｎ−ジメチル−ｍ−フエニレンジアミン、２−メ
チル−ｍ−フエニレンジアミン、４−メチル−ｏ
−フエニレンジアミン、４−メチル−ｍ−フエニ
レンジアミン、２−クロロ−ｍ−フエニレンジア
ミン、３−クロロ−ｏ−トルイジン、２−メトキ
シ−５−クロロアニリン、ｏ−エチルアニリン、
２，５−ジエトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−
ヒドロキシエチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−ヒ
ドロキシエチル−ｍ−トルイジンなどが挙げら
れ、ナフトール系化合物の例としてはα−ナフト
ール、β−ナフトール、２−カルボキシ−１−ナ
フトール、４−クロロ−１−ナフトール、１−ヒ
ドロキシ−２−ナフトエ酸、１−ナフトール−２
−スルホン酸、１−ナフトール−３−スルホン
酸、１−ナフトール−４−スルホン酸、２−ナフ
トール−６−スルホン酸、２−ナフトール−３，
６−ジスルホン酸などが挙げられる。
上記の酸化縮合はPHを約４〜12の範囲内で反応
を行わせることにより発色反応は定量的に完結す
る。上記PHの維持のために緩衝液またはアルカリ
水溶液としては炭酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、
ホウ酸塩緩衝液、水酸化アルカリ水溶液などが有
効に使用できる。
を行わせることにより発色反応は定量的に完結す
る。上記PHの維持のために緩衝液またはアルカリ
水溶液としては炭酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、
ホウ酸塩緩衝液、水酸化アルカリ水溶液などが有
効に使用できる。
上記の酸化縮合させるためにはアニリン誘導体
〔〕とカプラーを酸化縮合することのできる酸
化剤の存在下で行われる。このような酸化剤とし
ては、通常過ヨウ素酸塩、クロラミンＴ、次亜塩
素酸塩などのハロゲン系酸化剤もしくは過硫酸塩
などの過酸化物系酸化剤、過酸化水素などが挙げ
られるが、メタ過ヨウ素酸ナトリウムは好適な一
例である。
〔〕とカプラーを酸化縮合することのできる酸
化剤の存在下で行われる。このような酸化剤とし
ては、通常過ヨウ素酸塩、クロラミンＴ、次亜塩
素酸塩などのハロゲン系酸化剤もしくは過硫酸塩
などの過酸化物系酸化剤、過酸化水素などが挙げ
られるが、メタ過ヨウ素酸ナトリウムは好適な一
例である。
アニリン誘導体〔〕と上記カプラーとの酸化
縮合により生成する発色化合物は、カプラーの種
類により極大吸収波長が約550〜770nｍに巾広く
分布するが、通常は殆んど570〜680nｍに極大吸
収を有する有色系色素であり、呈色も極めて高感
度で安定性も良く、しかも温度による変動も殆ん
どなく、生体試験料中のビリルビンなどの挾雑物
による影響も受けにくいため、正の誤差も殆んど
受けることがないので、LAPやγ−GTPのペプ
チダーゼ活性測定に極めて好結果を与える。
縮合により生成する発色化合物は、カプラーの種
類により極大吸収波長が約550〜770nｍに巾広く
分布するが、通常は殆んど570〜680nｍに極大吸
収を有する有色系色素であり、呈色も極めて高感
度で安定性も良く、しかも温度による変動も殆ん
どなく、生体試験料中のビリルビンなどの挾雑物
による影響も受けにくいため、正の誤差も殆んど
受けることがないので、LAPやγ−GTPのペプ
チダーゼ活性測定に極めて好結果を与える。
上記のアニリン誘導体〔〕を呈色定量する他
の方法としては、ペンタシアノ鉄錯塩を過酸化物
で処理して呈色液を調製して発色させる方法が用
いられる。上記の過酸化物としては過ヨウ素酸ナ
トリウム塩、過ヨウ素酸カリウム塩、過マンガン
酸カリウム、過酸化水素などが挙げられるが、過
酸化水素は最も好適な一例である。上記鉄錯塩は
重炭酸塩、例えば重炭酸ナトリウム、重炭酸リチ
ウム、重炭酸カリウムなどと低分子デキストラン
を配合するとさらに安定な鉄錯塩試薬が得られ
る。また、これらの配合試薬は凍結乾燥した場合
は、鉄錯塩が非常に安定化され、呈色用反応試薬
としてキツト化する場合は凍結乾燥試薬とするこ
とが望ましい。
の方法としては、ペンタシアノ鉄錯塩を過酸化物
で処理して呈色液を調製して発色させる方法が用
いられる。上記の過酸化物としては過ヨウ素酸ナ
トリウム塩、過ヨウ素酸カリウム塩、過マンガン
酸カリウム、過酸化水素などが挙げられるが、過
酸化水素は最も好適な一例である。上記鉄錯塩は
重炭酸塩、例えば重炭酸ナトリウム、重炭酸リチ
ウム、重炭酸カリウムなどと低分子デキストラン
を配合するとさらに安定な鉄錯塩試薬が得られ
る。また、これらの配合試薬は凍結乾燥した場合
は、鉄錯塩が非常に安定化され、呈色用反応試薬
としてキツト化する場合は凍結乾燥試薬とするこ
とが望ましい。
上記の鉄錯塩を用いる呈色反応を行う場合に
は、酸性側で反応を進行する方が好ましい。使用
し得るPHとしては３〜７であるのが好ましく、４
〜5.5が最も好ましい。上記のPHを維持するため
に通常弱酸性の緩衝液が用いられるが、特に乳酸
塩、クエン酸塩、シユウ酸塩などの緩衝液が好ま
しい。緩衝液の濃度は0.01〜1Mの範囲内で使用
し得るが、0.05〜0.4Mの範囲の濃度が特に好ま
しい。
は、酸性側で反応を進行する方が好ましい。使用
し得るPHとしては３〜７であるのが好ましく、４
〜5.5が最も好ましい。上記のPHを維持するため
に通常弱酸性の緩衝液が用いられるが、特に乳酸
塩、クエン酸塩、シユウ酸塩などの緩衝液が好ま
しい。緩衝液の濃度は0.01〜1Mの範囲内で使用
し得るが、0.05〜0.4Mの範囲の濃度が特に好ま
しい。
上記の鉄錯塩とアニリン誘導体〔〕との反応
によつて形成される発色化合物は極大吸収波長が
700nｍ付近に分布し、色調が安定なためLAPや
γ−GTPのペプチダ−ゼ活性側定に適している。
によつて形成される発色化合物は極大吸収波長が
700nｍ付近に分布し、色調が安定なためLAPや
γ−GTPのペプチダ−ゼ活性側定に適している。
さらにナトリウムペンタシアノアコフエリアー
トNa2〔Fe（CN）5・H2O〕を遊離したアニリン誘
導体〔〕と反応させて発色化合物を形成せし
め、その発色化合物の量を比色定量してLAPや
γ−GTPのペプチダ−ゼ活性側を行なつてもよ
い。
トNa2〔Fe（CN）5・H2O〕を遊離したアニリン誘
導体〔〕と反応させて発色化合物を形成せし
め、その発色化合物の量を比色定量してLAPや
γ−GTPのペプチダ−ゼ活性側を行なつてもよ
い。
さらにまた、芳香族アミンを発色定量する方
法、例えばジアゾカツプリング法、アルデヒド系
化合物を反応させて生成するシツク塩基を定量す
る方法など公知の種々の化学的発色法を適用して
アニリン誘導体〔〕を発色定量することにより
LAPやγ−GTPのペプチダ−ゼ活性測定を行つ
てもよい。
