JPH06239894A - 新規な非ａ非ｂ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチド及び診断方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 新規な非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原ポリペプ
チド、該抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ド、及びそれらを用いた非Ａ非Ｂ型肝炎の診断方法 【効果】 従来の検査法では検出不可能だった新規な非
Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスに対する抗体の検出に有用であ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は，新規な非Ａ非Ｂ型肝炎
ウイルス抗原およびそれをコードするポリヌクレオチド
に関する。詳しくは，本発明は既存のＨＣＶ抗原と反応
しない非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清と特異的に抗原抗体反応
を示す新規な抗原ポリペプチド並びに該抗原ポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチド，及びそれらを用いた
非Ａ非Ｂ型肝炎の診断法に関する。

【０００２】

【従来の技術】非Ａ非Ｂ型肝炎とは，伝搬性のウイルス
により惹起されると考えられているウイルス性肝炎の
内，実体の明らかにされているＡ型肝炎ウイルス（HA
V），Ｂ型肝炎ウイルス（HBV），Ｄ型肝炎ウイルス（HD
V），あるいは肝細胞にも感染して症状を呈するサイト
メガロウイルス（CMV），エプスタイン・バーウイルス
（EBV），アデノウイルス等をその病因とする肝炎を，
ウイルス学的・血清学的に除外したものである。疫学的
証拠によれば非Ａ非Ｂ型肝炎には次の３つの型があると
示唆されている。即ち開発途上国で流行する水系伝染
型，輸血後（または注射針事故）型及び先進国諸国でみ
られる散発性（集団獲得）型である。水系伝染型は他の
２つの型とは異なるウイルスに起因すると考えられてい
たが，近年その主要な原因ウイルス（Ｅ型肝炎ウイル
ス）の遺伝子断片が，ゲンラボ(Genelabs)社（米国）と
米国CDC のグループにより単離された［国際公開第89/1
2462,89/12641号パンフレット(1990), Reyes,G.R.,et a
l.Science 247,1335(1990)］。本明細書においては特に
断わらない限り ”非Ａ非Ｂ型肝炎”とはこの水系伝染
型は含めず残りの輸血後型および散発性型により生じる
ものを意味する。

【０００３】厚生省の推計(1988年)によれば輸血後急性
肝炎の９割以上が，また散発性急性肝炎の約５割が非Ａ
非Ｂ型肝炎と推計されているが，こうして起こった肝炎
の，およそ半数が慢性肝炎に進み，10〜20 % は肝硬変
へと進行する。そして更には肝癌へと進んでいく過程に
おいても，非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの持続感染および/
またはそれに伴なう慢性炎症が関係していると考えられ
る。従って，非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの予防及び治療法
を確立することは医療上の緊急の要請であった。

【０００４】こうした非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの同定は
長年の努力にも関わらず困難を極めていたが，１９８９
年に入り２つのグループがその非Ａ非Ｂ型肝炎特異抗原
遺伝子の単離を報告した。一つはカイロン社（米国）の
グループによるものであり［Choo,Q-L.,et al.Science
244,359(1989), Kuo,G.,et al. Science244,362(1989),
特表平 2-500880号公報,欧州特許出願公開第318216号明
細書(1989),同第388232号明細書(1990)］，もう一つは
岡山大学（現 鹿児島大学）の有馬らのグループによる
ものである［Arima,T.,et al. Gastroenterologia Japo
nica 24,685(1989),Arima,T.,et al. Gastroenterologi
a Japonica 25,218(1990),欧州特許出願公開第363025号
明細書(1990)］。これらの遺伝子がコードする抗原（Ｃ
１００抗原，クローン１４抗原）はともに輸血後非Ａ非
Ｂ型慢性肝炎患者血清および散発性非Ａ非Ｂ型慢性肝炎
患者血清の６−８割と特異的に反応し，非Ａ非Ｂ型慢性
肝炎患者の診断に有用であることがしめされている。カ
イロン社のグループはこの遺伝子をコードするウイルス
をＣ型肝炎ウイルス（HCV）と命名した。しかしなが
ら，いまだ感染性ウイルス粒子や感染性ウイルスゲノム
の単離はなされておらず，非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスとし
ての病原性を証明するには至っていない。その後も，Ｈ
ＣＶcore抗原［下遠野邦忠，第３８回日本ウイルス学
会，演題１１２番］，そのエピトープを含むペプチド断
片ＣＰ９，ＣＰ１０［Okamoto,H.,et al., Japan J.Ex
p.Med.60,223(1990)］および細胞遺伝子由来の非Ａ非Ｂ
型肝炎関連抗原ＧＯＲ［赤羽賢浩ら，基礎と臨床 24,70
21(1990)］などが診断に応用されているが，これらの場
合も非Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者血清における検出率は７−
８割であり，既存の抗原では検出できない非Ａ非Ｂ型肝
炎の存在が知られている。また，こうした非Ａ非Ｂ型肝
炎ウイルスの存在は既存の抗原では健康人ＨＣＶキャリ
アーを完全に補足出来ないことを示唆する。実際，既存
の抗原を使用した供血液スクリーニングでは輸血後非Ａ
非Ｂ型慢性肝炎の発症率５０％前後しか減少しないと考
えられている［片山透，化学と生物 28,217(1990) ,Est
eban,J.I. et al.,N Engl J Med.,323,1107(1990)］。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】こうした既存の抗原で
検出できない非Ａ非Ｂ型肝炎が存在することの原因が， １）．ＨＣＶの多様性に由来するものか（ＨＣＶはきわ
めて変異に富むウイルスであることが知られているが
［Enomoto,N.,et al.,BBRC 170,1021(1990), 金子周一
ら,肝臓31 suppl.213(1990),加藤宣之ら,肝臓 31 supp
l.214(1990)］，これら全てのウイルスが共通のエピト
ープを有しているかどうかは定かではない。） ２）．同様の病態を惹起する別のウイルスが存在するの
か，３）．検査法の不正確さによるものなのかなどにつ
いては十分わかっていない。

