JPH0413655B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、メタン菌を有する被検体中のメタ
ン菌の菌数またはメタン生成活性を測定する方法
に関し、下水処理システムにおけるメタン醗酵槽
内等のように、多数の微生物群および消化汚泥等
の種々雑多な異物と共存するメタン菌の菌数また
はメタンの生成活性の測定方法に関するものであ
る。

［従来の技術］ 従来、微生物濃度から菌数または微生物の活性
を評価する方法として、微生物を含む溶液の可視
光の吸光度と微生物濃度との間に成立する一定の
相関関係を利用し、吸光度の測定により菌数等を
測定する方法が採られていた。

第２図は従来のこの種の測定方法を説明するた
めの装置系の要部ブロツク図である。図におい
て、１はメタン菌を有する被検体、２は光源、３
はこの光源２に電圧を印加する電源、４は光電子
増倍管、５はこの光電子増倍管４に電圧を印加す
る電源、６は光電子増倍管４の光電流を検出する
検出部である。

従来の測定方法は第２図の構成において、光源
２からの可視光をメタン菌を有する被検体１に照
射して透過させ、この透過光を光電子増倍管４で
受光し、その強度を光電子増倍管４の光電流値と
して検出部６により測定していた。そして、測定
された吸光度から既知の吸光度と微生物濃度の相
関関係に基いて微生物濃度を評価し、それに関連
する菌数または微生物の活性を評価していた。

他方、微生物の活性そのものを測定する方法と
して、微生物のエネルギー代謝サイクルにおける
アデノシン三リン酸ATP（Adenosine
Triphosphate）あるいはニコチンアミド アデ
ニンジヌクレオチドリン酸NAD（Ｐ）Ｈ
（Nicotinamide Adenine Dinucleotide
（phosphate））のような生体物質（主として補酵
素）の量を一定条件下で吸光度を光学的に測定す
る方法があつた。

［発明が解決しようとする課題］ 上記のような例えば第２図に示した手段による
従来の測定方法は、被検体の吸光度を測定してい
るため、被検体に多種類の微生物あるいは異物が
含まれている場合は、全体の量が濃度として測定
されるため、メタン菌のみの濃度、それに関連す
る菌数または活性を選択的に測定することは不可
能であつた。他方、微生物の活性そのものを測定
する方法は、ATPやHAD（Ｐ）Ｈが生物のエネ
ルギー代謝系に係る生体物質であるため、全ての
微生物に存在し、メタン菌のみの生成活性および
菌数の測定は不可能であつた。

この発明は上記のような課題を解決するために
なされたもので、被検体中の測定対象のメタン菌
に他のどのような微生物及び異物が共存していて
も、これらの共存物質による濁度の影響を受ける
ことなくメタン菌の菌数またはメタン生成活性を
測定することのできる測定方法を提供することを
目的とするものである。

［課題を解決するための手段］ この発明に係るメタン菌の菌数またはメタン生
成活性の測定方法は、希釈あるいはアルカリ処理
したメタン菌を有する被検体に励起光をその波長
を変化させて照射し、被検体が放射する放射螢光
を測定して、この放射螢光が、励起光の波長範囲
380〜440nｍにおいて、ピーク強度を示す励起光
の波長を検出し、この波長の励起光を被検体に照
射して、被検体が放射する波長450〜490nｍの範
囲における放射螢光のピーク強度を測定するとと
もに、励起光が被検体を透過した透過光量を測定
し、この透過光量から放射光の強度に対して被検
体の存在に由来する減弱効果の補正を行い、メタ
ン菌以外の共存物質による濁度の影響を除去して
上記メタン菌が放射する真の螢光強度を求め、メ
タン菌数と螢光強度の相関よりメタン菌数または
メタン生成活性を算出するものである。

［作用］ この発明においては、メタン菌を有する被検体
に波長を変化させて励起光を照射し、被検体から
放射される放射螢光が最大ピーク強度を示す波長
の励起光を照射して被検体が放射する放射螢光の
ピーク強度を測定し、同時に測定した励起光の透
過光量にもとづいて上記のピーク強度に対して減
弱効果の補正を行つて、メタン菌又はメタン生成
活性を求めている。ここで、その測定原理的作用
について説明をするとつぎのようになる。