法、例えばジアゾカツプリング法、アルデヒド系
化合物を反応させて生成するシツク塩基を定量す
る方法など公知の種々の化学的発色法を適用して
アニリン誘導体〔〕を発色定量することにより
LAPやγ−GTPのペプチダ−ゼ活性測定を行つ
てもよい。
次に、LAPの活性測定について更に詳しく説
明する。LAPの活性測定を行うに当つては、先
ずLAPの合成基質であるＬ−ロイシル−３，５
−ジハロゲノ−４−ヒドロキシアニリドに被験液
中のLAPを酵素反応させてアニリン誘導体〔〕
を遊離させる。被験液としては血清を0.01〜５ml
の範囲内で用いられる。上記酵素反応は通常37℃
付近で５分以上反応させればよい。この反応の至
適PHは6.5〜8.0の範囲にあるから、この範囲内で
適宜PHを設定すればよい。PHを保持するための緩
衝液としては、リン酸塩、バルビタール、ホウ酸
塩、トリスヒドロキシメチルアミノメタンなどの
緩衝液が用いられる。
明する。LAPの活性測定を行うに当つては、先
ずLAPの合成基質であるＬ−ロイシル−３，５
−ジハロゲノ−４−ヒドロキシアニリドに被験液
中のLAPを酵素反応させてアニリン誘導体〔〕
を遊離させる。被験液としては血清を0.01〜５ml
の範囲内で用いられる。上記酵素反応は通常37℃
付近で５分以上反応させればよい。この反応の至
適PHは6.5〜8.0の範囲にあるから、この範囲内で
適宜PHを設定すればよい。PHを保持するための緩
衝液としては、リン酸塩、バルビタール、ホウ酸
塩、トリスヒドロキシメチルアミノメタンなどの
緩衝液が用いられる。
生成したアニリン誘導体〔〕を定量するに当
つては、ｐ−キシレノールなどのカプラー共存下
でアルカリの条件下メタ過ヨウ素酸ナトリウムな
どの酸化剤で酸化縮合させて発色化合物を形成し
て比色定量してもよく、また過酸化水素などの酸
化剤でペンタシアノアミノフエロエートを酸化し
て得た呈色試薬を用いて発色させ、比色定量して
もよい。
つては、ｐ−キシレノールなどのカプラー共存下
でアルカリの条件下メタ過ヨウ素酸ナトリウムな
どの酸化剤で酸化縮合させて発色化合物を形成し
て比色定量してもよく、また過酸化水素などの酸
化剤でペンタシアノアミノフエロエートを酸化し
て得た呈色試薬を用いて発色させ、比色定量して
もよい。
次にγ−GTPの活性測定について更に詳しく
説明する。γ−GTPの活性測定を行うに当つて
は、先ずγ−GTPの合成基質であるγ−Ｌ−グ
ルタミル−３，５−ジハロゲノ−４−ヒドロキシ
アニリドに被検液中のγ−GTPを酵素反応させ
てアニリン誘導体〔〕を遊離させる。被験液と
しては血清を0.01〜５mlの範囲内で用いられる。
上記酵素反応は通常37℃付近で５分以上反応させ
ればよい。この反応の至適PHは7.3〜9.0の範囲に
あるから、この範囲内で適宜PHを設定すればよ
い。反応に際しては受容体としてアミノ酸やペプ
チド、例えばグリシルグリシンの適当量を含むPH
7.5〜9.0の緩衝液中で反応させ、試料中のγ−
GTP活性に比例して生成するアニリン誘導体
〔〕を定量すればよい。PHを保持するための緩
衝液としては、リン酸塩、バルビタール、ホウ酸
塩、炭酸塩、トリエタノールアミン、グリシン、
トリスヒドロキシメチルアミノメタンなどの緩衝
液が用いられる。
説明する。γ−GTPの活性測定を行うに当つて
は、先ずγ−GTPの合成基質であるγ−Ｌ−グ
ルタミル−３，５−ジハロゲノ−４−ヒドロキシ
アニリドに被検液中のγ−GTPを酵素反応させ
てアニリン誘導体〔〕を遊離させる。被験液と
しては血清を0.01〜５mlの範囲内で用いられる。
上記酵素反応は通常37℃付近で５分以上反応させ
ればよい。この反応の至適PHは7.3〜9.0の範囲に
あるから、この範囲内で適宜PHを設定すればよ
い。反応に際しては受容体としてアミノ酸やペプ
チド、例えばグリシルグリシンの適当量を含むPH
7.5〜9.0の緩衝液中で反応させ、試料中のγ−
GTP活性に比例して生成するアニリン誘導体
〔〕を定量すればよい。PHを保持するための緩
衝液としては、リン酸塩、バルビタール、ホウ酸
塩、炭酸塩、トリエタノールアミン、グリシン、
トリスヒドロキシメチルアミノメタンなどの緩衝
液が用いられる。
生成したアニリン誘導体〔〕を定量するに当
つては、LAPの活性測定におけると同様な化学
的発色法を用いて発色化合物に導き、比色定量す
ればよい。
つては、LAPの活性測定におけると同様な化学
的発色法を用いて発色化合物に導き、比色定量す
ればよい。
前記したように本発明の合成基質を用いる測定
法は、各反応工程が簡便なため、速やかに且つ正
確なLAP、γ−GTPのペプチダ−ゼ活性値を測
定することができるばかりでなく、生成する発色
化合物が通常500〜750nｍ附近に極大吸収を有す
るため、生成試料中の夾雑物による影響を受けに
くく、ペプチダ−ゼ活性測定において精度の高い
方法である。
法は、各反応工程が簡便なため、速やかに且つ正
確なLAP、γ−GTPのペプチダ−ゼ活性値を測
定することができるばかりでなく、生成する発色
化合物が通常500〜750nｍ附近に極大吸収を有す
るため、生成試料中の夾雑物による影響を受けに
くく、ペプチダ−ゼ活性測定において精度の高い
方法である。
次に実施例および参考例を挙げて本発明を具体
的に説明するが、これにより何ら本発明を限定す
るものではない。
的に説明するが、これにより何ら本発明を限定す
るものではない。
尚、実施例および参考例中に記載の略記号は次
の意味を有する。
の意味を有する。
Leu；Ｌ−ロイシル
ｒ−Glu；γ−グルタミル
BOC；ｔ−ブチルオキシカルボニル
OSu；Ｎ−ビドロキシスクシンイミドエステル
AcOH；酢酸
参考例 １
Ｌ−ロイシル−３，５−ジクロロ−４−ヒドロ
キシアニリド・塩酸塩 ２，６−ジクロロ−４−アミノフエノール1.78
ｇ（10ミリモル）および炭酸水素ナトリウム1.26
ｇ（15ミリモル）を水25mlに溶かし、これに０〜
５℃に冷却しつつBOC−Leu−OSu3.28ｇ（10ミ
リモル）のジオキサン（25ml）溶液を撹拌下滴し
た。室温で一夜撹拌した後、30℃以下でジオキサ
ンを減圧下留去した。残渣を酢酸エチル200mlに
溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、
1N塩酸、飽和食塩水の順で各50mlで３回づつ洗
浄した。酢酸エチル層を無水硫酸マグネシウムで
乾燥した後、減圧濃縮してBOC−Ｌ−ロイシル
−３，５−ジクロロ−４−ヒドロキシアニリド
2.96ｇを得た。次いで、これを2N−HCl／
AcOH15mlに溶かし、室温で２時間撹拌した後、
乾燥ジエチルエーテル100mlを加えて結晶化し、
乾燥エーテルで２回デカンテーシヨンした。得ら
れた結晶を減圧乾燥してＬ−ロイシル−３，５−
ジクロロ−４−ヒドロキシアニリド・塩酸塩を得
た。
キシアニリド・塩酸塩 ２，６−ジクロロ−４−アミノフエノール1.78
