JPH0413352B2 - - Google Patents

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【発明の詳細な説明】

(イ) 産業上の利用分野 本発明は、新規水溶性ジテトラゾリウム化合物
およびその化合物を用いる還元性物質の測定方法
に関し、さらに詳しくは、３，3′−（３，3′−ジ
ハロ−４，4′−ジフエニレン）−ビス（２，５−
ジフエニル−2H−テトラゾリウム）のフエニル
基にスルフアモイル基を介して１個のスルホン酸
基を有することを特徴とする水溶性のジテトラゾ
リウム化合物およびそれを用いる還元性物質の測
定方法に関する。 テトラゾリウム化合物は、脱水素酵素の活性度
の測定、それによる基質、さらにスーパーオキサ
イドイオンを生成する酸化酵素の作用対象である
基質の測定、すなわち食品中の添加物の定量、あ
るいは生体体液成分の臨床試薬として実用化され
ている。 (ロ) 従来の技術 水溶性テトラゾリウム化合物は、これを還元し
た時に生成するホルマザンが安定な水溶性化合物
であるので、このホルマザンを定量することによ
り水溶液中の還元性物質を測定することに利用さ
れる。 従来テトラゾリウム化合物としては、例えば２
−（４−ヨウ化フエニル）−３−（４−ニトロフエ
ニル）−５−フエニル−2H−テトラゾリウム塩
（INT）、３−（４，５−ジメチルチアゾリル−
２）−２，５−ジフエニル−2H−テトラゾリウム
塩（MTT）、２，2′，５，5′−テトラキス（４−
ニトロフエニル）−３，3′−（３，3′−ジメトキシ
−４，4′−ジフエニレン）−2H，2′H−ジテトラ
ゾリウム塩（NTB）、２，2′−ｐ−ジフエニレン
−３，3′，５，5′−テトラフエニル−2H，2′H−
ジテトラゾリウム塩（Neo−TB）などが代表的
に利用されている。しかしながら、これらテトラ
ゾリウム塩及びその還元体であるホルマザンはい
ずれも水に難溶性であり、使用にあたり多量の界
面活性剤あるいは有機溶剤の併用をやむなく行つ
ているのが現状である。特に臨床検査の分野では
生成されるホルマザンが測定機器の測光部位に色
素沈着を生じ、著しく検査結果に悪影響を与えて
いる。又、近年急速に進歩する検査の自動化に対
し、自動分析機の汚染による誤測定をまねいてい
る。 以上のような理由で、テトラゾリウム塩を使用
することが好ましい検査項目の場合でも、やむを
えず他の測定原理を使用することを強いられてい
た。 このような状況に対して、特公昭56−38154号、
特開昭56−61366号、特開昭56−61367号の各特許
公報、日本薬学会102年会講演要旨集341頁4K2−
４等に開示されるように、テトラゾール環に置換
するフエニル基に、直接スルホン酸基もしくはカ
ルボン酸基、又は四級アンモニユウム塩を含む側
鎖を導入する試みがなされている。 しかし、可溶化の目的でフエニル基に直接導入
されたこれら酸基のために、実際の測定で不可欠
な酵素機能が発揮される至適PH域内においては、
これらのテトラゾリウム化合物はホルマザンを生
じないので臨床検査の分野では応用困難である。
又、四級アンモニユウム塩導入化合物は水溶性の
点で不十分である。 又、最近では特開昭59−106476号公報に示され
るように、フエニル基に直接結合しない水溶性基
（スルホン酸基又は／およびカルボン酸基）２個
を含有させる方法も試みられている。 しかしながら、ここで提案されたテトラゾリウ
ム化合物の還元型であるホルマザンはPHの変化で
著しく分子吸光係数が変動する。 酵素反応を停止させるために、臨床検査では
酸、又はアルカリに反応液のPHを移行させる方法
が一般的であるが、ここで提案されたテトラゾリ
ウム化合物を用いる場合、著しく測定感度を低下
せしめる欠点を有している。 (ハ) 発明が解決しようとしている問題点 本発明者らは、このような従来の欠点を解決す
るためには、テトラゾリウム化合物が水易溶性で
あること、還元を受けるときにはPH依存性の小さ
いこと、特に臨床検査に使用される場合には還元
型ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド（以