【０００６】このように非Ａ非Ｂ型肝炎に対応した信頼
性の高い診断法及び治療用手段の開発に有用な抗原の固
定に関する研究は，現在もなお十分には完成されていな
い。本発明者らは，非Ａ非Ｂ型肝炎の１００％確実な診
断法，予防法をめざし従来の抗原では検出できなかった
非Ａ非Ｂ型肝炎患者を診断できる新規抗原を発見すべく
鋭意研究した。その結果，日本人ヒト血漿より新規な非
Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原の遺伝子を取得した。その遺
伝子の塩基配列を決定したところ，従来報告されている
ＨＣＶの塩基配列（公報,欧州特許出願公開第388232号
明細書(1990)第17図に示される塩基配列の5725番目から
6239番目）とホモロジーを有する新規な非Ａ非Ｂ型肝炎
ウイルスに由来する抗原であることを知り本発明を完成
した。

【０００７】

【課題を解決するための手段】

定義 本願で用いる「ポリヌクレオチド」とは，任意の長さを
持ったヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシ
リボヌクレオチド）のポリマーを意味する。又，この用
語には１本鎖および２本鎖の両方の形態が含まれる。
「エピトープ」という用語は，ポリペプチドの抗原決定
基を意味する。エピトープは，エピトープに特有のコン
ホメーション内に位置する３個のアミノ酸でも形成され
うるが，一般には少なくとも５〜１０個のアミノ酸から
成る。「非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗原」とは，本発明の抗原
以外の非Ａ非Ｂ型肝炎を診断できる抗原を意味し，ウイ
ルスゲノム由来および細胞遺伝子由来の双方の抗原が含
まれる（たとえば，Ｙ１９抗原，Ｙ２２抗原，Ｃ１００
抗原，Ｃｏｒｅ抗原，クローン１４抗原，ＧＯＲ抗原な
ど）。「非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原」とは，非Ａ非Ｂ
型肝炎関連抗原の内該ウイルスゲノム由来のものを意味
する。

【０００８】本発明の実施においては，特に指示されな
い限り，当該分野で公知である分子生物学，微生物学，
遺伝子工学，および免疫学の従来の手法が採用される。
このような手法は，以下の実験書を参照されたい。 実験書１：Sambrook.J., Fritsch,E.F.,および Maniati
s,T. Molecular Cloning2nd Ed.; Cold Spring Harbor
(1989) 実験書２： DNA cloning １巻（Glover, D.M. 編）IRL
Press. (1985) 実験書３： DNA Cloning ３巻（Glover, D.M. 編）IRL
Press. (1987) 実験書４： Handbook of experimental immunology, 4t
h ed. 1〜IV 巻(Weir, D.M. 編),Black-well (1986) 実験書５：Current Protocols in Molecular Biology(A
usubel,F.M. et al.,編)John Wiley & Sons (1988) 実験書６： Method in Enzymology 185巻（Goedd-el,D.
V.編）Academic Press（1990）

【０００９】（１）ウイルスＲＮＡの調製 a)患者血ウイルスからＲＮＡ の調製 HBs 抗原陰性，HBV-DNA 陰性，高 ALT（GPT）活性値(>3
5IU/l)を示すヒト血漿または非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清を
プールし，ウイルスRNA調製のための出発材料とする。
ウイルス粒子はポリエチレングリコール沈澱法により沈
澱物として濃縮・回収し，沈澱物からのRNAの抽出はグ
アニジン・チオシアネート法等の方法［Chomczynski,P.
and Sacchi,N.: Analytical Biochemistry 162, 159 (1
987)］により行なわれる。また，ヒト血漿また血清の代
わりに非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたチンパンジ
ー血清を用いることもできるが，一般にウイルスを異種
動物で継代した場合にウイルス遺伝子に変異が生じた
り，時には病原性が変化したりする場合もあるので，該
抗原をクローニングする場合にはヒト血漿また血清を出
発材料にするのが好ましい。

【００１０】b)患者肝組織からの RNA の調製 過去に非Ａ非Ｂ型肝炎に感染したことがあると考えられ
る肝臓がん患者より切除された肝組織より常法［実験書
１,７章］によりRNAを調製することができる。 (2) cDNA ライブラリ−の構築 得られた RNA を鋳型とし，ランダムヘキサマーをプラ
イマーとして Gubler-Hoffman法［Gene,25,263(1983)］
により二本鎖 cDNA を合成する。該 cDNA は常法により
λgt11ファージベクターに挿入される。λgt11は特定の
抗体に対応する抗原の遺伝子を単離するために開発され
たベクターであり公知である［Young,R.A. and Davis,
R.W., Proc.Natl.Acad.Sci.USA80,1194(1983)，実験書
２,p49-78 ］。またλgt11以外にλZAP,λZAPII,pUC19,
pUEX1などのベクタ−を使用してもよい。。