ｇ（10ミリモル）および炭酸水素ナトリウム1.26
ｇ（15ミリモル）を水25mlに溶かし、これに０〜
５℃に冷却しつつBOC−Leu−OSu3.28ｇ（10ミ
リモル）のジオキサン（25ml）溶液を撹拌下滴し
た。室温で一夜撹拌した後、30℃以下でジオキサ
ンを減圧下留去した。残渣を酢酸エチル200mlに
溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、
1N塩酸、飽和食塩水の順で各50mlで３回づつ洗
浄した。酢酸エチル層を無水硫酸マグネシウムで
乾燥した後、減圧濃縮してBOC−Ｌ−ロイシル
−３，５−ジクロロ−４−ヒドロキシアニリド
2.96ｇを得た。次いで、これを2N−HCl／
AcOH15mlに溶かし、室温で２時間撹拌した後、
乾燥ジエチルエーテル100mlを加えて結晶化し、
乾燥エーテルで２回デカンテーシヨンした。得ら
れた結晶を減圧乾燥してＬ−ロイシル−３，５−
ジクロロ−４−ヒドロキシアニリド・塩酸塩を得
た。
収量 1.89ｇ（収率57.7％）
分子式 C12H16N2O2Cl2・HCl
融点；127〜133℃（分解）
シリカゲル薄層クロマトグラフイ（TLC）；Rf＝
0.63〔ｎ−ブタノール−酢酸−水（４：１：
１）〕 参考例 ２ Ｌ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロ
キシアニリド・塩酸塩 ２，６−ジブロモ−４−アミノフエノール4.90
ｇ（18.3ミリモル）および炭酸水素ナトリウム
1.68ｇ（20ミリモル）を水70mlに溶かし、これに
０〜５℃に冷却しつつBOC−Leu−OSu6.01ｇ
（18.3ミリモル）のジオキサン（70ml）溶液を撹
拌下滴下した。室温で一夜撹拌した後、30℃以下
でジオキサンを源圧下留去した。残渣を酢酸エチ
ル400mlに溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム水溶
液、水、1N塩酸、飽和食塩水の順で各100mlで３
回づつ洗浄した。酢酸エチル層を無水硫酸マグネ
シウムで乾燥した後、減圧濃縮してBOC−Ｌ−
ロイシル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシア
ニリド5.8ｇを得た。次いでこれを2N−HCl／
AcOH30mlに溶かし、室温で２時間撹拌した後、
乾燥エーテルを加えて結晶化させてＬ−ロイシル
３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリド・塩
酸塩を得た。
0.63〔ｎ−ブタノール−酢酸−水（４：１：
１）〕 参考例 ２ Ｌ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロ
キシアニリド・塩酸塩 ２，６−ジブロモ−４−アミノフエノール4.90
ｇ（18.3ミリモル）および炭酸水素ナトリウム
1.68ｇ（20ミリモル）を水70mlに溶かし、これに
０〜５℃に冷却しつつBOC−Leu−OSu6.01ｇ
（18.3ミリモル）のジオキサン（70ml）溶液を撹
拌下滴下した。室温で一夜撹拌した後、30℃以下
でジオキサンを源圧下留去した。残渣を酢酸エチ
ル400mlに溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム水溶
液、水、1N塩酸、飽和食塩水の順で各100mlで３
回づつ洗浄した。酢酸エチル層を無水硫酸マグネ
シウムで乾燥した後、減圧濃縮してBOC−Ｌ−
ロイシル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシア
ニリド5.8ｇを得た。次いでこれを2N−HCl／
AcOH30mlに溶かし、室温で２時間撹拌した後、
乾燥エーテルを加えて結晶化させてＬ−ロイシル
３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリド・塩
酸塩を得た。
収量 2.50ｇ（収率32.8％）
分子式 C12H16N2O2Br2・HCl（416.54）
シリカゲル薄層クロマトグラフイ（TLC）；Rf＝
0.65〔ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：１〕 融点；131〜134℃（分解） 参考例 ３ γ−Ｌ−グルタミル−３，５−ジクロロ−４−
ヒドロキシアニリド Ｎ，Ｎ−フタロイル−Ｌ−グルタミン酸無水物
5.16ｇ（20ミリモル）および４−アミノ−２，６
−ジクロロフエノール3.56ｇ（20ミリモル）をジ
オキサン50mlに溶かし、60℃で２時間撹拌した。
ジオキサンを減圧下留去し、残渣にヒドラジン・
ヒドラート1.5mlのメタノール（50ml）溶液を加
え、室温で２日間放置した。メタノールを減圧下
留去し、残渣に水を加えた後、0.5N−HClでPH
３に調節して析出したγ−Ｌ−グルタミル−３，
５−ジクロロ−４−ヒドロキシアニリド3.96ｇを
得た。
0.65〔ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：１〕 融点；131〜134℃（分解） 参考例 ３ γ−Ｌ−グルタミル−３，５−ジクロロ−４−
ヒドロキシアニリド Ｎ，Ｎ−フタロイル−Ｌ−グルタミン酸無水物
5.16ｇ（20ミリモル）および４−アミノ−２，６
−ジクロロフエノール3.56ｇ（20ミリモル）をジ
オキサン50mlに溶かし、60℃で２時間撹拌した。
ジオキサンを減圧下留去し、残渣にヒドラジン・
ヒドラート1.5mlのメタノール（50ml）溶液を加
え、室温で２日間放置した。メタノールを減圧下
留去し、残渣に水を加えた後、0.5N−HClでPH
３に調節して析出したγ−Ｌ−グルタミル−３，
５−ジクロロ−４−ヒドロキシアニリド3.96ｇを
得た。
収量 3.96ｇ（収率64.5％）
分子式 C11H12N2O4Cl2
融点；214〜217℃（分解）
シリカゲルTLC；Rf＝0.49（ｎ−ブタノール：酢
酸：水＝４：１：１） 参考例 ４ γ−Ｌ−グルタミル３，５−ジブロモ−４−ヒ
ドロキシアニリド Ｎ，Ｎ−フタロイル−Ｌ−グルタミン酸無水物
2.18ｇ（8.4ミリモル）および４−アミノ−２，
６−ジブロモフエノール2.26ｇ（8.4ミリモル）
をジオキサン20mlに溶かし、60℃で1.5時間撹拌
した。ジオキサンを減圧下留去し、残渣にヒドラ
ジン・ヒドラート0.7mlのメタノール（20ml）溶
液を加え、室温で２日間放置した。メタノールを
減圧下留去し、残渣に水を加えた後、0.5N−
HClでPH３に調節して析出したγ−Ｌ−グルタミ
ル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリド
2.13ｇを得た。
酸：水＝４：１：１） 参考例 ４ γ−Ｌ−グルタミル３，５−ジブロモ−４−ヒ