下、NADHと略記。）または還元型ニコチン酸ア
ミドジヌクレオチド燐酸（以下、NADPHと略
記。）により特異的に作用されること、生成した
ホルマザン化合物が水易溶性でなければならない
ことなどに着目し、検討を行つた結果、本発明を
完成するに至つた。 すなわち、本発明の第一の目的は、還元性物質
によつて、電子伝達剤の存在下に水易溶性の発色
ホルマザンを生成する新規な水溶性テトラゾリウ
ム化合物を提供することである。 本発明の第二の目的は、新規なテトラゾリウム
化合物を用いて水性溶液中の還元性物質およびス
ーパーオキシドイオンを測定する方法の提供であ
る。 他の目的は生体体液中のNADHやNADPHに
特異的に有利な測定方法であり、水性溶液のPH変
動による影響が小さく、測定機器の汚染のない還
元性物質の測定方法にある。 (ニ) 問題点を解決するための手段 本発明の新規な水溶性ジテトラゾリウム化合物
は、一般式(1)で表される： ［式中、R₁およびR₃は水素、R₂およびR₄は式
(2)または(3) （式中、ＸおよびＹはSO₂NHおよびR₇は水
素、R₆およびR₈はスルホン酸基を示す。）で表さ
れる基、ＰおよびＱは水素、Ｚはハロゲンを示
す。］ スルホン酸基は、テトラゾール環と分子内塩を
形成している。 本発明のテトラゾリウム化合物は公知の原料、
方法により容易に製造することができる。 例えば、ｍ−トニロベンゼンスルホニルクロラ
イドとｍ−アミノベンゼンスルホン酸との縮合物
を還元して得られる式(4) のアミノ化合物を常法によりヒドラジン化合物と
し、次いで、例えばベンズアルデヒドと縮合すれ
ば式(5) で示されるフエニルヒドラゾン化合物が得られ
る。 これに、３，3′−ジクロロベンジジンのテトラ
ゾ化合物を常法によりカツプリングさせることに
よつて式(6) で示されるホルマザン化合物が得られる。 得られたホルマザン化合物を常法により酸化す
れば、目的とするジテトラゾリウム化合物(7) を得ることができる。 本発明のジテトラゾリウム化合物の製法は、後
記実施例に詳述されている。 本発明におけるジホルマザン化合物は、アルコ
ール等親水性の大きい有機溶媒に易溶であるた
め、酸化が極めて円滑であり酸化によつて得られ
るジテトラゾリウム塩化合物は水中分子内造塩に
より酸性下ではやや難溶の結晶として高純度に分
取することができ、カラム精製等繁雑な精製によ
らずとも比較的高純度の品質にすることができ
る。これらのテトラゾリウム化合物は水中、弱ア
ルカリ性とすることにより、実用上充分な水溶性
を有する。 本発明の第二の要旨は、前記一般式(1)で示され
る水溶性ジテトラゾリウム化合物を用ることを特
徴とする水性溶液中の還元性物質の測定方法に存
する。 ジテトラゾリウム化合物(1)は、還元性物質、例
えばNADHまたはNADPHの水素受容体として
作用し、あるいはスーパーオキサイドイオンによ
つて還元される。還元の際に定量的に生成するホ
ルマザンの量に比例する発色の程度を、吸光光度
測定法で測定することによつて、還元性物質であ
るNADH、NADPHまたはスーパーオキサイド
イオンの量を測定することができる。このような
測定方法は、脱水素酵素の活性度の測定、それに
よる基質の定量、即ち、生体成分、食品中の添加
物などの定量に極めて有用である。 これらの原理を、乳酸脱水素酵素（LDH）の
活性度測定に例にとり示せば次の通りである： （NAD：NADHの酸化型） これらの反応の結果定量的に生成するホルマザ
ンの濃度を、吸光度測定することにより定量すれ
ばLDHの活性度を測定することができる。 又、脱水素酵素を使用した生体成分の測定をコ
レステロールの測定について示せば次の通りであ
る： 同様にコレステロールの定量が可能である。 更に、生体成分中のクレアチン燐酸キナーゼ
（CPK）について示せば次の通りである： （NADP：NADPHの酸化型 HK：ヘキソキーゼ ADP：アデノシン−２−燐酸 ATP：アデノシン−３−燐酸 Ｇ−６−PDH：グルコース−６−燐酸脱水素
酵素） 従つて、同様にCPKの活性度の測定が可
能である。 テトラゾリウムの応用については、その他
種々の方法があり、それらは下記実施例によ