【００１１】(3)患者血清による cDNA ライブラリーの
イムノスクリーニング 組換え体λgt11は，宿主の大腸菌（例えば Y1090株な
ど）に感染させるが，一定の条件下でバクテリオファー
ジの増殖機構に従って増殖し，これに伴って，先に組み
込まれたcDNAも増幅される。増殖したバクテリオファー
ジは一定の条件下で，宿主大腸菌を溶菌し，肉眼的に認
識できるプラークを形成する。λgt11 ファージベクタ
ーに挿入された cDNA は，β-ガラクトシダーゼ(β-ga
l)との融合ポリペプチドとして発現されるため，特定の
抗原に対して生じた特異的な抗血清で多数の組換え体λ
gtllをスクリーニングすれば，特定の抗原ポリペプチド
をコードするcDNA を免疫化学的方法によって同定する
ことができる。本発明においては，上記(2)で作製した
cDNAライブラリーを，種々の非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清ま
たはそのプール血清でスクリーニングする事が望まし
い。具体的には，プラークを形成している培養シャーレ
等から発現された融合抗原蛋白をニトロセルロース膜に
トランスファ−し，上述の患者血清を 1 次抗体として
反応させ，これにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗（ヒト I
gG）IgG 等を２次抗体として反応させ，発色反応陽性と
なるプラークを単離する。

【００１２】(4)cDNA 配列の決定 こうして得られた本発明の抗原遺伝子の塩基配列は，組
換え体λgt11DNA上，およびサブクローニング後のプラ
スミドベクター DNA上でサンガー法［Sanger,F.,et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,74,5463(1977),実験書１,
１３章］を応用した市販のシークエンスキットを用いて
決定することが出来る。 (5)抗原遺伝子の塩基配列を利用した患者血清中の該ウ
イルスゲノムの検出法本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス
ポリヌクレオチドの相補鎖に由来する連続した８塩基ま
たはそれ以上の長さからなるポリヌクレオチドは，本発
明のウイルスゲノムとハイブリダイズし，血清や組織中
の該ウイルスの検出に用いるプローブとして有用であ
る。これらのポリヌクレオチドはホスホアミダイト法
［Hunkapiller, M. etal. Nature 310,105-111(1984)］
等の合成法，或は市販の DNA 合成機（例えば，アプラ
イドバイオシステムズ(ABI), 380A型 DNA 合成機など）
を用いて合成する事が出来る。また，本発明の非Ａ非Ｂ
型肝炎ウイルスポリヌクレオチドを鋳型にしてニックト
ランスレーション法，ランダムプライマーラベリング法
などを行い合成することも出来る。該ポリヌクレオチド
を診断に利用する際には，常法により，放射性プロー
ブ，ビオチン蛍光プローブ，及び化学発光プローブ等の
標識プローブとして用いることができるが，上述のハイ
ブリダイゼーション法，標識法，およびシグナルの増
幅，検出方法はいずれも公知であり，高橋豊三,ＤＮＡ
プローブＩＩ,シーエムシー (1990) を参照し実施する
ことができる。

【００１３】これまで非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスは患者血
清中に極微量にしか存在しない事（Ｂ型肝炎ウイルスの
場合の1/10⁵程度）が知られている。この様な場合に
は，本発明の塩基配列の一部を利用して１対，または２
対以上のＰＣＲ用プライマー対を合成し逆転写-PCR法
［Kawasaki,E.S.,et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,
5698(1988),Garson,J.A. et al.,Lancet,335,1419(199
0), Enomoto,N.,et al.,BBRC,170,1021(1990), Okamot
o,H.,et al.,Japan J.Exp.Med.,60,215(1990)］を行な
うことにより目的ウイルスゲノムを増幅後，検出する事
も出来る。 (6)非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチド及び融合
抗原ポリペプチドの調製 a)遺伝子組換え技術を用いた組換え抗原ポリペプチド及
び組換え融合抗原ポリペプチドの発現：

【００１４】該抗原ポリペプチドおよびそのエピトープ
を構成するポリペプチドおよびそれらの配列をふくむ融
合抗原ポリペプチドは公知の発現ベクターを用いて発現
できる。例えば，大腸菌での発現は実験書１の１７章，
実験書３,p59-88，実験書６,p11-128,Tabor,S. and Ric
hardson,C.C., P.N.A.S. 82,1074(1985)などを参考に行
なうことができる。本発明のポリペプチドを大腸菌で発
現する場合に，Ｎ末に開始コドンに由来するMetが付加
される。また，発現ベクターを構築する際に，使用する
制限酵素部位によっては，ベクターに由来するアミノ酸
が該ポリペプチドのＮ末に付加することがある（たとえ
ばMet Ala）。いずれの場合も，付加に伴う非Ａ非Ｂ型
患者抗体への反応性が変化しない限り，本発明の非Ａ非
Ｂ型肝炎ウイルス抗原に含まれる。また，酵母での発現
は実験書３,p141-161，実験書６,p231-484，また，ほ乳
動物細胞を宿主とした場合の発現方法は実験書１の１６
章，実験書３,p163-212，実験書６,p485-598などを参考
に実施することが出来る。発現した組換え抗原ポリペプ
チドは，溶解した細胞あるいは培地から当該分野では公
知の蛋白精製の手法（限外濾過，遠心分離，透析，イオ
ン交換クロマトグラフィー，疎水クロマトグラフィー，
ゲル濾過，電気泳動，アフィニティークロマトグラフィ
ー，ＨＰＬＣ等;たとえば Methods in Enzymology 182
巻(Deutscher,M.P.編) AcademicPress(1990)等を参照）
を利用することにより精製することができる。また，融
合抗原ポリペプチドの簡便な発現方法としては，例えば
本発明の組換え体λgt11クローンY30が溶原化した大腸
菌Y1089株をIPTG（isopropylthio-β-galactoside)を加
え誘導する方法である［実験書２,p76-77］。発現した
融合抗原ポリペプチドは，ゲルろ過および/またはβ-ga
lに対するマウスモノクローナル抗体（ベーリンガーマ
ンハイム,1083104）を用いた免疫沈降法またはアフィニ
ティークロマトグラフィー，および上述の手法用いて精
製できる。