ドロキシアニリド Ｎ，Ｎ−フタロイル−Ｌ−グルタミン酸無水物
2.18ｇ（8.4ミリモル）および４−アミノ−２，
６−ジブロモフエノール2.26ｇ（8.4ミリモル）
をジオキサン20mlに溶かし、60℃で1.5時間撹拌
した。ジオキサンを減圧下留去し、残渣にヒドラ
ジン・ヒドラート0.7mlのメタノール（20ml）溶
液を加え、室温で２日間放置した。メタノールを
減圧下留去し、残渣に水を加えた後、0.5N−
HClでPH３に調節して析出したγ−Ｌ−グルタミ
ル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリド
2.13ｇを得た。
収量 2.13ｇ（収率64.0％）
分子式 C11H12N2O4Br2
融点；191〜194℃（分解）〔日本薬局方一般試験
法融点測定の項に準じて測定した結果は199〜
200℃（分解）であつた。〕 シリカゲルTLC；Rf＝0.53（ｎ−ブタノール：酢
酸：水＝４：１：１） 実施例 １ Ｌ−ロイシル−３，５−ジクロロ−４−ヒドロ
キシアニリド、メタ過ヨウ素酸ナトリウム、ｐ
−キシレノールを用いるLAP活性測定 Ｌ−ロイシル−３，５−ジクロロ−４−ヒドロ
キシアニリド・塩酸塩を0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.0）に溶解して基質溶液とした（５ｍＭ）。この
基質溶液１mlに、患者血清（236G−Ｒ単位の
LAP）20μを加え良く混合し、37℃にて20分間
反応させた。反応後、２ｍＭメタ過ヨウ素酸ナト
リウム、10ｍMp−キシレノールを含有する0.2M
−KOH溶液からなる酸化試薬液３mlを加え反応
せしめて発色させた。
法融点測定の項に準じて測定した結果は199〜
200℃（分解）であつた。〕 シリカゲルTLC；Rf＝0.53（ｎ−ブタノール：酢
酸：水＝４：１：１） 実施例 １ Ｌ−ロイシル−３，５−ジクロロ−４−ヒドロ
キシアニリド、メタ過ヨウ素酸ナトリウム、ｐ
−キシレノールを用いるLAP活性測定 Ｌ−ロイシル−３，５−ジクロロ−４−ヒドロ
キシアニリド・塩酸塩を0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.0）に溶解して基質溶液とした（５ｍＭ）。この
基質溶液１mlに、患者血清（236G−Ｒ単位の
LAP）20μを加え良く混合し、37℃にて20分間
反応させた。反応後、２ｍＭメタ過ヨウ素酸ナト
リウム、10ｍMp−キシレノールを含有する0.2M
−KOH溶液からなる酸化試薬液３mlを加え反応
せしめて発色させた。
次いでこれを波長585nｍにおける発色液の吸
光度を測定したところO.D585＝0.18を得た。
光度を測定したところO.D585＝0.18を得た。
すなわち、本発明の合成基質は、臨床上、重要
とされているLAPに対して良く作用することが
示された。
とされているLAPに対して良く作用することが
示された。
実施例 ２
Ｌ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロ
キシアニリド、メタ過ヨウ素酸ナトリウム、ｐ
−キシリレノールを用いるLAP活性測定 Ｌ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロ
キシアニリド・塩酸塩を0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.0）に溶解して基質溶液とした（５ｍＭ）。この
基質溶液１mlに、患者血清（250G−Ｒ単位の
LAP）20μを加え良く混合し、37℃にて20分間
反応させた。反応後、２ｍＭメタ過ヨウ素酸ナト
リウム、10ｍＭ ｐ−キシレノールを含有する
0.2N−KOH溶液からなる酸化試薬液３mlを加
え、発色させた。
キシアニリド、メタ過ヨウ素酸ナトリウム、ｐ
−キシリレノールを用いるLAP活性測定 Ｌ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロ
キシアニリド・塩酸塩を0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.0）に溶解して基質溶液とした（５ｍＭ）。この
基質溶液１mlに、患者血清（250G−Ｒ単位の
LAP）20μを加え良く混合し、37℃にて20分間
反応させた。反応後、２ｍＭメタ過ヨウ素酸ナト
リウム、10ｍＭ ｐ−キシレノールを含有する
0.2N−KOH溶液からなる酸化試薬液３mlを加
え、発色させた。
次いで、これを波長585nｍにおける発色液の
吸光度を測定したところO.D.＝0.22を得た。
吸光度を測定したところO.D.＝0.22を得た。
すなわち、本発明の合成基質は、臨床上、重要
とされているLAPに対して良く作用することが
示された。
とされているLAPに対して良く作用することが
示された。
実施例 ３
γ−Ｌ−グルタミル−３，５−ジクロロ−４−
ヒドロキシアニリド、メタ過ヨウ素酸ナトリウ
ム、ｐ−キシレノールを用いるγ−GTP活性
測定 γ−Ｌ−グルタミル−３，５−ジクロロ−４−
ヒドロキシアニリド（５ｍＭ）及びグリシルグシ
ン（100ｍＭ）を50ｍＭトリス塩酸緩衝液（PH
8.0）に溶解して基質溶液とした。この基質溶液
0.5mlに、患者血清（130ｍＵ／mlのγ−GTP）
10μを加え良く混合し、37℃にて20分間反応さ
せた。反応後、２ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウ
ム、10ｍＭ ｐ−キシレノールを含有する0.2N
−KOH溶液からなる酸化試薬液２mlを加えて発
色させた。
ヒドロキシアニリド、メタ過ヨウ素酸ナトリウ
ム、ｐ−キシレノールを用いるγ−GTP活性
測定 γ−Ｌ−グルタミル−３，５−ジクロロ−４−
ヒドロキシアニリド（５ｍＭ）及びグリシルグシ
ン（100ｍＭ）を50ｍＭトリス塩酸緩衝液（PH
8.0）に溶解して基質溶液とした。この基質溶液
0.5mlに、患者血清（130ｍＵ／mlのγ−GTP）
10μを加え良く混合し、37℃にて20分間反応さ
せた。反応後、２ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウ
ム、10ｍＭ ｐ−キシレノールを含有する0.2N
−KOH溶液からなる酸化試薬液２mlを加えて発
色させた。
次いで、これを波長585nｍにおける発色液の
吸光度を測定したところO.D585＝0.112を得た。
吸光度を測定したところO.D585＝0.112を得た。
すなわち、本発明の合成基質は、臨床上、重要
とされているγ−GTPに対して良く作用するこ
とが示された。
とされているγ−GTPに対して良く作用するこ
とが示された。
実施例 ４
γ−Ｌ−グルタミル−３，５−ジブロモ−４−
ヒドロキシアニリド、メタ過ヨウ素酸ナトリウ