り明らかにされる。 実際の測定に当たつては、トリス燐酸緩衝
液などの適宜の媒体中において、被検液に定
量対象基質に特異的な酸化酵素、脱水素酵素
などの酵素類および一般式(1)で示されるジテ
トラゾリウム化合物を添加し、インキユベー
トして反応を進行せしめ、発色生成するホル
マザンの吸光度を測定し、被検液中の還元性
物質またはスーパーオキサイドイオン、さら
には基質を定量する。 スーパーオキサイドイオンの定量の際には
被検液中に、測定時間、感度、定量性など実
用的に測定効果をさらに助長させるために、
従来から使用されているフエノール類、チオ
フエノール類、アミン類などを添加しておく
こともできる。また測定時の好ましくない副
反応である自動酸化を防止するためにキレー
ト剤を加えてもよい。 これらの添加助剤は、適宜、単独または組
合わせて用いられる。特に添加助剤として界
面活性剤を併用することは、ホルマザン呈色
の極大吸収を長波長側にシフトする効果があ
つて、呈色感度をさらに増加させるので本発
明測定方法においては好ましい態様である。
界面活性剤としては、脂肪族、芳香族アルコ
ールのポリオキシエチレン誘導体が使用さ
れ、その重合度は５〜30程度が一般的であ
る。一般に市販されているノニオン系界面活
性剤が通常不便なく使用できる。 測定中の被検液のPHは、通常7.0〜8.0の中
性域が好ましいが、本発明の測定方法ではPH
6.0〜10.5の範囲においても呈色感度の変化
は少なく、酸性域でも変化は小さい。 (ホ) 作用および効果 本発明の一般式(1)で示されるジテトラゾリ
ウム化合物およびその還元体ホルマザンは、
スルホン酸基１個を有する置換スルフアモイ
ル基２個を有することによつて水溶性の過大
を抑制することができ、製造、精製が容易で
ある。 また還元して得られたホルマザンの中性付
近における吸光波形が、従来のホルマザンに
比較して長波長（約500nm）であるので、体
液中の着色成分450nm近辺と区別が著しく、
測定誤差を生じ難い。 また本発明のジテトラゾリウム化合物が還
元を受ける際のPH依存性が極めて小さいので
測定結果が再現性よく、しかも高感度に得ら
れる。 臨床検査分野でこれらジテトラゾリウム化
合物を使用して基質あるいは酵素活性度を測
定する時、生体成分に共存する種々の還元性
物質もまた同時にテトラゾリウム化合物を還
元して測定結果に正の誤差を与える結果とな
る。この影響を除くために、あらかじめヨウ
素酸カリウムなどの弱い酸化剤で検体（生体
成分）を前処理して還元性物質を除去した
後、基質あるいは酵素活性度の測定をする
が、本願発明のジテトラゾリウム化合物は
NADHやNADPHに特異的な作用性を有し、
生体成分に共存する種々の還元性物質や前処
理剤に影響されず正確な測定情報を得ること
ができる。 (ヘ) 実施例 以下に本発明を実施例および比較例により
詳述するが、本発明はこれら実施例に限定さ
れるものではない。 実施例 １ フエニルヒドラジン−３−スルホ−3′−ス
ルホン酸フエニルアミド34ｇを水1000mlに溶
解し、ベンズアルデヒド10.8ｇを加えた。次
いで、40〜45℃で２時間かきまぜた後、塩析
してヒドラゾン化合物を収率70％で得た。 得られたヒドラゾン化合物2.3ｇを、ソー
ダ灰６ｇを含む水40mlに添加して５〜10℃で
溶解し、別に３，3′−ジクロロベンジシン
0.63ｇを常法でテトラゾン化し、PHを約５に
調整した液を加え、アルカリ性において７時
間かきまぜたのち、得られたジホルマザン化
合物を中和、晶析、ろ別した。メタノールに
より精製し、ジホルマザン化合物のケーキ７
ｇを得た。 次に、湯浴中上記ジホルマザン化合物ケー
キをメタノール70mlに溶解し、70〜75℃で７
％塩酸10ｇを加え、次いで過硫酸アンモニウ
ム結晶２ｇを加え、酸化が終了するまで70〜
75℃で約２時間かきまぜた。活性炭を加えた
のち、熱ろ過し、ろ液を水で300mlに希釈し
て晶析した。析出した淡黄白色結晶をろ過
し、冷水で充分洗浄したのち乾燥した。淡黄
白色粉末1.3ｇを得た。 この生成物は、第１図に示すような赤外線
吸収曲線及び下記元素分析値を有する下式で