メタン菌は通常の微生物と異なる生理的性質を
もち、メタン菌のエネルギー代謝に関与している
電子伝達系に関してはまだその全容は不明である
が、メタン菌に固有な補酵素によるものであるこ
とが知られている。すなわち、メタン菌のエネル
ギー代謝系に存在する電子伝達系の中には、F₄₂₀
と命名される物質（補酵素）が電子キヤリアとし
て機能していることが知られており、これはメタ
ン菌に固有の物質であつて他の生物系には存在し
ていないものである。このように、メタン菌にの
み結合して電子伝達系（酸化還元系）に中心的に
係る物質（補酵素）F₄₂₀が、メタン醗酵において
有機物から生成した各種の醗酵生産物からメタン
を生成する活性に機能するものであるとされてい
る。すなわちF₄₂₀を中心としてメタン菌の電子伝
達系に関与する物質（以後F₄₂₀物質という）は生
菌（生きた状態の菌）の状態で計測可能であると
共に、他の微生物あるいは異物と異なる特異的か
つ計測可能な物理化学的性質を持つため、メタン
菌の生理的機能から直接メタン生成機能と関連し
ており、メタン菌の菌数またはメタン生成活性の
測定のための有効な計測対象となる。

実際に、特定の波長域の励起光をメタン菌に照
射すると、メタン菌のF₄₂₀物質に起因して放射す
ると考えられる螢光特性が、消化汚泥中等のメタ
ン菌以外の微生物および異物に起因する螢光特性
と、生菌の状態で異なる挙動を示すことが明らか
となつている。したがつて、メタン菌のみの標準
試料による螢光特性と、被検体のメタン醗酵槽か
らの螢光特性との比較較正から、メタン醗酵槽内
の真のメタン菌の菌数またはメタン生成活性を求
め得ることとなる。

以上はメタン菌のみに着目した測定原理である
が、メタン醗酵槽内の醗酵液等のメタン菌を有す
る被検体は、一般に他の物質の混入等によつて濁
度が高いために、原液または希釈した液であつて
も、螢光強度は濁度による減弱を受けている。こ
の対策として、励起光波長及び螢光波長における
被検体の濁度を励起光の透過光量から求めて上記
減弱効果を補正するので、被検体の濁度に影響さ
れることのないメタン菌の菌数またはメタン生成
活性の真の値が求められる。

［実施例］ 第１図はこの発明による測定方法の一実施例を
示す測定装置の模式構成ブロツク図である。図に
おいて、７はメタン醗酵槽、８はメタン醗酵槽よ
りメタン菌を含む試料を採取するサンプリング管
であり、採取された試料はポンプ９により試料調
整器１２に送液される。１０は液溜であり、試料
調整器１２に送液された試料を測定するのに適当
な被検体とするため、希釈あるいはアルカリ処理
するための溶液が溜められている。液溜１０の溶
液は計量してポンプ１１で試料調整器１２に送液
され、試料と混合される。

混合されて被検体として調整された溶液は、螢
光及び濁度を測定するための試料室１３に移され
る。次いで試料室１３の被検体に光源１５の光を
分光器１６を通して波長を測定した励起光が照射
される。被検体の濁度のため減弱した透過光は、
分光器２３を通して光電子増倍管２４で受光し、
光電流に変換されて検出器２２で測定される。ま
た分光器１６を通した励起光の照射により、被検
体のメタン菌固有の物質により放射する螢光は、
分光器２０により螢光の波長を選定し、光電子増
倍管２１で受光して光電流値に変換され、検出器
２２で測定される。次いで、検出器２２から検出
信号がマイクロプロセツサー２６に送られる。マ
イクロプロセツサー２６には、検出器２２から螢
光の値を示す検出信号を濁度の値を示す検出信号
で補正をする計算機能を有しており、濁度を補正
した螢光の強度が得られる。又マイクロプロセツ
サー２６はこのような計算機能のほかにサンプリ
ング管、送液等装置内の諸機能を自動制御する機
能をも備えている。マイクロプロセツサー２６で
処理されたデーターは出力端子２７で出力表示さ
れる。出力端子２７は、処理データー及び制御シ
ーケンスの出力表示のみならず、マイクロプロセ
ツサー２６への入力データーも出力端子２７を通
じて行なわれる。なお測定の終了した被検体は、
ポンプ１８により試料室から排液して廃液溜１９
に棄てられる。

次に、前記の測定原理に基づき、第１図の測定
装置による測定方法の具体的手順について説明す
る。

上記の原理に基づく測定方法の操作は次のよう
に行なう。試料をメタン醗酵槽７からサンプリン
グ管８で採取し試料調整器１２で所定の被検体と
なるように希釈あるいはアルカリ処理して調整
し、試料室１３の容器に入れて被検体とする。次
いで、分光器１６でF₄₂₀物質に螢光を発光させる
特定の波長の範囲の励起光を選択する。励起光の
波長として380〜440nｍの波長範囲の光を使用す
る。この選択された特定波長の励起光は試料室１
３に照射され、被検体より生ずる螢光は分光器２
０を通して光電子増倍管２１で受光され、また被
検体を透過した光は分光器２４を通して光電子増
倍管２４で受光する。螢光の強さを示す光電流及
び濁度を示す光電流は検出器２２で時系列的に測
定され、検出信号としてマイクロプロセツサー２
６に入力される。マイクロプロセツサー２６にお
いては、透過光量にもとづいて被検体の濁度によ
る螢光の強度の減弱を補正して真の螢光の強度を
演算する計算を行う。その結果は出力端子２７に
表示される。