ム、ｐ−キシリレノールを用いるγ−GTP活性
測定γ−Ｌ−グルタミル−３，５−ジブロモ−４
−ヒドロキシアニリド（５ｍＭ）およびグリシル
グリシン（100ｍＭ）を50ｍＭトリス塩酸緩衝液
（PH8.0）に溶解して基質溶液とした。この基質溶
液0.5mlに患者血清（130ｍＵ／mlのγ−GTP）
10μを加え良く混合し、37℃にて20分間反応さ
せた。反応後、２ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウ
ム、10ｍＭ ｐ−キシレノールを含有する0.2N
−KOH溶液からなる酸化試薬液２mlを加えて発
色させた。
ヒドロキシアニリド、メタ過ヨウ素酸ナトリウ
ム、ｐ−キシリレノールを用いるγ−GTP活性
測定γ−Ｌ−グルタミル−３，５−ジブロモ−４
−ヒドロキシアニリド（５ｍＭ）およびグリシル
グリシン（100ｍＭ）を50ｍＭトリス塩酸緩衝液
（PH8.0）に溶解して基質溶液とした。この基質溶
液0.5mlに患者血清（130ｍＵ／mlのγ−GTP）
10μを加え良く混合し、37℃にて20分間反応さ
せた。反応後、２ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウ
ム、10ｍＭ ｐ−キシレノールを含有する0.2N
−KOH溶液からなる酸化試薬液２mlを加えて発
色させた。
次いで、これを波長585nｍにおける発色液の
吸光度を測定したところO.D585＝0.140を得た。
吸光度を測定したところO.D585＝0.140を得た。
すなわち、本発明の合成基質は、臨床上、重要
とされているγ−GTPに対して良く作用するこ
とが示された。
とされているγ−GTPに対して良く作用するこ
とが示された。
実施例 ５
Ｌ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロ
キシアニリド、メタ過ヨウ素酸ナトリウム、２
−クロロ−５−メチルフエノールを用いる
LAP活性測定 Ｌ−ロイシル−３，５ジブロモ−４−ヒドロキ
シアニリド・塩酸塩を0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.0）に溶解して基質溶液とした（５ｍＭ）。この
基質溶液１mlに、患者血清（250G−Ｒ単位の
LAP）20μを加え良く混合し、37℃にて20分間
反応させた。反応後、２ｍＭメタ過ヨウ素酸ナト
リウム、５ｍM2−クロロ−５−メチルフエノー
ルを含有する0.2N−KOH溶液からなる酸化試薬
液３mlを加え発色させた。
キシアニリド、メタ過ヨウ素酸ナトリウム、２
−クロロ−５−メチルフエノールを用いる
LAP活性測定 Ｌ−ロイシル−３，５ジブロモ−４−ヒドロキ
シアニリド・塩酸塩を0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.0）に溶解して基質溶液とした（５ｍＭ）。この
基質溶液１mlに、患者血清（250G−Ｒ単位の
LAP）20μを加え良く混合し、37℃にて20分間
反応させた。反応後、２ｍＭメタ過ヨウ素酸ナト
リウム、５ｍM2−クロロ−５−メチルフエノー
ルを含有する0.2N−KOH溶液からなる酸化試薬
液３mlを加え発色させた。
次いで、これを波長635nｍにおける発色液の
吸光度を測定したところ、O.D585＝0.33を得た。
吸光度を測定したところ、O.D585＝0.33を得た。
すなわち、本発明の合成基質は、LAPに対し
て良く作用することが示された。
て良く作用することが示された。
実施例 ６
γ−Ｌ−グルタミル−３，５−ジブロモ−４−
ヒドロキシアニリド、メタ過ヨウ素酸ナトリウ
ム、２−クロロ−５−メチルフエノールを用い
るγ−GTP活性測定 γ−Ｌ−グルタミル−３，５−ジブロモ−４−
５ｍＭヒドロキシアニリド（５ｍＭ）およびグリ
シルグリシン（100ｍＭ）を50ｍＭトリス塩酸緩
衝液（PH8.0）に溶解して基質溶液とした。この
基質溶液0.5mlに患者血清（130ｍＵ／mlのγ−
GTP）10μを加え良く混合し、37℃にて20分間
反応させた。反応後、２ｍＭメタ過ヨウ素酸ナト
リウム、５ｍM2−クロロ−５−メチルフエノー
ルを含有する0.2N−KOH溶液からなる酸化試薬
液２mlを加えて発色させる。
ヒドロキシアニリド、メタ過ヨウ素酸ナトリウ
ム、２−クロロ−５−メチルフエノールを用い
るγ−GTP活性測定 γ−Ｌ−グルタミル−３，５−ジブロモ−４−
５ｍＭヒドロキシアニリド（５ｍＭ）およびグリ
シルグリシン（100ｍＭ）を50ｍＭトリス塩酸緩
衝液（PH8.0）に溶解して基質溶液とした。この
基質溶液0.5mlに患者血清（130ｍＵ／mlのγ−
GTP）10μを加え良く混合し、37℃にて20分間
反応させた。反応後、２ｍＭメタ過ヨウ素酸ナト
リウム、５ｍM2−クロロ−５−メチルフエノー
ルを含有する0.2N−KOH溶液からなる酸化試薬
液２mlを加えて発色させる。
次いで、これを波長635nｍにおける発色液の
吸光度を測定したところO.D635＝0.214を得た。
吸光度を測定したところO.D635＝0.214を得た。
すなわち、本発明の合成基質は、γ−GTPに
対して良く作用することが示された。
対して良く作用することが示された。
実施例 ７
Ｌ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロ
キシアニリド、ナトリウムペンタシアノアミノ
フエロエートを用いるLAP活性測定 ナトリウムペンタシアノアミノフエロエート２
ｇを水20mlに溶解し、0.3％過酸化水素60mlを加
え、更に10％重炭酸ナトリウム液20mlを加えた。
次にデキストランT10（フアルマシア社製）４ｇ
を加え、呈色原液を調製した。反応停止・呈色原
液１mlに１％食塩および0.5％Tween80を含有す
る0.2Mのクエン酸緩衝液（PH4.5）50mlを加えて
調製した。
キシアニリド、ナトリウムペンタシアノアミノ
フエロエートを用いるLAP活性測定 ナトリウムペンタシアノアミノフエロエート２
ｇを水20mlに溶解し、0.3％過酸化水素60mlを加
え、更に10％重炭酸ナトリウム液20mlを加えた。
次にデキストランT10（フアルマシア社製）４ｇ
を加え、呈色原液を調製した。反応停止・呈色原
液１mlに１％食塩および0.5％Tween80を含有す
る0.2Mのクエン酸緩衝液（PH4.5）50mlを加えて
調製した。
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解した５ｍＭ
Ｌ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロ
キシアニリド・塩酸塩１mlに患者血清（250G−
Ｒ単位のLAP）20μを加え良く混合し、37℃に
て20分間反応させた。反応後、反応停止・呈色液
５mlを加え、室温に20分間放置し、呈色させた