示されるジテトラゾリウム化合物である。 元素分析値（％） Ｃ Ｈ Ｎ Ｓ 計算値 52.96 3.02 12.35 11.31 分析値 52.88 3.00 12.47 11.41 実施例 ２ 実施例１のヒドラジン化合物の代わりに、
下記参考例に従つて得られるフエニルヒドラ
ジン−４−スルホ−3′−スルホン酸フエニル
アミドを使用する以外は同様の合成法によ
り、第２図に示すような赤外吸収曲線及び下
記元素分析値を有する下式で示されるジテト
ラゾリウム化合物1.5ｇを得た。 元素分析値 Ｃ Ｈ Ｎ Ｓ 計算値 52.96 3.02 12.35 11.31 分析値 52.86 3.01 12.38 11.34 参考例 フエニルヒドラジン−４−スルホ−3′−スルホ
ン酸フエニルアミドの製法： １−アセチル−アミノベンゼン−４−スルホニ
ルクロライド25ｇを、ｍ−アミノベンゼンスルホ
ン酸18ｇを水150mlにソーダ灰15ｇ共存下に溶か
した溶液中に20〜25℃で徐々に加え、５〜６時間
かきまぜたのち、塩酸酸性とし、析出物をろ過す
る。得られたケーキを５％苛性ソーダ150ml中に
90〜95℃で２時間処理したのち、中和して１−ア
ミノベンゼン−４−スルホ−3′−スルホン酸フエ
ニルアミド水溶液を収率約70％で得る。 以下常法により得られた１−アミノベンゼン−
４−スルホ−3′−スルホン酸フエニルアミドをヒ
ドラジン化合物とする。 次に、上記実施例において得られた本発明の化
合物を用いたNADHによる発色テスト及び水溶
性の実施例を示す。 実施例 ３〜４ 実施例１および２でえられたジテトラゾリウム
化合物をトリトンＸ−405，0.4％、NAD2mM／
、ジアホラーゼ2U／mlを含有する0.1Mトリス
燐酸緩衝液（PH7.5）３mlに、0.2mM／になる
よう加え、混和し、更にNADH2.8mM／を含
む水溶液50μを加え、35〜40℃で５分間加温の
あと、吸光度を測定した。水溶性および発色性を
次表に示す。

【表】 本発明のジテトラゾリウム化合物は、実用上充
分な水溶性を有するとともに、NADH−ジアホ
ラーゼ系のような低還元電位系においても良好な
発色を示している。 実施例 ５ 実施例２で得たジテトラゾリウム化合物
0.2mM／、トリトンＸ−405，0.4％、NAD
2mM／、ジアホラーゼ2U／mlを含有する0.1M
トリス燐酸緩衝液（PH7.5）３mlをとる。一方、
トリトンＸ−405を加えない同様の組成の緩衝液
３mlをとる。両液にNADH2.8mM／水溶液
50μを加え、37℃で５分間加温後、それぞれの
吸光スペクトルを測定した。結果を第３図に示
す。 第３図に示す通り、界面活性剤を併用する場
合、実施例２で得た本発明のジテトラゾリウム化
合物では極大波長520nmから525nmにシフトし、
その吸光度は約２倍に増大する。 次に、本発明化合物による呈色のPH依存の様子
をNADHの測定を例にとつて示す。 実施例 ６ トリトンＸ−405，0.4％を含有する0.1Mトリ
ス燐酸緩衝液において、PHを5.8、6.5、7.0、7.4、
8.0、8.4、9.0、9.4、9.8、10.5に調製した溶液を
準備し、各々に実施例２で得た本発明ジテトラゾ
リウム化合物0.2mM／、ジアホラーゼ2U／ml
を加え、その溶液2.5mlにNADH2.5mM／水溶
液50μを加え、37℃で５分間加温後、各PHにお
いて生成されたホルマザンの極大吸光度をプロツ
トした。結果を第４図に示す。 即ち、呈色の感度は少なくともPH7.2〜10.5に
おいて変化はなく、酸性域においても変化は著し
く少ない。このことはNADHの測定及び各種脱
水素酵素の至適PHが著しく広範囲に使用できるこ
とを意味し、再現性よく、安定した測定結果が高
感度に得られることになる。 実施例７および比較例１ トリトンＸ−405，0.4％を含有する0.1Mトリ
ス燐酸緩衝液（PH5.8、7.5、8.4、9.0、9.8に調整）
に実施例２で得たジテトラゾリウム化合物（実施
例７）又はNTB（比較例１）を各0.2mM／、
ジアホラーゼ2U／mlになるよう加え反応液を調
製する。この反応液2.5mlに50mg／ｄアスコル
ビン酸水溶液50μを加え、37℃で５分間加温し
てから、生成されるそれぞれのホルマザンの極大