【００１５】b)ペプチド合成による該抗原ポリペプチド
の調製： 該抗原ポリペプチドは，本発明で決定したアミノ酸配列
をもとに化学合成によっても供給されうる。好ましく
は，全配列を合成が比較的容易な長さの断片（10〜50残
基）に，しかも隣り合う断片同士が5〜10残基程度重複
するよう分割して合成しそのすべてを混合して使用して
もよい。さらに好ましくは，エピトープマッピングによ
りエピトープが１つまたは複数に特定されれば，その断
片を単独または複数混合して使用するのがよい。該抗原
ポリペプチドのアミノ酸配列を含む各種ポリペプチドは
液相法あるいは固相法により手動で，または自動合成装
置（例えばＡＢＩ社の430A型ペプチド合成機）により化
学合成することができる。t-Boc法またはFmoc法に従い
固相法により合成したポリペプチドは樹脂よりトリフル
オロメタンスルホン酸，フッ化水素，またはトリフルオ
ロ酢酸などを用いて切り出される。これらの合成ペプチ
ドは，精製度を高めるために，分取用逆相高性能液体ク
ロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ）によって精製するのが好
ましい。

【００１６】(7)イムノアッセイによる患者血清中のウ
イルス抗体の検出法 本発明によって得られた非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原ポ
リペプチド，またはそのエピトープを含む抗原ポリペプ
チドは，イムノアッセイを用いて，例えば，血液，血
漿，血清，髄液などの体液試料およびヒト免疫グロブリ
ン製剤などを含む生物学的試料に於ける非Ａ非Ｂ型肝炎
ウイルス抗体の存在を検出するために使用することがで
きる。イムノアッセイでは上記抗原ポリペプチドと試料
中の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗体との間で免疫学的結合
体（抗原抗体結合物）を形成し得る条件下で該抗原ポリ
ペプチドを試料と接触させる。抗原抗体結合物がたとえ
わずかでも形成されるのであれば，試料中に非Ａ非Ｂ型
肝炎ウイルス抗体が存在することが分かり，適当な手段
によって検出・測定できる。そのような検出方法とし
て，免疫沈澱法，凝集法，ラジオイムノアッセイ(RIA),
EIA,ELISA,ウエスタンブロットアッセイあるいはバイン
ディングイムノアッセイなどがある。さらに該抗原ポリ
ペプチドを用いるアッセイプロトコールは競合的または
非競合的結合方法によってもできる。

【００１７】最も簡便な方法としては，例えば本発明に
より得られた抗原を例えば β-galとの融合蛋白として
発現させ，ニトロセルロース膜にブロットしたものを固
相に固定した抗原とし，ELISA法により非Ａ非Ｂ型肝炎
ウイルス抗体を検出する方法（イムノプラークアッセ
イ，ウエスタンブロットアッセイなど）である（実施例
４）。該抗原ポリペプチドはアッセイ方法に応じて標識
物でラベルしてもよい。ポリペプチドに結合するラベル
は公知の物を用いる事ができ，例えば，蛍光分子，発光
色素分子，放射性分子，酵素，コファクター，ビオチン
・アビジン，金コロイド，磁性粒子などがある。又，本
発明の抗原ポリペプチドを化学修飾すれば，公知手段に
よって，キャリアタンパクやキャリアポリペプチドある
いは公知の支持体に結合することができる。この様な支
持体としては，例えばポリスチレンやポリビニル製のマ
イクロタイタープレートやビーズ，ガラス管やガラスビ
ーズ，また紙，セルロース，セルロース誘導体やシリカ
のようなクロマトグラフィー用支持体も用いることがで
きる。これらアッセイ法のうち，特に患者血清や血液あ
るいは血液製剤などを大規模スクリーニングするには，
ELISA，凝集法またはウエスタンブロットアッセイなど
が好適である。

【００１８】

【発明の効果】本発明の抗原ポリペプチドは，従来の抗
原を利用した検査法では検出不可能だった新規な非Ａ非
Ｂ型肝炎ウイルスに対する抗体の検出に有用である。す
なわち該抗原ポリペプチドは，既存の抗原では診断でき
なかった非Ａ非Ｂ型肝炎関連疾患の診断に有用であり，
治療方針の決定及び疫学調査に役立つ。また，該抗原ポ
リペプチドは既存の抗原では検出できなかった非Ａ非Ｂ
型肝炎ウイルスの健常人キャリアーの補足が可能であ
り，供血液のスクリーニングに有用である。また，本発
明の抗原ポリペプチドにさらに非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗原
ポリペプチドを混ぜ合わせた混合抗原と生物学的試料中
に存在する非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗体との反応で形成
される免疫学的結合物を測定して，生物学的試料中の非
Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗体の存在を確認する非Ａ非Ｂ型
肝炎ウイルス抗体を検出することができる。

