JPH04131084A - 熱安定性シトシンデアミナーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、一般的に酵素シトシンデアミナーゼに関する
。さらに特定すれば９本発明は、　５ａｃｃｈａｎシ１
竪ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来する熱安定性シトシンデ
アミナーゼの精製および組換え産生に関する。

（従来の技術） シトシンデアミナーゼ（ＣＤアーゼ、　ＥＣ３，５，４
，１）−’は２次の反応により、シトシンからウラシル
への加水分解を触媒する。

微生物のピリミジン代謝で重要な役割をはだすこの酵素
は（０’　ＤｏｎｏｖａｎおよびＮｅｕｈａｒｄ、　１
９７０）＋　いくつかの異なった微生物から単離された
。しかし。

哺乳類細胞には存在しないようである（ＮｉＮｈｉｙａ
ｗ＋ａら、　１９８５）。

様々な微生物由来のＣＤアーゼの物性は１分子量。

安定性、およびサブユニット組成の点で大きく異なるこ
とが示されてきた。例えば、　ＳａＪｍｏｎｅｌｌａシ
１１！■エリ−由来のＣＤアーゼが、　５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにより均一になるように精製されたところ、それぞれ
が５４キロダルトン（ｋＤａ）の４つのサブユニットか
ら構成されていた０１ｅｓｔら、　１９８２）　、一方
、　Ｅｓｃｈｅｒｉ仕」　い旦由来の該酵素は、　２０
０ｋＤａの分子量を有し、　３５ｋＤａおよび４６ｋＤ
ａのサブユニットから構成される（Ｋａ　ｔｓｕｒａｇ
ｉら、　１９８６）　。これらの酵素の両方とも非常に
熱安定であり、５５℃において高い活性を維持している
。

パンｆ１ｍ＜ｓ犯匹加■μリシ埼　ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）もまた。

ＣＤアーゼの供給源として使用されてきた。以前にパン
酵母から得られたＣＤアーゼは、ゲル濾過により決定さ
れたところ分子量３４ｋＤａを有しており　（Ｉｐａｔ
ａ　ら、　１９７Ｌ　１９７８）、　５Ｏ３−ＰＡＧＥ
およびアミノ酸分析により決定されたところ３２〜３３
ｋＤａを有していた（Ｙｅｒｇａｔｉａｎら、　１９７
７）　、それゆえ、以前にパン酵母から単離されたＣＤ
アーゼ酵素は、単一のタンパクであるようである。

以前に単離されたパン酵母ＣＤアーゼの溶液は。

４°Ｃ，ｐＨ５〜９０間で保存された場合、少なくとも
４８時間活性を維持した（ｌｐａｔａら、　１９７１．
１９７８）。

しかし、３７°Ｃでは、パン酵母ＣＤアーゼの粗試料は
。

１時間でその活性の半分が消失することが示され（Ｋｒ
ｅａｍおよびＣｈａｒｇａｆｆ、　１９５２）、　　該
酵素の精製された形態では、３０分の半減期を有してい
た（Ｋａｔｓｕｒａｇｉ、　１９８８）　、　３７°Ｃ
における半減期は、該酵素をエポキシ−アクリルビーズ
上に固定することにより２８日まで増大され得る（Ｋａ
ｔｓｕｒａｇｉら、　１９８７）。

このように、パン酵母由来のＣＤアーゼの熱安定性は、
それが低分子量であることとともに、上記細菌の酵素と
は異なっている。

ＣＤアーゼは、治療用としてプロドラッグ５−フルオロ
シトシン（５−ＰＣ）を制ガン剤５−フルオロウラシル
（５−ＦＣ）に変換するために使用されてきた（Ｋａｔ
ｓｕｒａｇｉら＋　１９８７；　ＮｉＮ１５ｈｉｙａ　
ら、　１９８５；　５ａｋａｉ　　ら。

１９８５；　５ｅｎｔｅｒら、　１９Ｂ？）　、　　し
かし、　ＣＤアーゼの細菌の供給源は、充分な活性を得
るために大量の培養を必要とし、そのような使用のため
には実質的ではない（Ｓａｋａｉら、　１９８５）。加
えて、微生物の抽出物は、その受容体に望ましくない副
作用をひきおこし得る。

これらの問題を克服するために、酵母がＣＤアーゼの供
給源として使用され得る。しかし、以前の酵母由来の生
成物の熱不安定性のため、酵素をその使用前に固定化す
ることが必要であるＣＫａｔｓｕｒａｇｊら、　１９８
７）。したがって、熱安定性の酵母ＣＤアーゼの単離・
精製により、制ガン治療に使用される改善された酵素が
提供される。同様に、酵母からの熱安定性ＣＤアーゼの
遺伝子をクローニングすることにより、遺伝子自身に限
定された変性あるいは付加、遺伝子の発現を制御する配
列、および遺伝子と他の分子との間で作製される遺伝子
融合を導入することができる。そのような新しい構築物
は、制ガン治療における該酵素の効率または有用性を増
大させる。

（発明の要旨） 本発明は、パン酵母由来の熱安定性ＣＤアーゼの予期せ
ぬ発見に基づく。この酵素のアミノ酸配列分析によれば
、公知の他のタンパクの配列と有意な相同性が見られな
い。

本発明は、熱安定性ＣＤアーゼまたはそれと機能上等価
なタンパクをコードする。単離されたヌクレオチド配列
を提供し、そして、この配列を含有し、そして該配列の
発現において効果的である組換え発現ベクター、それに
より形質転換された宿主細胞、および組換えにより熱安
定性ＣＤアーゼまたはその機能的等個物を産生ずる方法
を提供する。

上記産生方法は、上記形質転換された宿主細胞を増殖さ
せることを包含する。

好ましい実施態様では、上記ヌクレオチドは。

第１Ｏ図に示される配列と実質的に同一である。

好ましい実施態様では、上記組換え発現ベクターは、前
記ヌクレオチド配列が、宿主細胞と適合性の制御配列と
作動可能に連結している。

本発明は、単離された。熱安定性ＣＤアーゼ、またはそ
れと機能的に等価なタンパクをも提供する。

好ましい実施態様では、上記ＣＤアーゼは、第６図また
は第１０図に示されるアミノ酸配列、またはそれと実質
的に相同でありかつ機能的に等価なアミノ酸配列を包含
する。

本発明の好ましい実施態様では、　ＣＤアーゼは酵母か
ら単離される。特に好ましい実施態様では。

単離される。

本発明の別の局面、利益および用途は、当業者がこの開
示を見れば、容品に明らがとなるであろう。

（以下余白） （発明の構成） 本発明を実施する場合、特にことわりがないがぎり、タ
ンパク化学１分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ
技術の通常の技術が用いられ得る。

これらの技術は、当業者の範囲内である。このような技
術は２文献で充分説明されている〔例えば。

５ｃｏｐｅｓ、Ｒ，に、＋Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓａｎｄ　Ｐｒａ
ｃｔｉｃｅ＋第２版、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ
ｇ、　１９８７年；Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ、Ｓ、ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ。

Ｋａｐｌａｎ編集、＾ｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒ＠ｓｓ、
Ｉｎｃ、；Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｆｒ１ｔｓｃｈおよびＳ
ａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ
：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ＭａｎｕａＬ第２版、　
１９８９年；Ｏ１ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔ
ｈｅｓｉｓ＋　ＭＪ、Ｇａ１ｔＷ集、　１９８４年参照
〕。

Ａ、定１ 本発明を説明する際に２次の用語が用いられ得るが、こ
こで使用された場合、以下に示されるように定義される
ことを意図している。

ｒ熱に安定なシトシンデアミナーゼ」は、遊離した非固
定化状態で、３７℃で１２時間より長く、好ましくは３
７°Ｃで１日以上より長く、最も好ましくは３７°Ｃで
８日より長く、少なくとも５０％の活性を有するＣＤア
ーゼをいう　（この活性は、以下で充分に説明されるア
ッセイにより、単離された上記酵素の存在下で５ＦＣか
ら５ＰＵへの交換をモニターすることにより決定される
）。

アミノ酸配列またはタンパクは、アミノ酸の少なくとも
約５０％、好ましくは少なくとも約８５％。

および最も好ましくは少なくとも約９０〜９５％が。

その分子の所定の長さにわたって一致する場合。

他のアミノ酸配列またはタンパクと「実質的に相同」で
ある。さらに、そのアミノ酸の変異は、置換、欠失また
は付加を包含し得る。

「機能上等価な」という用語は、そのようなアミノ酸配
列またはタンパクが５−ＦＣを５−ＦＵに変換し得る（
実施例で述べられる）上記熱に安定な酵素を産生じ得る
鎖であることを明確にすることを意図する。熱に安定な
ＣＤアーゼと機能上等価なタンパクが１本発明の図面に
示されるアミノ酸配列と正確に−・致した配列またはそ
の全体の配列を持つ必要はない、むしろ、そのタンパク
は、アミノ酸配列の生物学的活性のある断片で構成され
得る（その活性は上で定義された）。さらに、生物学的
に活性を有するかぎり、このタンパクは９図示される配
列に対する付加、欠失または置換を包含し得る。

「精製されたタンパク」は、他の物質を実質的に含有し
ていないタンパクである。例えば、タンパクＡは、Ｂが
他の細胞成分およびタンパクの混合物であり、存在する
Ａ＋Ｂの合計の少なくとも約５０重量％、より好ましく
は少なくとも７５重量％。

および最も好ましくは９０〜９５重量％、または、さら
に９９重量％がＡの場合、Ｂを実質的に含有していない
。しかし「精製された」という用語は、精製されたタン
パクが誘導される方法には関係しない。したがって、精
製されたタンパクは１組換え技術により製造されたタン
パク、合成により製造され生物から直接単離されたタン
パクであり得る。

「ポリペプチド」および「タンパク」という用語は、最
も広い意味で用いられる。すなわち、「ペプチド」およ
び「タンパク」は、ペプチド結合によって連結されたあ
らゆるアミノ酸のポリマー（ジペプチドまたはこれより
大きいペプチド）である。従って、この用語には、オリ
ゴペプチド。

タンパク断片、類似体、ミューティン（変異タンパク）
、融合タンパクなどが包含される。この用語には、天然
および組換えタンパクが包含される。

「組換え」タンパクまたはポリペプチドは９組換えヌク
レオチド配列から発現されるタンパク。

すなわち、所望のポリペプチドをコードする外因性ＤＮ
Ａの構築物により形質転換された細胞から産性されるタ
ンパクをいう。

Ｃ［１アーゼをコードするヌクレオチド配列を特徴づけ
るためにここで用いられる「組換え」という用語は、ゲ
ノム、　ｃＤＮＡ＋半合成または合成起源の核酸配列の
以下のようなものをいう；すなわち。

その核酸配列は、起源または操作によって、天然には生
じないヌクレオチド配列、または、それが天然に連結さ
れている核酸配列以外の核酸配列に連結されたヌクレオ
チド配列である。

「レプリコン」は、細胞内で、ポリヌクレオチド複製の
自律単位として挙動する。すなわち、それ自身の制御下
で複製し得る９あらゆる遺伝要素（例えば、プラスミド
、染色体、ウィルス）である。

「ベクター」は、他のポリヌクレオチドのセグメントが
結合されて、結合されたセグメントの複製および／また
は発現を起こすレプリコンである。

「発現ベクター」は、自律性の複製または組込みを行い
得るベクターをいい、適切な宿主内で所望のヌクレオチ
ド配列の転写と翻訳を行う制御配列を持っている。

「コード配列」は、ポリペプチドに転写および／または
翻訳されるポリヌクレオチド配列である。

「プロモーター配列」は、　ＲＮＡポリメラーゼを結合
させて、下流の（すなわち３′方向の）コード配列の転
写を開始させることができるＤＮＡ　ｉｊｉ！ｆ５領域
である。