なお、第１図の測定装置においては、分光器２
０を特定波長（螢光波長）に固定し、分光器１６
を特定波長域で走査してやればF₄₂₀物質の励起ス
ペクトルが得られる。また、分光器１６を特定波
長（励起波長）に固定し、分光器２０を特定波長
域で走査することにより、F₄₂₀物質の螢光スペク
トルが得られる。このようにすると、これらのス
ペクトルのいずれにおいてもF₄₂₀物質に起因する
スペクトル強度のピークが得られ、F₄₂₀物質の存
在量すなわち、メタン菌数またはメタン生成活性
に対応するスペクトル強度として同定することが
できる。ルーチン測定においては、励起及び螢光
スペクトルのうちのどちらかのスペクトルを測定
することで十分であることが、次図の実施例に示
すように確認されている。

第３図はメタン醗酵槽から採取した被検体のメ
タン菌を含む消化汚泥の濁度補正前後の螢光特性
を示す特性線図である。図中、実線は補正前の励
起スペクトル、一点鎖線は補正前の螢光スペクト
ルを示している。図の縦軸はスペクトル強度であ
り、横軸は励起（実線）スペクトルに対しては励
起光の波長λ_Eを、螢光（一点鎖線）スペクトルに
対しては螢光の波長λ_Fを示す。なおＡ、Ｂで示す
領域は、それぞれ励起スペクトル、螢光スペクト
ルによる補正後のスペクトル強度を示す。

第３図の実線曲線は、分光器２０を螢光波長λ_F
＝470nmの螢光のみが通過するように固定し、分
光器１６により励起波長λ_Eを350〜440nｍの範囲
内で連続走査して得られた励起スペクトルを示
す。この場合、約420nｍの位置にピーク（ａ点）
を示している。さらに、一点鎖線曲線は、分光器
１６を励起光波長λ_E＝420nｍに固定し、分光器
２０を用いて螢光波長λ_Fが380〜490nｍの波長範
囲で連続走査して求めた螢光スペクトルである。
この場合、約470nｍの螢光波長λ_Fでピーク（ｂ
点）を示している。ａ点とｂ点のスペクトル強度
がほぼ一致することは、両スペクトル最大値を互
にパラメータとして２つのスペクトルを求めたこ
とから当然の結果である。しかしこの特性は、は
じめにλ_Fを任意に設定して励起スペクトルを求め
たのち、この励起スペクトルのピークを示すλ_Eを
一定として螢光スペクトルを求め、もう一度、螢
光スペクトルの最大値を示すλ_Fを一定として励起
スペクトルを求める操作により簡単に第３図の螢
光特性が求められる。

一旦、第３図の特性が得られると、メタン菌を
測定対象とする未知の被検体に対しては、λ_F＝
470nｍ一定で励起スペクトルの最大値を求める
か、λ_E＝420nｍ一定で螢光スペクトルの最大値
を求めることのいずれか、又は両方（確認のた
め）のスペクトルを求めることで、メタン菌に対
する各スペクトルの補正前の最大値（ａ、ｂ）が
容易に求められる。なお、試料調整器１２におい
て処理されるアルカリ溶液の濃度等により各スペ
クトルの最大値（ａ、ｂ）が左右にシフトするた
め、予め最大値の波長が特定できない場合、この
ような方法により最大値を示す波長を求めること
ができる。

濁度補正は、上記のスペクトル測定と同時に、
分光器２３と光電子増倍管２４によつて透過光量
を時系列的に求め、その減少度から濁度の補正率
を求め検出器２２、マイクロプロセツサー２６に
よつて、ａ、ｂ点の補正を行い、それぞれ第３図
に示す補正後の強度Ａ、Ｂを得ることができる。
なお、第３図におけるピーク（ａ、ｂ点）は、試
料調整器１２において処理されるアルカリ溶液の
濃度等によりシフトするものであり、励起光の波
長範囲が380〜440nｍ、放射螢光の波長範囲が
450〜490nｍであれば、メタン菌の菌数またはメ
タン生成活性を測定することが可能である。