【００１９】また，免疫学的結合物を測定する方法がＥ
ＬＩＳＡ法により非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗体を検出す
ることができる。また，抗原ポリペプチドＹ３０群の抗
体の存在を分析するためのキットであって，適当な容器
内に，抗原ポリペプチドＹ３０群またはＹ３０群に含ま
れる抗原ポリペプチドのエピトープと免疫学的に同一と
みなしうるエピトープを有する抗原ポリペプチドを有す
るキットを作成することができる。また，本発明のポリ
ヌクレオチドプローブを用いて，非Ａ非Ｂ型肝炎ウイル
スに由来するポリヌクレオチドをハイブリダイジェイシ
ョン法にて検出することができる。また，本発明のポリ
ヌクレオチドプライマー対を用いて，非Ａ非Ｂ型肝炎ウ
イルスに由来するポリヌクレオチドを逆転写−ＰＣＲ法
にて検出することができる。また，該抗原ポリペプチド
を用いて，該ウイルス抗原の検出及び非A非B型肝炎の治
療に利用し得るポリクローナル抗体及びモノクローナル
抗体を作成することができる。また，該抗原ポリペプチ
ドはウイルスの感染予防及び感染後の治療のためのワク
チンの製造に利用できる。本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイ
ルスポリヌクレオチドは，該抗原を製造するための遺伝
子として有用であり，また，従来の検出法を用いた検出
感度では測定不可能なウイルスゲノム（粒子）の検出に
利用することができる。

【００２０】

【実施例】以下に実施例をあげて，本発明を更に具体的
に説明するが，これらは本発明の範囲を制限するもので
はない。 実施例１： cDNA 作成のための血漿 RNA の抽出 ALT 活性値が異常高値 (>70IU/l) で HBs 抗原および H
BV-DNA が陰性を示す凍結血漿 2000 ml を室温で融解し
たのち，5000rpm(日立,RPR9-2 ローター),20分4゜C で
遠心しフィブリンを除去した。上清に 80g のポリエチ
レングリコール4000 を加え溶解した。30 分間氷冷した
のち同じ条件で遠心し，沈澱物を回収した。沈澱物から
のRNAの抽出は，グアニジン・チオシアネートを用いた
AGPC法［Chomczynski, P. および Sacchi,N.: Analytic
al Biochemistry,162,156(1987)］に準じた。すなわち
沈澱物を２倍量（沈澱物1g を 1 mlと換算）の溶液 6D
(6M グアニジン・チオシアネート，25mM クエン酸ナトリ
ウム ，pH7.0 , 0.5% サルコシール, 0.1M 2-メルカプ
トエタノール）に溶解後，0.1 容量の 2M 酢酸ナトリウ
ム(pH4.0) を加え，次に等容量のフェノール，0.2 容量
のクロロホルム：イソアミルアルコール混液 (49:1) で
抽出を行った。15分間氷冷後，遠心し上層を分取し，等
量の 2-プロパノールを加え，RNA を沈澱させた。遠心
後，沈澱物を 0.5ml の溶液 4D ( 4M グアニジン・チオ
シアネート，25mM クエン酸ナトリウム pH7.0 ; 0.5%サ
ルコシール, 0.1M 2-メルカプトエタノール）で溶解
後，2倍容量のエタノールを添加し，再度 RNA を沈澱さ
せた。遠心後沈澱物を 75% エタノールで洗浄し，乾燥
させた。沈澱物は， 50μlの滅菌蒸留水に溶解し，RNA
溶液とした。

【００２１】実施例２： cDNA ライブラリーの作成 10μlのRNA 溶液 を出発材料に cDNA 合成を行った。RN
A から ２本鎖 cDNAの作成は，市販の cDNA 合成システ
ム・プラス（アマシャム, RPN- 1256Z) を用いて行っ
た。 RNA から１本鎖 cDNA の変換率は 約２％，１本鎖
cDNA から２本鎖cDNAへの変換率は，約100% であっ
た。合成した２本鎖 cDNA は，エタノール沈澱を行った
のち 100μl の TE 溶液 (10mM Tris-Cl, pH8.0 1mM ED
TA) に溶解した。次に市販の cDNA 合成キット（ファル
マシア LKB, 27-9260-01) を用いて以下の反応を行っ
た。cDNA 溶液をキットに付属しているSephacryl S-300
スパンカラムを通すことにより，1×T4 リガーゼ溶液
にバッファー交換を行った。次に，説明書に準じ EcoRI
アダプターの付加反応と T4 キナーゼ反応を行った。c
DNA に結合しなかったアダプターは，SephacrylS-300
スパンカラムを用いて除去した。溶出液中の cDNA は，
5μg のキャリアー tRNA とともにエタノール沈澱を行
った。沈澱物は 75% エタノールで洗浄したのち風乾し
た。次に 市販の cDNA クローニングシステムλgt11・
アダプター法（アマシャム,RPN 1280) を用いて以下の
反応を行った。沈澱物に 5μl の滅菌蒸留水 ,4μl(2μ
g) の λgt11 EcoRI アーム，1μl の L/K バッファー
を加えて溶解したのち，1μl (2.5U) の T4リガーゼを
加え1，5℃ で一晩放置した。次に，GIGAPACKＩＩ Gold
λDNA パッケージングキット(Stratagene,200216)を用
いて上記反応物（組み換えλgt11 DNA が含まれる）の
in vitro パッケージング反応を行いc,DNAライブラリー
(Lot.B) を作成した。

【００２２】実施例３： 非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原
遺伝子のイムノスクリーニングによるクローニング cDNA ライブラリー (Lot.B) 中のプラークと１次抗体お
よび２次抗体との反応は，市販のスーパースクリーン・
イムノスクリーニングシステム（アマシャム,RPN 1281
Z) の方法に準じて行った。スクリーニングに使用した
１次抗体は，非Ａ非Ｂ型肝炎患者のプール血清（５名の
急性肝炎回復期と５名の慢性肝炎）を，大腸菌ライゼー
ト（バイオ・ラッド, 17-3205) で吸収 (2mg ライゼー
ト／ml 血清）したものを溶液Ａ(10mM Tris-Cl, pH7.5
150mM NaCl, 2% (W/V) BSA) で 20倍希釈して使用し
た。２次抗体には，パーオキシダーゼ標識したヤギ抗
（ヒト IgG）IgG (カッペル, 3201-0081) を500 倍希釈
して使用した。発色反応は市販のラムダ・リフト検出キ
ット GAR-HRP (バイオ・ラッド, 17-3556) を用いて行
った。約500,000 個のプラークより１０ケの陽性プラー
ク（ニトロセルロースフィルター上で青紫色に発色）を
単離した。その中の１クローンをY30と命名し，以下の
解析を続けた。