コード配列の転写がＲＮＡポリメラーゼのプロモーター
配列への結合によって起こる場合、コード配列は、細胞
内でプロモーター配列の「制御下ｊにある。次いで、得
られた１ｌＲＮＡの翻訳によって。

コード配列内にコードされたポリペプチドが性成する。

「作動可能に連結された」という用語は、その構成要素
が、その通常の機能を発揮するような配置に並置されて
いることをいう。したがって、コド配列に作動可能に連
結された制御配列は、コード配列を発現することができ
る。

「制御配列」は、コード配列の転写および／または翻訳
を制御する配列をいう；この配列には。

限定されないが、プロモーター配列、転写の開始および
終止の配列、および翻訳の開始および終止の配列が包含
され得る。さらに「制御配列」は。

コード配列内にコードされたポリペプチドのプロセッシ
ングを制御する配列をいう。これらの配列には、限定さ
れないが９分泌、プロテアーゼの切断、およびポリペプ
チドのグリコジル化を制御する配列が包含される。

「シグナル配列」は、コード配列の前部に位置して得る
。この配列はシグナルペプチド、すなわち、ポリペプチ
ドに対するＮ末端をコードし、このシグナルペプチドは
宿主細胞と連絡し、ポリペプチドを細胞表面に向けるか
、またはポリペプチドを培地中に分泌させる。このシグ
ナルタンパクは、タンパクが細胞から離れる前に宿主細
胞により切離される。シグナル配列は、原核生物および
真核生物に天然に存在する各種のタンパクと結合したも
のが見つけられ得る。例えば２　α因子、すなわち、天
然酵母のタンパクは酵母から分泌され。

そのシグナル配列は、培地中に分泌される非相同のタン
パクに連結され得る（米国特許第４，５４６，０８２号
参照）。さらに、α因子とその類僚体は、サツカロミセ
ス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびタルイベロミ
セス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｓｙｃｅｓ）のような各種の酵
母から非相同タンパクを分泌させることが見出されてい
る［例えば、ヨーロッパ特許出願公開箱０．３０１，６
６９号（公開日１９８９年２月１日）参照］。

「形質転換」は、外因性のポリヌクレオチドを宿主細胞
に挿入することである。この外因性ポリヌクレオチドは
、プラスミドとして維持され得るか、または宿主ゲノム
内に組込まれ得る。

「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞ｊなどの微
生物を表す用語は、交換可能な同意語として用いられ１
組換えベクターまたは転移されるＤＮＡの受容体として
用いられ得る。または用いられてきた細胞をいい、トラ
ンスフェクトされたもとの細胞の後代が含まれる。単一
の親細胞の後代は、偶然または計画的な変異のために９
元の親と。

ゲノムまたは全ＤＮＡ補体が、必ずしも完全に同一でな
くてもよいことが理解される。したがって。

この用語は、関連する性質（例えば、所望の遺伝子産物
をコードする構造遺伝子に連結されたクローン化遺伝子
による。必須酵素をコードする天然遺伝子の置換）によ
って特徴づけられる親に充分類似した親細胞の後代を意
味する。

ＣＤアーゼの「治療に有効な量」は、　ＣＤアーゼが作
用する基質とともに投与された時に、基質を。

腫瘍細胞の成長を阻害し得る活性のある細胞毒性薬剤に
変換するのに充分な量である。

Ｂ、二股敗星亙汰 本発明は、熱安定性を示す、酵母から単離されたＣＤア
ーゼに向けられる。このＣＤアーゼは、以前に酵母から
単離されたＣＤアーゼ酵素とは異なる特性を有している
。新規に単動された酵母ＣＤアーゼは、ゲル濾過クロマ
トグラフィーで決定したところ、約３２ｋＤａである。

５Ｏ５−ＰＡＧＥでは、　１７ｋＤａの位置に主要バン
ドを示し、このことは２本発明のＣＤアーゼは二量体で
構成され、各サブユニットは約１７ｋＤａの分子量を有
することを示している。さらに、以前に単離された酵母
ＣＤアーゼ酵素は、３７℃では著しい不耐熱性を示した
が１本発明の精製された酵素は、この温度で安定である
。さらに、この新しいＣＤアーゼのアミノ酸配列は、配
列が決定された他の公知のタンパクと、有意な配列相同
性を全く示さない、この独特のＣＤアーゼをコードする
遺伝子のクローニングと発現によって、約４７４塩基対
の長さのコード配列が得られ、予想分子量が約１７，５
０６ダルトンの１５８アミノ酸のタンパクを指定する。

熱に安定なＣＤアーゼは、有子嚢胞子酵母、有担子胞子
酵母および不完全酵母のメンバーを含む酵母から単離さ
れ得る。ＣＤアーゼは、好ましくは、サツカロミセトイ
デエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｏｉｄｅａｅ）のメ
ンバーから単離され、サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｓ＋ｙｃｅｓ）の種が好ましく、特にサツカロミセス
セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｗ＋ｙｃｅｓ　５ｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）　（パン酵母）が好ましい。フライシュ
マン圧搾酵母（Ｆｌｅｉｓｈｍａｎｎ’ｓ　Ｃｏｍｐｒ
ｅｓｓｅｄ　Ｙｅａｓｔ）が熱に安定なＣＤアーゼの優
れた起源であることがわかったが。

これはパン類製造業者と食料品店から容易に入手できる
。

本発明のＣＤアーゼ精製法は、すでに報告されている方
法（例えば、　Ｋａｔｓｕｒａｇｉ　ら、　１９８７年
；ｉｆａｔｓｕｒａｇｉ　　ら、　１９８６年５Ｉｐａ
ｔａら、　１９７８年；Ｉｐａｔａら。

１９７１年の各文献参照）およびＫａｔｓｕｒａｇｉ　
（１９Ｂ８年）の方法とは異なる方法である。具体的に
述べると。

この方法は、異なる精製工程を用いており、アニオン交
換クロマトグラフィーと疎水性クロマトグラフィーとの
工程の間にゲル浸透カラムによる精製法を追加（以下に
述べる）するとともに、異なる精製条件（異なる緩衝液
、　ｐＨ，およびＥＤＴＡやＤＴＴのような緩衝液の成
分を包含する）を用いていることを含む。その上、以前
の方法では熱に安定な酵素は得られない。

（以下余白） 酵母から熱に安定なＣＤアーゼを精製する第１工程は、
　ＣＤアーゼを含有する自己分解物にするために酵母細
胞を破裂させることを包含する。自己分解は、公知のい
くつかの方法のどれを用いても行うことができる。例え
ば、酵母細胞は、クニンツの方法（１９４７年）に従っ
て、トルエンで原形質を分離され得る。特に有用なのは
、酵母を酢酸エチルのような有機溶媒に暴露し２次いで
緩衝液を添加して、溶液のｐＨを約７に維持することで
ある。

適切な緩衝液には、リン酸カリウム緩衝液、リン酸緩衝
食塩水、トリス緩衝液、および当該分野で公知のその他
いくつかの緩衝液が包含される。緩衝液は、　ＣＤアー
ゼを安定化させるために、１〜２５％の範囲にある。好
ましくは１５％の濃度の硫酸アンモニムをＥＤＴＡおよ
びＤＴＴ　　（ジチオトレイトール）とともに含有する
ことが好ましい。あるいは。

ＥＤＴＡおよびＤＴＴは、この緩衝液および後で使用さ
れる緩衝液から除くことができる。ＥＤＴＡを用いる場
合、その濃度は、　Ｑ、１ｍＭ〜１１０１ＩＩの範囲に
あり。

５ｍＭが好ましく、またＤＴＴは、　Ｏ，０１１１１Ｍ
〜１０ｍＭの濃度で、好ましくは０．１ｗＭで用いられ
得る。この混合物は敞日間撹拌され、　ｐＨは約７に維
持される。

細胞の破片は遠心分離により除去され得る。

自己分解に続いて、硫酸アンモニウムを用いて。

自己分解物から全タンパクを沈澱させる。硫酸アンモニ
ウムは、タンパクに対するＣＤアーゼのより高い比を得
るのに充分な濃度で添加される。例えば、硫酸アンモニ
ウムは、最初６０〜８０％の飽和度。

好ましくは７０％の飽和度に達するように添加される。

　ＥＤＴＡは１反応混合物中に、好ましくは１〜３ｇ／
ｌの濃度、より好ましくは１．５〜２．０ｇ／ｌで含有
され９反応は数時間実施され、遠心分離した後、沈澱が
回収される。ベレットを、適切な緩衝液（例えば、　ｐ
ｉｔが約７のＰＢＳ　、緩衝液は、上記のようにＥＤＴ
ＡおよびＤＴＴを含有することが好ましい）に溶解させ
９次いで、溶液を同じ緩衝液に対して透析する。透析物
は、硫酸アンモニウムを加え約５０％の濃度にして、２
回目の処理が行われ得る。この場合も上記のようにＥＤ
Ｔ＾を含有させる。

沈澱は遠心分離により再び回収され、上清液に硫酸アン
モニウムを添加して、約７３％飽和度にする。沈澱は回
収され、　ｐＨが約５．６〜８．５の適切な緩衝液に溶
解される。この緩衝液としては、　ＤＴＴを上記の濃度
で含有するｐＨ８，０のトリス緩衝液が好ましい。再構
成させた沈澱は１次にこの緩衝液に対して数時間透析さ
れる。透析物から得られたＣＤアーゼば、さらに１例え
ば、架橋アガロースまたはセルロースバッキング材を用
いるアニオン交換クロマトグラフィーにより精製される
。ファーマシア社から入手可能なＱセファロースおよび
ＤＥＡＥセファロースのようなアニオン交換体が特に適
切である。適切な平衡化緩衝液には２例えば、トリス緩
衝液またはリン酸緩衝液が包含され、溶離は。

線形勾配を用いて行われる。０．１ｓ＋ＭのＤＴＴを含
有するｐＨ８，０の２０ｍＭトリス緩衝液を、同緩衝液
にＯ〜０．３ＭのＫＣＩを含有させた線形勾配とともに
用いるのが特に適切である。

アニオン交換クロマトグラフィーに続いて、　ＣＤアー
ゼ活性（以下に述べられるようにしてアッセイされる）
を有する画分がプールされ１次いで。

例えば約３０．０００ダルトン（Ｄａ）以下の分子量カ
ントオフを行うフィルターを用いる限外濾過法によりＳ
縮される。

次に、得られたＣＤアーゼ含有溶液は、ゲル浸透カラム
に通される。特に有用なのは、架橋されたデキストラン
、アガロース、またはデキストラン／ビスアクリルアミ
ドのゲルがあり、セファデックスＧ−７５，Ｇ−１００
またはセファクリルＳ−１００が好ましい。溶離液は、
　ｐＨが約７の当該分野で公知の通常の緩衝液でよ（、
先に述べたＤＴＴを含有するＰＢＳが好ましい。ＣＤア
ーゼ活性を有する画分はプールされ、リン酸カリウムの
ような緩衝液に対して透析される。この緩衝液は、自己
分解物用緩衝液について先の述べたように、約１〜２？
Ｉの硫酸アンモニウムとＥＤＴＡとＤＴＴとを含有する
ことが好ましい。所望するのであれは、２回目のゲル浸
透カラムを這され得２次いで、活性画分は２例えば。