吸光度で吸光度を測定した、その結果をプロツト
して第５図の結果を得た。 第５図からわかるように、従来使用されている
NBTに比較し、各PHにおいて本発明のジテトラ
ゾリウム化合物では生成されるホルマザンは著し
く少ない。このことはアスコルビン酸に対し還元
され難いことを示し、NTBに比較しNADHに対
し、特異的に作用することの一面を示すものであ
る。 実施例 ８ 実施例１で得た本発明ジテトラゾリウム化合物
1mM／、乳酸リチウム塩25mM／、
NAD2mM／、ジアホラーゼ2U／ml、EDTA
−2NalmM／を、トリトンＸ−405，0.4％を含
む0.2Mトリス塩酸緩衝液（PH8.2）に加え、発色
試液とする。 ヒト血清20μをとり、発色試薬2.5mlを加え、
37℃の恒温で連続的に生成されるホルマザンの極
大吸光度である517nmの吸光度を測定した。結果
を第６図に示す。 又、ヒト血清を20、30、40μと増加させ、同
様に連続的に吸光度を測定した後、１分間当り吸
光度の変化量をプロツトして第７図に示す結果を
得た。 これらの結果から、本発明の測定方法は体液成
分の測定に効果的で、定量的な反応であることが
わかる。 次にスーパーオキサイドの定量についてコレス
テロールの定量を例にとり示す。 実施例 ９ 実施例１で得た化合物0.2mM／、コレステ
ロールオキシダーゼ0.2U／ml、ペルオキシダー
ゼ10U／ml、Ｎ−エチル（２−ヒドロキシ−３−
スルフオプロピル）−ｍ−トルイジン1mM／、
還元型グルタチオン0.5mM／を、トリトンＸ
−100，0.2％を含む0.1Mトリス塩酸緩衝液に溶
解し、発色試薬とする。 コレステロールをイソプロパノールに溶解し、
300mg／ｄの濃度に調製し試料とする。 試料10、20、30、40、50μを各々取り、発色
試薬５mlを加え、37℃の恒温下で５分間インキユ
ベート後、試薬ブランクを対照に517nmの吸光度
を測定した。結果を第８図に示す。 このことは、コレステロールオキシダーゼの作
用により生成されたスーパーオキサイドイオンを
定量的に測定できることを示すものである。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は、実施例１および２で得
たジテトラゾリウム化合物の赤外吸収スペクト
ル、第３図は、実施例５で得られた吸光スペクト
ル、第４図は、実施例６で得られた吸光度を示す
図、第５図は、実施例７で得られた吸光度を示す
図、第６図および第７図は、実施例８で得られた
吸光度を示す図、および第８図は、実施例９で得
られた吸光度を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式(1) ［式中、R₁およびR₃は水素、R₂およびR₄は式
   (2)または(3) （式中、ＸおよびＹはSO₂NH、R₅およびR₇は
   水素、R₆およびR₈はスルホン酸基を示す。） で表される基、ＰおよびＱは水素、Ｚはハロゲン
   を示す。］で表される新規水溶性ジテトラゾリウ
   ム化合物。 ２ 一般式(1) ［式中、R₁およびR₃は水素、R₂およびR₄は式
   (2)または(3) （式中、ＸおよびＹはSO₂NH、R₅およびR₇は
   水素、R₆およびR₈はスルホン酸基を示す。） で表される基、ＰおよびＱは水素、Ｚはハロゲン
   を示す。］で表される水溶性テトラゾリウム化合
   物を用いることを特徴とする水性溶液中の還元性
   物質の測定方法。 ３ 還元性物質が還元型ニコチン酸アミドアデニ
   ンジヌクレオチド又は還元型ニコチン酸アミドジ
   ヌクレオチド燐酸である特許請求の範囲第２項に
   記載の測定方法。 ４ 還元性物質がスーパーオキサイドイオンであ
   る特許請求の範囲第２項に記載の測定方法。 ５ テトラゾリウム化合物を界面活性剤と併用す
   る特許請求の範囲第２〜４項のいずれかに記載の
   測定方法。 ６ 水性溶液中の還元性物質を測定することによ
   つて水性溶液中の成分を定量する特許請求の範囲
   第２〜５項のいずれかに記載の測定方法。 ７ 水性溶液中の成分が生体体液中の成分である
   特許請求の範囲第６項に記載の測定方法。