後、700nｍにて吸光度を測定した。その結果、
O.D700＝0.21であつた。
Ｌ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロ
キシアニリド・塩酸塩１mlに患者血清（250G−
Ｒ単位のLAP）20μを加え良く混合し、37℃に
て20分間反応させた。反応後、反応停止・呈色液
５mlを加え、室温に20分間放置し、呈色させた
後、700nｍにて吸光度を測定した。その結果、
O.D700＝0.21であつた。
実施例 ８
γ−Ｌ−グルタミル−３，５−ジブロモ−４−
ヒドロキシアニリド、ナトリウムペンタシアノ
アミノフエロエートを用いるγ−GTP活性測
定 50ｍＭトリス塩酸緩衝液（PH8.0）に溶解した
５ｍＭ γ−Ｌ−グルタミル−３，５−ジブロモ
−４−ヒドロキシアニリド、100ｍＭグリシルグ
リシン溶液１mlに患者血清（130ｍＵ／mlのγ−
GTP）20μを加えて良く混合し、37℃にて20分
間反応させた。反応後、実施例７に記載した反応
停止・呈色液５mlを加え、20分間放置し、呈色さ
せた後、700nｍに吸光度を測定した。その結果、
O.D700＝0.132であつた。
ヒドロキシアニリド、ナトリウムペンタシアノ
アミノフエロエートを用いるγ−GTP活性測
定 50ｍＭトリス塩酸緩衝液（PH8.0）に溶解した
５ｍＭ γ−Ｌ−グルタミル−３，５−ジブロモ
−４−ヒドロキシアニリド、100ｍＭグリシルグ
リシン溶液１mlに患者血清（130ｍＵ／mlのγ−
GTP）20μを加えて良く混合し、37℃にて20分
間反応させた。反応後、実施例７に記載した反応
停止・呈色液５mlを加え、20分間放置し、呈色さ
せた後、700nｍに吸光度を測定した。その結果、
O.D700＝0.132であつた。
実施例 ９
Ｌ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロ
キシアニリド、ナトリウムペンタシアノアコフ
エリアートを用いるLAP活性測定法 Ｌ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロ
キシアニリド・塩酸塩を0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.0）に溶解して基質溶液（５ｍＭ）とした。こ
の基質溶液１mlに患者血清（250G−Ｒ単位の
LAP）20μを加え良く混合し、37℃にて15分間
反応させた。反応後、１％−ナトリウムペンタシ
アノアコフエリアート30mlに0.2M EDTA・2Na
（PH11）溶液90mlを加えて調製した溶液４mlを加
え37℃にて15分間反応させた。反応呈色後、
730nｍにて吸光度を測定した。その結果、O.D730
＝0.232であつた。
キシアニリド、ナトリウムペンタシアノアコフ
エリアートを用いるLAP活性測定法 Ｌ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロ
キシアニリド・塩酸塩を0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.0）に溶解して基質溶液（５ｍＭ）とした。こ
の基質溶液１mlに患者血清（250G−Ｒ単位の
LAP）20μを加え良く混合し、37℃にて15分間
反応させた。反応後、１％−ナトリウムペンタシ
アノアコフエリアート30mlに0.2M EDTA・2Na
（PH11）溶液90mlを加えて調製した溶液４mlを加
え37℃にて15分間反応させた。反応呈色後、
730nｍにて吸光度を測定した。その結果、O.D730
＝0.232であつた。
１％−ナトリウムペンタシアノアコフエリアー
トは、１％−ニトロプルシツドナトリウムNa2
〔Fe（CN）5NO〕−１％炭酸ナトリウム液を15分
間、紫外線照射して作製した。
トは、１％−ニトロプルシツドナトリウムNa2
〔Fe（CN）5NO〕−１％炭酸ナトリウム液を15分
間、紫外線照射して作製した。
実施例 10
γ−Ｌ−グルタミル−３，５−ジブロモ−４−
ヒドロキシアニリドを用いたγ−GTPの検量
線 γ−Ｌ−グルタミル−３，５−ジブロモ−４−
ヒドロキシアニリド（５ｍＭ）およびグリシルグ
リシン（100ｍＭ）を50ｍＭトリス塩酸緩衝液
（PH8.0）に溶解して基質溶液とした。この基質溶
液0.5mlに血清γ−GTP（74〜370ｍＵ／ml）10μ
を加えて良く混合し、37℃にて20分間反応させ
た。反応後、２ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム、
10ｍＭ ｐ−キシレノールを含有する0.2N−
KOH溶液からなる酸化試薬液２mlを加えて発色
させた。
ヒドロキシアニリドを用いたγ−GTPの検量
線 γ−Ｌ−グルタミル−３，５−ジブロモ−４−
ヒドロキシアニリド（５ｍＭ）およびグリシルグ
リシン（100ｍＭ）を50ｍＭトリス塩酸緩衝液
（PH8.0）に溶解して基質溶液とした。この基質溶
液0.5mlに血清γ−GTP（74〜370ｍＵ／ml）10μ
を加えて良く混合し、37℃にて20分間反応させ
た。反応後、２ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム、
10ｍＭ ｐ−キシレノールを含有する0.2N−
KOH溶液からなる酸化試薬液２mlを加えて発色
させた。
次いで、これを波長585nｍにおける発色液の
吸光度を測定した。その結果を第１図に示した。
この結果より血清γ−GTPが良好に測定される
ことが示された。
吸光度を測定した。その結果を第１図に示した。
この結果より血清γ−GTPが良好に測定される
ことが示された。
実施例 11
Ｌ−ロイジル−４−Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリド
とＬ−ロイジル−３，５−ジブロモ−４−ヒド
ロキシアニリドを用いたLAP測定法の比較。
とＬ−ロイジル−３，５−ジブロモ−４−ヒド
ロキシアニリドを用いたLAP測定法の比較。
従来からLAP測定法に使用されている公知化
合物Ｌ−ロイシル−４−Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリ
ドと本発明の参考例２の化合物を用いLAP測定
法の比較を行つた。
合物Ｌ−ロイシル−４−Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリ
ドと本発明の参考例２の化合物を用いLAP測定
法の比較を行つた。
Ｌ−ロイシル−４−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノア
ニリド1.0ｍＭ、フエノール0.1％を含有するPH
7.0、0.1Mリン酸緩衝液を調製して基質溶液とし
た。この基質溶液2.0mlに種々の血清試料50μを