５０００Ｄａの分子量カントオフを行うフィルターを用
いる限外濾過法で濃縮され得る。

得られたＣＤアーゼ含有物質は１次に、疎水性に基づい
て物質を分離するカラムに適用され９例えば、リン酸カ
リウム緩衝液に硫酸アンモニウムを含有させた逆勾配を
用いて溶離される。ＣＤアーゼ活性を有する画分を合わ
せ、　５００００ａの分子量カットオフのフィルターを
用いる限外濾過法で濃縮する。：ａ縮物は、その後の使
用のために凍結して保存され得る。しかし、２回目のゲ
ル浸透カラム処理が行われない場合、および／またはＣ
Ｄアーゼの比活性が低い場合は、上で述べた他のゲル浸
透カラムが使用され得る。このようにして精製されたＣ
Ｄアーゼは、熱に安定であり、それゆえ、自由な形に凍
結または凍結乾燥して保存され得る。

ＣＤアーゼの活性は、精製中に、当該分野で公知のいく
つかの方法によりモニターされ得る。例えば、　ＣＤア
ーゼ存在下でのシトシンからウラシルまたはその誘導体
への変換は、この変換に伴う２８６０ｍにおける吸光度
の低下から、直接分光光度ア・ンセイによってモニター
され得る（例えば、　ＩｐａｔａおよびＣｅｒｃｉｇｎ
ａｎｉ、　１９７８年の文献参照）。あるいは、　Ｎｉ
Ｎ１５ｈｉｙａら（１９８５年）により記載された５Ｆ
Ｃから５ＦＵへの変換を分光光度測定法でモニターする
ことによって、活性が測定され得る。なお。

この文献は本発明に援用される。

上記の方法で精製された熱に安定なＣＤアーゼは。

本発明の試験のセクションで述べられたように配列が決
定され、その部分的なアミノ酸配列が第６図に示され得
た。その配列は、配列が決定された他の公知のタンパク
とは、実質的な相同性を全く示さない。この情報に基づ
いて、熱に安定なＣＤアーゼは組換え技術で製造され得
る。例えば、　ＣＤアーゼをコードするＤＮＡ配列は、
得られたアミノ酸配列に基づいて、適切なコドンを用い
て合成により製造され得る。一般に、　ＣＤアーゼの発
現に用いられる宿主に対して好ましいコドンが選択され
得る。完全配列は、標準法で製造されたオリゴヌクレオ
チドをオーバーラツプして組み立てられる（例えば＋　
Ｅｄｇｅ、　Ｎａｔｕｒｅ、２９２巻、７５６頁、　１
９８１年；Ｎａｍｂａｊｒ　ら、　５ｃｉｅｎｃｅ、２
２３巻、　１２９９頁、　１９８４年；Ｊａｙら、　　
Ｊ、Ｂｉｏｌ、ＣｈｅＩｌｌ、２５９巻、　６３１１頁
、　１９８４年参照）。

あるいは１組換えの熱に安定なＣＤアーゼは、以下の方
法により製造され得る。決定されたアミノ酸配列の一部
分に対するコドンを含有するオリゴヌクレオチドプロー
ブが製造され得、　ＣＤアーゼをコードする遺伝子のゲ
ノムまたはｃＤＮＡのライブラリーをスクリーニングす
るために使用される。オリゴヌクレオチドツブローフ゛
およびＤＮパライフ゛ラリ−の製造、および核酸ハイブ
リダイゼーションによるそれらのスクリーニングの基本
的な方法は。

当業者には公知である（例えば、　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌ
ｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ、　　上記文献；　Ｔ
、Ｍａｎｉａｔｉｓら、上記文献参照）。陽性のハイブ
リダイゼーションによってスクリーニングされたライブ
ラリー由来のクローンが同定されたならば、制限酵素分
析およびＤＮＡ配列決定が行われ得、特定のライブラリ
ーの挿入断片が、　ＣＤアーゼをコードする遺伝子を含
有することを確認する。さらに、ポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）が増幅のために用いられ得９次いで、　ＣＤ
アーゼをコードするヌクレオチド配列を検出する。

この方法は、　５ａｉｋｉ　ら、　　１９８６年の文献
、および米国特許第４．６８３，１．９５号および第４
，６８３，２０２号に記載されており、その開示事項は
本発明に援用されるものである。ＰＣＲで増幅された産
物のヌクレオチド配列の分析は、　５ａｉｋｉ　ら（１
９８８年）の文献に記載された直接配列分析法により行
われ得る。

あるいは、増幅された標的配列は、配列分析の前にクロ
ーン化され得る。酵素によって増幅されたゲノムセグメ
ントの直接のクローン化および直接配列分析の方法は、
　５ｃｈａｒｆら（１９８６年）の文献に記載されてい
る。この方法では、　ＰＣＲ技術に用いられるプライマ
ーは、その５°末端の近くが修飾され１例えば、Ｈ１３
配列決定ベクター中で直接クローン化するために好都合
な制限部位を生成される。

増幅後、　ＰＣＲ産物は適切な制限酵素によって切断さ
れる。その制限断片はＭ１３ベクターに連結され。

例えば、　Ｊ？１１０３宿主に形質転換され、プレート
され３次いで得られたプラークは、標識されたオリゴヌ
クレオチドのプローブを用いてハイブリダイゼーション
によりスクリーニングされる。クローン化および配列分
析のその他の方法は、当該分野では公知である。

本発明で用いられる特に好ましい方法では、２つのオリ
ゴヌクレオチドのプライマーを１部分的なアミノ酸配列
とＤＮＡ配列の［ゲスマーＪ　　（ｇｕｅｓｓｌｌｌｅ
ｒ）配列を設計する際のガイドとしてニス・セレフシエ
（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のコドン使用パタ
ーン（ＧｕｔｈｒｉｅおよびＡｂｅｌｓｏｎ　（１９８
２年）の文献）とを用いて合成した。これらのプライマ
ーを、クローン化された酵母ゲノムライブラリーＩＩＮ
Ａが鋳型として存在するＰＣＨに用いた。アミノ酸が、
著しいコドン使用のかたよりを示すＣＤアーゼの領域お
よび／または縮重をほとんど示さないＣＤアーゼの領域
から、オリゴヌクレオチドを合成した。第１プライマー
のＣＤＡ４Ｒ１は、アミノ末端のアミノ酸配列に対応す
る３３のヌクレオチドを含有する４２号体であった。一
方、第２プライマーのＣＤＡ４Ｒ１は。

そのタンパクのカルボキシ末端の近くに位置する配列に
相補的なヌクレオチドを含有していた。これらのオリゴ
ヌクレオチドの配列を第７図に示す。

２つゲノムライブラリーをＰＣＲ反応における鋳型ＤＮ
Ａとして用い１両者が、長さが約３５０塩基対の単一の
特異的断片を生成することがわかった（大きさは、入手
可能な対応するアミノ酸配列がら予測した）。ＰＣＲブ
ライマーをその５”末端のＥｃｏＲＩ制限部位で設計し
、　ＰＣＲで生成する断片のクローン化を容易にした。

３５０塩基対のＰＣＲ由来の断片をゲル電気泳動法で精
製し、適切なベクターでサブクローン化してＩ）ＮＡの
配列を決定した。

（以下余白） ＰＣＲ由来の断片もまた。コロニーフィルターハイブリ
ダイゼーション法によって酵母ライブラリーをスクリー
ニングするだめのＣＤアーゼ特異的プローブとして用い
た。ゲスマーオリゴヌクレオチドをプローブとして用い
る最初の試みは、ハイブリダイゼーション後のシグナル
／ノイズ比が低いために失敗した。可能性があるすべて
のクローンを取り圧し、２回再度スクリーニングを行い
、正のハイブリダイゼーションシグナルを確認した。

プラスミドを個々のクローンから精製し、一連の制限酵
素を個々に用いて、そして、複数個を用いて消化を行う
ことにより、制限地図を作成した。

クローン化されたＰＣＲ断片と、　ＣＤアーセをコード
するゲノムクローンとの両方のＤＮＡ配列分析を行った
。反応条件を変えることによって２ブライマーに直接隣
接する配列から数百塩基対離れた配列までの分析が可能
であった。得られたＤＮＡ配列を第８図に示す。図から
明らかなように、この配列は９３％相同で２３個がミス
マツチであり、３３０個がマツチしていた。この配列内
に見出されたＯＲＰを第９図に示す。第１０図は、　０
ＲＦ２のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示
す。このことにより先に決定されたアミノ酸配列が確認
され、そして、精製タンパクの分析により得られる部分
配列のいずれの端部にも、僅かに少数のアミノ酸が付加
していることが予想される。

このＤＮＡ配列のデータは次に、　ＣＤアーゼをコード
する。増幅されたＤＮＡカセットを生成させるための新
しいＰ［Ｒブライマーを設計するのに、用いられる。こ
のようなカセットは、真核もしくは原核細胞中に高レベ
ルの遺伝子発現を行い、かつ。

癌抗原を標的にした免疫グロブリン分子を含む（これに
は限定されない）生物学的に重要な他の分子とロＤアー
ゼ間の遺伝子融合を起こすよう設計された遺伝子構築物
に用いることができる。

ＣＤアーゼをコードする配列は、当該技術分野で公知の
適切ないずれのベクターもしくはレプリコンにもクロー
ン化することができる。クローン化用組換え体ＤＡ’Ａ
ベクター、およびこれらが形質転換し得る宿主細胞（大
括弧内に示す）の例とじては次のようなものがある：λ
バクテリオファージ〔イヘ・コリ　（Ｅ、　　ｃｏｌｉ
）　　”Ｊ　、　　ｐＢＲ３２２Ｃイー・］リコ。

ｐＡｃＹｃ１７７　Ｃイー　−コリコ、　ｐＫＴ２３０
　Ｃグラム陰性菌コ。

ｐＧＶ１１０６　　［グー）ム陰性菌］　、　ｐＬＡＦ
Ｒｌ　〔グア’ＡＩＩ性菌〕、　ｐＭＥ２９０　Ｃイー
・コリ以外のグラム陰性菌〕。

ｐＨ〜１１４〔イー・コリ；バシラス・サチリス（Ｂａ
ｓｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）　：］　、　ｐＢＤ９
　Ｃバシラス〕、　ｐｌＪ６１　　Ｃストレプトミセス
）　、　ｐＵｃ６　ＣストレプトミセスＥ　、　　ＹＩ
ｐ５〔サツカロミセス）　、　ＹＣｐ１９　　［サツカ
ロミセス〕およびウシ乳頭腫ウィルス（哺乳類細胞〕。

ＣＤアーゼタンパクのコード配列は、プロモータリポソ
ーム結合部位（細菌発現用）および必要に応じてオペレ
ーターの制御下に配置することができ（本明細書ではこ
れらをまと杓てパ制御′”要素と呼ぶ）、その結果、　
ＣＤアーゼタンパクをコードするＤＮＡ配列は、この発
現構築物を有するベクターで形質転換された宿主細胞中
でＲＮＡに転写される。このコード配列は、シグナルペ
プチドもしくはリーダー配列を有していてもいなくても
よい。リーダー配列は、！！ｌ訳後のプロセッシングに
より細菌宿主で除去され得る（例えば、米国特許第４．
４３１．７３９号、第４．４２５．４３７号および第４
．３３８゜３９７号参照）。

制御配列に加えて、宿主細胞の生育に関連して発現ＣＤ
アーゼ配列の調節ができる調節配列を加えることが望ま
しい。調節配列は、当業者にとって公知のものであり、
その例には、化学的もしくは物理的刺激に対して反応し
、遺伝子の発現を開始もしくは停止させる配列が含まれ
、それには調節化合物の存在が含まれる。他の種類の調
節要素。