そして、これらのスペクトルからメタン菌及び
メタンの生成活性を同定する。同定するにはあら
かじめ螢光スペクトルの強度のピーク及びスペク
トルの強度の変化に対応したメタン菌の菌数ある
いはメタン生成活性が既知である必要がある。そ
こで標準試料としてのメタン菌について、それら
の関係を求める測定をしておく。それにはメタン
醗酵槽の消化汚泥からメタン菌を単離する。その
単離したメタン菌、例えばメタノザルチナ バル
ケリ（Methanosarcina barkeri）を他の生体物
質を含まない培地に懸濁し、そのメタン菌を標準
試料として励起光の波長を変化した場合の螢光ス
ペクトルの強度のピークが表われる点を求め、前
記の濁度補正によつて補正後の螢光強度を算出す
る。一方、この培地上に生育するメタン菌のコロ
ニーを数えることによりメタン菌の菌数を求める
ことができ、また、このメタン菌が発生するメタ
ン量を測定することにより標準試料におけるメタ
ン発生量を求めることができる。その結果螢光ス
ペクトルとメタン菌数及びメタン生成活性との相
関関係が明らかとなる。第４図、第５図はそのよ
うにして求められた相関関係の一例を示す校正線
図であり、励起光の波長を420nｍとした場合の
螢光スペクトルの強度と、メタン菌数およびメタ
ン発生量の関係を示したものである。第４図の横
軸は螢光スペクトル強度、縦軸はメタン菌数であ
り、第５図の横軸は第４図と同じであるが、縦軸
はメタン（ガス）の発生量を示す。いずれの校正
曲線もよい直線性が得られ、十分に使用可能であ
ることが認められる。

本発明の測定方法を実施する装置を第１図に示
したが、励起光を照射する光源１５に印加される
電圧または光電子増培管２１，２４に導入される
光の強度に応じて印加する電圧を変化させ、光電
子増培管２０，２４に流れる光電流値をその光電
子増培管２１，２４に適した範囲内に保つと共
に、放射する螢光の強度または各印加電圧に対す
る光電流値を一定螢光強度または一定印加電圧に
対する光電流値に換算するという動作を、システ
ムコントローラーにより自動的に行うこともでき
る。また、メタン醗酵槽７に直接に検出子を導入
して、別々に螢光及び濁度を検出しても同様に本
発明の目的を達成できる。

なお、被検体について下水道処理システムなど
のメタン醗酵槽における他の微生物群及び異物の
共存する系について説明したが、それ以外の微生
物群及び異物が共存しても同様にして測定するこ
とができる。

［発明の効果］ この発明は以上説明したとおり、メタン菌に他
のどのような微生物および異物が共存していて
も、濁度の影響を受けることなくメタン菌の菌数
またはメタン生成活性を測定することが可能とな
る。そのためメタン醗酵槽が効率よく運転でき、
下水道処理システム等メタン醗酵槽を有するプロ
セスの運転及び管理システムの最適化を容易に達
成しうる効果がある。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の測定方法の一実施例を示す
測定装置の模式構成ブロツク図、第２図は従来の
測定方法を説明する装置系を含む要部ブロツク
図、第３図はこの発明によるメタン醗酵槽から採
取した被検体のメタン菌を含む消化汚泥の濁度補
正前後の螢光特性を示す特性図、第４図はメタン
菌数と螢光スペクトル強度との関係を示す校正線
図、第５図はメタン発生量と螢光スペクトル強度
との関係を示す校正線図である。 図において、７はメタン醗酵槽、８はサンプリ
ング管、９はポンプ、１０は液溜、１１はポン
プ、１２は試料調整器、１３は試料室、１４は電
源、１５は光源、１６は分光器、１７は排液管、
１８はポンプ、１９は廃液溜、２０は分光器、２
１は光電子増培管、２２は検出器、２３は分光
器、２４は光電子増培管、２５は電源、２６はマ
イクロプロセツサー、２７は出力端子である。
なお、図中同一符号は同一または相当部分を示
す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ (a) 希釈あるいはアルカリ処理した、メタン
   菌を有する被検体に励起光をその波長を変化さ
   せて照射し、 (b) 上記被検体が放射する放射螢光を測定して、
   該放射螢光が、励起光の波長範囲380〜440nm
   において、ピーク強度を示す励起光の波長を検
   出し、 (c) 次いで、該波長の励起光を上記被検体に照射
   して、上記被検体が放射する波長範囲450〜
   490nmにおける放射螢光のピーク強度を測定す
   るとともに、 (d) 上記励起光が上記被検体を通過する透過光量
   を測定し、 (e) 該透過光量に基づいて上記放射螢光のピーク
   強度に対して上記被検体の存在に由来する減弱
   効果の補正を行い、 (f) 上記メタン菌が放射する真の螢光強度を求め
   る ことを特徴とするメタン菌の菌数またはメタン生
   成活性の測定方法。