【００２３】実施例４： クローンY30の抗原特異性試験 a) イムノプラークアッセイ Y30クロ−ンと陰性クロ−ン（λgt11親株）を 2:8 の割
合で混合したものをプレーティングし，上述のイムノス
クリーニングの方法を用いて，Ｃ１００抗体，Ｙ１９抗
体［ＨＣＶ ＮＳ３由来のＹ１９抗原（特願平２−１９
５７３５，平成２年７月２４日出願）に対する抗体］，
ＣＰ９＋ＣＰ１０抗体のいずれもが陰性の非Ａ非Ｂ型慢
性肝炎患者血清（５名），非Ａ非Ｂ型肝硬変患者血清
（５名）および健常人コントロール血清（６名）との反
応性を調べた。その結果，クローンY30は，既存のＨＣ
Ｖ抗原では反応しなかった非Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者血清
および肝硬変患者血清と特異的に反応することが示され
た（表１）。すなわち，クローンY30は既存のＨＣＶ抗
原が反応しない非Ａ非Ｂ型肝炎患者由来の血清により免
疫学的に認識される抗原をコードしていることが確認さ
れた。

【００２４】 表１ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Ｎ 陽性率 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 非Ａ非Ｂ型慢性肝炎 ５ ３／５ 非Ａ非Ｂ型肝硬変 ５ ４／５ 健常人コントロール ６ ０／６ ＡＬＴ高値供血液 ２０ ６／２０ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−

【００２５】更に，クローンY30は，ＡＬＴ異常高値
（３５ＩＵ／Ｌ以上）の供血液の中で，Ｃ１００抗体，
Ｙ１９抗体，ＣＰ９＋ＣＰ１０抗体の全てが陰性の検体
２０例中６例と反応した。

【００２６】実施例５： クローンY30由来の cDNA の塩
基配列および該配列内にコードされる抗原ポリペプチド
配列の決定 クローンY30を実験書１の 2.118 記載のプレートライゼ
ート法により増殖させたのちファージ DNA を調製し
た。5μg のファ−ジ DNA を EcoRI消化後，フェノール
抽出を行い次にエタノール沈澱を行なった。3μg の Ec
oRI 消化物をアルカリホスファターゼ処理した後，T4
キナーゼと γ³²P-ATP を用いて5′末端ラベルを行っ
た。フェノール抽出とエタノール沈澱によりDNA 断片を
精製した後，5.0%ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行
いオートラジオグラフィーにより EcoRI 消化により切
り出された cDNA の長さを調べた。その結果 cDNA のサ
イズは約510基対であることが判った。次に前述の EcoR
I 消化物と EcoRI 消化後脱リン酸化した pTZ19（ファ
ルマシア LKB, 27-4986-01) とで T4リガーゼ反応を行
った。反応液を大腸菌JM109 (宝酒造, 9052) にトラン
スフェクシヨンし，約510 塩基のインサートをもつプラ
スミドを単離した (pTZ19-Y30と命名) pTZ19-Y30 を導
入した菌株は微工研条寄第３８１８号として寄託されて
いる。

【００２７】このpTZ19-Y30に組み込まれた cDNA の塩
基配列は，7-deaza Sequenase Version2.0 Kit （東洋
紡 US70777）を用いてシークエンス反応を行い決定し
た。決定にはM13 プライマー M4 (宝酒造,3832)，M13
プライマー RV (宝酒造, 3830)，および４種の合成プラ
イマーを用いて両方鎖を読み，決定した。 。また，決
定した配列のいずれの鎖が組換えλgt11 上で β-gal
蛋白と融合蛋白を形成するのに関与していたかを確認す
るため λgt11 EcoRI 部位プライマー正向，逆向(New E
ngland Biolabs,1218,1222) を用いてファージDNA を直
接鋳型に用いて塩基配列決定を行った。これらの結果に
基づき，非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清に特異的に反応する抗
原をコードする塩基配列および抗原のアミノ酸配列をつ
ぎのように決定した。

【００２８】 塩基配列： GGAGAGGGGGCGGTCCAGTGGATGAACAGACTGATCGCCTTTGCCTCCAGAGGAAACCATGTTGCACCTAC CCACTACGTGGCGGAATCTGATGCTTCGCTGCGCGTAACGCAGATTCTAAGTTCACTCACAATTACCAGCT TACTTAGGAGGCTACATGCCTGGATCACTGAAGATTGCCCAGTCCCATGTTCGGGGTCTTGGCTCCAGGAC ATTTGGGATTGGGTTTGTTCCATTCTCACAGACTTTAAGAACTGGCTGTCCTCAAAATTGTTCCCCAAAAT GCCCGGCCTTCCCTTTATCTCTTGCCAAAAGGGATACAGGGGTGTATGGGCTGGCACGGGAGTCATGACTA CTCGGTGCCCATGCGGGGCAAACATCTCGGGCCATGTCCGCATGGGTACCATGAAAATAACAGGCCCGAAG ACTTGCTTGAACCTGTGGCAGGGAACCTTCCCCATTAATTGTTACACAGAAGGGCCCTGCGTGCCAAAACC CCCTCCTAATTACAAGACC