例えばエンハンサ−配列もベクター中に存在し得る。

発現ベクターは、　ＣＤアーゼコード配列が、適切な調
節配列とともにベクター中に配置されることにより構築
される。上記ベクター中での制御配列に関しての、コー
ド配列の位置および方向は、コード配列が制御配列の“
制御下で転写されるような位置および配列である（つま
り制御配列の位置においてＤＮＡ分子に結合するＲＮＡ
ポリメラーゼがコード配列を転写する）。ＣＤアーゼを
コードする配列を修飾することは、この目的を達成する
のに望ましいことである。例えば、ある場合においては
、この配列を、該配列が適切な方向で制御配列に連結す
るように修飾すること、つまり、読み枠を維持するよう
に修飾することが必要である。

制御配列および、別の調節配列は、上記のクローニング
ベクターのようなベクターに挿入する前にコード配列に
連結してもよい。あるいは、コード配列は、すでに制御
配列と適切な制限部位を有する発現ベクターに直接クロ
ーン化してもよい。

多くの原核発現ベクターが当該技術分野で知られている
。例えば、米国特許第４．４４０．８５９号、第４、４
３６．８１５号、第４．４３１．７４０号、第４．４３
１．７３９号、第４．４２８．９４１号、第４．４２５
．４３７号、第４．４１８．１４９号、第４．４１１．
９９４号、第４．３６６、２４６号、第４，３４２、８
３２号；英国特許出願ＧＢ２．１２１．０５４号、　Ｇ
Ｂ２，００８．１２３号、　２．００７，６７５号；お
よびヨーロッパ特許出願第１０３．３９５号を参照され
たい。酵母発現ベクターも当該技術分野で公知である。

例えば、米国特許第４．４４６．２３５号、第４．４４
３．５３９号、第４．４３０４２８号；ヨーロッパ特許
出願第１０３．４０９号、第１００，５６１号および９
６．４９１号を参照されたい。哺乳類発現ベクターもま
た。公知である。

選択される発現系および宿主に依存して、　ＣＤアーゼ
は、上記発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、　
ＣＤアーゼが発現される条件下で増殖させることによっ
て製造される。次いでこのタンパクは宿主細胞から単離
され精製される。発現系がタンパクを増殖培地内に分泌
する場合には、このタンパクは培地から直接精製され得
る。タンパクが分泌されない場合には、それは細胞溶解
物から単離される。適切な増殖条件および回収法の選択
は。

当業者の技術範囲内にある。

酵母中でＣＤアーゼ配列を制御して誘発させる構築物の
１例は、［Ｄアーゼカセットを、″フユージョネーター
”　（ｆｕｓｉｏｎａｔｏｒ）と呼ばれる酵母ベクター
に挿入したものである。このベクターは、米国、ワシン
トン州、シアトルのワシントン大学。

遺伝学ＢおよびＮＩＨから人手可能である。このような
構築物を第１１図に示す。この構築物において。

ＣＤアーゼは、その発現を、酵母由来の９高度に発現さ
れ厳密に調節されたＧＡＬＩＯプロモーターの制御下に
置くポリリンカーに挿入される（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ。

Ｍ、　１９８７年）。ＧＡＬＩＯプロモーターはガラク
トースに反応し、遺伝子の高レベルの発現をその制御下
で誘発する。このベクターはまた。　ＤＮＡ配列を適当
に変化させることによってＣＤアーゼ−１ａｃＺ融合体
を創製するのに使用され得る。生成した融合タンパクに
より、誘発の定量、精製、および生物学的分析が容易に
なる。これらの構築物は、　Ｈｏｖｌａｎｄら（１９８
９年）の文献に記載されているような適切な酵母株に形
質転換するこよができる。この酵母株には、上記のよう
な構築物とともに用いるのが望ましいいくつかの変異体
が含まれている。特に。

ｇａｌｌ変異体が存在し、これはガラクトース利用の第
１段階を触媒する酵素を減少させ、その結果。

培地中の誘発物質（ガラクトース）を枯渇するのを防止
する。ｒｅｇ］−５旧変異体もまた存在し、これは、ガ
ラクトース遺伝子発現のグルコースによる抑制を排除し
、培養物を増殖および生存度に最適な条件下に置くこと
を可能にする。誘発は、ガラクトースを添加して、グル
コースをベースとする培地をガラクトース富化させるこ
とによって容易に行われ得る。最後に、この酵母株には
プロテアーゼが不足した変異体がいくつか存在し、増殖
中に生成した非相同タンパクもしくはその断片の安定性
を増大化する。このような発現構築物は、内因性遺伝子
で得られる発現レベルを用いて、従来不可能であった量
で、　ＣＤアーゼを酵母から単離および精製するのを促
進するに違いない。

その他の構築物が哺乳類細胞の培養系に用いるために創
製され得る。本発明の好ましい態様において、　ＣＤア
ーゼをコードするカセットは、　ＰＣＲ技術を用いて、
オンコスタチンＭ　（Ｍａｌｉｋら、　１９８９年）の
分泌シグナルペプチドに連結され９次に、＠乳類での発
現に適切なエンハンサ−プロモーター終止およびプロセ
ッシングのシグナルを有する哺乳類発現ベクターｐＨ３
ＭＰｙ　（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、　１９９０年）
に挿入される。この構築物は、　Ｃ［ＩＳ細胞にトラン
スフェクトされ（Ａｒｕｆｆｏｉ６よび５ｅｅｄ、　１
９８７年）血清を含有しない培養培地が集められ、そし
て内因性酵素活性を欠いた系内でＣＤアーゼ活性が分析
される。同様に、　ＣＤアーゼおよび他の関連分子との
遺伝子融合を行うためのｃＤＮＡ構築物が標準法で構築
され、　ＣＯＳ細胞にトランスフェクトされ１次に細胞
抽出物もしくは上澄液が、タンパクとその活性について
分析される。

他の遺伝子融合体もまた。ＣＤアーゼの組換えによる生
産に用いられる。例えば、　ＣＤアーゼをコードするヌ
クレオチド配列もしくは機能性変異体もしくはその断片
は、　ｃＤＮＡがコードし、癌抗原を標的とする免疫グ
ロブリン分子に融合され得、抗体酵素融合タンパクが形
成され得る。腫瘍細胞上で優先的に発現する決定因子を
認識するモノクローナル抗体が得られている（Ｈｅｌ　
Ｉｓｔｒｏｍら、　１９８４年）従って１選択された腫
瘍細胞を特異的に標的とする融合タンパクが創生され得
る。例えば、米国特許第４．９０６．５６２号およびＨ
ｅｌｌｓｔｒｏｍ、　１９８５年の文献を参照されたい
。次にこの酵素は、腫瘍細胞部位に直接作用して、前駆
薬剤５ＦＣを抗腫瘍剤５ＦＩＩに変換することができる
。目的とする酵素をコードする遺伝子と、癌細胞を標的
にした抗体とのゲノム融合体によって、２つのタンパク
の化学的結合が不要となる。同様に、目的とする２つの
分子間のｃＤＮＡ構築物は、非相同発現系内でのこのよ
うな構築物のフレキシビリティを増大することができる
。

ある系においては、癌抗体のＨ鎮のｃＤＮＡは、この抗
体を産生ずる細胞系から得られる。二のｃＤＮＡの全部
または一部をコードするＰＣＲフラグメントは、当業者
に公知の方法により得ることができる。

２つのカセットの枠内融合は、いくつかの位置における
標準的技術により可能であり、得られた融合遺伝子は、
望ましい生物学的活性についてタンパクの産生を試験し
た。この抗体分子のし鎖部分をコードするｃＤＮＡを有
する２番目のプラスミドのコトランスフェクションによ
り、活性型ＣＤ了−ゼ酵素に融合した生物学的に活性な
抗体フラグメントを単離できる。このようにして、望ま
しい位置に対するこの酵素の標的化が達成される。

機能的には同等の熱安定性ＣＤアーゼの変異体または類
似体を作ることも望ましい。変異体または類似体は、　
ＣＤアーゼをコードする配列部分の欠失。

配列の挿入、および／またはこの配列内の１個またはそ
れ以上の核酸の置換により、調製され得る。

ヌクレオチド配列を修飾する手法９例えば１部位特異的
変異法またはＰＣＲオリゴヌクレオチド変異法は、当業
者に公知である。例えば、■、マニアナイスらを参照さ
れたい。

本発明のＣＤアーゼは、既知のアミノ酸配列または目的
とする遺伝子のＤＮＡ配列から得たアミノ酸配列を用い
た固相ペプチド合成法のような化学的合成によっても生
産される。このような方法は当業者に既知である。

熱安定性ＣＤ了−ゼは、化学療法剤として用いることが
できる。特に、この酵素は、インビボにおいて、プロド
ラッグである５ＦＣを抗癌剤である５ＦＵに変換し得る
。従って江Ｄアーゼは、　５Ｆ［ｌ：と共投与すること
ができる。例えば、腫瘍部位または近傍に外科的にＣＤ
アーゼを置き、　５ＦＣを経口投与する（例えば、　Ｋ
ａｔｓｕｒａｇｉ　ら、　１９８７．が記載している）
ことにより共投与することが可能である。上記文献は、
参考文献として、ここに引用する。あるいは、この酵素
は、これらの腫瘍に特異的な抗体を用いて腫瘍に対して
江りアーゼ／抗体複合体を標的移送することにより、腫
瘍部位へ運ぶことができる。この複合体は、化学的方法
によっても。

または、上記のように、適当な免疫グロブリンとＣＤア
ーゼ遺伝子との遺伝子融合物を構築することにより遺伝
子操作的にも生産することができる。

（実施例） 本発明を実施するための特定の実施例を以下に示す。こ
の実施例は９例示を目的としたものであり９本発明の範
囲を制限することを意図していない。

実施例１ 酵素精製、活性測定、およびＣＤアーゼ特徴づけＣＤア
ーゼは、以下の方法を用いて、フレイシュマンの圧搾パ
ン酵母から精製した。精製の全工程は、４℃で行われた
。酵素活性は、５フルオロシトシン（５Ｆ［：）の３ｍ
Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液を用いて、３７
℃で測定されたにシャ７ら。

１９８５）。この文献の開示内容は、すべて参考文献と
してここに含まれている。酵素溶液を加え、その反応経
過を、　０．１Ｎ　ＨＣＩで消光したアリクオツドにつ
いて分光光度計でモニターした。２５５／２９０の吸光
度比を用いて、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）の生成
量を算出した。酵素活性の１単位は、３７℃において、
１分間に１μｍｏｌの５ＦＩｌが生成される活性と定義
される。タンパク濃度は、ピアース（ロックフォード、
イリノイ）から入手したＢＣＡアッセイを用いて測定さ
れた。各精製工程後、　５Ｏ３−ＰＡＧＥを用いてタン
パク組成を調べた。

（以下余白） 工】、　　　″の パン酵母（２，２５ｋｇ）にエチルアセテート（２２５
紙）を加え、３０分間撹拌した。これに、１５％硫酸ア
ンモニウム　５ｍＭ　ＥＤＴＡ、および０．１曽門ジチ
オスレイトール（ＤＴＴ）を含有する５０１リン酸カリ
ウム緩衝液ｐＨ７，２を２．２５４加えた。この混合物
を３日間攪拌し、固形のトリヒドロキシメチルアミノメ
タン（Ｔｒｉｓ）を用いて毎日ｐＨ７，２に調整した。

細胞残層は、　１０．ＯＯＯｒｐｍ　１５分間の遠心分
離により取り除いた。

工　２．　　　アンモニウム ＥＣＴ八（１，８ｇ／ｆ）および硫酸アンモニウム（３
７１ｇ／　ｌ　）を加えて、工程１の上清から、すべて
のタンパクを沈澱させ、そして、硫酸アンモニウムの最
終濃度を、７０％飽和とした。この溶液を４°Ｃで約１
６時間置き、その後沈澱物を遠心分離で採集した。この
ペレツトを　５＋ＭＥＤＴＡおよび０．１＋ｎＭ　ＤＴ
Ｔを含有する５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７，２
に溶解させ　この緩衝液に対する透析を約１２〜１６時
間行なった。