加えよく混合したのち、37℃、20分間反応させ
た。その後発色試薬〔１−ナフトール−２−スル
ホン酸（カプラ）、メタ過ヨウ素酸ナトリウム〕
1.0mlを加え、呈色（青色）した反応液を675nｍ
で吸光度を測定した。
ニリド1.0ｍＭ、フエノール0.1％を含有するPH
7.0、0.1Mリン酸緩衝液を調製して基質溶液とし
た。この基質溶液2.0mlに種々の血清試料50μを
加えよく混合したのち、37℃、20分間反応させ
た。その後発色試薬〔１−ナフトール−２−スル
ホン酸（カプラ）、メタ過ヨウ素酸ナトリウム〕
1.0mlを加え、呈色（青色）した反応液を675nｍ
で吸光度を測定した。
別にＬ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４−ヒ
ドロキシアニリド塩酸塩を0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.0）に溶解して基質溶液とした（５ｍＭ）。
この基質溶液2.0mlを用いて上記と同じ血清試料
20μとよく混合し、37℃、15分間反応後、発色
試薬〔ｐ−キシレノール（カプラー）、メタ過ヨ
ウ素酸ナトリウム〕2.0mlを加えて、呈色（青色）
した反応液を610nｍで吸光度を測定した。
ドロキシアニリド塩酸塩を0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.0）に溶解して基質溶液とした（５ｍＭ）。
この基質溶液2.0mlを用いて上記と同じ血清試料
20μとよく混合し、37℃、15分間反応後、発色
試薬〔ｐ−キシレノール（カプラー）、メタ過ヨ
ウ素酸ナトリウム〕2.0mlを加えて、呈色（青色）
した反応液を610nｍで吸光度を測定した。
上記両方法により測定した同一血清試料につい
ての吸光度をプロツトして第２図に示すごとき結
果を得た。
ての吸光度をプロツトして第２図に示すごとき結
果を得た。
なお、血清試料として通常血清の他高システイ
ンアミノペプチダーゼ（CAP）血清を用いて測
定した。
ンアミノペプチダーゼ（CAP）血清を用いて測
定した。
その結果、本発明の合成基質はCAPにより作
用されることはない。本願明の合成基質を用いる
ことにより、公知基質の約10倍の感度でLAP活
性測定が可能であることが判つた。
用されることはない。本願明の合成基質を用いる
ことにより、公知基質の約10倍の感度でLAP活
性測定が可能であることが判つた。
第１図はγ−GTPの検量線、第２図は本発明
の合成基質と公知の合成基質との測定法相関図で
ある。
の合成基質と公知の合成基質との測定法相関図で
ある。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 被験液に含有されているＬ−ロイシンアミノ
ペプチダーゼおよびγ−グルタミルトランスペプ
チダーゼからなる群より選ばれるペプチダーゼの
活性測定において、 式 （式中、ＲはＬ−ロイシンアミノペプチダーゼ活
性測定の場合にＬ−ロイシル基、γ−グルタミル
トランスペプチダーゼ活性測定の場合にγ−Ｌ−
グルタミル基を示し、ＸおよびＹは同一か異なり
ハロゲン原子を示す）で表わされるアミド化合物
またはその塩に、被験液に含有されているペプチ
ダーゼを作用させて、式 （式中、ＸおよびＹは前記と同じ意味を有する）
で表わされるアニリン誘導体を遊離せしめ、次い
で該アニリン誘導体を化学的発色手段により発色
させて生成する発色化合物を比色定量することを
特徴とする新規な合成基質を用いるＬ−ロイシン
アミノペプチダーゼおよびγ−グルタミルトラン
スペプチダーゼからなる群より選ばれるペプチダ
ーゼの活性測定法。 ２ アミノ化合物がＬ−ロイシル−３，５−ジハ
ロゲノ−４−ヒドロキシアニリドであり、ペプチ
ダーゼがＬ−ロイシンアミノペプチダーゼである
特許請求の範囲第１項記載の測定法。 ３ Ｌ−ロイシル−３，５−ジハロゲノ−４−ヒ
ドロキシアニリドがＬ−ロイシル−３，５−ジブ
ロモ−４−ヒドロキシアニリドまたはＬ−ロイシ
ル−３，５−ジクロロ−４−ヒドロキシアニリド
である特許請求の範囲第２項記載の測定法。 ４ アミド化合物がγ−Ｌ−グルタミル−３，５
−ジハロゲノ−４−ヒドロキシアニリドであり、
ペプチダーゼがγ−グルタミルトランスペプチダ
ーゼである特許請求の範囲第１項記載の測定法。 ５ γ−Ｌ−グルタミル−３，５−ジハロゲノ−
４−ヒドロキシアニリドがγ−Ｌ−グルタミル−
３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリドまた
はγ−Ｌ−グルタミル−３，５−ジクロロ−４−
ヒドロキシアニリドである特許請求の範囲第２項
記載の測定法。 ６ 化学的発色手段がカプラーを共存させて酸化
縮合を行い、発色させる方法である特許請求の範
囲第１項記載の測定法。 ７ カプラーが該アニリン誘導体と酸化縮合して
発色化合物を形成する芳香族化合物である特許請
求の範囲第６項記載の測定法。 ８ 芳香族化合物がフエノール系化合物、アミノ
フエノール系化合物、アニリン系化合物またはナ
フトール系化合物である特許請求の範囲第７項記
載の測定法。 ９ 化学的発色手段がペンタシアノ鉄錯塩を用い
て発色させる方法である特許請求の範囲第１項記
載の測定法。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57150701A JPS5942350A (ja) | 1982-09-01 | 1982-09-01 | 新規な合成基質を用いるＬ‐ロイシンアミノペプチダーゼおよびγ‐グルタミルトランスペプチダーゼからなる群より選ばれるペプチダーゼの活性測定法 |
| US06/526,031 US4588836A (en) | 1982-09-01 | 1983-08-24 | Novel synthetic substrate and assay method using the same |
| DE19833331588 DE3331588A1 (de) | 1982-09-01 | 1983-09-01 | Amidverbindungen |
| IT22726/83A IT1171084B (it) | 1982-09-01 | 1983-09-01 | Substrato sintetico per il saggio dell'attivita' peptidasica e procedimento di saggio della peptidasi |
| FR8314039A FR2532307B1 (fr) | 1982-09-01 | 1983-09-01 | Nouvel amide utilisable comme substrat synthetique et procede de dosage l'utilisant |