【００２９】 アミノ酸配列： N - X Gly Glu Gly Ala Val Gln Trp Met Asn Arg Leu Ile Ala Phe Ala Ser Arg Gly Asn His Val Ala Pro Thr His Tyr Val Ala Glu Ser Asp Ala Ser Leu Arg Val Thr Gln Ile Leu Ser Ser Leu Thr Ile Thr Ser Leu Leu Arg Arg Leu His Ala Trp Ile Thr Glu Asp Cys Pro Val Pro Cys Ser Gly Ser Trp Leu Gln Asp Ile Trp Asp Trp Val Cys Ser Ile Leu Thr Asp Phe Lys Asn Trp Leu Ser Ser Lys Leu Phe Pro Lys Met Pro Gly Leu Pro Phe Ile Ser Cys Gln Lys Gly Tyr Arg Gly Val Trp Ala Gly Thr Gly Val Met Thr Thr Arg Cys Pro Cys Gly Ala Asn Ile Ser Gly His Val Arg Met Gly Thr Met Lys Ile Thr Gly Pro Lys Thr Cys Leu Asn Leu Trp Gln Gly Thr Phe Pro Ile Asn Cys Tyr Thr Glu Gly Pro Cys Val Pro Lys Pro Pro Pro Asn Tyr Lys Thr - C （上記式中，ＸはＮ末端が水素原子，Met AlaまたはAla
であることを意味する。）

【００３０】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：５１６ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類： 配列 GGAGAGGGGG CGGTCCAGTG GATGAACAGA CTGATCGCCT TTGCCTCCAG AGGAAACCAT 60 GTTGCACCTA CCCACTACGT GGCGGAATCT GATGCTTCGC TGCGCGTAAC GCAGATTCTA 120 AGTTCACTCA CAATTACCAG CTTACTTAGG AGGCTACATG CCTGGATCAC TGAAGATTGC 180 CCAGTCCCAT GTTCGGGGTC TTGGCTCCAG GACATTTGGG ATTGGGTTTG TTCCATTCTC 240 ACAGACTTTA AGAACTGGCT GTCCTCAAAA TTGTTCCCCA AAATGCCCGG CCTTCCCTTT 300 ATCTCTTGCC AAAAGGGATA CAGGGGTGTA TGGGCTGGCA CGGGAGTCAT GACTACTCGG 360 TGCCCATGCG GGGCAAACAT CTCGGGCCAT GTCCGCATGG GTACCATGAA AATAACAGGC 420 CCGAAGACTT GCTTGAACCT GTGGCAGGGA ACCTTCCCCA TTAATTGTTA CACAGAAGGG 480 CCCTGCGTGC CAAAACCCCC TCCTAATTAC AAGACC 516

【００３１】配列番号：２ 配列の長さ：１７２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 他の情報：Ｎ末端は，水素原子，Ｍｅｔ Ａｌａまたは
Ａｌａのいずれかと結合している。 Gly Glu Gly Ala Val Gln Trp Met Asn Arg Leu Ile Ala Phe Ala Ser Arg 1 5 10 15 Gly Asn His Val Ala Pro Thr His Tyr Val Ala Glu Ser Asp Ala Ser Leu 20 25 30 Arg Val Thr Gln Ile Leu Ser Ser Leu Thr Ile Thr Ser Leu Leu Arg Arg 35 40 45 50 Leu His Ala Trp Ile Thr Glu Asp Cys Pro Val Pro Cys Ser Gly Ser Trp 55 60 65 Leu Gln Asp Ile Trp Asp Trp Val Cys Ser Ile Leu Thr Asp Phe Lys Asn 70 75 80 85 Trp Leu Ser Ser Lys Leu Phe Pro Lys Met Pro Gly Leu Pro Phe Ile Ser 90 95 100 Cys Gln Lys Gly Tyr Arg Gly Val Trp Ala Gly Thr Gly Val Met Thr Thr 105 110 115 Arg Cys Pro Cys Gly Ala Asn Ile Ser Gly His Val Arg Met Gly Thr Met 120 125 130 135 Lys Ile Thr Gly Pro Lys Thr Cys Leu Asn Leu Trp Gln Gly Thr Phe Pro 140 145 150 Ile Asn Cys Tyr Thr Glu Gly Pro Cys Val Pro Lys Pro Pro Pro Asn Tyr 155 160 165 170。 Lys Thr

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/51 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 7823−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｌ 9015−2Ｊ 33/576 Ｚ 9015−2Ｊ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 有馬 暉勝 鹿児島県鹿児島市平之町５−１ 403号