二の透析物にＥＣＴ八（１，８ｇ／ｌ）を加え、５０％
飽和となるよう硫酸アンモニウムを加えた（３１４８　
ｇ酸アンモニウム／！透析物）。１時間後、沈澱物を遠
心分離し、さらに、最終ｇ酸アンモニウム濃度が７３％
飽和となるように硫酸アンモニウムを上清に加えた。沈
澱物を採集し、　Ｏ，ｌ＋Ｍ　ＤＴＴを含有する２０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８，０のＩｆに溶解させ、この
緩衝液を用いて約１２〜１６時間よく透析した。

工　３．　　イオン−りロマトグーフィー工程２の透析
物を、　０．１ｍＭ　ＤＴＴを含有する２０ｍＭＴｒｉ
ｓ緩衝液ｐ）１８．０で平衡化した４、８　Ｘ２５ＣＩ
ＩＱ−セファロース（ファーマシア）カラムに付した。

カラムを洗浄後、酵素を、上記緩衝液中０−０．３？Ｉ
　ＫＣＩの線型勾配によって溶出した。ＣＤアーゼ活性
を有する画分をプールし、限外濾過（アミコン、　ＰＭ
３０フィルター）により約１５ＩＩｌに′ａ縮した。

工　４．　ゲル゛　クロマトグラフィー工程３のＣＤア
ーゼを含む溶液をＧ−７５セフアデツクスカラム（２，
５Ｘ１００　Ｃａ＋）に付し、　０．１ａ＋Ｍ　ＤＴＴ
を含有するＰＢＳで溶出した。ＣＤアーゼ活性を有する
画分をプールし３次いで、　１．８Ｍ硫酸アンモニウム
。

５ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．１　ｍＭ　ＤＴＴを含む１０
０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７，０の４ｆに対し透
析した。

工　５．疎　　　　　　クロマトグーフィー工程４の物
質を、　１．８Ｍ硫酸アンモニウム、５１ＥＤＴＡおよ
び０．１＋Ｍ　ＤＴＴを含有する１００ｍＭ　リン酸カ
リウム緩衝液ｐ）１７．０で平衡化した２、５　Ｘ１５
Ｃ１ｍオクチル−セファロース（ファーマシア）カラム
に付した。カラムをこの緩衝液で洗浄し、酵素を、上記
リン酸緩衝液中１．８〜ＯＭ硫酸アンモニウムの線型勾
配で溶出し、た。ＣＤアーゼ活性を有する画分を集めて
、限外濾過（アミコン、ＹＭ５フィルター）で濃縮した
。

工　６．　ゲル′３　クロマトグラフィー工程５の物質
の、？容出液としてＰＢＳを用いたＧ７５セファデック
ス上の最終的ゲル濾過は、工程４に示したようにして行
なわれた。精製酵素は、限外Ｉ＃、過で濃縮され、−７
０°Ｃで保存された。

工程毎の精製結果を１表１に示す。各精製工程毎にタン
パク組成を調べるために用いられた５ＤＳＰＡＧＥプロ
フイールを、第１図に示す。最終酵素調製物は、約１７
ｋＤａの大きなハンドと約１９ｋＤａの小さなバンドか
らなる。

表１ ２．２５　　パン　　からＣＤアーゼの工程　　　総タ
ンパク　総活性　比活性　精製倍率（Ｎ）１４）２ＳＯ
４ ３６，０００ ０，０３５ ２，５ セファロース ４　、２００ ０．１６ １１．４ ７５セフアテフクス ３．５ オクチル セファ０−ス １　、８００ ７５セフ７テフクス ４．８００ １゜ ＣＡ （ピアース） を用いて測定したタンパク濃度 ２　酵素活性１単位は、３７°Ｃにおいて、１分間に１
μ■ｏｆ　５ＦＵが生成される活性とする。

ＣＤアーゼの分子量は、この精製酵素をリボヌクレアー
ゼＡ　（１３，７ｋＤａ）　、　　キモトリプシノーゲ
ンＡ（２５ｋＤａ）　、卵白アルブミン（４３ｋＤａ）
　とともにＧ−５０セフアデツクスカラムにかけること
により測定された。

画分は、総タンパクを測定するために２８０ｎｍの吸光
度をモニターされ、基質として５ＦＣを用いて。

ＣＤアーゼ活性をモニターされた。ＣＤアーゼ酵素活性
は、約３２ｋＤａに中心があった（第２図Ａ）。この酵
素は、キャリブレーションスタンダードなしでカラムに
付した場合全く同じ容量で溶出した（第２図Ｂ）。

精製ＣＤアーゼの３７°Ｃ’Ｊン酸緩衝生理食塩水中ｐ
Ｈ７，２での安定性は、基質として５ＦＣを用いて測定
された。酵素活性のゆっ（つとした減少が、インキュベ
ーションの延長と共にみられた（第３図）。

これらの条件下では、５．２日後に酵素活性の半分が失
われた。インキュベーションの最初の４時間では９酵素
活性の明らかな低下はなかった。（第３図挿入図）。

実施例２ ＣＤアーゼのアミノ　配Ｉ ＣＤアーゼの配列解析に用いた試薬は、アプライド　バ
イオシステム社から入手した。逆相ＲＰＬＣに用いた溶
媒は、プルデイックアンドジャクソンかう入手した。４
−ビニルピリジンは、アルドリッチケミカル社から、　
ＣＮＢｒはコダックから人手し、他のすべての化学物質
は試薬用であった。黄色ブドウ球菌由来のエンドプロテ
イナーゼＧｌｕ−Ｃは、マイルズ　ラボラトリ−から入
手した。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ几…辷のエンドプロテ
イナーゼＡｓｐ−ＮおよびエンドプロテイナーゼＬｙｓ
−Ｃは、ベーリンガーマンハイムから入手した。

自動配列分析は、　ＲＵＮ４７０−ＬまたはＰＲＯ４７
０−Ｌプログラムを用いて、モデル４７５Ａアミノ酸シ
ークエンサー（ＡＢＩ）により行なわれた。全部で１．
５■のＢｉ。

Ｂｒｅｎｅ　（ＡＢＩ）を分析し、試料を分析する前に
、エドマン分解を２，３回行なった。チアゾリノン誘導
体の、フェニルチオヒダントインアミノ酸への変換は、
６１°Ｃにおいて、２５％ＴＦＡを用いて行なわれた。

フェニルチオヒダントインアミノ酸誘導体は、開始緩衝
液として５％（ｖ／ｖ）テトラヒドロフランを含有する
酢酸ナトリウム緩衝液を用いたＰＴＩ（Ｃ１８カラム（
２，ｌＸ２２０　ｍ、ＡＢＩ）の逆相ＨＰＬＣにより。

そして、制限緩衝液として５００ｎＭジメチルフェニル
チオウレア（ＡＢＩ）を含有するアセトニトリル緩衝液
を用い、モデル１２０Ａ　ＰＴＨ分析機（ＡＢＩ）で分
離した。

ＣＤアーゼおよびペプチドを、モデル１３０Ａ分離シス
テム（アプライドバイオシステム社）による逆相ＨＰＬ
Ｃを用いて精製した。分離は、　ＲＰ−３００カラム（
２，Ｉ　Ｘ　３０ｍ　；ＡＢＩ）上で４０°Ｃにおいて
行なった。タンパクおよびペプチドフラグメントの溶出
のために、　０．１　ｄ／分で２時間に渡る。０．１％
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液中のアセントニトリ
ル０〜６０％の線型勾配を用いた。ＣＮＢｒペプチド、
エンドブロテイナーゼＬｙｓ−Ｃペプチド、エンドブロ
テイナーゼＧｌｕ−Ｃ，およびエンドブロテイナーゼＡ
ｓｐ−Ｎべ′プチドは、それ以上に精製しないで、配列
分析に用いた。

ＣＤアーゼの４−ビニルピリジンとの 実施例１の工程６から得たＣＤアーゼを、以下の方法に
従い、４−ビニルピリジンを加えることにりよ変性させ
た。ＣＤアーゼを、　６Ｆグアニジン−ＨＣｌ。

０．１％Ｎａ２ＥＤＴＡを含有する０、４Ｍ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ緩衝液ｐｕｓ、ｓの０．１　ｄ中の２０＋ｎＭ
ジチオスレイトールにより、５０°Ｃで２時間還元した
後、　１００ｍＭの４−ビニルピリジンで室温にて一晩
反応させた。この反応混合液を、２０％ＴＦＡを用いて
ｐＨ２，０に酸性化し、上記の逆相ＨＰＬＣにより、脱
塩および精製を行った。

得られた産物の）ＩＰＬＣ分析により、２つの異なるピ
ークが認められ（第４図）、これらは５ＤＳ−ＰＡＧＥ
により分離され、再度分析された（第５図）。小さい方
ピーク（プールＡ）は、第１図の１９ｋＤａのハンドに
対応し、大きい方のピークは、　１７ｋＤａのハンドに
対応した。

アミノ酸フェニルチオヒダントインに１体の同定法によ
り、プールＡ（第４図）のタンパクのアミノ末端アミノ
酸配列が、２７残基まで得られた。この配列は、パン酵
母スーパーオキサイドジスムターゼ（ＥＣ１，１５，１
，１，スタインマン、　１９８０）のＮ末端配列と同一
であることが見出された。このことは、精製ＣＤアーゼ
のゲル中でみられた小さなバンド（第１図、第５図）の
同一性を立証した。

第４図の大きなピーク（ブールＢ）のエドマン分解から
アミノ酸配列を得ることができなかったことから、　Ｃ
Ｄアーゼのアミノ末端がブロックされていることが示唆
される。そのため、　ＣＤアーゼの部分的アミノ酸配列
を、以下に示す通り、酵素的にあるいは臭化シアノゲン
分解による選択されたフラグメントの配列解析により得
た。

ＣＤアーゼの　　　および　　　　” ４−ビニルピリジンで変性されたＣＤアーゼのエンドプ
ロティナーゼＬｙｓ−ＣおよびエンドフロティナーゼＧ
ｌｕ−Ｃによる分解を、　Ｏ，］Ｍ　Ｔｒｉｓ　ｆｈ酸
緩衝液（ｐＨ８，０）　４０　μ！中中子７°Ｃ約１２
〜１６時間行った。

酵素／基質比は、それぞれ１　：　１０　（ｈｔ／ｗｔ
）であった。エンドプロティナーゼＡｓｐ−Ｎ分解は、
酵素／基質比１　：　１００．３７°Ｃ１約１２〜１６
時間で同様の方法で行われた。酵素的消化物は、２０％
ＴＦＡでｐＨ２，０に酸性化され、逆相ＨＰＬＣで分離
された。

臭化シアノゲン（ＣＮＢｒ）は、　ＣＤアーゼをメチオ
ニン残基で切断するために用いた。４−ビニルピリジン
で変性されたＣＤアーゼ（２，２５ｎｗｏりは、７０％
ギ酸４０μ！で再構成され、２００倍モルを越えるＣＮ
Ｂｒを含有する７０％ギ酸を加えた。反応を、３５°Ｃ
で２時間進行させた後、室温で約１２〜１６時間行った
。

この消化物を水で希釈し、減圧乾燥により過剰のＣＮＢ
ｒを取り除いた。逆相ＨＰＬＣ分析のための溶液は。

１％ＴＦＡ中で調製された。

第６図に、臭化シアノゲン分解、およびエンドブロティ
ナーゼＧｌｕ−Ｃ，エンドプロテイナーゼｔ、ｙｓ−Ｃ
およびエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎの酵素を用いた
タンパク分解から得られたフラグメントに基づいた。　
ＣＤアーゼの部分的アミノ酸配列を示す。