| DE3348172A DE3348172C2 (ja) | 1982-09-01 | 1983-09-01 | |
| US06/713,242 US4675290A (en) | 1982-09-01 | 1985-03-18 | Assaying peptidase enzyme activity |
| FR858508107A FR2567907B1 (fr) | 1982-09-01 | 1985-05-30 | Nouvel amide utilisable comme substrat synthetique et procede de dosage l'utilisant |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57150701A JPS5942350A (ja) | 1982-09-01 | 1982-09-01 | 新規な合成基質を用いるＬ‐ロイシンアミノペプチダーゼおよびγ‐グルタミルトランスペプチダーゼからなる群より選ばれるペプチダーゼの活性測定法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13749585A Division JPS6117550A (ja) | 1985-06-24 | 1985-06-24 | 新規な合成基質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5942350A JPS5942350A (ja) | 1984-03-08 |
| JPS6338200B2 true JPS6338200B2 (ja) | 1988-07-28 |
Family
ID=15502523
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57150701A Granted JPS5942350A (ja) | 1982-09-01 | 1982-09-01 | 新規な合成基質を用いるＬ‐ロイシンアミノペプチダーゼおよびγ‐グルタミルトランスペプチダーゼからなる群より選ばれるペプチダーゼの活性測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5942350A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4735038B2 (ja) * | 2005-05-16 | 2011-07-27 | 日本精工株式会社 | 無段変速装置 |
| GB2454672A (en) * | 2007-11-13 | 2009-05-20 | Mologic Ltd | Chromogenic protease substrates |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5929068B2 (ja) * | 1976-06-01 | 1984-07-18 | 三共株式会社 | α−Ｌ−アミノ酸アニリド化合物 |
| JPS5452042A (en) * | 1977-09-28 | 1979-04-24 | Kanto Kagaku | Llleucyllpphydroxyanilide and measuring method by using it |
-
1982
- 1982-09-01 JP JP57150701A patent/JPS5942350A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5942350A (ja) | 1984-03-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4588836A (en) | Novel synthetic substrate and assay method using the same | |
| US4281181A (en) | Novel L-γ-glutamyl-3-carboxy-4-hydroxyanilide and salts thereof | |
| US4167449A (en) | Composition and method for determining transferase and protease activity | |
| JPH0411199B2 (ja) | ||
| CA1097198A (en) | Method for the determination of enzyme activities | |
| JPS6338200B2 (ja) | ||
| JPS6117956A (ja) | 新規な尿中カリクレイン測定用基質 | |
| JPH0411537B2 (ja) | ||
| JPH0418840B2 (ja) | ||
| EP0224254B1 (en) | a novel substrate for plasma kallikrein and a method for measuring biological components using the same | |
| JPS6210160B2 (ja) | ||
| JP2838866B2 (ja) | 酸化発色分析における還元物質の活性抑制方法 | |
| JPS6342635B2 (ja) | ||
| EP0224255B1 (en) | Synthetic peptidic substrate for determination of trypsin and alpha 1-antitrypsin | |
| CA1087075A (en) | Composition and method for determining transferase and protease activity | |
| JPS58172354A (ja) | ペプチド誘導体 | |
| US4950593A (en) | Improved method for assaying proteolytic enzymes | |
| JPS596898A (ja) | アミノペプチダ−ゼ活性測定法およびそれに用いる合成基質 | |
| JPH0458898A (ja) | トリペプチド及びそれを用いるアンギオテンシン変換酵素の活性測定方法 | |
| JPS5859952A (ja) | 新規合成基質 | |
| JP3667470B2 (ja) | 酸性カルボキシペプチダーゼ活性の測定法及び測定試薬 | |
| JPS61112096A (ja) | 新規な血液凝固因子測定用基質及びこれを用いる測定方法 | |
| JPS6261319B2 (ja) | ||
| JPH04305560A (ja) | アルギニン誘導体またはその可溶性塩、及びエキソペプチダーゼ活性測定法 | |
| JPH0244519B2 (ja) |