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記アミノ酸配列で示される非Ａ非Ｂ型肝
   炎ウイルス抗原ポリペプチド Ｙ３０群 N - X Gly Glu Gly Ala Val Gln Trp Met Asn Arg Leu Ile Ala Phe Ala Ser Arg Gly Asn His Val Ala Pro Thr His Tyr Val Ala Glu Ser Asp Ala Ser Leu Arg Val Thr Gln Ile Leu Ser Ser Leu Thr Ile Thr Ser Leu Leu Arg Arg Leu His Ala Trp Ile Thr Glu Asp Cys Pro Val Pro Cys Ser Gly Ser Trp Leu Gln Asp Ile Trp Asp Trp Val Cys Ser Ile Leu Thr Asp Phe Lys Asn Trp Leu Ser Ser Lys Leu Phe Pro Lys Met Pro Gly Leu Pro Phe Ile Ser Cys Gln Lys Gly Tyr Arg Gly Val Trp Ala Gly Thr Gly Val Met Thr Thr Arg Cys Pro Cys Gly Ala Asn Ile Ser Gly His Val Arg Met Gly Thr Met Lys Ile Thr Gly Pro Lys Thr Cys Leu Asn Leu Trp Gln Gly Thr Phe Pro Ile Asn Cys Tyr Thr Glu Gly Pro Cys Val Pro Lys Pro Pro Pro Asn Tyr Lys Thr - C （上記式中，ＸはＮ末端が水素原子，Met AlaまたはAla
   であることを意味する。）
2. 【請求項２】請求項１の抗原ポリペプチドに含まれるエ
   ピトープと免疫学的に同一とみなし得るエピトープを有
   する連続した５個以上の請求項１記載のアミノ酸配列を
   含む抗原ポリペプチド
3. 【請求項３】化学合成された請求項１または２記載の抗
   原ポリペプチド
4. 【請求項４】請求項１または２記載のアミノ酸配列を有
   する融合抗原ポリペプチド
5. 【請求項５】抗原ポリペプチドがβ-ガラクトシダーゼ
   (β-gal)と融合されたものである請求項４記載の融合抗
   原ポリペプチド
6. 【請求項６】請求項５記載の融合抗原ポリペプチドを発
   現する組換え体λgtll クローンY30
7. 【請求項７】請求項１,２,４または５記載の抗原または
   融合抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
8. 【請求項８】下記塩基配列で示される非Ａ非Ｂ型肝炎ウ
   イルスポリヌクレオチド GGAGAGGGGGCGGTCCAGTGGATGAACAGACTGATCGCCTTTGCCTCCAGAGGAAACCATGTTGCACCTAC CCACTACGTGGCGGAATCTGATGCTTCGCTGCGCGTAACGCAGATTCTAAGTTCACTCACAATTACCAGCT TACTTAGGAGGCTACATGCCTGGATCACTGAAGATTGCCCAGTCCCATGTTCGGGGTCTTGGCTCCAGGAC ATTTGGGATTGGGTTTGTTCCATTCTCACAGACTTTAAGAACTGGCTGTCCTCAAAATTGTTCCCCAAAAT GCCCGGCCTTCCCTTTATCTCTTGCCAAAAGGGATACAGGGGTGTATGGGCTGGCACGGGAGTCATGACTA CTCGGTGCCCATGCGGGGCAAACATCTCGGGCCATGTCCGCATGGGTACCATGAAAATAACAGGCCCGAAG ACTTGCTTGAACCTGTGGCAGGGAACCTTCCCCATTAATTGTTACACAGAAGGGCCCTGCGTGCCAAAACC CCCTCCTAATTACAAGACC
9. 【請求項９】非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスに由来するポリヌ
   クレオチドを検出するためのポリヌクレオチドプローブ
   であって，請求項８記載の相補鎖の配列に由来する連続
   した８塩基，またはそれ以上の長さからなるポリヌクレ
   オチドプローブ
10. 【請求項１０】非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスに由来するポリ
    ヌクレオチドを逆転写−ＰＣＲ法にて検出するためのポ
    リヌクレオチドプライマー対であって，請求項８記載の
    配列およびその相補鎖に由来する連続した８塩基，また
    はそれ以上の長さからなるポリヌクレオチドプライマー
    対
11. 【請求項１１】請求項１,２,３,４または５記載の抗原
    または融合抗原ポリペプチドをコードする組換え体発現
    ベクターで形質転換された宿主細胞を該ポリペプチドを
    発現する条件下で培養することを特徴とする抗原ポリペ
    プチドの生産方法
12. 【請求項１２】前記発現ベクターが大腸菌用発現ベクタ
    ーでありそして前記宿主が大腸菌である請求項１１記載
    の生産方法
13. 【請求項１３】請求項１１または１２記載の生産方法に
    より生産された組換え抗原ポリペプチド
14. 【請求項１４】請求項 １，２，３，４，５または１３
    記載の抗原ポリペプチドと生物学的試料中に存在する非
    Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗体との反応で形成される免疫学
    的結合物を測定して，生物学的試料中の非Ａ非Ｂ型肝炎
    ウイルス抗体の存在を確認する非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス
    抗体の検出方法
15. 【請求項１５】請求項１，２，３，４，５または１３記
    載の抗原ポリペプチドに非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗原ポリペ
    プチドを混ぜ合わせた混合抗原と生物学的試料中に存在
    する非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗体との反応で形成される
    免疫学的結合物を測定して，生物学的試料中の非Ａ非Ｂ
    型肝炎ウイルス抗体の存在を確認する非Ａ非Ｂ型肝炎ウ
    イルス抗体の検出方法
16. 【請求項１６】免疫学的結合物を測定する方法がＥＬＩ
    ＳＡ法であることを特徴とする請求項１４または１５記
    載の検出方法
17. 【請求項１７】抗原ポリペプチドＹ３０群の抗体の存在
    を分析するためのキットであって，適当な容器内に，抗
    原ポリペプチドＹ３０群またはＹ３０群に含まれる抗原
    ポリペプチドのエピトープと免疫学的に同一とみなしう
    るエピトープを有する抗原ポリペプチドを有するキット
18. 【請求項１８】請求項９記載のポリヌクレオチドプロー
    ブを用いて，非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスに由来するポリヌ
    クレオチドをハイブリダイジェイション法にて検出する
    方法
19. 【請求項１９】請求項１０記載のポリヌクレオチドプラ
    イマ一対を用いて，非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスに由来する
    ポリヌクレオチドを逆転写−ＰＣＲ法にて検出する方法