１５４個にわたるアミノ酸が、このタンパクの大部分を
含有することが確認、された。アミノ酸残基の番号付け
は、未だ同定されていないアミノ末端付近のアミノ酸を
含んでいない。この部分的ＣＤアーゼ配列を、マウスの
アデノシンデアミナーゼ（ユングら、　１９８５）およ
びパン酵母ｄＣＭＰデアミナーゼ（マンキントンシュと
ハイネス、　１９８６）を含む他の既知の配列と比較す
ると１本質的な相同性はみられなかった。

（以下余白） 実施例３ ＣＤアーゼ遺伝子のクローニングと発現口Ｄアーゼをコ
ードする遺伝子をＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　（パン酵
母）の実験室株から単離し、以下の方法を用いて、ｒ＠
乳類細胞系で発現させた。

工程１：ＰＣＲを用いたＣＤアーゼ特異的プローブの作
製 オリゴヌクレオチドブライマーは１部分的アミノ酸配列
と、　ＤＮＡ配列の「ゲスマー（ｇｕｅｓｓｍｅｒ）　
Ｊセグメントを設計するガイドとしてＳ、ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ（グスリーとアベルソン、　　１９８２）由来
のコドン使用パターンを用い、自動［］ＮＡ合成装置に
より合成された。これらのオリゴヌクレオチドは、　Ｐ
ＣＲのブライマーとして用いられ、クローニングした酵
母ゲノムライブラＩＪ−ＤＮＡが鋳型として存在した。

［：ＤＡ４Ｒ１および［：ＤＡ５＾Ｓと呼ばれるブライ
マーは。

共に３３ヌクレオチド配列を含む４２量体であり、それ
ぞれＣＤアーゼのセンス鎮およびアンチセンス釦に対応
する。各オリゴヌクレオチドの残基は、　Ｅｃ。

Ｒ１の制限酵素切断部位をコードした。この２つのプラ
イマーを配列を、第７図に示す。

両プライマーは、１回の反応あたり５０または１００１
００ｐ存在した。ＰＣＲ反応の訪型ＤＮＡとして用いた
２つの遺伝子ライブラリーは、　５ａｕ３Ａの部分的制
限酵素分解の後、　［’Ｖ１３またはＹＣｐ５０シャト
ルベクターのいずれかのＢａｍＨＩ部位へ導入すること
によって酵母ゲノムＤＮ＾から構築された。これら２つ
のベクターおよびそのゲノムライブラリーは。

船釣に当該技術分野で入手可能であり、ワシントン大学
の遺伝子学部から入手した。両ライブラリーは、既に細
菌ホストに形質転換されたものを人手した。ライブラリ
ー〇）ＩＡは、アルカリ溶解プラスミド調製法により単
離され、セシウムタライドエチジウムブロマイド密度勾
配の遠心分離によりその後精製された。ＰＣＲ反応は、
　ＣｓＣｌ精製の酵母由来Ｃν１３またはＹＣｐ５０ゲ
ノムライブラＩＪ−ＯＮＡＩ　、ｃｚｇ　、各プライマ
ー５０または１００１００ｐ、　１０ｘＰ（：Ｒ反応緩
衝液（ストラタジーン）の１／１０容量、１．２５ｍＭ
　ｄＮＴＰ　（＾、　Ｇ、　Ｔ、　Ｃ）の１６／１００
容量、　ＰＣＲ用蒸用水留水よびＴａｑ　ＤＮＡポリメ
ラーゼ０．５　μｉｉ　　（５１／μｍストラタジーン
）を用いて調製され、最終容量１００μ矛、とされた。

反応は、滅菌した微量遠沈管内にて、蒸発を防ぐための
７５μにの精製鉱油層の下で行われた。Ｐ（１，Ｒ反応
を、パーキンーエルマーシータス温度周期変換器の中で
、以下の温度変化を包含する３０周期グラグラムにおい
て進行させた。すなわち、変性のために９４℃３０秒間
、アニリングのために５５℃の４５秒間、伸展させるた
めに７２℃を１．５分間（９０秒間）の工程周期である
。

ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲルで分析し。

ＣＤアーゼのほとんどをコードする。予想された３５０
塩基対フラグメントを確認した。３５０塩基対フラグメ
ントは１次に、予備的アガロースゲル電気泳動の後に、
プライマーと、調製物と異なるフラグメントとを除くた
めに、シーンクリーンキット　（ＢＩＯＩＯＩ）のプロ
トコルおよび試薬を用いて溶出することにより精製され
た。

工程１によるＰＣＲプライマーは４作製したフラグメン
トのすべてのクローニングを促進するために、　ＥＣ０
ＲＩ制限部位の５°末端を操作した。ＰＣＲによるフラ
グメントの精製３５０塩基対の一部は、制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで消化し、　ＥｃｏＲＩ切断したファージシトベク
ターｐＢｓＩＩ−３Ｋ”　　（ストラタジーン）に連結
した。制限酵素は、ベリーンガーマンハイムバイオケミ
カルズ（ＢＭＢ）から入手した。消化には。

３７℃で２時間インキユベートシ、続いてフェノール：
クロロホルム：イソアミルアルコールノ等量混合液で抽
出後、エタノール沈澱を行った。フラグメントを、再度
ＴＥ　（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８，０，１
ｍＭＥＤＴＡ　ｐＨ８，０）に懸濁し、Ｔ４ＤＮＡ　リ
ガーゼ（ＢＭＢ）を用いてともに連結した。コンピテン
トＪＭ１０９細菌は、結合反応の１７５を形質転換し、
その適当な希釈液を、　ＸＧａ１　（ジメチルポルノア
ミド中の２％保存液（５０μＭ　）およびＩＰＴＧ　（
１００ｍＭ保存液の１０μｌ）を補足したＬＢ＋アンピ
シリン（１００μｇ／−）プレートにプレート化した。

白色コロニーを取り出し、サムプルツクら（１９８９）
に示されたプロトコルに従って、小規模プラスミド調製
を行った。

プラスミドは、　ＥｃｏＲＩで消化することにより、３
５０塩基対挿入物についてスクリーニングされた。いく
つかの異なる単離物を取り比し、プラスミドＤＮＡを単
離精製し、さらにＯＮ＾配列分析に付した。

工程１で得られたＰＣＲフグメントは、遺伝子を含むク
ローンに対してゲノムライブラリーをスクリーニングす
る際に、ＣＤアーゼをコードする配列を検出するための
プローブとしても用いられた。

精製フラグメントを、α−３２Ｐ−ｄｃＴＰおよびベー
リンガーマンハイムバイオケミカルズ製のプライマー　
ＤＮＡ無作為ラベリングキットを用いて標識した。

酵母ライブラリーを、　１８士アンピシリン培地で一晩
増殖させ、その希釈液をＬＢ＋アンピシリン培地プレー
ト上にプレート化し、プレートあたり２５０〜２０００
コロニーノ密度ノコロニーヲ得り。コロニーの取り上げ
は、シュリーシャーアンドシュエル製の０．４５μｍニ
トロセルロース円形または正方形フィルターを用いて行
った。フィルターは、フィルターのコロニー側を、ファ
ツトマン３ＭＭ紙の上に乗せ、固定するため１０％ＳＯ
３に６分間、変性させるために１．５Ｍ　ＮａＯＨ，１
，５Ｍ　ＮａＣ１に５分間、中和するために０．５Ｍ　
ＮａＣ］、　０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　ｐＨ７，
４に５分間浸し、そして、２ＸＳＳＣに５分間浸した後
。

スタータリンカ−（ストラタジーン）を用いて説胡書の
指示通りにｔｌＶ架橋を行って処理された。次に、フィ
ルターを２　ｘＳＳＣｌ：　５分間浸し、５ＸＳＳ［：
。

０．５％ＳＯ３，１ｍＭ　ＥＤＴＡ中５０℃で予備洗浄
を行った。

プレハイブリダイセーションは、１２フィルター入りの
パック毎に２０ｍｆ溶液が入る。ヒートシール可能なプ
ラスチックバッグの中で行った。プレハイブリダイゼー
ション溶液は５０％ホルムアップヒト、　　６　ｘｓｓ
ｃ、　　０．０１Ｍ　ＮａＰ　　ｐＨ６，８，１ｍＭ　
ＥＤＴ＾　（ｐＨ８，０）、　０．５％ＳＤＳ、　１１
００Ａ１／−の変性サケ精子ＤＮＡ。

および５×デンハート溶液を含有した。プラスチックバ
ックを、４２℃の水浴中に浸し、１２〜１６時間インキ
ュベートした。ラベルしたプローブは、ブツシュ−カラ
ム（ストラタジーン）からの溶出により、導入されてい
ないヌクレオチドから精製された。プローブを、約１１
０６ｃｐ／−液体となるように加え、ハイブリダイゼー
ションのだｂに４２℃で１２〜１６時間インキュベート
した。

フィルターを、室温で２　Ｘ　ＳＳＣ，０，１％ＳＯ３
中で数回洗浄した後、５５℃で１時間Ｉ　Ｘ５ＳＣ，Ｑ
、１％ＳＯ３中で洗浄した。フィルターを風乾し、サラ
ンラップで包み、−７０℃で一晩１強化スクリーンと共
に。

Ｘ線フィルムにさらした。オートラジオグラフは。

ハイブリダイゼーションの陽性信号を示すクローンを選
別するために、フィルターとマスタープレートとを並べ
て行った。陽性クローンは、プラスミドを単離するまで
に、上記方法で２回以上再スクリーニングされた。プラ
スミドＤＮＡは、タロラムフェニコール増幅されたしＢ
＋アンピシリン培養物５００祿の増殖により単離され、
その後、サムプルツクら　（１９８９年）の示したアル
カリ溶解法を用いて精製された。セシウムクロライドエ
チジウムブロマイド平衡遠心分離により精製されるプラ
スミドもあるが、その他は、　ＰＺ２５３カラム（５゛
→３“）から溶出された後、ポリエチレングリコール沈
澱。

フェノール：クロロホルム抽出、そしてエタノール沈澱
が行われた。

オリゴヌクレオチド１８量子体のいくつかを１合成する
か、あるいは、　ＰＣＲとゲノムＣＤアーゼクローン出
来のＤＮＡの配列決定のために用いた。一部のプライマ
ーは、コード鎖から配列を作製し、その他は、相補的Ｄ
ＮＡ釦から配列を得た。配列決定反応は、シークエナー
ゼハージョン２，０キット（ユナイテッドステイツバイ
オケミカル）が提供するプロトコルと試薬に従って行っ
た。ＤＮＡは。

配列決定反応の前に、　０．２Ｎ　ＮａＤ）Ｉ中でアル
カリ変性により変性された。ラベルした反応混合液の希
釈と１反応時間は、目的とする配列の領域に依存して変
化された。大部分の反応は、１つの反応当り、　　１〜
１．５ｐｍｏｌの鋳型ＤＮＡとプライマーを、１０〜１
５μＣ１のα−３５Ｓ−ｄＡＴＰと共に用いた。試料を
８％ポリアクリルアミド−尿素シーフェンシングゲルに
担持し、解析されるべき配列に応じて、１〜７時間実施
した。ゲルを、１０％メタノール、１０％酢酸にて３０
分間固定させ、減圧ポンプに接続したスラブ−ゲル乾燥
器を用いて、８０℃４５分間乾燥させた。乾燥したゲル
を、室温で１８〜７２時間コダックＸＡＲ−５フィルム
にさらした。配列は９手動で読まれた。配列データの整
合と分析は、シーンプロソフト　（リバーサイドサイエ
ンティフィック。

シアトル、ワシントン州）を用いたコンピュータにより
行われた。第８図は、ゲノム（’Ｄアーゼをコードする
クローンの核酸配列を示す。第１０図は。

予測されるアミノ酸配列を示す。図に見られるように、
コード配列は、約４７４塩基対からなり、１５８アミノ
酸のタンパクを特定する。そのため、　ＣＤアーゼの予
測される分子量は、約１７．５０６ダルトンとなる。

工程４で得られたＤＮＡ配列を用いて、ＣＤアーゼをコ
ードするＰＣＲで作製されたカセットのためのオリゴヌ
クレオチドプライマーを設計した。これらのオリゴヌク
レオチドの一部は１分泌シグナルペプチドおよびクロー
ニングまたは発現において用いられる制限酵素切断部位
等の追加配列を有していた。オリゴヌクレオチドプライ
マーは、適当な配列を末端に追加してＰＣＲフラグメン
トを作製するために、２つひと組で用いられた。

特に１ＣＤアーゼをコードするカセットは、　　ＣＤア
ーゼ特異的配列とクローニングのための制限酵素切断部
位をコードする追加配列の両方を含む２つのプライマー
を用いて、　ＰＡＲにより構築された。

５゛プライマーは、４５塩基の相同配列を含む６５量体
であり、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、　５ａｌｌ、および
Ｎｃｏｌの切断部位を含む５”末端に結合した。ＣＤア
ーゼのゲノムコピーの５゛末端とは完全に同一ではなか
った。

３′プライマーは、３９量子体で、５′末端にＸｂａｌ
末端が結合した。　（１，０了−ゼのＣ末端のアンチセ
ンス釦と同一であった。用いられた銃撃は、１反応あた
り約１ｎｇのＣＤアーゼのゲノムクローンであった。

各プライマーは、　７５μｍｏｌ濃度存在した。ＰＣＲ
反応は、工程１に示すように行われた。

ＰＣＲ反応産物は、クロロホルムによる抽圧およびエタ
ノール沈澱により精製された。その後ＤＮＡは、制限酵
素旧ｎｄＩＩＩおよびＸｂａｌにより消化され。

ゲル電気泳動にかけられ、シーンクリーン（ＢＩｏｌｏ
ｌ）を説明書に従って用いて溶出することにより精製さ
れた。

工程６：哺乳類系におけるＣＤアーゼの発現工程５で精
製されたフラグメントを、　ＨｉｎｃｌＩ［ｌ　−Ｘｂ
ａｌで消化したＣ０Ｍ８またはｐＨ３Ｍプラスミドベク
ターに連結し、宿主細菌であるＭＣ１０６１の中に形質
転換させた（アルフォおよびシード、　１９８７）。ｐ
　Ｈ３！＋！ベクターの遺伝子地図を第１２図に示す。

その構造を！３．Ｕするた約に、　２０の形質転換体を
取り圧し。

プラスミド調製物の小規模アルカリ溶解を行いその一部
を旧ｎｄＩＩＩ　＋　Ｘｂａｌで消化した。３つの調製
物のうち残るプラスミドは、　ＤＥＡＥ−デキストラン
トランスフェクション法（アウスベルラ編９分子生物学
の最新プロトコル）により、　［Ｏ３細胞のトランスフ
ェクションに用いた。

簡潔に説明すると、　３．５　Ｘ１０５ＣＯ３細胞を［
１ＭＥＭ／１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の６ｃｍ＠ｉ
養皿にプレート化し、６％［０２中３７℃で一部インキ
ユベートした。

この小調製物から得たＤＮＡには、最終容量が１００μ
βとなるように、　ＰＢＳおよび５０ｍｇ／ｍｆＤＥＡ
Ｅ−デキストランを、以下に示した量で加えた。

対照 擬似（ｓｈａｍ）対照０μｆ　　　８０μ！　　２０ｐ
ＲＢＢＩ　　　　　　　４μｆ　　　７６μｍ　　２０
μｍＣＤアーゼトランスフェクタント １−１　　　　　　１３μｌ　　　６７μＡ　　　２０
μ！１−４　　　　　　１３μｌ１６７μ！　　２０μ
に２−６　　　　　　１３μｍ　　６７μ！　　２０μ
ｍ各トランスフェクションは、２試料ずつ行われた。１
日経た培養培地を、培養皿から吸引し、１回の洗浄あた
り２ｒＩｆ！のＰＢＳで、細胞を３回洗浄した。ＤＭＥ
Ｍ−１０ロキントランスフエクシヨン培地を、１．７ｍ
ｆ／プレート加え、　ＤＮＡカクテルを培地中に滴下し
た。トランスフェクション インキュベートし、培地を取り除き、細胞にＦＢＳ／１
０％ＤＭＳＯで２分間ショックを与えた後、血清を含ま
ない培地で３回洗浄し、１プレートあたり３．５ｄのＤ
ＭＥＭ／１０％ＰＢＳ中で３日間インキュベートした。

（以下余白） １、ラジオイムノ沈降反応ニ ラジオイムノ沈降反応（ＲＩＰＳ）に用いる工程６で得
られたプレートは、　　２００　μｃｉ／ｍｆ３５Ｓ−
メチオニンを含む片時調製した０μ！Ｍ／１０％ＦＢＳ
中で約１２〜１６時間インキュベートした。

ＲＩＰＳｉｌ、　３７℃約１２〜１６時間のインキュベ
ーションの後、ラベルした培地を吸引し、各培養皿に１
％ＤＧ−ＰＯ４ＲＪＰＡＥ緩衝液（５０ｍＭ　ＮａＪＰ
０４．１％デオキシコール酸ナトリウム、１％　トリト
ンＸ−１００，０゜％ＳＤＳ、　　１５０ｍＭ　ＮａＣ
１，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、　　５ｍＭ　ＥＧＴＡ、　２ｍ
ＭＰＭＳＦ、およびＩμｇ／ｍｆアプロチニン−１％オ
クトグルコシドを加えたＰＯ４−ＲＩＰＡＥ）を加え、
水冷中で１０分間インキ−ベートした。分解物を１（７
オークリツジ遠沈管に写し、　４０，０００ｒｐｍ、　
４℃で４０分間遠心分離した。上清を水冷下２本の微量
遠沈管に移した（０．４ｍｆ／チューブ）。ＢＢＩ　　
）ランスフェクタントは、２μｇの抗体と共にインキュ
ベートしたが、他のトランスフエクタントには、１７．
５μ！または３１．５μｇのウサギ抗ＣＤアーゼポリク
ローナル抗血清を加えた。ＲＩＰＳを、氷冷下１時間イ
ンキュベートした。ＢＢＩチューブには２番目の抗体と
してヒツジ抗マウス抗体を加え、水冷下２０分間インキ
コベートした。

黄色ブドウ球菌（カルビオケム）を、０．５％ＮＰ−４
０／ＴＢＳ緩衝液（７００μｆ）で洗浄後、０．０５％
ＮＦ−４０／ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、最終的には１ｍｇ
／ｍｌ卵白アルブミンを含むＰＯ４−ＲＩＰＡＥ　Ｍ＃
ｒ液（ＴＢＳ、即ち５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ｔ（ＣＩ、　
ｐｌ（７，４，１ｍＭＥＤＴＡ、　１５０ｍＭ　ＮａＣ
Ｉ）に再度懸濁した。洗浄した黄色ブドウ球菌の５０μ
ｍをＲＩＰ物質に加え、水冷下１０分間インキュベート
した。ＲＩＰＳは、微量遠沈管内でペレット化され。

０．５　ｍｊ！ＴＮＥＮ（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
　ｐ）１８．０．１００ｍＭ　Ｎａ［：］。

１１ｍＭＥＤＴＡ、　０．５％ＮＦ−４０）で３回洗浄
された。元の４００μｌの２試料から得た最終ベレット
は、３５μ矛還元または３５μ！非還元５Ｏ５−ＰＡＧ
Ｅ用緩衝液に再度懸濁させた。試料をバイオ−ラッドの
低分子量タンパクマーカーとともに１０−２０％５Ｏ３
−ＰＡＧＥ勾配ゲルに担持させ、３００ボルト約２時間
の電気泳動を行った。ゲルは、クマシーブルーで１時間
染色し、　１０％メタノール、５％酢酸で約１２〜１６
時間脱色し、３０分間発色を強めるためにさらした後。

水で３回洗浄し、６０℃で１時間乾燥した。ゲルを４時
間Ｘ線フィルムにさらすと、擬似対照に１７．０００ダ
ルトンのバンドが認められ、　ＢＢＩ試料では、　１７
，０００ダルトンのバンドは５忍められなかったが、　
４５，０００ダルトン付近に特異的なバンドがみられた
。３つのトランスフエクタントにはすべて、約１７．０
００ダルトンに特異的なバンドが認められた。

２、ウェスタン分析： 工程６でえられた２重のトランスフェクションプレート
は、ラベルしないまま１こしておき、３日間のインキ；
ベーション後に回収した。培地を吸引して捨て、細胞を
ＰＢＳで洗浄した後、１μｇ／−アプロチニンおよび３
０μｇ　／ｍｆＰＭｓＦを含む１０ｍＭＴｒ　１ｓ−Ｈ
ＣＩ　（ｐＨ８，０）　０．５ｒｎｌ中に懸濁した。細
胞は、滅菌スクレーパを用いて培養皿から取り除き、水
冷下で滅菌微量遠沈管に移した。各懸濁液を、水冷下２
〜１５秒間最強で超音波処理した。この分解物を氷玲微
量遠沈管で２０分間遠心分離することにより細胞残渣を
取り除き、上清を新しいチューブに移した。酵素アッセ
イは、以下の通りに行った。

これらの分解物の一部を、精製ＣＤアーゼに対して生じ
たポリクローナルウサギ抗血清を用いたウェスタンプロ
ットにも用いた。希釈していないトランスフエクタント
分解物の２５μ矛を、　ＲＩＰＳに示したように５Ｏ３
−ＰＡＧＥ電気泳動に付した。ただし。

濃度標準として、精製ＣＤアーゼ酵素の一連の希釈物を
ゲルに担持させた。５００ｎｇ　／レーンの濃縮したＣ
Ｏアーゼは、　　１１００ｎ、　２０ｎｇ、　４％ｇ、
　０．８％ｇ　／レーンと５倍ずつ希釈された。その後
このゲルを、　Ｃ３Ｈクローニングマニユアル（サムプ
ルツクら、　１９８９）のプロトコルに従って、ニトロ
セルロールフィルターに電気プロットした。

フ゛ロットは、プロット−（Ｂｌｏｔｔｏ、すなわちｐ
ｅｓ十１％脱脂乳十０．５％ＮＰ−４０）中１時間でブ
ロックされた。２．５μｇ／ｒｎ１．ポリクローナルウ
サギ抗ｃ（）アーゼ血清を含む片時調製したプロア）−
を、このフィルターに加え、室温で１時間インキュベー
トした。フィルターは、プロット−中で５分間３回洗浄
した後、アルカリホスファターゼ接合体（ベーリンガー
マンハイムバイオケミカル）を１：１０００でプロット
−中に希釈したものの中でインキュベートした。過剰な
抗体接合体をプロット−中で３回洗浄することにより取
り除き、最後にアルカリホスファターゼ基質緩衝液（１
００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）ＩＣＩ　ｐＨ９，５，１００ｍ
Ｍ　Ｎａ［：］、　５５ｍＭＭｇＣ１□）で洗浄した。

その後フィルターを発色させるために、　１２ｍｇブロ
モコリンドリルリン酸と７ｍｇニトロブルーテトラゾリ
ウムを加えた４０ｒｎｌの基質緩衝液中に１５分間イン
キュベートした。反応は、フィルターを蒸留水で洗浄す
ることにより停止した。

発色を行うと、３つのトランスフェクションすべてに約
１７．０００ダルトンのバンドがみられ、その強度は、
精製ＣＤアーゼの濃度標準の０．８ｎｇより大きく４ｎ
ｇより小さかった。

３、組換えで発現したＣＤアーゼの活性測定上記形質転
換されたＣＯ８細胞からの抽出物について、５−フルオ
ロシトシン（５−ＦＣ）かう５−フルオロウラシル（５
−ＦＩＪ）の変換を測定した。ＣＤアーゼ（１−１゜１
−４．２−６）を含むトランスフェクタント（３Ｘ１０
’細胞）、　擬似トランスフェクション、または対照プ
ラスミドトランスフェクション（８８１）を、　ＩＯｍ
ＭＴｒｊｓ緩衝液０．５ｍｌ中で超音波処理し、遠心分
離した。各上清１００μｍと１μｇ／−のＣＤアーゼ溶
液を、１７０μβのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と
。

３０ｍＭ　５−ＦＣ溶液３０μｍとに加えた。これによ
り。

３ｍＭ５−ＦＣの反応混合液３００μｍを得た。対照反
応として、酵素を入れない反応も行った。

これらの試験管を、３７℃で２４時間インキュベートし
た後、各溶液５０μｌを取り、　０．ＩＮ　ＩＬｃＩ　
１−で反応をクエンチングした。これらの試料を、２５
５および２９０ｎｍでＵｖ分光光度計を用いて測定した
。

（０，１１９１Ｘ　０Ｄ２＝ｏ　Ｏ，０２４８５Ｘ　０
Ｌｓｓ）　Ｘ　２０＝ｍＡｌ　５−ＦＣおよび （０，１８４９Ｘ　ＤＤ２５ｓ　０．０４９０７ｘ　０
Ｄ２＝ｏ）　Ｘ　２０＝ｍＭ　５−Ｆ２Ｏ式を用いて、
　５−ＦＣから５−ＦＵに変換した量を算出した。次い
で９元の細胞抽出物中の活性単位数を計算した（１単位
−５−ＦＣから５−ＦＩＪへ１　μｍｏｌ　／分変換）
。擬似およびＢＢＩ　）ランスフェクション。

および酵素なしの反応では、活性が認められず。

ＣＤアーゼの３つのトランスフェクタントはすべて活性
であった。トランスフェクタント１−１は、０．４１Ｘ
　１０−３単位、１−４は０．５４Ｘ　１０−’単位、
そして、２−６は０．２６Ｘ１０−３単位であった。Ｃ
Ｏアーゼ１／Ｊｇ／ｍｆの対照アッセイでは、　５−Ｆ
Ｃすべてが５−Ｆｌｌに変換した。精製ＣＤアーゼの活
性を４０［Ｊ／ｍｇとすると、１０ｎｇ（１−１）、　
１３．５ｎｇ（１−４）、および７．３ｎｇ　（２−６
）の活性型ＣＤアーゼが発現したことになる。

同じ試料について、別のアッセイ法も行った。

上清５０μｍまたはＣＤアーゼ１μｇ　／ｍｌｉ、　１
３０μ１ＰＢＳ、　２０　μｍ　３０ｍＭ　５−ＦＣ，
および、　１　μｃｉ　［３Ｈ］５〜ＦＣを各アッセイ
試験管に入れた。これらの反応は２４時間インキユベー
トシ、蒸発乾固後残渣を２０μβメタノールに溶解し、
シリカゲル薄層クロマトフラフィ−（ＴＬＣ）板上にス
ポットして行った。

薄層板は、　９６：４アセトン／水で展開された。この
とき、　　５−ＦＣおよび５−ＦＣのＲｆはそれぞれ０
．２および０．８であった。ＴＬＣ板の適当な部分を切
り取り。

シンナレーションカウンターでカウントし、各試料中の
５−ＦＣおよび５−ＦＵの相対量を測定した。擬似およ
びＢＢＩアッセイでは、　５−ＦＣが得られず、トラン
スフェクシントすべてで、　５−Ｆ［’の１４％が５−
Ｆｌｌに変換していた。これは、試料あたり０．６　Ｘ
ｌ０−’単位ということになり、　［、ｌＶ実験で算出
した量を立証している。ＣＤアーゼ１μｇ／−の対照反
応では。

５−ＦＣすべてが５−Ｆ［Ｉに変換した。

実験は、　ＣＤアーゼトランスフェクタントが、実際に
活性型酵素を発現していることを示している。

このことは、ウェスタンプロット分析と考え合わせて１
組換え酵素の比活性が酵母から単離したそれと同等であ
ることを示している。

このように、熱安定性ＣＤアーゼならびにその精製方法
と組換え製造方法を開示した。本発明の好ましい実施態
様をある程度詳細に示したが、これは例示であって、制
限するものではなく、特許請求の範囲に定義された本発
明の意図および範囲から離れるこさなしに明らかな変更
をなし得るこ出は理解されている。

（以下余白） （発明の要約） 熱安定性シトシンデアミナーゼ（ＣＤア〜ゼ）、および
それをコードする遺伝子、ならびに、それを単離し、精
製し、そして組換えにより産生ずる方法が開示される。

熱安定性ＣＤアーゼは、　５ａｃｃｈａｒ。

離された酵素は、約３２ｋＤａの分子量を有しくゲル濾
過クロマトグラフィーにより決定された）、それぞれが
約１７ｋＤａの分子量を有する。２つのサブユニットか
ら構成されている。よく精製された熱安定性酵母口Ｄア
ーゼは、他の公知の配列決定されたタンパクと有意な配
列の相同性を示さない。

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ｏｌ、Ｃｈｅｍ、　　２６０＋１０２９９−１０３０７
゜

【図面の簡単な説明】

以下の図面は１本発明の開示内容の一部を構成する。 第１図は、　ＣＤアーゼの５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還
元条件下、１４％ポリアクリルアミド）を示す図である
。 各レーンに示される物質は１次のものである。レーン１
および９．マーカータンパク；レーン２゜実施例１の工
程からの自己分解上清；レーン３゜実施例１の工程２の
（ＮＨ，）　２ＳＯ，沈澱（７０％）後の生成物；レー
ン４．実施例１の工程２の（Ｎｉ１４）　２Ｓｏ。 沈＃　（５０〜７３％）後の生成物；レーン５．実施例
１の工程３のΩ〜セファロースクロマトグラフィー後誘
導された生成物；レーン６、実施例１の工程４の６−７
５カラム後の生成物；レーン７、実施例１の工程５のオ
クチル−セファロース精製後の生成物；レーン８．実施
例１の工程６の２回目の６−７５カラム後得られる最終
精製物。 第２図は、　Ｇ−５０セフアデツクスカラム（１，５Ｘ
　１００ｃｍ）からのＣＤアーゼの溶離プロフィールを
示す図である。（Ａ）精製されたロアーゼ２７１１は、
リボヌクレアーゼ゛Ａ　（２ｍｇ）、　　卵白アルブミ
ン（２ｍｇ）、およびキモトリプシノーゲンＡ　（１ｍ
ｇ）と混合され、　ＰＢＳで溶離された。両分は、全タ
ンパク含量を決定するため２８０ｎｍでモニターされ、
　ＣＤアーゼ活性を決定するため基質として５ＦＣを使
用しながら２９０ｎｍでモニターされた。（Ｂ）キャリ
ブレーションスタンダードを用いない、上記Ｇ−５０セ
ファデックスカラムからのＣＤアーゼの溶離。 第３図は、３７℃におけるＣＤアーゼの安定性を示す図
である。ＰＢＳ　（プロテアーゼを含有しないＢＳＡ（
１ｍｇ／ｍｌ）を含有）中のＣＤアーゼ（７２Ｌｌ／ｍ
ｇ）は。 ポリプロピレンチューブ中で３７℃でインキュベートさ
れた。様々な期間において、　ＣＤアーゼ活性が。 酵素溶液１０μβを使用して決定された。 第４図は、　ＨＰＬＣで精製されたＣＤアーゼのプロフ
ィールを示す図である。水平なバーは、アミノ酸配列分
析のためにプールされた画分を示す。 第５図は、　ＨＰＬＣ精製後のＣＤアーゼの５Ｏ５−Ｐ
ＡＧＥ分析（還元条件下、１５％ポリアクリルアミド）
を示す図である。レーン１．プールＡ；レーン２．プー
ルＢ０ 第６図は、　ＣＤアーゼの部分的なアミノ酸配列を示す
図である。口ＮＢｒ　（Ｍシリーズ）、　エンドブロテ
イナーゼＧｌｕ−Ｃ（Ｅシリーズ）、　エンドプロテイ
ナゼＬｙｓ、［：　（Ｋシリーズ）、およびエンドプロ
テイナーゼＡｓｐ−Ｎ　（Ｄシリーズ）による開裂から
得られたペプチドを示す。 第７図は、ブライマーＣＤＡ４Ｒ１およびＣＤＡ３八Ｓ
のヌクレオチド配列、それに対応するアミノ酸配列。 およびＣＤアーゼアミノ酸配列中におけるこれらのプラ
イマーの相対的な位置を示す図である。ＣＤＡ４Ｒ１は
センス鋼上の５°から３゛に向かい、一方ＣＤＡ５ＡＳ
はアンチセンス如上の５′から３′に向かう。 ！８図１ｔ、［：Ｄアーゼをコードするゲノムクローン
由来のＤＮＡのヌクレオチド配列を示す図である。 第９図は、　ＣＤアーゼのゲノム配列中に見られるオー
ブンリーディングフレーム（ＯＲＦｓ）を示す図である
。 第１０図は、　０ＲＦ２のヌクレオチド配列およびそれ
に対応するアミノ酸配列を示す図である。ヌクレオチド
配列から予言されたが、ペプチド配列上に見畠されなか
った。さらに別のアミノ酸が、太字で強調され、開始お
よび停止コドンが四角で囲まれている。 第１１図は、ＣＯアーゼ遺伝子を含有するプラスミド発
現ベクター「フユージョネータ−（ｆｕｓｉｏｎａｔｏ
ｒ）　Ｊを示す図である。 第１２図は。 ｐＨ３Ｍベクターの制限地図を示す図である。 以 上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、熱安定性シトシンデアミナーゼ、またはそれと機能
   的に等価なタンパクをコードする、単離れたヌクレオチ
   ド配列。 ２、前記配列が、第１０図に示される配列と実質的に同
   じである、請求項１に記載のヌクレオチド配列。 ３、請求項１または２のヌクレオチド配列を含有し、そ
   して該配列の発現において効果的である、組換え発現ベ
   クター。 ４、前記ヌクレオチド配列が、宿主細胞と適合性の制御
   配列と作動可能に連結している、請求項３に記載の組換
   え発現ベクター。 ５、請求項４の組換え発現ベクターで形質転換された宿
   主細胞。 ６、請求項５の宿主細胞を増殖させることを包含する、
   組換え熱安定性シトシンデアミナーゼ、またはそれと機
   能上等価なタンパクを産生する方法。 ７、単離された、熱安定性シトシンデアミナーゼ、また
   はそれと機能的に等価なタンパク。 ８、第６図または第１０図に示されるアミノ酸配列、ま
   たはそれと実質的に相同でありかつ機能的に等価なアミ
   ノ酸配列を包含する、請求項７に記載のシトシンデアミ
   ナーゼ。 ９、酵母から単離される、請求項７に記載のシトシンデ
   アミナーゼ。 １０、￥Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ￥￥ｃｅｒｅｖｉ
   ｓｉａｅ￥から単離される、熱安定性シトシンデアミナ
   ーゼ。